CN104513821A - 改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因及其重组载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1第25位至第450位所示，该序列根据家蚕的密码子偏好性进行设计，能够在家蚕中正常表达和翻译；本发明还公开了含改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因的重组载体，该重组表达载体含有增强子hr3和分泌型丝胶1基因启动子Ser1，能够在家蚕中部丝腺细胞特异表达人酸性成纤维细胞生长因子，并将重组蛋白分泌至蚕丝的丝胶层中，其获得的蚕丝具有生物活性，直接使用具有促进细胞增殖的功能，是一种良好的医用材料。

Description

改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因及其重组载体和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因，还涉及含有改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因的重组载体和改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因的应用。

背景技术

家蚕以泌丝著称，是最早被人类所完全驯化利用的经济动物（昆虫）之一。家蚕的丝腺是合成、分泌蚕丝蛋白的器官，是整个蚕丝业的生物学基础。经过数千年的人工驯化，家蚕的丝腺具备了超强的蛋白质合成与分泌能力，一头体重5g左右家蚕能合成分泌约0.5g蚕丝蛋白，为目前已知昆虫之最。蚕丝蛋白主要由丝素蛋白（fibroin）和包裹在其外层的丝胶蛋白（sericin）构成：丝素蛋白是蚕丝的主体，约占75%，由蚕的后部丝腺合成，包括fib-H链、fib-L链和P25三种主要组分，均不溶于水；其余为丝胶蛋白，约占25%，由蚕的中部丝腺合成，包括丝胶1(Sericin1）、丝胶2(Sericin2）和丝胶3(Sericin3）三种主要组分，其中又以丝胶1蛋白含量最高，均可溶于水。蚕丝是天然的蛋白丝纤维，丝素是构成整个蚕丝绸产业的基础，其卓越的机械性能使其被广泛应用于纺织业，此外，丝素蛋白也具有很好的生物相容性，作为生物材料被广泛用做手术缝合线，人造血管，药物载体以及组织工程支架等。丝胶蛋白是一类亲水胶性蛋白，除了黏附在丝素的外层形成茧丝之一基本功能之外，丝胶蛋白本身也具有多种生物学功能，被用做可降解的生物材料，生物医学材料，成型品聚合物，功能性膜材料，光纤以及织物等。

以鳞翅目昆虫Trichoplusia ni来源的piggyBac转座子发展而来的遗传操作工具在家蚕中的成功应用，为遗传改造家蚕并赋予其新型功能提供的宝贵契机。家蚕丝腺几个主要的丝蛋白编码基因Fib-H，Fib-L，P25以及Sericin1的启动子被用于构建转基因表达系统，用于控制外源基因在转基因家蚕丝腺中的精确与高量表达。这些表达系统被用来表达各种功能蛋白，以此提高蚕丝的机械与生物学功能。如，利用Fib-H表达系统在家蚕后部丝腺特异表达蛛丝-蚕丝融合蛋白，使蚕丝的机械性能得到大幅提高。利用Fib-H表达系统在家蚕后部丝腺特异表达三种不同的荧光蛋白，而创作出彩色茧丝。利用Fib-L表达系统在家蚕后部丝腺特异表达碱性人成纤维生长因子（bFGF）使蚕丝的水溶蛋白经过复性处理后具有促细胞增殖的生物学功能。在蚕丝中表达胶原或纤维连接蛋白赋予蚕丝更好的细胞黏附特性。但是这些新型蚕丝的应用都需要事先利用酸、碱、高温等条件将蚕丝中的丝胶成分去除，这将会增加生产成本并导致环境污染，并影响其实际应用。因此，探索研究能被直接用作功能材料的新型蚕丝显得尤为迫切。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因；本发明的目的之二在于提供含有所述改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因的重组载体；本发明的目的之三在于提供所述改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因在家蚕中部丝腺细胞表达制备促进细胞增殖的蚕丝中的应用；本发明的目的之四在于提供利用所述改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因在家蚕中部丝腺表达制得的蚕丝；本发明的目的之五在于提供所述的蚕丝在制备促进细胞增殖的材料中的应用。

为实现上述发明目的，提供如下技术方案：

1.改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1第25位至第450位所示。

优选的，核苷酸序列如SEQ ID NO.1第7位至第450位所示。

2.含有所述改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因的重组载体。

优选的，所述重组载体含有表达改造的人酸性成纤维细胞生长因子表达框。

优选的，所述表达框为顺序连接的增强子hr3，分泌型丝胶I启动子Pser1sp，人酸性成纤维细胞生长因子基因和终止子SV40。

更优选的，所述表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

最优选的，所述重组载体是以pBac[3×p3EGFP，af]载体为骨架载体，在AscI酶切位点处连入SEQ ID NO.2所示序列。

3.所述改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因在家蚕中部丝腺细胞表达制备促进细胞增殖的蚕丝中的应用。

4.所述改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因在家蚕中部丝腺表达制得的蚕丝。

5.所述的蚕丝在制备促进细胞增殖的材料中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明公开了一种改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因，该基因根据家蚕密码子偏好进行设计，能够在家蚕丝腺中表达，并且该基因在分泌型丝胶1基因启动子Ser1和增强子hr3作用下能够在家蚕中部丝腺中表达，其表达的重组蛋白能够分泌至蚕丝的丝胶层中，并且获得的蚕丝具有生物活性，直接使用具有促进细胞增殖的功能，同时利用本发明制得的蚕丝促细胞增殖功能的发挥可不依赖于肝素，同时由于本发明制得的蚕丝不需经过复性、脱胶等处理，能够降低生产成本和对环境的污染，能够用作良好的生物医学材料；本发明还公开了改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因的重组载体，含有增强子hr3，分泌型丝胶I启动子Pser1sp，将目的基因特异的、高效的表达，为制备新型功能蚕丝奠定了基础。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为转人酸性成纤维细胞生长因子hFGF1基因家蚕的构建（A：转基因载体示意图。3×p3EGFP代表转基因筛选标记；hr3代表从家蚕杆状病毒重庆株系（BmNPV Chongqing strain）中克隆而来的增强子hr3；Pser1sp代表分泌型丝胶1基因启动子；SV40代表转录终止子；B：根据家蚕密码子使用偏好型优化而来的hFGF1DNA序列和对应的氨基酸序列；C：转基因家蚕荧光筛选，注射G1代蚕卵和蛾子的复眼发散绿色荧光转基因阳性个体均由红色箭头标出，标尺大小为2mm）。

图2为重组hFGF1蛋白在转基因家蚕中的表达检测（A：中部丝腺中重组hFGF1蛋白的免疫组化分析，a和b表示转基因家蚕中部丝腺的免疫组化在荧光以及白光下的结果，c和d表示正常对照家蚕中部丝腺的免疫组化在荧光以及白光下的结果，标尺大小为100μm；B：重组hFGF1蛋白在中部丝腺中的SDS-Page（左）和Westernblot检测（右）；C：重组hFGF1蛋白在蚕丝中的表达检测以及含量测定）。

图3为细胞培养用蚕丝薄片的制备（A转hFGF1基因家蚕蚕茧；B转hFGF1基因家蚕蚕茧，蚕茧薄层经过5次超纯水漂洗晾干；C蚕茧薄层打孔制成6mm直径的圆薄片；标尺大小为1cm）。

图4为转hFGF1蚕丝生物学功能检测（A为肝素存在时，转hFGF1蚕丝促进NIT/3T3s细胞生长的情况；B为利用CCK-8测定肝素存在时，转hFGF1蚕丝促进NIT/3T3s细胞增殖情况；C为无肝素时，转hFGF1蚕丝促进NIT/3T3s细胞生长的情况；D为利用CCK-8测定无肝素时，转hFGF1蚕丝促进NIT/3T3s细胞增殖情况，标尺大小为200μm）。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例中使用的细胞系为小鼠成纤维细胞NIH/3T3，由中国西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室保存。

一、转人酸性成纤维细胞生长因子（hFGF1）基因家蚕的制备

将商业合成经过密码子优化的人酸性成纤维细胞生长因子（hFGF1）基因，即改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1所示核苷酸的上游为BamHI酶切位点，下游为NotI酶切位点，第7位至第24位为6个组氨酸标签密码子，第25位至第450位为改造的人酸性成纤维细胞生长因子。将合成的序列经BamHI和NotI双酶切后连接至经同样没切的psl1180[hr3PSer1spRedSV40]载体中（见公开号为CN102492692A的中国专利），得psl1180[hr3PSer1hFGF1SV40]载体，其载体结构如图1A所示。然后用AscI内切酶酶切psl1180[hr3PSer1sphFGF1SV40]载体，切下表达改造的人酸性成纤维细胞生长因子的表达框，序列如SEQ ID NO.2所示，该表达框包括顺序连接的hr3增强子、分泌型丝胶I启动子Pser1sp，改造的hFGF1基因（在hFGF1基因3’端融合有6个组氨酸标签密码子）和终止子SV40，并将其连接在同样经过AscI内切酶酶切的转基因表达载体pBac[3×p3EGFPaf]（Horn and Wimmer2000；Thomas et al.2002）中，得转基因表达载体phShFGF1Sv40。该表达载体以家蚕神经复眼特异启动子（3×p3）驱动的绿色荧光蛋白基因（EGFP）为转基因筛选标记，含有一个hr3增强子，以此提高分泌型丝胶I启动子Pser1sp的转录活性，含有经过密码子优化的改造的hFGF1基因，且在hFGF1基因3’端融合表达6个组氨酸标签的核苷酸，并以SV40为转录终止子，其中带组氨酸标签的hFGF1基因如图1B所示。

将转基因表达载体phShFGF1Sv40与编码piggyBac转座酶的辅助质粒pA3PIG按照1：1摩尔比混合（400ng/μL），参照申请号为200910103397.6公开的方法进行显微注射。具体步骤为：将混合后的质粒注射已解除滞育的大造早期胚胎（产卵后2～5h），随后用无毒胶水对注射孔进行封口，经35%的甲醛蒸汽消毒5分钟后，置于25℃，相对湿度85%的环境中孵化，孵化的幼虫（G0代）采用人工饲料饲育，至成虫后进行自交或回交制种，获得的G1代蚕卵（第7天）在宏观体视荧光显微镜（Olypus MVX10，日本）下检测，绿色荧光观察采用波长为460～490nm的激发光，筛选出在眼睛或神经特异激发绿色荧光的转基因阳性蛾圈（图1C），所得转基因阳性蛾圈率为5.8%。将阳性蛾圈中的阳性个体饲养至蛾期，将转基因家蚕蛾子（图1C）与正常家蚕蛾子进行回交制种，获得稳定的转基因品系，命名为hShFGF1Sv40。

二、转基因家蚕中hFGF1重组蛋白的表达检测

将hShFGF1Sv40转基因家蚕5龄第6天的中部丝腺进行免疫组化分析。具体步骤为：取1cm左右长度的5龄第6天hShFGF1Sv40转基因家蚕的中部丝腺，利用O.C.T.试剂（SakuraFinetechnical）进行冷冻包埋，在冷冻切片机中将包埋的中部丝腺切成厚度约为10μm的横切面，贴于载玻片上，免疫组化的一抗为兔源抗hFGF1抗体（Biovision），二抗为FITC-labeledGoat Anti-Rabbit IgG（Beyotime），荧光信号的采集利用荧光显微镜（Nikon），结果如图2A所示。由图2A可知，转基因家蚕中部丝腺的丝胶层有强烈的绿色荧光信号，对照无明显的荧光信号，表明重组hFGF1蛋白在转基因家蚕的中部丝腺细胞中高效合成，并分泌至丝腺层中。

为进一步验证荧光信号属于重组hFGF1蛋白，提取转基因家蚕中部丝腺总蛋白进行SDS-Page以及Westernblot检测。具体步骤为：取1g转基因家蚕中部丝腺，置于10mL PBSpH8.0缓冲液中，剪碎后，于4℃过夜振荡，18000rpm，4℃离心5分钟收集上清部分。取20μL上清蛋白样品于15%的SDS-Page胶中进行电泳分离，并利用考马斯亮蓝染色，结果如图2B所示。结果表明：在转基因组泳道中的17kDa蛋白分子量marker的上方的出现一条差异条带，该差异条带的分子量大小与重组hFGF1蛋白的预期大小一致。按照前述相同的方法分离上清蛋白样品，并将SDS-Page胶中的蛋白转移至PVDF膜上，将PVDF膜置于含5%脱脂奶粉的TBST中，于4℃过夜封闭，次日，先用TBST洗涤1次，再将膜放入含兔抗hFGF1（购自Biovision公司）稀释比例1：10000的TBST中，室温摇床孵育1.5h，用TBST洗涤5次，再将膜放入含HRP标记的羊抗兔二抗（购自碧云天公司）、稀释比例为1：20000的TBST中，室温摇床孵育1小时，TBST洗涤5次后用ECL-Advance发光检测试剂（购自Amersham公司）盒进行显色，结果如图2B所示。Westernblot的杂交结果表明，其差异条带即为重组hFGF1蛋白条带。

将转基因家蚕蚕茧粉碎成细磨，按照30mg/mL溶于萃取缓冲液（20mM Tris-cl，8M urea，pH7.0）中，室温振荡过夜，18，000rpm，4℃离心5分钟收集上清蛋白样品。取20μL上清蛋白样品与hFGF1蛋白标准品进行SDS-Page与Westernblot检测。方法与前述方法相同，结果如图2C所示。结果显示：转基因家蚕茧丝中含有大量的重组hFGF1蛋白，与中部丝腺内容物中的检测结果一致，表明重组蛋白能被分泌至丝腺腺腔的丝胶层中，并随丝胶蛋白分泌到蚕丝中形成蚕茧。将hFGF1重组蛋白在SDS-Page以及Westernblot中的蛋白条带与hFGF1蛋白标准品的蛋白条带利用imageJ软件进行灰度比对分析。结果显示：转基因家蚕中hFGF1重组蛋白的含量约为21ng/μL蚕丝萃取总蛋白，即0.07%茧层重量。

三、转hFGF1基因蚕丝的生物学功能检测

为检测hFGF1重组蛋白在蚕丝中是否具有其天然活性，以便直接将这种转基因蚕丝开发成为新型的生物医学材料。收集转hFGF1基因家蚕茧壳和正常家蚕茧壳，利用镊子将其撕扯成薄层，浸入双蒸水中清洗5次，置于超净台中风干，利用打孔器将薄层制成直径为6mm的小圆片（～13μg/片，约含10ng hFGF1重组蛋白），然后放入超净台紫外灭菌4小时，即制成培养细胞用的蚕丝薄片（图3）。蚕丝生物学功能测试用的细胞为商业化的小鼠成纤维细胞（NIH/3T3），将NIH/3T3培养于含有10%(v/v)胎牛血清（FBS，Gibco）的DMEM培养基中，培养条件为37℃，5%CO₂，收集生长至96%汇合度的NIH/3T3细胞按照500/100μL/孔的细胞浓度贴壁平铺于96孔板中，并用含0.5%(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM培养基中饥饿处理24小时。再将制备的蚕丝薄片按照1片/孔添加至96孔板中，并以每孔10ng的hFGF1标准品作为阳性对照，并在孔中添加肝素（heparin）作为对照，肝素的工作浓度为8U/mL。孵育48小时后，小心将蚕丝薄层从96孔板中取出，吸去孔内培养基，并加入新的100μL DMEM培养基。将96孔板置于显微镜下观察经过蚕丝孵育后的细胞的生长状况。随后，向96孔板内按照10uL/孔的剂量加入CCK-8试剂（购自碧云天公司），于37℃反应4h后，在450nm波长下测定孔内细胞的吸收值。每个测试组分别设置3个平行试验，且重复3次以上。结果显示：加肝素时，转hFGF1基因蚕丝和hFGF1蛋白标准品都能显著促进NIH/3T3细胞的生长（图4A），CCK-8测试结果显示转hFGF1蚕丝的具有明显的促细胞增殖活性，且比hFGF1蛋白标准品高，暗示hFGF1重组蛋白的促有细胞丝分裂活性在蚕丝中可稳定的维持（图4B）；不加肝素时，转hFGF1基因蚕丝处理组的细胞生长情况良好，而hFGF1蛋白标准品处理的进细胞几乎不生长（图4C），CCK-8测试结果进一步显示，不加肝素时，转hFGF1基因蚕丝具有明显的促细胞增殖活性，而hFGF1标准品组的促细胞增殖效果不明显（图4D），说明该转基因蚕丝可在不依赖肝素的情况下直接用于制备具有细胞增殖功能的生物医学材料。

综上所述，利用本发明构建转基因表达载体phShFGF1SV40制备的转基因家蚕hShFGF1SV40能特异高效的在中部丝腺细胞中合成人酸性成纤维细胞生长因子重组蛋白并分泌至蚕丝的丝胶层中，获得的转基因蚕丝中重组蛋白的含量约为0.07%茧层重。转基因蚕丝的生物学活性测试结果表明：转基因蚕丝具有显著的促进细胞增殖功能，提示重组蛋白hFGF1在蚕丝中依然具有促细胞有丝分裂活性。此外，该转基因蚕丝可不依赖于肝素而发挥促进细胞增殖的功能，使得该转基因蚕丝可以直接用于生物医学材料的制备。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.1第25位至第450位所示。

2.根据权利要求1所述的改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.1第7位至第450位所示。

3.含有权利要求1或2所述改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因的重组载体。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体含有表达改造的人酸性成纤维细胞生长因子表达框。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述表达框为顺序连接的增强子hr3，分泌型丝胶I启动子Pser1sp，人酸性成纤维细胞生长因子基因和终止子SV40。

6.根据权利要求3或4所述的重组载体，其特征在于，所述表达框的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是以pBac[3×p3EGFP，af]载体为骨架载体，在AscI酶切位点处连入SEQ ID NO.2所示序列。

8.权利要求1或2所述改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因在家蚕中部丝腺细胞表达制备促进细胞增殖的蚕丝中的应用。

9.利用权利要求1或2所述改造的人酸性成纤维细胞生长因子基因在家蚕中部丝腺表达制得的蚕丝。

10.权利要求9所述的蚕丝在制备促进细胞增殖的材料中的应用。