CN112852876A - 一种表达人表皮生长因子的家蚕丝腺重组表达载体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种表达人表皮生长因子的家蚕丝腺重组表达载体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明具体涉及一种表达人表皮生长因子的家蚕丝腺重组表达载体及其制备方法和应用，属于生物材料领域。本发明所由构建的重组表达载体由截短型丝素重链N‑端结构域、C‑端结构域、优化的人表皮生长因子和家蚕核型多角体病毒增强子融合而成，最大限度地去除了融合蛋白中含有的内源丝蛋白额外结构域的冗余部分，在不影响融合外源目标蛋白整合进入丝基材料的遗传杂交过程的前提下，尽可能地消除了融合蛋白存在的多余翻译后修饰，从而实现利用遗传杂交创制表达高生物学活性人表皮生长因子的功能性蚕丝材料，为利用以家蚕为代表的先进生物合成平台开发新型高生物学活性丝基材料提供可行的解决方案。
Description
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种表达人表皮生长因子的家蚕丝腺重组表达载体及其制备方法和应用。
背景技术
蚕丝，也称茧丝，是家蚕吐丝结茧时由丝腺分泌的液状丝蛋白固化及纤维化而形成的连续长纤维。蚕丝属于多孔性蛋白纤维，其作为纺织材料具有透气性好、吸湿性极佳等优点。此外，蚕丝所具有的优良机械性能、环境稳定性、生物相容性以及生物可降解性等理化性质，使其作为一种理想的生物材料逐渐在医学和生物组织工程研究领域崭露头角。近年来，蚕丝作为原材料逐渐被广泛应用于组织修复用生物材料的开发研究，并在细胞培养载体、伤口敷料、人工皮肤及组织工程支架等新型材料的创制研究领域显示出良好的应用效果和巨大的潜在开发前景。但是随着社会的发展，蚕丝所具有的传统优良性状已经不能完全满足医用生物材料的需求，科研人员们迫切地期望能够获得既保留蚕丝原有优良机械性能和生物相容性等理化性状，又具有如促细胞生长、增殖、粘附以及伤口愈合等生物学活性的新型蚕丝生物材料。
以转基因家蚕作为生物杂交平台(Bio-hybridization platform)，通过遗传杂交(Genetic hybridization)将外源感兴趣蛋白(Protein(s)ofinterest，POI)整合进入丝基材料，为这些新型蚕丝生物材料的设计、合成以及功能化的实现提供了一种非常具有前途的自下而上的方法。目前利用基于piggyBac转座子系统的家蚕遗传改良技术已成功开发了多种转基因家蚕丝腺表达系统，包括家蚕后部丝腺表达系统——丝素(Silk fibroin，SF)重链(SF heavy chain，SF-h)、丝素轻链(SF light chain，SF-1)和Fhx/P25表达系统，这些系统将POI表达于丝纤维的内部丝素层；家蚕前中部丝腺表达系统——丝胶1(Ser1)和丝胶3(Ser3)表达系统，这些系统将POI表达于丝纤维的外部丝胶层。实际上，为获得适用于进一步提取和加工的遗传改良丝基生物材料，需要将外源POI通过遗传杂交整合进入蚕丝纤维的丝素层。目前唯有SF-h和SF-1表达系统能够实现将外源POI整合进入蚕丝纤维的丝素层，这2个系统也是目前报道的合成新型外源蛋白功能性蚕丝材料，应用最为广泛和成熟的转基因家蚕丝腺表达系统。迄今为止，借助于SF-h和SF-1表达系统，已经通过遗传杂交创制了数十种丝素层含有不同功能性POI(包括人III型胶原蛋白、人碱性成纤维生长因子、猫干扰素、人血管内表皮生长因子等)的遗传改良丝基材料。
转基因家蚕合成的外源POI本质上是融合蛋白(Fusion proteins)，即融合POI(F-POI)。利用转基因家蚕合成外源POI的传统策略，通常是将来自于内源性SF蛋白的额外结构域引入POI结构序列的上游和/或下游，从而形成F-POI。通过这种方式，可以确保F-POI和内源SF蛋白同时合成并一同被分泌至蚕茧。上述SF-h和SF-1表达系统，均是通过将SF-h蛋白或SF-1蛋白的部分结构序列与POI序列融合表达，从而创制蚕丝丝素层中含有F-POI的外源蛋白功能化丝基材料。然而，内源丝蛋白额外结构域的特定部分可能导致F-POI产生多余的翻译后修饰，并影响其正常折叠。这些异常修饰会导致F-POI的生物学活性显著降低，进而限制了转基因家蚕生物杂交平台在丝基材料功能化方面的应用。实际上，利用传统SF-h和SF-1丝素表达系统，通过遗传杂交方式创制的遗传改良蚕丝材料，其含有的F-POI的生物学活性与天然POI相比，往往呈显著降低甚至完全失活。该现象已经成为了制约外源蛋白功能化丝基材料推广和发展的主要瓶颈之一。目前文献报道的上述表达人III型胶原蛋白、人碱性成纤维生长因子、猫干扰素和人血管内表皮生长因子的遗传改良丝基材料，均出现了由于F-POI的异常修饰而导致其生物学活性显著降低的现象。
家蚕后部丝腺合成和分泌的天然SF-h蛋白，包含3个结构域：N-端结构域(含146个氨基酸)、重复结构域和C-端结构域(含57个氨基酸)。位于N-端结构域1-21位的氨基酸序列是SF-h蛋白的信号肽，其被认为是介导SF-h蛋白通过内质网膜转运，并从后部丝腺细胞运输至丝腺腔所必须的序列。该信号肽序列最终将从成熟的SF-h蛋白裂解。SF-h蛋白C-端结构域最后1-20位的氨基酸中含有3个半胱氨酸(第1、4和20位)，这些氨基酸可以形成分子内或分子间的二硫键，从而确保SF-h蛋白正确折叠并与其他丝蛋白组装形成丝素分泌单元。此外，有研究表明在SF-h蛋白的N-端和C-端结构域均存在一些可能发生翻译后修饰(包括磷酸化修饰或N-糖基化修饰)的氨基酸。对于生物工程蛋白而言，其在合成过程中多余的翻译后修饰不但可能导致目标蛋白的实际分子量与理论分子量产生巨大差异，而且可能影响目标蛋白的正常折叠与加工，进而使目标蛋白的生物学活性显著降低。
传统SF-h表达系统旨在将SF-h的整个重复结构域替换为天然POI的原始结构序列，从而合成具有全长序列的F-POI，因此其保留并融合了来自于天然SF-h蛋白的额外结构域(即N-端和C-端结构域)，进而也保留了可能发生多余翻译后修饰的氨基酸位点。在早期研究中，中国专利(公开号：CN101195834A)中的家蚕传统SF-h表达系统，在转基因蚕丝中表达的外源蛋白含量最高可达16％，这是目前报道表达F-POI效率最高的转基因家蚕丝腺表达系统。但研究发现，利用传统SF-h表达系统创制的不同类型F-POI，由于受到多余翻译后修饰的影响，其均出现F-POI的实际分子量显著高于理论分子量的现象；而且F-POI的生物学活性与天然POI相比均显著降低甚至完全失活，严重影响了基于遗传改良的生物活性蛋白功能性蚕丝材料的应用推广。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种表达人表皮生长因子的家蚕丝腺重组表达载体；本发明的目的之二在于提供所述家蚕丝腺重组表达载体的制备方法；本发明的目的之三在于提供一种外源蚕丝蛋白；本发明的目的之四在于提供所述外源蚕丝蛋白在制备以丝素为基底的生物材料中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种表达人表皮生长因子的家蚕丝腺重组表达载体，所述表达载体包括载体骨架和目的基因表达框，所述目的基因表达框包括优化的人表皮生长因子基因序列(EGF)和家蚕核型多角体病毒增强子序列(hr3)，核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1。
作为优选的技术方案之一，所述目的基因表达框还包括编码SF-h蛋白N-端结构域1-21位氨基酸的序列优化截短型启动子序列(FHP3s)，核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
作为优选的技术方案之一，所述目的基因表达框还包括编码SF-h蛋白C-端结构域1-20位氨基酸的截短型SF-h基因轻链结合位点序列(LBSs)，核苷酸序列为SEQ ID NO.5。
作为优选的技术方案之一，所述载体骨架为pBac{3×P3-DsRed}。
2、所述表达载体的制备方法，所述方法如下：将hr3、FHP3s、EGF和LBSs顺次连接至pUC57-T-simple载体，获得含有hr3-FHP3s-EGF-LBSs表达框的重组载体pUC-hr3-FHP3s-EGF-LBSs；AscI/FseI双酶切所述重组载体，回收hr3-FHP3s-EGF-LBSs表达框片段，将其连接至AscI/FseI双酶切的pBac{3×P3-DsRed}载体骨架，即得到家蚕丝腺重组表达载体pBac{3×P3-DsRed；FHP3-EGF-LBS}。
3、一种外源蚕丝蛋白，所述外源蛋白是由所述家蚕丝腺重组表达载体所表达。
4、所述外源蚕丝蛋白在制备以丝素为基底的生物材料中的应用。
作为优选的技术方案之一，所述生物材料为转基因丝素基可注射水凝胶、泡沫支架、丝素膜、纳米丝和纳米球。
有益效果：
1)本发明根据家蚕基因组序列数据库中家蚕丝腺表达内源基因的序列密码子偏好性，对人表皮生长因子基因序列进行了优化设计，使人工改造的EGF基因更有利于在活体家蚕个体丝腺中表达；
2)与传统的家蚕丝腺表达系统相比，本发明利用增强子hr3结合优化的截短型家蚕丝素重链表达系统调控重组融合人表皮生长因子F-POI(EGF)基因在家蚕后部丝腺特异性高效表达，同时不影响F-POI(EGF)在丝腺中转运及其在蚕丝中分泌的遗传杂交过程，并且可以显著提高转基因蚕丝中F-POI(EGF)的生物学活性；
3)本发明所构建的家蚕丝腺重组表达载体所表达的具有人表皮生长因子生物学活性的蚕丝蛋白，可以被加工为多种不同类型的丝素基生物材料，通过实验证实转基因丝素基材料中释放的F-POI(EGF)具有显著的促细胞增殖生物学活性，甚至能够与市售的EGF标准品相媲美，利用计算机3D结构建模证实本发明的功能化转基因蚕丝中表达的F-POI(EGF)与天然EGF蛋白相比，二者具有极高的结构相似性，从而也说明本发明获得的转基因蚕丝具有极高的人表皮生长因子生物学活性；
4)本发明能够有效克服基于遗传杂交手段获得的传统功能化蚕丝材料，其所含重组融合外源感兴趣蛋白活性显著降低的主要技术障碍，并为利用以家蚕为代表的先进生物合成平台来开发新型高性能丝基材料提供了可行的解决方案。
附图说明
图1为2种不同F-POI(EGF)基因表达框及相应转基因家蚕重组载体示意图，A：家蚕丝素重链基因和2种不同F-POI(EGF)基因表达框结构示意图；B：表达2种不同F-POI(EGF)蛋白的转基因家蚕重组载体结构示意图。
图2为表达不同F-POI(EGF)蛋白的转基因家蚕及转基因蚕茧的鉴定结果图，A：野生型家蚕和2种表达不同F-POI(EGF)蛋白的转基因家蚕复眼照片；B：家蚕丝素重链蛋白和2种不同F-POI(EGF)蛋白的结构示意图；C：脱胶前后的野生型单丝切片和分别含有2种不同F-POI(EGF)蛋白的转基因单丝切片的免疫荧光检测照片；D：脱胶前后的含有2种不同F-POI(EGF)蛋白的转基因茧丝溶液的SDS-PAGE和Western blot检测图，NEC和NsECs茧丝蛋白样品中分别检测到了不同分子量大小的特异性F-POI(EGF)蛋白(分别用星号和三角形标示)。
图3为利用野生型丝素和2种含有不同F-POI(EGF)蛋白的转基因丝素再生水溶液制备的不同类型丝素基生物材料(可注射水凝胶、泡沫支架、丝素膜、纳米丝和纳米球)的数码照片或扫描电镜照片。
图4为含有F-POI蛋白的转基因丝素基生物材料的促细胞生长活性鉴定结果图，A：利用萃取自转基因丝素膜中的不同F-POI(EGF)处理NIH/3T3细胞24h后，分别针对细胞核、Ki-67蛋白和F-actin的免疫荧光图像；B：Ki-67染色检测生长24h后的细胞增殖状态；C：用CCK-8试剂盒测定生长72h后的细胞代谢活性；D：用QuantiFluor dsDNA试剂盒检测生长72h内的细胞增殖率。
图5为从头预测3D建模方法比较转基因蚕丝中表达的不同重组融合人表皮生长因子蛋白与天然EGF蛋白结构相似性结果图，A：2种F-POI(EGF)蛋白、已公开文献中的转基因家蚕表达的重组EGF蛋白(TSF-P(s))和天然EGF蛋白氨基酸的多序列比对，N-端结构域、EGF序列和C-端结构域的氨基酸分别用蓝色、橙色以及紫色背景表示，位于N-端结构域2个倒三角之间的1v21位氨基酸是SF-h的信号肽序列(在蛋白分泌过程中建模中)，N-端结构域和C-端结构域分别包含的浅蓝色框(△标示)和紫色框(□标示)表示预测发生磷酸化修饰的氨基酸，N-端结构域包含的深蓝色框(○标示)表示预测发生糖基化修饰的氨基酸、C-端结构域包含的黑色框(☆标示)表示会形成分子内或分子间二硫键的半胱氨酸；B：2种F-POI(EGF)蛋白、TSF-P(s)和天然EGF蛋白结构模型，紫色、橙色和蓝色分别表示SF-h蛋白的N-端结构域、天然EGF蛋白的结构片段和SF-h蛋白的C-端结构域(或截短型C-端结构域)，蓝色和紫色的球分别表示N-端和C-端结构域的预测磷酸化位点，深蓝色的球表示N-端结构域上预测的糖基化位点，粉红色线条表示C-端结构域(或截短型C-端结构域)的半胱氨酸残基，相应的表面模型以黑色虚线框显示。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明实施例中使用的小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞系(ATCC)，用含有10％胎牛血清(FBS)、50mg/mL链霉素和100mg/mL氨苄青霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，均来自Gibco)培养。
实施例1
构建表达人表皮生长因子的家蚕丝腺重组表达载体
家蚕SF-h基因(NCBI基因ID：693030)和中国发明专利(公开号：CN101195834A)中的家蚕传统丝素表达系统中的丝素重链启动子序列(FHP3)和轻链结合位点序列(LBS)，家蚕核型多角体病毒增强子hr3序列(核苷酸序列为SEQ ID NO.1)、编码SF-h蛋白N-端结构域1-21位氨基酸的序列优化截短型启动子序列(FHP3s，核苷酸序列为SEQ ID NO.2)、优化人表皮生长因子(EGF)基因(核苷酸序列为SEQ ID NO.3，氨基酸序列为SEQ ID NO.4，POI(EGF))和编码SF-h蛋白C-端结构域1-20位氨基酸的截短型SF-h基因轻链结合位点序列(LBSs，核苷酸序列为SEQ ID NO.5)，均由中国南京GenScript公司合成。
GenScript公司通过无缝连接的方式将上述基因序列分别拼接为FHP3-EGF-LBS和hr3-FHP3s-EGF-LBSs表达框。然后分别连接进pUC57-T-simple载体的AscI和FseI酶切位点之间获得重组载体pUC-FHP3-EGF-LBS和pUC-hr3-FHP3s-EGF-LBSs。接下来经AscI/FseI双酶切上述重组载体，分别回收得到相应的FHP3-EGF-LBS和hr3-FHP3s-EGF-LBSs表达框片段，然后将其连接进相同酶切的pBac{3×P3-DsRed}载体，即得到转基因重组载体pBac{3×P3-DsRed；FHP3-EGF-LBS}(以下简称NEC)，和pBac{3×P3-DsRed；hr3-FHP3s-EGF-LBSs}(以下简称NsECs)，如图1中A、B所示。所构建的2个转基因重组载体均含有启动子3×P3启动的红色荧光蛋白(DsRed)基因表达框，其在家蚕眼和神经特异表达的红色荧光蛋白将作为阳性转基因家蚕的筛选标记。
实施例2
转基因家蚕的制备
用商业化滞育家蚕品系932作为原始材料，亲代蚕卵经16℃低温催青处理以解除子代蚕卵的滞育；然后将重组载体NEC或NsECs与辅助质粒pHA3PIG按照摩尔比1∶1混合，然后注射至解除滞育的G0代蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25℃、相对湿度为85％的环境中催青孵化；将孵化G0代蚁蚕用桑叶饲养至化蛾，将获得的G0代蚕蛾通过回交或自交方式制种，收集G1代蚕卵；用
电动宏观荧光显微镜在解除滞育的G1代蚕卵中筛选眼部或神经系统发红色荧光的阳性转基因家蚕；将获得的阳性转基因家蚕饲养至上蔟采茧并进一步自交选纯，即获得能稳定遗传的转基因家蚕品系。表1为转基因载体注射及阳性转基因蚕筛选统计。
表1转基因载体注射及阳性转基因蚕筛选统计
结果如图2(A、B)和表1所示，获得的NEC和NsECs蚕蛾(成虫)的眼睛中可以观察到DsRed-Express发出的红色荧光，而野生型(WT)蚕蛾不含有眼荧光(图2中A)，表明所有设计的转基因表达框都成功插入到NEC和NsECs家蚕基因组；图2中B显示了NEC和NsECs家蚕体内和蚕茧中表达的2种F-POI(EGF)蛋白结构示意图，NEC家蚕表达的F-POI(EGF)蛋白含有完整的SF-h蛋白N-端结构域和C-端结构域，NsECs家蚕表达的F-POI(EGF)蛋白含有优化的编码SF-h蛋白N-端结构域和优化的编码SF-h蛋白C-端结构域。表1中结果显示，通过荧光检测以及分子鉴定，所获得的基因组中分别含有FHP3-EGF-LBS和hr3-FHP3s-EGF-LBSs表达框插入的转基因家蚕品系NEC和NsECs。
实施例3
转基因茧丝中F-POI(EGF)蛋白的表达检测
为了从蚕茧中提取混合的SF和F-POI(EGF)用于进一步的材料制备，将蚕茧应切成碎片并经脱胶除去丝胶层。脱胶处理的具体操作步骤如下：随机选取表达2种不同F-POI(EGF)蛋白的NEC和NsECs蚕茧切成0.5～1cm的小块，浸泡于0.08％(w v-1)碳酸钠和0.12％(w v-1)马赛肥皂(Marseille soap)的混合物中，70℃脱胶45min，用Milli-Q系统(Millipore，Billerica，MA)的超纯水漂洗3-4次，去除丝胶。
为鉴定2种F-POI(EGF)蛋白在NEC和NsECs丝纤维中的分布，制备用于组织免疫荧光检查的转基因丝纤维样品。具体操作步骤如下：将未脱胶或脱胶的NEC和NsECs蚕丝纤维用10％(v v-1)福尔马林固定过夜，将蚕丝纤维缠绕成束(约50～100根丝纤维)，嵌入Tissue-Tek OCT冷冻包埋剂(Sakura Finetek，Torrance，CA，USA)，然后在-40℃下冷冻过夜。随后，将冷冻后的包埋样品切割成10μm厚的切片，用抗EGF抗体(ab155576，Abcam，USA)作为一抗，携带荧光基团的羊抗鼠IgG H&L(Alexa-Fluor 594)(ab150116，Abcam，USA)作为二抗对切片进行免疫组化染色，并在荧光显微镜(BX51TRF Olympus，Tokyo，Japan)下观察。结果如图2中C所示，脱胶前的NEC和NsECs丝纤维的丝素层均可观察到红色荧光信号，丝胶层则不含有荧光信号，而脱胶后的NEC和NsECs丝素中仍保留较为强烈的红色荧光信号。结果表明，截短型N-端结构域和C-端结构域同样可以确保F-POI(EGF)蛋白特异性分泌至茧丝的丝素层，并在脱胶过程中保持F-POI(EGF)蛋白在丝素层中的稳定性。
通过SDS-PAGE与Western blot检测并计算2种不同F-POI(EGF)蛋白分别在NEC和NsECs蚕茧中的表达量，同时评估脱胶过程造成的F-POI(EGF)蛋白损失率。具体操作步骤如下：分别称取30mg的脱胶或未脱胶的NEC和NsECs碎茧片浸于500μL的9.3M溴化锂(LiBr)溶液，在60℃下溶解2.5h，用渗析膜(MWCO 3500，Pierce)对再生溶液进行渗析以去除盐份。用双氰胺酸(BCA)蛋白检测试剂盒(Beyotine Biotech)检测透析后茧丝蛋白溶液浓度，在蛋白样品中加入2％(v v-1)的β-半乳糖苷酶(2-ME)并煮沸5min，用SDS-PAGE(15％，Bio-Rad)胶进行电泳分离。以市售的EGF标准品(AF-100-15，PeproTech，USA)为阳性对照，野生型(WT，普通蚕茧)脱胶茧丝为阴性对照。电泳完毕的SDS-PAGE胶用0.1％(w v-1)考马斯亮蓝R-250，10％(v v-1)乙酸，50％(v v-1)甲醇染色。Western blot使用商品化抗EGF抗体(ab155576，Abcam，USA)作为一抗，相应的羊抗鼠H&LIgG(HRP)(ab205719，Abcam，USA)作为二抗，按照试剂盒说明书操作步骤进行。使用ECL+Western Blot检测试剂(Beyotime，江苏，中国)并根据制造商的说明书方法进行操作，利用Clinx化学发光成像系统(ChemiScope5300，上海，中国)检测免疫反应蛋白杂交信号。使用Image-J软件计算F-POI(EGF)蛋白杂交信号的强度，取3次独立实验的结果并进行误差分析(结果用平均值±标准差表示)。结果如图2中D、表2和表3所示，与野生型(WT)茧丝样品相比，NEC和NsECs茧丝蛋白样品中分别检测到了不同分子量大小的特异性F-POI(EGF)蛋白(图2中D)；通过与蛋白Marker进行对比计算可知，NEC茧丝蛋白样品含有的F-POI(EGF)蛋白实际分子量(约为36kDa)要大于其理论分子量(25.9kDa)，而NsECs茧丝蛋白样品含有的F-POI(EGF)蛋白实际分子量(约为9kDa)则与其理论分子量(8.5kDa)相似(表2)；利用Image-J软件分析Western blot杂交条带结果显示，2种F-POI(EGF)蛋白占未脱胶处理的NEC和NsECs茧壳总蛋白的比例分别为14.28±1.09％和2.75±0.51％；脱胶处理之后，2种F-POI(EGF)蛋白占NEC和NsECs丝素蛋白溶液的比例分别为7.13±1.79％和1.16±0.23％(表3)。综合上述研究结果表明，利用本发明中的新型丝腺表达系统表达的截短型N-端结构域和C-端结构域，能够实现NsECs茧丝中的F-POI(EGF)蛋白实际分子量和理论分子量相一致，即同样能够避免F-POI(EGF)蛋白发生多余的翻译后修饰。另外，2种F-POI(EGF)蛋白在脱胶过程中的损失率均为50％，说明截短型N-端结构域和C-端结构域与传统的全长型N-端结构域和C-端结构域对F-POI(EGF)蛋白的脱胶损失影响保持一致，截短型N-端结构域和C-端结构域并不会导致F-POI(EGF)蛋白脱胶损失率提高。(表2：转基因茧丝中含有的2种不同F-POI(EGF)蛋白以及EGF蛋白标准品的理论与实际分子量统计；表3：转基因茧丝中含有的2种不同F-POI(EGF)蛋白在脱胶处理前后占茧丝总蛋白质量百分数)
表2
表3
实施例4
利用F-POI(EGF)蛋白茧丝制备不同类型的功能性丝素基生物材料
以上述实施例3中获得的分别含有2种不同F-POI(EGF)蛋白的NEC和NsECs丝素蛋白水溶液为原料，按照常规丝素基生物材料的加工方法，制备了转基因丝素基可注射水凝胶、泡沫支架、丝素膜、纳米丝和纳米球(图3)，从而证实本发明获得的2种SF/F-POI(EGF)混合水溶液，均可用于制备类似常规天然丝素基组织工程应用的各种生物材料。具体制备步骤如下：
可注射水凝胶通过超声法制备：i)将NEC(或NsECs)丝素溶液用去离子水稀释为20mg/mL浓度；ii)用超声仪以20％的振幅超声处理丝素溶液60s，每超声1s暂停1s；iii)将超声后丝素溶液注入注射器于4℃放置过夜即获得NEC(或NsECs)丝素基可注射水凝胶。
泡沫支架通过浇铸法制备：i)将NEC(或NsECs)丝素溶液用去离子水稀释为20mg/mL浓度，并倒入塑料培养皿中；ii)将培养皿置于冷藏室使丝素溶液冷却至4℃，然后将培养皿转移至-20℃冰箱放置过夜；iii)随后将培养皿转移-80℃冰箱再保存24h；iv)然后将丝素进行冷冻干燥，冻干后在室温下水蒸气退火过夜；v)最后将获得的丝素泡沫支架切割成立方体。
丝素膜通过薄膜浇铸法制备：i)将NEC(或NsECs)丝素溶液用去离子水稀释为20mg/mL浓度，并浇注在塑料培养皿上；ii)待丝素溶液自然风干后，在室温下水蒸气退火过夜；iii)最后用打孔器将获得的丝素膜打孔成圆片。
纳米纤维网格通过静电纺丝法制备：i)将聚环氧乙烷(poly(ethylene oxide))与NEC(或NsECs)丝素溶液(浓度为75mg/mL)按照质量比为0.3∶1的比例混合溶解；ii)用静电纺丝机对这些混合溶液进行静电纺丝(流速为20μL/min，电压为20-25kV，距离为20cm)；iii)静电纺丝后，纳米纤维网格在室温下水蒸气退火过夜。
纳米球通过丙酮沉淀法制备：i)将NEC(或NsECs)丝素溶液用去离子水稀释为40mg/mL浓度，然后逐滴加入丙酮溶液中使丝素形成纳米球并析出；ii)用去离子水清洗纳米球，5000rpm离心1h，共重复3次收集纳米球。
进一步比较含有2种不同F-POI(EGF)蛋白的转基因丝素基生物材料的促细胞生长活性。利用小鼠成纤维NIH/3T3细胞来检测丝素膜中2种不同F-POI(EGF)蛋白的生物学活性。将分别从NEC和NsECs组丝素膜提取的2种F-POI(EGF)蛋白和市售EGF标准品(AF-100-15，PeproTech，USA)溶液(作为阳性对照组)稀释至浓度为0.25nM(0.25nM为实验鉴定的EGF蛋白对NIH/3T3细胞的最佳刺激浓度)，然后用稀释后溶液处理NIH/3T3细胞。由于稀释后的野生型(WT)丝素膜提取物对细胞增殖没有显著影响，因此使用不含EGF的细胞培养基作为阴性对照组。
通过检测不同处理组中的核糖体RNA转录相关增殖标志物Ki-67蛋白的含量，来判定细胞的代谢活性。结果如图4中A、B、C所示，处理24h后，NsECs和阳性对照组中含有Ki-67蛋白的阳性增殖细胞占细胞总数的百分比显著高于NEC组(P＜0.05)和阴性对照组(P＜0.01)(图4中A和B)。该实验结果表明，与传统F-POI(EGF)蛋白相比，含有截短型N-端结构域和C-端结构域的F-POI(EGF)蛋白具有可媲美于市售的EGF蛋白标准品的促细胞增殖活性。处理72h后，通过CCK-8检测印证了Ki-67蛋白的检测结果，与传统F-POI(EGF)蛋白相比，含有截短型N-端结构域和C-端结构域的F-POI(EGF)蛋白和市售的EGF蛋白标准品处理组明显提高了细胞的代谢活性(P＜0.05)(图4中C)。
此外，通过检测不同处理组细胞的DNA含量以量化细胞增殖活性。结果如图4中D所示，在前12h内，4个实验组的细胞增殖情况相似；24h后，阳性对照组和NsECs组细胞数量显著高于阴性对照组(P＜0.05)，且随着培养时间的延长，这种差异越来越大；72h后，阳性对照组和NsECs组细胞增殖率均显著高于NEC组(P＜0.01)，而NEC组细胞数量显著高于阴性对照组(P＜0.05)。综上所述，传统丝腺表达系统表达的含有全长型N-端结构域和C-端结构域的F-POI(EGF)蛋白的生物学活性，明显低于利用本发明专利中的新型丝腺表达系统表达的含有截短型N-端结构域和C-端结构域的F-POI(EGF)蛋白。此外，含有截短型N-端结构域和C-端结构域的F-POI(EGF)的生物学活性甚至与市售的EGF蛋白标准品相当。
实施例5
3D建模方法比较不同重组融合人表皮生长因子蛋白与天然EGF蛋白结构相似性
名称为“hEGF生物活性新型蚕丝材料的创制与研究”的论文中，公开了一种被命名为TSF-P(s)的表达在蚕丝中的重组表皮生长因子活性蛋白(陆威健.hEGF生物活性新型蚕丝材料的创制与研究.西南大学硕士学位论文，2015)，所公开的EGF蛋白氨基酸序列与实施例1中NsECs组的POI(EGF)蛋白序列相比，上游和下游各多出4个氨基酸(图5中A)。从生物学研究角度而言，公认蛋白质的活性和功能由其三维结构所决定。为了评估2种F-POI(EGF)蛋白、TSF-P(s)蛋白与天然EGF蛋白结构的相似性，使用DMPfold(http：//bioinf， cs.ucl.ac.uk/psipred/)进行蛋白的从头建模，构建2种F-POI(EGF)蛋白、TSF-P(s)蛋白以及天然EGF蛋白的3D结构模型，如图5中B的结构模型所示，来自NsECs组的F-POI(EGF)蛋白、TSF-P(s)蛋白和天然EGF蛋白具有相似的中心对齐的β-片层结构，而来自NEC组的F-POI(EGF)则不具有该中心对齐的结构。如表4所示，NsECs组的F-POI(EGF)蛋白与天然EGF蛋白之间的C-alpha RMSD值
远小于NEC组的F-POI(EGF)或TSF-P(s)蛋白与天然EGF蛋白之间的C-alpha RMSD值(分别为
和
)。此外，NsECs组的F-POI(EGF)蛋白v.s.天然EGF蛋白预测结构的TM-score为0.413，远高于NEC组的F-POI(EGF)蛋白v.s.天然EGF蛋白预测结构的TM-score(0.066)以及TSF-P(s)蛋白v.s.天然EGF蛋白预测结构的TM-score(0.125)，其中TM-score分数范围为0～0.1747代表2种蛋白结构之间具有随机性。总而言之，蛋白的3D结构模型数据表明，与其他2种重组EGF蛋白相比，来自NsECs组的去除多余翻译后修饰位点的F-POI(EGF)蛋白和天然EGF蛋白之间的结构相似性最高，从而有效地增强了NsECs组茧丝材料中表达F-POI(EGF)蛋白的生物学活性。(表4：不同F-POI(EGF)和TSF-P(s)蛋白模型与天然EGF蛋白模型的C-alpha原子均方根偏差(RMSD)和TM-score)
表4
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 西南大学
<120> 一种表达人表皮生长因子的家蚕丝腺重组表达载体及其制备方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 949
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagcgtcgtg aaaagaggca atgacaaata caaaacgacg tatgagcaga cccgtcgcca 60
agacgggtct acctctaaga tgatgtcatt tgttttttaa aactaactcg ctttacgagt 120
agaattctac gtgtaaaaca taatcaagag atgatgtcat ttgtttttca aaaccaaact 180
cgctttacga gtagaattct acgtgtaaaa cacaatcaaa agatgatgtc attcgttttt 240
caaaaccgaa tttaagaaat gatgtcattt gtttttcaaa accaaactcg ctttacgagc 300
agaattctac gtgtaaaaca caatcaagag atgatgtcat ttgtttttca aaactgaatg 360
atgtcatttg tttttcaaaa ctaaacttgc tttgcgagta gaattctacg tgtaaaacac 420
agtcaagaga tgatgtcatt tgtttttcaa aactgaaccg gctttacgag tagaattcta 480
cttgtaaaac ataatcaaga gatgatgtca tttgtttttc aaaactgaac tggctttacg 540
agtagaattc tacgtgtaaa acataatcaa gagatgatgt catcattaaa ctgatgtcat 600
tttatacacg attgttaaca tgtttaataa tgactaattt gtttttccaa attaaactcg 660
ctttacgagt agaattctac ttgtaacgca cgattaagta tgaatcataa gctgatgtca 720
tttgttttcg acataaaatg tttatacaat ggaatcttct tgtaaattat ccaaataata 780
taatttatcc gattctacgt tacatttaaa ttcgttgtta tcgtacaatt cttcaggaca 840
cgccatgtat tggtcatttt tagcgtgcaa ccaacgattg tatttgacgc cgtcgttgga 900
ttgcgtgttc aggttggcgt acacgtgact gggcacggct tctttttcc 949
<210> 2
<211> 1929
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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gaaaacaaaa tcgttctgtg aaaattcaaa caaaaatatt ttttcgtaaa aacacttatc 120
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acagatatcg taaattgtgc catttgattt gtcacgcccg ggggggctac ggaataaact 1080
acatttattt atttaaaaaa tgaaccttag attatgtaac ttgtgattta tttgcgtcaa 1140
aagtaggcaa gatgaatcta tgtaaatacc tgggcagact tgcaatatcc tatttcaccg 1200
gtaaatcagc attgcaatat gcaatgcata ttcaacaata tgtaaaacaa ttcgtaaagc 1260
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tcgaggtagc attctgttac attttaatac attggtatgt gattataaca cgagctgccc 1440
actgagtttc tcgccagatc ttctcagtgg gtcgcgttac cgatcacgtg atagattcta 1500
tgaagcactg ctcttgttag ggctagtgtt agcaaattct ttcaggttga gtctgagagc 1560
tcacctaccc atcggagcgt agctggaata ggctaccagc taataggtag ggaaaacaaa 1620
gctcgaaaca agctcaagta ataacaacat aatgtgacca taaaatctcg tggtgtatga 1680
gatacaatta tgtactttcc cacaaatgtt tacataatta gaatgttgtt caacttgcct 1740
aacgccccag ctagaacatt caattattac tattaccact actaaggcag tatgtcctaa 1800
ctcgttccag atcagcgcta acttcgattg aatgtgcgaa atttatagct caatatttta 1860
gcacttatcg tattgattta agaaaaaatt gttaacattt tgtttcagta tgtcgcttat 1920
acaaatgca 1929
<210> 3
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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atgtatattg aagctcttga taagtatgct tgcaactgtg ttgtgggcta catcggcgag 120
cgttgccaat acagggacct caagtggtgg gaactccgt 159
<210> 4
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
50
<210> 5
<211> 222
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtggaattc ctagaagaca actagttgtt aaattcagag cactgccttg tgtgaattgc 60
taatttttaa tataaaataa cccttgtttc ttacttcgtc ctggatacat ctatgttttt 120
tttttcgtta ataaatgaga gcatttaagt tattgttttt aattactttt ttttagaaaa 180
cagatttcgg attttttgta tgcattttat ttgaatgtac ta 222
Claims (8)
1.一种表达人表皮生长因子的家蚕丝腺重组表达载体，其特征在于，所述家蚕丝腺重组表达载体包括载体骨架和目的基因表达框，所述目的基因表达框包括优化的人表皮生长因子基因序列EGF和家蚕核型多角体病毒增强子hr3序列，核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1。
2.如权利要求1所述的家蚕丝腺重组表达载体，其特征在于，所述目的基因表达框还包括编码SF-h蛋白N-端结构域1-21位氨基酸的序列优化截短型启动子FHP3s序列，核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
3.如权利要求1或2所述的家蚕丝腺重组表达载体，其特征在于，所述目的基因表达框还包括编码SF-h蛋白C-端结构域1-20位氨基酸的截短型SF-h基因轻链结合位点LBSs序列，核苷酸序列为SEQ ID NO.5。
4.如权利要求3所述家蚕丝腺重组表达载体，其特征在于，所述载体骨架为pBac{3×P3-DsRed}。
5.权利要求4所述的家蚕丝腺重组表达载体的制备方法，其特征在于，所述方法如下：将hr3、FHP3s、EGF和LBSs顺次连接至pUC57-T-simple载体，获得含有hr3-FHP3s-EGF-LBSs表达框的重组载体pUC-hr3-FHP3s-EGF-LBSs；AscI/FseI双酶切所述重组载体，回收hr3-FHP3s-EGF-LBSs表达框片段，将其连接至AscI/FseI双酶切的pBac{3×P3-DsRed}载体骨架上，即得到家蚕丝腺重组表达载体pBac{3×P3-DsRed；FHP3-EGF-LBS}。
6.一种外源蚕丝蛋白，其特征在于，所述外源蛋白是由1-4任一项所述的家蚕丝腺重组表达载体所表达。
7.权利要求6所述的外源蚕丝蛋白在制备以丝素为基底的蚕丝材料中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述蚕丝材料为转基因丝素基可注射水凝胶、泡沫支架、丝素膜、纳米丝和纳米球。
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