CN105861515B - 适于家蚕丝腺表达的改造人血清白蛋白基因及其表达系统和应用 - Google Patents
适于家蚕丝腺表达的改造人血清白蛋白基因及其表达系统和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了适于家蚕丝腺表达的改造人血清白蛋白基因及其表达系统和应用，改造人血清白蛋白基因如SEQ ID NO.1第7‑1767位所示，其编码的氨基酸如SEQ ID NO.2所示，将改造人血清白蛋白基因与分泌型丝胶1基因启动子和分泌型丝胶1基因终止子构成表达框，并用增强子Hr3增强表达，同时连入piggyBac转座臂和荧光筛选标记基因构建表达系统，该表达系统能够在家蚕丝腺中高效表达重组人血清白蛋白，并且具有生物活性，能够用于大规模生产重组人血清白蛋白，具有良好的市场前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，特别涉及改造的人血清蛋白基因，还涉及含有改造的人血清蛋白基因的表达系统和利用家蚕丝腺表达重组人血清白蛋白的方法。
背景技术
进入21世纪以来，随着人类对医用、药用、食用、美容、保健等各种用途的功能性蛋白需求量的日益增大，依靠提取、生产天然来源的蛋白质已无法满足快速增长的市场需求。建立和完善各种高效的原核和真核表达系统，利用大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、昆虫以及哺乳动物等作为宿主生物反应器，是实现低成本、规模化生产具有生物学活性的重组外源蛋白的有效和可持续方法，并成为当今世界研究的热点。利用中国仓鼠卵巢细胞作为生物反应器生产外源蛋白是目前最为标准的表达模式，但其运营成本和对环境的要求极为苛刻，严重限制了其大规模推广应用。为了建立低成本、规模化、安全可持续的高效生产外源蛋白的生物工厂，自2000年以来，科研人员开始尝试利用转基因生物，如哺乳动物、鸟类、昆虫以及植物的器官作为生物反应器来生产重组外源蛋白。
家蚕以泌丝著称，是最早被人类所完全驯化利用的经济动物(昆虫)之一。家蚕的丝腺是合成、分泌蚕丝蛋白的器官，是整个蚕丝业的生物学基础。经过数千年的人工驯化，家蚕的丝腺具备了超强的蛋白质合成与分泌能力，一头体重5g左右家蚕能合成分泌约0.5g蚕丝蛋白，为目前已知昆虫之最。蚕丝蛋白主要由丝素蛋白(fibroin)和包裹在其外层的丝胶蛋白(sericin)构成：丝素蛋白是蚕丝的主体，约占75％，由蚕的后部丝腺合成，主要包括丝素重链(FibH chain)、丝素轻链(FibL chain)和丝素P25三种；其余的25％为丝胶蛋白，由蚕的中部丝腺合成，包括丝胶1(Sericin1)、丝胶2(Sericin2)和丝胶3(Sericin3)三种主要组分，其中又以丝胶1蛋白含量最高，均可溶于水。随着现代分子生物学和转基因技术的发展，家蚕绢丝腺的高效合成与分泌丝蛋白这一特征，以及所具备的糖基化、甲基化等对外源蛋白保持活性极其重要的蛋白质翻译后修饰加工能力，饲养成本低，可工厂化生产，对人畜安全等特点，使其成为理想的生物反应器模型，备受各国研究人员关注并竞相开发利用。
2000年，田村等人利用pBac转座子介导显微注射家蚕蚕卵并获得了稳定遗传的转基因家蚕；2003年，夏庆友等人完成了家蚕基因组计划，家蚕丝腺中涉及丝蛋白合成的重要编码基因如丝素重链(FibH chain)基因、丝素轻链(FibL chain)基因、丝胶1(Sericin1)基因、丝胶2(Sericin2)基因、丝胶3(Sericin3)基因以及丝素P25基因等的启动子调控元件被克隆，同时对表达系统进行优化，获得了高效的转基因家蚕丝胶1表达系统。这些基础研究结果使得利用转基因家蚕组织特异表达系统，在丝腺中大规模生产重组外源蛋白成为可能。
人血清白蛋白是由585个氨基酸组成的单链蛋白质，分子量为67kDa，人血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等，同时还可维持血液正常的渗透压。在临床上人血清白蛋白可用于治疗休克与烧伤，用于补充因手术、意外事故或大出血所致的血液丢失，也可以作为血浆增容剂补充血液的不足，同时人血清白蛋白还可用于治疗胎儿骨髓成红血细胞增多症，肝硬化引发的肝腹水等。据统计，全球每年对人血清白蛋白的需求量超过500吨。目前人血清白蛋白的商业化生产主要通过血液分离纯化途径实现，不仅价格非常昂贵，同时存在疾病传播的风险，比如肝炎和HIV。监管部门也曾呼吁制药公司使用非动物来源的血浆进行血清白蛋白的生产，这样可以有效的控制疾病因子感染的风险。因此，利用基因重组技术来生产人血清白蛋白，不仅可以有效的控制疾病传播的风险，同时也可作为血液来源的人血清白蛋白的替代，具有巨大的市场开发前景。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种适于家蚕丝腺表达的改造人血清白蛋白基因；本发明的目的之二在于提供含有适于家蚕丝腺表达的改造人血清白蛋白基因的表达系统；本发明的目的之三在于提供表达系统在家蚕丝腺表达重组人血清白蛋白中的应用；本发明的目的之四在于提供利用表达系统在家蚕丝腺中表达重组人血清白蛋白的方法。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1、适于家蚕丝腺表达的改造人血清白蛋白基因，其特征在于：所述改造人血清白蛋白基因如SEQ ID NO.1第7-1767位所示。
优选的，所述改造人血清白蛋白基因编码的氨基酸如SEQ ID NO.2所示。
2、含有所述适于家蚕丝腺表达的改造人血清白蛋白基因的表达系统。
优选的，所述表达系统含有顺序连接的增强子hr3，分泌型丝胶1基因启动子、改造人血清白蛋白基因和丝胶1基因的终止子。
优选的，所述表达系统还含有荧光筛选标记基因表达框和piggyBac转座臂序列，所述荧光筛选标记基因表达框位于所述增强子hr3上游，所述piggyBac转座臂序列位于荧光筛选标记基因表达框与piggyBac转座臂序列之间。
更优选的，所述表达系统的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3、所述表达系统在家蚕丝腺表达重组人血清白蛋白中的应用。
4、利用所述表达系统在家蚕丝腺中表达重组人血清白蛋白的方法，包括如下步骤：将所述表达系统转化解除滞育家蚕蚕卵，用无毒胶水封口后经甲醛蒸汽消毒，孵化，筛选转基因阳性蛾圈，取阳性转基因家蚕茧壳，在液氮中粉碎成粉末，然后溶解于含20mMTris-Cl，8M Urea，pH 7.9的缓冲液中，离心收集上清，经纯化，得重组人血清白蛋白。
优选的，茧壳粉末溶解于缓冲液中茧壳粉末的浓度为20mg/mL。
优选的，所述纯化的具体方法为：将上清液过Capto MMC亲和层析柱，用含25mM PB(磷酸盐缓冲液)，100mM NaCl，pH6.5的漂洗液洗脱除杂，再用含25mM PB，100mM NaCl，pH7.0-7.5的洗脱液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩，超滤除盐；然后再过HiTrap Q柱纯化，用含25mM PB，150mM NaCl，pH8.0的漂洗液洗脱除杂，接着用含25mM PB，200mM NaCl，pH8.0的洗脱液洗脱，收集洗脱液并将洗脱液浓缩，加入固体硫酸铵至终浓度为2M，然后过HiTrap Phenyl FF柱，经过含25mM PB，1M(NH4)2SO4，pH8.0的漂洗液除杂后，再用含25mMPB，1.6M(NH4)2SO4，pH8.0的洗脱液，洗脱液即为纯化后的重组人血清白蛋白。
本发明的有益效果在于：本发明通过优化人血清白蛋白的编码序列，获得适合家蚕密码子偏好的人血清白蛋白基因序列，将优化的人血清白蛋白基因序列与含有分泌型丝胶1基因启动子和终止子构成表达框并利用增强子Hr3增强表达、荧光标记基因筛选和piggyBac转座臂构建高效表达系统，该系统能够在家蚕中部丝腺特异高效表达，获得结构和活性与天然人血清白蛋白相似的重组人血清白蛋白，为高效大规模生产人血清白蛋白重组蛋白提供了可能，生产的重组人血清白蛋白可以替代血液来源的人血清白蛋白，能够有效控制疾病传播的风险，具有巨大的市场开发前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为转基因表达载体phSHSASer结构图(3×p3EGFP表示转基因荧光筛选标记基因；hr3表示增强子hr3；Ser1表示分泌型丝胶1基因启动子；HSA表示进过密码子优化设计的人血清白蛋白基因编码序列；Ser1PA表示丝胶1基因的终止子；ITR表示piggyBac转座臂序列)。
图2为转基因G1代蚕卵荧光筛选结果图(A：卵绿色荧光图；B：卵白光图；C：蛾子绿色荧光图；D：蛾子白光图)。
图3为sgHSA家蚕茧壳蛋白SDS-PAGE电泳图(1-62：62个转基因阳性个体茧壳蛋白；WT：正常茧壳蛋白；箭头所示为该蛋白所占总蛋白的百分比)。
图4为sgHSA家蚕茧壳蛋白中rHSA的检测(A：SDS-PAGE电泳图；B：Western Blot图)。
图5为sgHSA家蚕中部丝腺内容物中rHSA的检测(A：SDS-PAGE电泳图；B：WesternBlot图)。
图6为rHSA蛋白的分离纯化(A：纯化流程；B：纯化过程的SDS-PAGE检测；C：纯化过程的Western Blot检测；星号表示为降解的rHSA蛋白)。
图7为重组HSA蛋白的二级结构检测(A：rHSA蛋白在190-250nm之间的CD图谱；B：rHSA蛋白在250-320nm之间的CD图谱；C：rHSA蛋白在190-450nm之间的紫外光谱；D：天然HAS蛋白在190-250nm之间的CD图谱；E：天然HSA蛋白在250-320nm之间的CD图谱；F：天然HSA蛋白在190-450nm之间的紫外光谱)。
图8为重组HSA蛋白促进细胞生长结果图。
图9为重组HSA蛋白促进NIH/3T3细胞增殖测试结果。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本实施例使用的家蚕品种为大造(P50)，由本实验室保存。幼虫在25℃人工气候箱中用人工饲料饲养。小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3由本实验室保存，并培养于含有10％(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM培养基中，在37℃、CO2浓度为5％的条件下培养。质粒载体pSLfa1180fa(Carsten Horn.et al 2000)、pBac[3×p3EGFPaf](Carsten Horn.et al2000)，pBac[3×p3DsRedaf](Aichun Zhao.et al 2010)由本实验室保存。
DNA聚合酶Ex-Taq，LA-Taq，限制性内切酶，碱性磷酸酶，测序克隆载体pMD19-Tsimple载体，DNA Ligation Kit Ver.2.0和荧光定量PCR试剂盒SYBR premix Ex TaqTM购自TaKaRa公司。转化用大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1，质粒DNA提取试剂盒EasypurePlasmid MiniPrep Kit购自北京全式金生物技术有限公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒GelExtraction Mini Kit(50)购自上海华舜生物技术有限公司。转基因注射用超纯质粒提取试剂盒QIA prep Spin Miniprep Kit(50)购自QIAGEN。Total RNA Kit II(50)试剂盒购自Omega Bio-Tec公司。人血清白蛋白多克隆抗体(anti-HSA antibody)和人血清白蛋白标准品(HSAstd)均购自Abcam公司。
实施例1
1、基因合成
从NCBI下载人血清白蛋白(Homo sapiens albumin，HSA，GI：215982788)成熟肽氨基酸序列，根据家蚕密码子使用偏好型进行优化设计编码序列，并在人血清白蛋白(HSA)氨基酸序列的C端融合6个组氨酸氨基酸，形成HSA-His6，为方便操作在HSA-His6的核苷酸序列两端分别接上BamHI和NotI酶切位点，即如SEQ ID NO.1所示的序列，表达框编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2、转基因表达载体的构建
人工合成经过密码子优化设计的含人血清白蛋白基因编码序列(SEQ ID NO.1)的双链，用BamHI和NotI酶切后替换psl1180[hr3Pser1spRedSer1PA]载体(psl1180[hr3Pser1spRedSer1PA]载体见公开号为102492692A的中国专利)中的红色荧光蛋白基因DsRed，得psl1180[hr3Ser1spHSASer1]，再通过AscI位点构建到pBac[3×p3EGFPaf]载体的AscI位点中，形成转基因表达系统，命名为phSHSASer，其结构如图1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。图1中3×p3EGFP表示绿色荧光标记基因，用于筛选转基因的荧光标记基因；hr3表示增强子hr3；Ser1表示分泌型丝胶1基因启动子；HSA表示经过密码子优化设计的人血清白蛋白基因编码序列(SEQ ID NO.1)；Ser1PA表示丝胶1基因的终止子；ITR表示piggyBac转座臂序列。
3、显微注射与荧光筛选
将制备的转基因表达载体phSHSASer1和辅助载体pHA3PIG质粒分别稀释至浓度为400ng/μL，转基因表达载phSHSASer1与辅助载体pHA3PIG质粒按1：1的摩尔比混合。将混合后的质粒注射400粒已解除滞育的大造早期胚胎(产卵后2～5h)，随后用无毒胶水对注射孔进行封口，经35％的甲醛蒸汽消毒5分钟后，置于25℃、相对湿度为85％的环境中孵化，孵化获得137头G0代幼虫，将孵化的幼虫采用人工饲料饲育，至成虫后进行自交或回交共获得的38个蛾圈G1代蚕卵，将获得的G1代蚕卵在第7天用宏观体视荧光显微镜(Olypus MVX10，日本)下检测绿色荧光(图2)，绿色荧光观察采用波长为460～490nm的激发光，经观察筛选并获得5个在眼睛或神经特异激发绿色荧光的转基因阳性蛾圈，阳性率为16％，将转基因阳性蛾圈命名为sgHSA。
实施例2
1、检测茧壳总蛋白中重组人血清白蛋白(rHSA)含量
将sgHSA转基因家蚕的G1代5个不同的阳性蛾圈中的阳性个体分别单独饲养，并对上蔟后的62个阳性个体茧壳的rHSA蛋白进行SDS-Page检测，检测方法如下：将茧壳于液氮中粉碎成粉末，按照20mg/mL的茧壳浓度溶于浓度为20mM Tris-Cl，8M Urea(pH 7.9)的缓冲液中4℃过夜振荡，之后在18000rpm、4℃条件下离心15min，离心收集上清。将离心后的上清液在12％的SDS-PAGE分离胶电泳检测，并利用考马斯亮蓝染色，结果如图3所示。结果显示，转基因阳性个体的茧壳蛋白泳道在72kDa分子量附近出现差异条带，与rHSA蛋白的理论分子量大小一致。由图3还可以看出差异条带在不同的转基因个体来源的茧壳总蛋白中的含量明显不同。根据差异条带进行灰度计算，估算出差异蛋白的含量，结果表明rHSA蛋白最高约占茧壳总蛋白的40％。
为进一步对该差异蛋白进行鉴定，选择其中4个含量最高的转基因个体的茧壳蛋白与HSA标准品进行Western blot检测，具体步骤如下：将茧壳于液氮中粉碎成粉末，按照20mg/mL的茧壳浓度溶于20mM Tris-Cl，pH 7.9，8M Urea的缓冲液中4℃过夜振荡，之后在18000rpm、4℃条件下离心15min，离心收集上清。将收集的上清液经在12％的SDS-PAGE分离胶中电泳检测，然后采用电转膜法将SDS-PAGE胶中的蛋白转移至PVDF膜上，再将PVDF膜置于含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液中，4℃过夜封闭。免疫杂交前，于室温利用TBST缓冲液清洗PVDF膜3次，每次10min。利用含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液按10000倍稀释比例配置抗HAS一抗(人血清白蛋白多克隆抗体)杂交液，将PVDF膜浸入杂交液中室温振荡孵育2h，TBST洗膜5次，每次5min。利用TBST缓冲液按20000倍稀释比例配置HRP标记的羊抗兔IgG(购自碧云天公司)得二抗杂交液，将TBST清洗后的PVDF膜浸入二抗杂交液中于室温振荡孵育2h，TBST洗膜5次，每次5min。将清洗后的PVDF膜置于干净的保鲜膜上，将ECL显色液(AmershamBiosciences)均匀滴在PDVF膜面上，室温避光孵育5min，利用Chemiscope Series(Clinxscience instruments)仪器进行曝光和成像，结果如图4所示。结果显示，转基因茧壳蛋白在72kDa分子Marker附近出现的差异条带可以与人血清白蛋白多克隆抗体发生特异的反应，且结果与HSA标准品的结果一致，证实该差异条带即是转基因家蚕特异表达的rHSA蛋白，通过与HSA标准品进行灰度比对，我们推算出1g蚕丝中rHSA蛋白的含量约为3mg。以上结果表明，将人血清白蛋白的密码子优化后构建重组表达载体所形成的表达系统高效的重组生产人血清白蛋白，并分泌到家蚕蚕丝中。此外，重组蛋白在不同阳性蛾圈来源的个体中的含量具有显著的差异，这可能与HSA基因在家蚕染色体上的位置有关，重组蛋白表达受到染色体位置效应的影响。
2、检测中部丝腺总蛋白中重组蛋白
将茧壳总蛋白中rHSA含量高的阳性个体的中部丝腺的重组蛋白进行SDS-PAGE和Western Blot检测，检测方法如下：将五龄第6天转基因蚕的中部丝腺取出，剪碎后溶于PBS中(pH5.0)，于4℃振荡过夜，之后在12000rpm、4℃条件下离心15min，收集上清，将收集的上清经12％的SDS-PAGE分离胶进行电泳分离，并利用斯亮蓝染色，结果如图5A所示。结果显示，转基因中部丝腺内容物溶出蛋白在72kDa分子Marker附近出现的差异蛋白条带，条带大小与HSA标准品一致。然后对差异蛋白进行Western Blot检测，检测方法与茧壳蛋白的方法相同，结果如图5B所示。结果显示，该差异蛋白条带可以与人血清白蛋白多克隆抗体发生特异的反应，结果与HSA标准品一致，表明PBS缓冲液可以将重组HSA蛋白溶解出来。根据灰度计算中部丝腺溶出的总蛋白中rHSA的含量，结果表明中部丝腺溶出的总蛋白中rHSA约占15％～18％。
随后，将收集的上清液过Capto MMC亲和层析柱，HiTrap Q柱以及HiTrap PhenyLFF柱。具体方法为：上清液首先过CaptoMMC亲和层析柱(GE healthcare)，用漂洗液(25mMPB，100mM NaCl，pH6.5)除杂，洗脱液(25mM PB，100mM NaCl，pH7.0-7.5)洗脱收集，经过浓缩，超滤除盐；样品再过HiTrap Q柱纯化，并用漂洗液(25mM PB，150mM NaCl，pH8.0)洗脱除杂，洗脱液(25mM PB，200mM NaCl，pH8.0)中洗脱收集，将收集液浓缩至1mL，加入固体硫酸铵至终浓度为2M，并上样于HiTrap Phenyl FF柱，经过漂洗液(25mM PB，1M(NH4)2SO4，pH8.0)除杂后，HSA富集于洗脱液(25mM PB，1.6M(NH4)2SO4，pH8.0)中，样品浓缩后进行12％SDS-PAGE和Western Blot检测，结果如图6所示。结果显示，经纯化后最后获得纯度大约90％的rHSA蛋白。
3、重组人血清白蛋白(rHSA)的结构测定
将纯化的rHSA溶解于浓度为25mM PB，100mM NaCl，pH7.0的溶液至终浓度为0.3mg/mL的条件下，测定HSA在190-250nm之间的CD图谱。在HSA的浓度为1mg/mL的条件下，测定HSA在250-320nm之间的CD图谱与190-450nm之间的紫外光谱，结果如图7所示。结果显示：在CD：190-250nm，250-320nm和UV：190-450nm处，转基因家蚕表达的rHSA与HSA标准品具有相似的吸收峰值，表明纯化获得rHSA与HSA蛋白具有一至的二级结构。因此，我们推测利用转基因家蚕表达的rHSA应该具有其生物学功能。该结果标志着本研究建立的表达系统可以实现rHSA的高效重组表达。
4、重组人血清白蛋白(rHSA)的生物活性测定
将NIH/3T3细胞培养于含有10％(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM培养基中，在37℃、CO2浓度为5％的条件下培养，收集生长至96％汇合度的NIH/3T3细胞按照500个/孔的细胞浓度贴壁平铺于96孔板中，并用含0.5％(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM培养基饥饿处理6小时，将纯化的重组rHSA添加至96孔板至终浓度为0.8mg/mL，并以等浓度的HSA标准品(HSAstd)作为阳性对照。在孵育的24，48和72小时三个时间点对细胞进行增殖检测。检测方法为：首先在显微镜下观察经过蚕丝孵育后的细胞的生长状况，结果如图8所示；结果显示：在48h和96h两个观测点，重组rHSA蛋白和商业化HSA蛋白标准品处理的NIH/3T3细胞的生长状态明显优于对照组，表明重组rHSA蛋白可以促进细胞的生长。随后，向96孔板内加入CCK-8试剂(购自上海碧云天生物技术有限公司)，添加剂量为10uL/孔，于37℃反应4h后，测定不同处理组的细胞分别在孵育24h，48h，72h和96h四个时间点时在450nm处的吸光值。每个测试组分别设置3个平行试验，且重复3次以上，结果图9所示。结果显示，重组rHSA蛋白处理组在450nm处的吸光度值要明显高于对照组，且效果略优于等量的HSA标准品在各个时间点的吸光值。综合以上结果标志着本研究建立的表达系统可以实现rHSA的高效重组表达，且获得rHSA重组蛋白具有生物活性。
在本发明中，通过利用建立的表达系统phSHSASer，对人血清白蛋白(HSA)进行重组表达。根据家蚕基因组密码子使用的偏好型人工设计并合成了人血清白蛋白(HSA)的编码基因，构建转基因表达载体phSHSASer1。通过显微注射家蚕胚胎，我们建立转基因家蚕品系sgHSA，其中sgHSA筛选获得5个不用阳性蛾圈来源的品系。利用SDS-PAGE和Western Blot检测方法，在sgHSA家蚕的茧壳中检测到rHSA蛋白有高效表达，并且rHSA蛋白的含量最高的占茧丝可溶蛋白的40％，与HSA标准品进行灰度比对，推算出sgHSA茧丝中rHSA蛋白含量为3mg/g。结果说明经过系统性优化建立的表达系统phSHSASer，其表达效率达到了国外目前所使用表达系统的水平。在此基础之上，利用PBS对sgHSA家蚕中部丝腺腺腔内容物中的重组蛋白进行分离纯化，通过三步层析可获得纯度为90％的rHSA蛋白，相信通过对纯化步骤的进一步优化，rHSA的纯度会进一步提高。随后，我们对纯化获得rHSA蛋白的二级空间结构进行CD光谱扫描，结果显示rHSA蛋白与天然的HSA蛋白具有一致的二级结构，通过细胞生物学实验初步证实sgHSA转基因家蚕表达的重组HSA具有生物学活性。
综上所述，通过对HSA靶标外源蛋白的重组表达，分离纯化和活性鉴定，我们初步证实前面所建立的表达系统可实现外源蛋白在转基因家蚕丝腺中的高效分泌表达，并生产具有生物学活性的重组蛋白。结果表明表达系统可为家蚕丝腺生物反应的实用化进程的基础技术体系。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (2)
1.在家蚕中部丝腺表达重组人血清白蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述表达系统转化解除滞育家蚕蚕卵，用无毒胶水封口后经甲醛蒸汽消毒，孵化，筛选转基因阳性蛾圈，取阳性转基因家蚕茧壳，在液氮中粉碎成粉末，然后溶解于含20mM Tris-Cl、8MUrea、pH 7.9的缓冲液中，离心收集上清，经纯化，得重组人血清白蛋白；
所述纯化的具体方法为：将上清液过Capto MMC亲和层析柱，用含25mM 磷酸盐缓冲液、100mM NaCl、pH 6.5的漂洗液洗脱除杂，再用含25mM磷酸盐缓冲液、100mM NaCl、pH 7.0-7.5的洗脱液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩，超滤除盐；然后再过HiTrap Q柱纯化，用含25mM磷酸盐缓冲液、150mM NaCl、pH 8.0的漂洗液洗脱除杂，接着用含25mM磷酸盐缓冲液、200mM NaCl、pH 8.0的洗脱液洗脱，收集洗脱液并将洗脱液浓缩，加入固体硫酸铵至终浓度为2M，然后过HiTrap Phenyl FF柱，经过含25mM磷酸盐缓冲液、1M (NH4)2SO4、pH 8.0的漂洗液除杂后，再用含25mM磷酸盐缓冲液、1.6M (NH4)2SO4、pH 8.0的洗脱液洗脱，收集的洗脱液即为纯化后的重组人血清白蛋白；
所述表达系统含有顺序连接的增强子hr3，分泌型丝胶1基因启动子、改造的人血清白蛋白基因和丝胶1基因的终止子；还含有荧光筛选标记基因表达框和piggyBac转座臂序列；所述表达系统的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述改造的人血清白蛋白基因如SEQ ID NO.1第7-1767位所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：茧壳粉末按20mg/mL的茧壳浓度溶于缓冲液中。
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