CN102492692A - 增强子Hr3 - Google Patents

Abstract

本发明涉及增强子Hr3，由如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列组成，其可用于在家蚕中制备重组外源蛋白；本发明还涉及含有增强子Hr3的重组载体，所述增强子Hr3通过其NcoI酶切位点与不含增强子的载体的启动子上游的NcoI酶切位点连接，共同组成含有增强子Hr3的重组载体；本发明在细胞水平鉴定一类增强子hr3、转录激活因子IE1、非翻译区序列5’UTR和3’UTR等增强基因表达的功能元件，在此基础上将最佳的元件整合建立高效、稳定的丝胶I(Sericin1)表达系统，实现在转基因家蚕中部丝腺高效表达重组外源蛋白。

Description

增强子 Hr3

技术领域

本发明涉及生物基因工程，特别涉及家蚕的转基因领域。

背景技术

随着21世纪生物工程以及基因工程的迅速发展，人们对医用、药用、食用、美容、保健等各种用途的功能性蛋白需求量日益增大，依靠天然来源的蛋白质提取和生产已无法满足快速增长的市场需求。建立和完善各种高效的原核和真核表达系统，并利用菌株、细胞和昆虫等作为宿主生物反应器，是实现低成本、规模化生产具有生物学活性的重组外源蛋白的有效和可持续方法，并成为当今世界研究的热点。利用中国仓鼠卵巢细胞作为生物反应器生产外源蛋白是目前最为标准的表达模式，但其运营成本和对环境的要求极为苛刻，严重限制了其大规模推广应用。为了建立低成本、规模化、安全可持续的高效生产外源蛋白的生物工厂，自2000年以来，科研人员开始尝试利用转基因生物，如哺乳动物、鸟类、昆虫以及植物的器官作为生物反应器来生产重组外源蛋白。

家蚕以泌丝著称，是最早被人类所完全驯化利用的经济动物（昆虫）之一。绢丝腺是合成、分泌蚕丝蛋白的唯一器官，为整个蚕丝业的生物学基础。经过数千年的人工驯化，家蚕的绢丝腺具备了超强的蛋白质合成与分泌能力，一头体重5g左右家蚕能合成分泌约0.5g蚕丝蛋白，为目前已知昆虫之最。蚕丝蛋白主要由丝素蛋白（fibroin）和覆被在其外层的丝胶蛋白（sericin）构成：丝素蛋白是蚕丝的主体，约占75%，由蚕的后部丝腺合成，包括fib-H链、fib-L链和P25三种主要组分，均不溶于水；其余为丝胶蛋白，约占25%，由蚕的中部丝腺合成，包括丝胶1(Sericin1）、丝胶2(Sericin2）和丝胶3(Sericin3）三种主要组分，其中又以丝胶1蛋白含量最高，均可溶于水。随着现代分子生物学和转基因技术的发展，家蚕绢丝腺的高效合成与分泌丝蛋白这一特征，以及所具备的糖基化、甲基化等对外源蛋白保持活性极其重要的蛋白质翻译后修饰加工能力，饲养成本低，可工厂化生产，对人畜安全等特点，使其成为理想的生物反应器模型，备受各国研究人员关注并竞相开发利用。

2000年，田村等人利用pBac转座子介导显微注射家蚕蚕卵并获得了稳定遗传的转基因家蚕；2003年，夏庆友等人完成了家蚕基因组计划，家蚕丝腺中涉及丝蛋白合成的重要编码基因如丝素重链(FibH chain)基因、丝素轻链(FibL chain)基因、丝胶1(Sericin1)基因、丝胶2(Sericin2)基因、丝胶3(Sericin3)基因以及P25基因等的启动子调控元件被鉴定和克隆，这些基础研究结果使得利用转基因家蚕组织特异表达系统，在丝腺中大规模生产重组外源蛋白成为可能。近年来，国内外利用pBac转座子介导的转基因技术以及家蚕组织特异启动子元件在丝腺中尝试表达了多个外源蛋白，包括：在后部丝腺表达了丝素重链融合的EGFP(Zhao et al. 2010)、猫干扰素（Kurihara et al. 2007)、蜘蛛丝牵引蛋白（Zhu et al. 2010)、人Ⅲ型胶原蛋白的部分肽段(Tomita et al. 2003)、增强型红色荧光蛋白(Tomita et al. 2003)，丝素轻链融合的羟基脯氨酸胶原部分肽段(Adachi et al. 2006)、成纤维细胞生长因子(Hino et al. 2006)、增强型绿色荧光蛋白(Shimizu et al. 2007)、部分胶原蛋白肽段（Yanagisawa et al. 2007)，以及P25融合的红色荧光蛋白(Royer et al. 2005)等；在中部丝腺表达了人血清白蛋白（Ogawa et al. 2007)、增强型绿色荧光蛋白(Tomita et al. 2007)、鼠单克隆抗体(Iizuka et al. 2009)、人胶原蛋白α链基因(Adachi et al. 2010)以及可溶性GM-Csf受体α(Urano et al. 2010)等。但总体上，上述研究成果的产业化推进颇为困难，主要原因在于：在丝素中生产的外源蛋白虽具有较高的含量，但重组蛋白极难纯化且易破坏其生物活性；在丝胶中生产的外源蛋白虽较容易纯化，但利用现有丝胶表达系统获得的重组蛋白含量极低而难以实现规模化生产。因此，针对外源蛋白表达合成的各个关键环节，改造并建立新的高效、稳定的表达系统，并通过转基因技术实现外源蛋白的高效生产，是解决上述瓶颈的根本出路。也是今后家蚕生物反应器开发的核心所在。

外源基因在真核细胞、组织中的表达受到转录水平、转录后调控（包括mRNA的转运和稳定性调控）、翻译效率、翻译后调控以及蛋白分泌等一系列调控，这些调控是由启动子调控区、外源基因ORF中的顺式作用元件与宿主体内的反式调控因子协同完成，该过程极其精密和复杂。另一方面，基于pBac转座子介导的家蚕转基因是由pBac携带外源基因以随机方式插入整合至家蚕基因组中，这种随机插入往往会使外源基因受到基因组插入位点位置效应的影响，使得外源基因的表达量降低。因此，我们需要对外源基因的表达系统进行改造，从转基因的转录水平、翻译效率以及转基因mRNA的稳定性三个方面进行系统性的优化，以实现外源基因的高效和稳定表达，建立高效稳定的家蚕转基因表达系统，以期利用该系统规模化生产具有高附加值的重组外源蛋白，打破家蚕只能作为传统产业的壁垒，为家蚕新型生物产业的开发提供可靠技术体系保障。

发明内容

本发明的目的在于提供一种增强子及其制备方法和应用，其可以提高启动子的活性及转录水平。另外，本发明还提供含有所述增强子的重组表达载体，其无论是在转录水平，还是mRNA的翻译效率，或是mRNA在细胞内的运输与定位及其稳定性等方面均有所提高。

上述目的的实现是通过如下技术手段获得的：1）从家蚕杆状病毒BmNPV株系（重庆株）中克隆获得的增强子hr3，增强子通过提高启动子的活性从而提高外源基因的转录水平；2）克隆两种含有不同长度5’UTR的家蚕肌动蛋白4基因启动子(BmAct4-57, BmAct4-114)，以提高mRNA的翻译效率；3）从家蚕丝腺三个重要基因fibH，fibL和Ser1基因中克隆获得的3’UTR序列，以提高mRNA在细胞内的运输与定位及其稳定性。4）构建基于家蚕肌动蛋白4启动子的荧光素酶报告基因(LUC)表达检测系统，在细胞水平对上述功能元件进行鉴定，确定促进外源基因表达的最佳组合。5) 利用最佳组合的功能元件构建转基因家蚕丝胶1表达系统，并制备转基因家蚕，从转基因水平评价该表达系统用于表达外源重组蛋白的效率。

具体技术方案为：

增强子Hr3，由如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成。

增强子Hr3的制备方法，以BmNPV基因组作为模板，涉及上游引物: 5'catgccatggaaaaagaagccgtgccca 3'，下游引物: 5'catgccatggcagcgtcgtgaaaagagg 3'，利用PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，54℃退火30秒，72 ℃延伸45秒，共30个循环；最后72 ℃延伸10 分钟，得增强子hr3。

所述的增强子Hr3在家蚕中制备重组外源蛋白的应用。

含有增强子Hr3的重组载体，所述增强子Hr3通过其NcoI酶切位点与不含增强子的载体的启动子上游的NcoI酶切位点连接，共同组成含有增强子Hr3的重组载体。

所述的含有增强子Hr3的重组载体，所述含有增强子Hr3的重组载体的终止子如SEQ ID NO:3所示。

所述的含有增强子Hr3的重组载体，所述含有增强子Hr3的重组载体的终止子如SEQ ID NO:5所示。

所述的含有增强子Hr3的重组载体，所述含有增强子Hr3的重组载体的终止子如SEQ ID NO:6所示。

所述的含有增强子Hr3的重组载体，所述含有增强子Hr3的重组载体具体为pBac[3xp3EGFP-hr3Pser1spRedsv40]，其中，含增强子Hr3、启动子Pser1sp(如SEQ ID NO:10所示)、红色荧光蛋白基因Red和终止子SV40的表达框通过ASCI连接于转座子pBac[3xp3EGFPaf]转基因表达载体上。

所述的含有增强子Hr3的重组载体，所述含有增强子Hr3的重组载体具体为pBac[3xp3EGFP-hr3Pser1spRedsv40]，具体为将pBac[3xp3EGFP-hr3Pser1spRedsv40]中终止子SV40被如SEQ ID NO:6所示的Ser1PA置换。

所述的含有增强子Hr3的重组载体，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述的含有增强子Hr3的重组载体，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

有益效果在于：

本发明是关于利用一系列具有提高基因表达量功能的调控元件对转基因表达载体进行系统的优化改造，构建高效稳定的转基因表达系统，提高外源基因在转基因家蚕中的表达水平。转基因在真核生物体内基因的表达受到转录、翻译、以及翻译后修饰等一系列复杂的调控；同时，作为一种外在性的基因表达产物，为了减少因外源基因的表达而造成对宿主自身的不良影响，宿主自身会抑制外源基因的表达，导致重组蛋白在转基因家蚕中的表达水平很低，严重制约了其实用化开发。本发明针对上述问题对表达系统进行了系统的改造，具有以下优点：①本发明首先利用家蚕肌动蛋白4基因(BmAction4)启动子BmA4-57建立了一种能在昆虫细胞中进行的瞬时表达的载体系统，同时还对BmA4-57启动子中的非编码区序列5’UTR进行了优化，提高了载体的翻译效率，为快速鉴定增强元件的功能提供一套高效的报告系统。②本发明利用上述报告系统鉴定从家蚕NPV病毒（重庆株系）中分离得到的hr3增强子元件的功能，发现其能显著提高报告基因的转录水平，进一步将hr3用于提高转基因丝胶1表达系统的转录活性，证实hr3能提高重组外源蛋白RFP在转基因家蚕中部丝腺的蛋白表达水平达7倍，在此基础之上，从家蚕NPV病毒（重庆株系）中分离得到的IE基因能进一步提高重组外源蛋白RFP的表达水平达2.1倍。③本发明还利用上述报告系统鉴定FibL终止子(FibLPA)，FibH终止子(FibHPA)以及Ser1终止子(Ser1PA)的功能，发现它们都能提高报告基因mRNA的稳定性，其中Ser1PA的效果最为显著，进一步将Ser1PA用于提高转基因丝胶1表达系统的mRNA稳定性，实验证实Ser1PA亦能提高重组外源蛋白RFP在转基因家蚕中部丝腺的蛋白表达水平达2.14倍。通过以上系统改进，使得重组红色荧光蛋白(RFP)在茧壳中的含量提高累计达31.5倍。至此，本发明利用以上调控元件建立了高效的转基因家蚕丝胶I表达系统，该系统可用于其他重组外源蛋白在转基因家蚕中进行特异高量表达。

附图说明

图1为载体的结构示意图。

图2为psl1180[BmAct4-57LUCsv40]以及psl1180[BmAct4-114LUCsv40]质粒DNA转染细胞LUC荧光素酶活性分析图，其中，A为荧光素酶活性值，B为相对荧光素酶酶活值/μg蛋白，C为LUCmRNA相对拷贝数。

图3为及LUC mRNA拷贝数分析图，其中，A为。

图4为丝胶I(sericin1)的启动子测序鉴定图，其中，A为 Pser1sp的测序鉴定，B为Pser1测序鉴定。黑色字体带灰色背景序列（-528~+1）为丝胶1基因启动子调控区，黑色大写字体的序列为丝胶I(sericin1)基因的5‘UTR，黑色小写字体的序列为丝胶I(sericin1)基因的信号肽，促使重组蛋白分泌表达。TSS为转录起始位点，signal peptide为信号肽起始密码，Initiation codon of Red为红色荧光蛋白的起始密码子。

图5为重组载体结构示意图，其中，A为pBac[3xp3-EGFP, Pser1spRedsv40]基础丝胶1表达载体，B为pBac[3xp3-EGFP, hr3Pser1spRedsv40]转基因表达载体，C为pBac[3xp3-Red, Pser1ie1sv40]，D为pBac[3xp3-EGFP, hr3Pser1spRedser1PA]。

图6为在宏观体视荧光显微镜下检测红色荧光蛋白表达的照片，其中，A为丝胶1启动子Pser1sp的驱动下，红色荧光蛋白基因在家蚕的中部丝腺特异表达照片，标尺为0.5cm，B为对hSRSV转基因家蚕的5龄第6天的中部丝腺进行冷冻切片并荧光观察照片，标尺为1.0mm。

图7为SRSV，hSRSV和hSRSV+Sie1的G1代转基因家蚕SDS-Page以及Western blotting检测红色荧光蛋白表达量的图片，其中，A为SDS-Page，B和C为Western blotting。

图8为psl1180[hr3-BmAct4-114LUCsv40]，psl1180[hr3-BmAct4-114LUCFibHPA]，psl1180[hr3-BmAct4-114LUCFibLPA]和psl1180[hr3-BmAct4-114LUCSer1PA]质粒DNADNA转染细胞LUC荧光素酶活性分析图，其中，A为LUC荧光素酶活性分析图，B为相对荧光素酶酶活值/μg蛋白，C为LUC mRNA拷贝数分析图。

图9为hSRSV，hSRSE转基因家蚕表达重组RFP的SDS-Page以及Western blotting检测图片，其中A为SDS-Page图片，B为Western blotting图片。

具体实施方式

1为了实现快速检测调控元件的增强功能，本发明首先以pSLfa1180fa载体(Carsten Horn. et al 2000)为骨架，构建一个适用于在昆虫细胞水平进行瞬时表达的表达系统psl1180[BmAct4-57LUCsv40]，该载体中依次含有(从5’到3’)家蚕肌动蛋白4 (BmAction4)的启动子BmAct4-57，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，荧光素酶报告基因(Luciferase)和sv40转录终止子(sv40)。为提高该表达系统的效率，本发明还对BmAct4-57启动子的5’UTR进行改造形成改进型的启动子BmAct4-114，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，用以替换BmAct4-57形成psl1180[BmAct4-114LUCsv40]；

2从重庆株家蚕杆状病毒(BmNPV CQ strain)的基因组中克隆增强子Hr3 ，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，将其置于BmAct4-114启动子前面，形成psl1180[hr3BmAct4-114LUCsv40]。利用转染昆虫细胞系、荧光素酶报告基因检测系统以及实时荧光定量PCR（real time PCR）技术对该载体中的Hr3进行功能鉴定。

3以pBac[3xp3EGFPaf]转基因表达载体骨架(Carsten Horn. et al 2000)为基础，构建一个转基因家蚕丝胶表达载体pBac[3xp3EGFP-Pser1spRedsv40]，该载体以眼神经组织特异启动子3xp3驱动的绿色荧光蛋白基因EGFP为筛选标记，其中，以丝胶1基因(Sericin1)启动子调控区序列作为启动子，红色荧光蛋白基因Red作为报告基因，以及sv40转录终止信号，该转基因表达载体能在家蚕中部丝腺特异表达红色荧光蛋白，并分泌到家蚕丝腺腺腔中。

4构建又一个转基因家蚕丝胶表达载体pBac[3xp3EGFP, hr3Pser1spRedsv40]，与载体pBac[3xp3EGFP-Pser1spRedsv40]不同的是该载体中的丝胶I基因(Sericin1)的启动子调控区序列前连接了增强子Hr3，以检测Hr3在转基因水平对外源基因表达的增强效果。构建又一个转基因家蚕丝胶表达载体pBac[3xp3-Red, Pser1ie1sv40]，该载体以pBac[3xp3Redaf](Aichun Zhao. et al 2000)转基因家蚕表达载体为骨架，以眼神经组织特异启动子3xp3驱动的红色荧光蛋白基因Red为筛选标记，其中，以丝胶I基因(sericin1)启动子调控区序列作为启动子，从重庆本地感染家蚕的杆状病毒株系(BmNPV CQ strain)的基因组中克隆的转录激活因子IE1作为目的基因，以及sv40转录终止信号。

5将步骤3、4中构建的两个转基因表达载体分别与辅助质粒pHA4PIG一起显微注射到家蚕蚕卵中，通过G0代自交制种后的荧光筛选获得含有以上四种基因型的转基因家蚕，分别命名为SRSV，hSRSV和Sie1。

6 将SRSV转基因家蚕，hSRSV转基因家蚕分别与正常的大造品系家蚕回交制种，另外将Sie1转基因家蚕与hSRSV转基因家蚕进行杂交制种，将SRSV，hSRSV以及hSRSV+Sie1转基因家蚕的茧壳用于SDS-Page以及Western blotting检测其中红色荧光蛋白表达量，以检测hr3和IE1在转基因水平对重组蛋白表达量的提高效果。

7克隆获得家蚕丝蛋白合成相关的三个基因fibH，fibL和Ser1基因的3’UTR命名为fibHPA(如SEQ ID NO:4所示)，fibLPA(如SEQ ID NO:5所示)和Ser1PA(如SEQ ID NO:6所示)，分别将其替换psl1180[hr3BmAct4-114LUCsv40]载体中的sv40形成psl1180[hr3BmAct4-57LUCfibHPA]，psl1180[hr3BmAct4-114LUCfibLPA]，psl1180[hr3BmAct4-114LUCSer1PA]，利用细胞表达载体系统对以上3个UTR的功能进行检测。

8构建又一个转基因家蚕丝胶表达载体pBac[3xp3EGFP-hr3Pser1spRedSer1PA]，与表达载体pBac[3xp3EGFP-hr3Pser1spRedsv40]不同的是该载体中的sv40终止信号被Ser1PA置换掉，用于检测Ser1PA对转基因mRNA稳定性的影响，提高转基因的表达量。

9将pBac[3xp3EGFP-hr3Pser1spRedSer1PA]表达载体与辅助质粒pHA4PIG一起显微注射到家蚕蚕卵中，通过G0代自交制种后的荧光筛选获得含有标记基因型的转基因家蚕，并命名为hSRSE。

10 将hSRSV转基因家蚕，hSRSE转基因家蚕分别与正常的大造品系家蚕回交制种，将hSRSV，hSRSE转基因家蚕的茧壳用于SDS-Page以及Western blotting检测其中红色荧光蛋白表达量，其中以hSRSV作为比较，以检测Ser1PA在转基因水平对重组蛋白表达量的提高效果。

实施例 1 基于家蚕 Act4 启动子的细胞表达系统的建立与优化

1 表达载体构建

A. 家蚕肌动蛋白4基因启动子的克隆（B. mori Action4）：以家蚕二化性品种大造基因组为模板，根据NCBI公布的家蚕A4启动子序列（GenBank登陆号GI:1794195）设计一条上游引物含有一个Sal I位点：5'GCgtcgacTCATCTTGTCACACCTA 3'和下游引物含有一个BamH I位点：5'cccggatccCTTGAATTAGTTTTTAATTAAATAGTTCTATTATAA 3，利用PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72 ℃延伸30秒，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。将回收获得的A4启动子片段，命名为BmAct4-57，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，并连接到测序载体上进行测序鉴定。

B. 报告基因萤火虫荧光素酶基因（Firefly luciferase）的克隆：根据荧光素酶报告基因的编码区CDS设计一条上游引物含有BamH I位点: 5' GCggatccATGGAAGACGCCAAAAACA 3'和一条下游引物含有Not I位点: 5'ATTTgcggccgcTTACACGGCGATCTTTCC3'，以PGL3-Basic（promega）载体为模板，利用PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72 ℃延伸1.5分钟，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。将回收获得的荧光素酶报告基因连接到测序载体上进行测序鉴定。

C. Sv40终止子的克隆：以pBac[3xp3EGFPaf]转基因表达载体骨架(Carsten Horn. et al 2000)为模板，设计上游引物Sv40PA-F: 5'CCgcggccgcGACTCTAGATCATAATCAGCCATACC3'含有一个Not I位点和下游引物Sv40PA-R: 5'CATGaagcttTAAGTACATTGATGAGTTTGGACAA3'含有一个 Hind III位点，利用PCR扩增获得Sv40终止子，并连接到测序载体上进行测序鉴定。

D. 家蚕肌动蛋白4基因（B. mori Action4）启动子5’UTR的优化：以家蚕二化性品种大造基因组为模板，根据NCBI公布的家蚕A4启动子序列（GenBank登陆号GI:1794195）设计一条上游引物含有一个Sal I位点：5'GCgtcgacTCATCTTGTCACACCTA 3'和一条下游引物含有一个BamH I位点：R5'CCggatccACCAATCCTCTAACAAC 3'，利用PCR扩增, 扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，54℃退火30秒，72 ℃延伸30秒，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，将回收获得的A4启动子片段，命名为BmAct4-114，并连接到测序载体上进行测序鉴定。

将克隆获得的家蚕肌动蛋白4基因的启动子（上游为SalI，下游为BamHI）、荧光素酶报告基因LUC（上游为BamHI，下游为NotI）以及来自SV40的3’UTR sv40（上游为NotI，下游为HindIII）依次（从5’端到3’端）连接至pSLfa1180fa载体(Carsten Horn. et al 2000)之上，形成基础瞬时表达载体，命名为psl1180[BmAct4-57LUCsv40]（图1）。在上述构建的基础瞬时表达载体之上，将优化了5’UTR的启动子BmAct4-118通过SalI和BamHI限制性内切酶，置换原来的BmAct4-57，形成的载体命名为psl1180[BmAct4-114LUCsv40]（图1）。

2 LUC荧光素酶活性检测

采用Qiagen超纯质粒提取试剂盒提取psl1180[BmAct4-57LUCsv40]以及psl1180[BmAct4-114LUCsv40]质粒DNA，细胞转染按照Cellfectin® II Reagent标准步骤进行：转染前一天，用无抗生素的Grace培养基将状态良好（>95%存活率）的sf9细胞重悬并铺板至24孔板内，细胞终浓度为8×10⁵/孔。利用无抗生素的Grace培养基按体积:质量=100μL：1μg比稀释待转染质粒，利用无抗生素的Grace培养基按体积:体积=100μL：5μL稀释脂质体，然后将稀释后的质粒与脂质体按等体积混合，室温静置0.5 h后，按照每孔0.1ug的DNA量转染Sf9以及BmE细胞，72 h后检测荧光素酶活性，共进行3次平行重复实验。利用Luciferase Assay System细胞裂解液裂解、收集细胞后，利用Multi-Detection Microplate Reader（FL×800，BIO-TEK公司）测定荧光素酶吸光值，然后采用BCA试剂盒对细胞裂解液进行蛋白浓度测定，荧光素酶活性值以相对荧光素酶酶活值/μg蛋白(RLU/μg蛋白)表示。细胞瞬时转染的结果表明：增加5’leader length的长度即从57bp到114bp能够提高荧光素酶活性，其中在SF9细胞系中提高3.4倍，BmE中提高1.1倍（图2A, 2B）。

3 LUC mRNA拷贝数检测：

采用Qiagen超纯质粒提取试剂盒提取上述构建的2个表达载体的DNA质粒，准备进行细胞转染。从转染后0h，20h，39h，48h，72h，96h等6个时间点收集sf9细胞，按照Omega RNA抽提试剂盒的标准步骤提取细胞总RNA，并进行反转录制备cDNA。利用定时实量PCR即Realtime PCR 方法，试剂选用日本TAKARA公司的SYBR Green Realtime PCR Master mix，仪器选用 Biorad 公司 IQ5 实时定量 PCR仪，LUC的引物为：

LUC-F： 5' acggattaccagggatttcagt 3'

LUC-R：5' gacacctttaggcagaccagtaga 3'

内参基因选用 sf9-rPL3基因的引物为：

sf9-rPL3-F: 5' ggtaatcgctcacacccaaat 3'

sf9-rPL3-R: 5' agcaaacacagagtccacagg3'

反应体系为：

cDNA模板 1.0 µL；

Realtime Master Mix 10µL；

引物1 (20 µM) 0.5µL；

引物2 (20 µM) 0.5µL；

ddH₂O 至20µL。

反应条件选用三步法条件为：95℃预变性1 min，95℃变性5s，55℃退火15 s，2℃ 延伸15s，40个循环。以内参基因的循环数为标准，计算目的基因相对内参基因表达水平的变化，将最低相对值设为1，其它值分别与最低值进行比较即可。检测上述2个的表达载体的报告基因LUC在转染后的6个时间点转录水平的变化。 定量PCR结果显示：在sf9细胞中，增加A4启动子5’leader length的长度从57bp到114bp之后， LUC的mRNA水平出现了明显降低（图2C），但是LUC的活性却提高了3.4倍（图2A），因此增加A4启动子5’leader length的长度提高了LUC的mRNA的翻译效率。

实施列 2. 来源于家蚕杆状病毒（ BmNPV ）重庆株系的 hr3 的功能鉴定与应用

1 细胞表达载体构建

A. 家蚕杆状病毒（BmNPV）同源重复性序列hr3的克隆：从感染杆状病毒的重庆本地家蚕大造（P50）品系中分离、纯化获得BmNPV基因组作为模板，根据NCBI已经公布家蚕杆状病毒T3株系（BmNPV T3 strain）（GenBank登陆号：L24902）的hr3同源重复序列设计一条上游引物含有一个Nco I位点F: 5'CATGccatggAAAAAGAAGCCGTGCCCA 3'，和一条下游引物含有一个Nco I位点R: 5'CATGccatggCAGCGTCGTGAAAAGAGG 3'，利用PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，54℃退火30秒，72 ℃延伸45秒，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，将回收获得的重庆本地株系的杆状病毒同源重复序列（hr3）连接到测序载体上进行测序鉴定。得如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在上述构建的psl1180[BmAct4-114LUCsv40]瞬时表达载体之上，将克隆获得的hr3增强子序列通过NcoI限制性内切酶构建到启动子上游，形成的载体命名为psl1180[hr3-BmAct4-114LUCsv40]（图1）。

B. 家蚕杆状病毒（BmNPV）转录激活因子IE1基因的克隆：从感染杆状病毒的重庆本地家蚕大造（P50）品系中分离、纯化获得BmNPV基因组作为模板，根据NCBI已经公布家蚕杆状病毒T3株系（BmNPV T3 strain）GenBank登陆号GI:438817的ie1基因序列设计一条上游引物含有一个BamH I位点F: 5' CGCggatccATGACGCAAATTAATTTTAA 3'和一条下游引物含有一个Not I酶切位点R: 5' ATTTgcggccgcTTAATTAAATTCAA 3'，利用PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72 ℃延伸90秒，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，将回收获得的重庆本地株系的杆状病毒IE1基因连接到测序载体上进行测序鉴定，如SEQ ID NO:7所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

在上述构建的psl1180[BmAct4-114LUCsv40]瞬时表达载体之上，将克隆获得的hr3增强子序列通过NcoI限制性内切酶构建到启动子上游，形成的载体命名为psl1180[hr3-BmAct4-114LUCsv40]（图1）。

2 LUC荧光素酶活性检测

采用Qiagen超纯质粒提取试剂盒提取psl1180[BmAct4-114LUCsv40]以及psl1180[hr3-BmAct4-114LUCsv40]质粒DNA，细胞转染与荧光素酶活性检测均按照实施例1中所述步骤进行，结果显示：hr3增强子能显著增强提高A4-114启动子的活性，其中在SF9中提高5倍，BmE中提高2.4倍（图3A, 2B）。

3 LUC mRNA拷贝数检测

采用Qiagen超纯质粒提取试剂盒提取上述构建的2个表达载体的DNA质粒，准备进行细胞转染。细胞转染按照实施例1所述步骤进行，从转染后0h，20h，39h，48h，72h，96h等6个时间点收集sf9细胞，按照Omega RNA抽提试剂盒的标准步骤提取细胞总RNA，并进行反转录制备cDNA。按照实施例1所述的定时实量PCR方法检测psl1180[BmAct4-114LUCsv40]以及psl1180[hr3-BmAct4-114LUCsv40]载体中LUC在转染后的6个时间点转录水平的变化。结果显示：在sf9细胞中，从家蚕NPV病毒重庆株系基因组中分离的hr3增强子能显著增强A4-114启动子的转录活性（图3C），使报告基因LUC的活性提高达到5倍（图3A、B）。因此，本发明获得的hr3具有提高外源基因转录水平功能。

4含Hr3增强子和IE1的双元杂交转基因丝胶1表达载体的构建

以品种大造基因组为模板，根据家蚕9倍基因组数据库设计丝胶I基因（sericin1）启动子区域特异引物：Ser1-F: 5’CAAAgtcgacGAAAACAGCACACACACTAC 3’，Ser1-R: 5’AAAAggatccAGACCCGATGATAAGACG 3’，Ser1signal peptide-R: 5’AAAAggatccTGTATCTCGATTGCCGGGGTGGTGACCGAAGGCTTTTACGCTgagcgcagccaacgcaatc’ 3，通过PCR扩增获得两条丝胶I(sericin1)的启动子，其中一条不含信号肽进行胞内表达，命名为Pser1,图4A,其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，一条含信号肽进行分泌表达，命名为Pser1sp（图4B），其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示,并克隆到T载体进行测序鉴定。

本发明所使用的转基因骨架载体pBac[3xp3-EGFPaf] (Carsten Horn. et al 2000)以及pBac[3xp3-Redaf] (Aichun Zhao. et al 2010)是基于鳞翅目昆虫细胞系的杆状病毒的转座子pBac的转基因载体。转基因表达载体的构建过程为：以pSLfa1180fa载体(Carsten Horn. et al 2000)为中间载体，将中部丝腺特异表达的丝胶1基因启动子Pser1sp（上游为SalI，下游为BamHI）、红色荧光蛋白基因Red（上游为BamHI，下游为NotI）以及转录中止信号sv40（上游为NotI，下游为HindIII）依次连接至pSLfa1180fa载体上，形成psl1180[Pser1spRedsv40]；在此基础之上，将增强子hr3通过NcoI连接至Pser1sp上游，形成psl1180[hr3Pser1spRedsv40]；随后利用AscI分别将psl1180[Pser1spRedsv40]，psl1180[hr3Pser1spRedsv40]载体中的表达框切下，连接至经同样酶切后的转基因骨架载体pBac[3xp3-EGFPaf]之上，形成pBac[3xp3-EGFP, Pser1spRedsv40]基础丝胶1表达载体（图5A），和含增强子hr3的pBac[3xp3-EGFP, hr3Pser1spRedsv40]转基因表达载体（图5B）。另外，将启动子Pser1（上游为SalI，下游为BamHI）、转录激活因子ie1（上游为BamHI，下游为NotI）以及转录中止信号sv40（上游为NotI，下游为HindIII）依次连接至pSLfa1180fa载体之上，形成psl1180[Pser1ie1sv40]，随后利用AscI将psl1180[Pser1ie1sv40]中的表达框切下，连接至经同样酶切后的转基因骨架载体pBac[3xp3-Redaf]之上，形成pBac[3xp3-Red, Pser1ie1sv40]（图5C），该转基因表达载体以眼、神经特异启动子3xp3驱动的红色荧光蛋白基因Red作为筛选。

5 转基因家蚕的制备

本发明利用pHA4PIG(马三垣 等., 家蚕转基因技术中若干因素对转基因效率的影响. 2009)作为辅助质粒产生转座酶，利用QIAGEN Plasimd Mini Kit（Qiagen）质粒抽提试剂盒分别提取pBac[3xp3-EGFP,Pser1spRedsv40]，pBac[3xp3-EGFP,hr3Pser1spRedsv40]，以及pBac[3xp3-Red, Pser1ie1sv40]质粒分别与pHA4PIG质粒按1∶1摩尔比混合后，参照（家蚕滞育品种的转基因方法，申请号 200910103397.6)中所述的方法进行显微注射。主要步骤为：将混合后的质粒注射已解除滞育的大造早期胚胎(产卵后2～5 h)，随后用无毒胶水对注射孔进行封口，经35%的甲醛蒸汽消毒5分钟后，置于 25℃，相对湿度85%的环境中孵化，孵化的幼虫(G0代)采用人工饲料饲育，至成虫后进行自交或回交制种，获得的G1代蚕卵（第7天）在宏观体视荧光显微镜(Olypus MVX10, 日本)下检测，绿色荧光观察采用波长为460～490nm的激发光，筛选出在眼睛或神经特异激发绿色荧光和红色荧光的转基因阳性蛾圈，分别命名为SRSV，hSRSV和Sie1，显微注射与转基因筛选的统计数据（表1）。

6 转基因家蚕丝腺中重组RFP的荧光检测

本发明利用hSRSV转基因家蚕的5龄第6天的丝腺为材料，在宏观体视荧光显微镜(Olypus MVX10, 日本)下检测红色荧光蛋白表达，结果显示：本发明克隆获得的丝胶1启动子Pser1sp的驱动下，红色荧光蛋白基因能在家蚕的中部丝腺特异表达（图6A）。随后，对hSRSV转基因家蚕的5龄第6天的中部丝腺进行冷冻切片并荧光观察，结果显示：本发明克隆获得的丝胶1启动子Pser1sp能使红色荧光蛋白表达并分泌至丝胶层中（图6B）

7 hr3、转录激活因子IE1增强重组RFP表达水平的分子检测

将SRSV，hSRSV和Sie1的G1代转基因家蚕分别进行饲养，制种时SRSV，hSRSV与正常大造进行回交制种，Sie1与hSRSV转基因家蚕进行杂交制种，在G2代蛹期通过荧光观察筛选具有SRSV，hSRSV和hSRSV+Sie1基因型的家蚕，并从中随机选取10个茧壳，将其剪碎，溶于含20mM Tris-cl，pH 7.9，8M urea的缓冲液中至终浓度为50mg茧壳/ml，之后放入80℃热水浴中处理15min，再12000×g，4℃离心15min收集上清溶液。收集的上清溶液按蛋白浓度BCA标准法进行蛋白浓度测定与定量。将获得的蛋白样品与5×上样缓冲液混合，按照20ug/孔的上样量进行电泳，将蛋白质转移到FDVF膜上，置于含5%脱脂奶粉的TBST中，于4℃过夜封闭，次日，先用TBST洗涤1次，再将膜放入含兔抗RFP（购自Biovision公司）稀释比例1：10000的TBST中，室温摇床孵育1.5h，用TBST洗涤5次，再将膜放入含Hrp标记的羊抗兔二抗（购自碧云天公司），稀释比例 1：20000的TBST中，室温摇床孵育1小时，TBST洗涤5后用ECL-Advance发光检测试剂(购自Amersham公司)盒进行显色。结果显示：SRSV，hSRSV转因家蚕茧壳的蛋白泳道与对照相比在红色荧光蛋白（RFP）分子量大小一致的附近处出现一条明显的差异条带（图7A），利用红色荧光蛋白特异抗体进行western blot实验证实差异条带即为重组的红色荧光蛋白，结果说明重组红色荧光蛋白在丝腺成功地表达并能分泌至茧壳中（图7B），利用BandScan5.0软件以及Quantity One软件进行密度计算显示hSRSV泳道中RFP的含量占茧壳溶出总蛋白量的21.2%，与SRSV泳道中的重组红色荧光蛋白含量3.2%相比提高了约7倍（图7A，B）。在此基础上，hSRSV转基因与Sie1转基因杂交之后的茧壳中重组红色荧光蛋白的表达量进一步提高约2.1倍（图7C），以上结果说明从重庆株系BmNPV病毒基因组中获得的hr3以及IE1能提高外源基因在转基因家蚕中的表达量，累计达14.7倍。

实施例 3. 家蚕丝腺丝蛋白合成三个关键基因终止信号的功能鉴定与应用

1 细胞表达载体构建

以家蚕二化性品种大造五龄第三天丝腺cDNA为模板，根据NCBI已经公布的家蚕FibH基因序列（GenBank登陆号GI: 8572060） 为基础设计3’UTR上游引物FibH PolyA-F: 5'ttgcggccgcTTTTAATATAAAATAACCCTTGTT 3'含有一个Not I位点和下游引物FibH PolyA R: 5'ccaagcttCTTAGTTGAGAAGGCATACTTG 3'含有一个 Hind III位点；根据NCBI已经公布的家蚕FibL基因序列（GenBank登陆号GI:112984493）为基础设计3’UTR上游引物FibL PolyA-F: 5'ttgcggccgcATAAGAACTGTAAATAATGTATATA 3'含有一个Not I位点和下游引物FibL PolyA-R: 5'ccaagcttATCTGGAAAACTGGATACATCT 3'含有一个 Hind III位点；根据NCBI已经公布的家蚕Sericin1基因序列（GenBank登陆号GI:112984399）为基础设计3’UTR上游引物Ser1 PolyA-F: 5’ATTTgcggccgcTACAACTAAACACGACTTGGAG 3’ 含有一个Not I位点和下游引物Ser1 PolyA-R: 5’CCCaagcttTTCGTCAATGTATCAGTTTTGGTGC 3’含有一个 Hind III位点；利用PCR扩增获得上述三个基因的3’UTR片段，并连接到测序载体上进行测序鉴定。

在上述构建的psl1180[hr3-BmAct4-114LUCsv40]瞬时表达载体之上，将克隆获得的FibH，FibL以及Ser1基因的3’UTR序列，分别通过NotI和HindIII置换原来的SV40的3’UTR，形成的载体命名为psl1180[hr3-BmAct4-114LUCFibHPA]，psl1180[hr3-BmAct4-114LUCFibLPA]和psl1180[hr3-BmAct4-114LUCSer1PA]（图1）。

2 LUC荧光素酶活性检测

采用Qiagen超纯质粒提取试剂盒提取psl1180[hr3-BmAct4-114LUCsv40]，psl1180[hr3-BmAct4-114LUCFibHPA]，psl1180[hr3-BmAct4-114LUCFibLPA]和psl1180[hr3-BmAct4-114LUCSer1PA]质粒DNA，细胞转染与荧光素酶活性检测均按照实施例1中步骤进行，结果显示：与SV40 polyA相比，FibL polyA，FibH polyA以及Ser1 polyA能提高荧光素酶的活性，其中Ser1 polyA的效果最为显著，在SF9中的提高达2.3倍（图8A），BmE中达2.6倍（图8B）。

3 LUC mRNA拷贝数检测

采用Qiagen超纯质粒提取试剂盒提取psl1180[hr3-BmAct4-114LUCsv40]，psl1180[hr3-BmAct4-114LUCFibHPA]，psl1180[hr3-BmAct4-114LUCFibLPA]和psl1180[hr3-BmAct4-114LUCSer1PA]质粒DNA，准备进行细胞转染。细胞转染按照实施例1中步骤进行，从转染后0h，20h，39h，48h，72h，96h等6个时间点收集sf9细胞，按照Omega RNA抽提试剂盒的标准步骤提取细胞总RNA，并进行反转录制备cDNA。按照实施例1中步骤（7）所述的定时实量PCR方法检测LUC在转染后的6个时间点转录水平的变化。结果显示：在sf9细胞中，Ser1PA是通过提高LUC的mRNA稳定性，使得mRNA能大量富积，从而提高LUC的表达量（图8C）。

4 含Ser1PA的转基因表达载体构建

将Ser1PA（上游为NotI，下游为HindIII）置换psl1180[hr3Pser1spRedsv40]中的sv40形成psl1180[hr3Pser1spRedser1PA]；随后利用AscI将psl1180[hr3Pser1spRedser1PA]载体中的表达框切下，连接至经同样酶切后的转基因骨架载体pBac[3xp3-EGFPaf]之上，形成pBac[3xp3-EGFP, hr3Pser1spRedser1PA]（图5D），这个转基因表达载体以眼、神经特异启动子3xp3驱动的绿色荧光蛋白基因EGFP作为筛选。

5 转基因家蚕的制备

本发明利用pHA4PIG(马三垣 等., 家蚕转基因技术中若干因素对转基因效率的影响. 2009)作为辅助质粒产生转座酶，利用QIAGEN Plasimd Mini Kit（Qiagen）质粒抽提试剂盒分别提取pBac[3xp3-EGFP, hr3Pser1spRedser1PA]质粒分别与pHA4PIG质粒按1∶1摩尔比混合后，参照（家蚕滞育品种的转基因方法，申请号 200910103397.6)中所述的方法进行显微注射。主要步骤为：将混合后的质粒注射已解除滞育的大造早期胚胎(产卵后2～5 h)，随后用无毒胶水对注射孔进行封口，经35%的甲醛蒸汽消毒5分钟后，置于 25℃，相对湿度85%的环境中孵化，孵化的幼虫(G0代)采用人工饲料饲育，至成虫后进行自交或回交制种，获得的G1代蚕卵（第7天）在宏观体视荧光显微镜(Olypus MVX10, 日本)下检测，绿色荧光观察采用波长为460～490nm的激发光，筛选出在眼睛或神经特异激发绿色荧光的转基因阳性蛾圈，命名为hSRSE，显微注射与转基因筛选的统计数据（表1）。

6 Ser1PA提高重组RFP表达水平的分子检测

将hSRSV和hSRSE的G1代转基因家蚕分别进行饲养，与正常大造进行回交制种，在G2代蛹期通过荧光观察筛选具有hSRSV和hSRSE基因型的家蚕，并从中随机选取10个茧壳，将其剪碎，溶于含20mM Tris-cl，pH 7.9，8M urea的缓冲液中至终浓度为50mg茧壳/ml，之后放入80℃热水浴中处理15min，再12000×g，4℃离心15min收集上清溶液。收集的上清溶液按蛋白浓度BCA标准法进行蛋白浓度测定与定量。SDS-Page和Western blot参照实施例2所述的方法进行，结果显示：hSRSV和hSRSE转因家蚕茧壳的蛋白泳道与对照相比在红色荧光蛋白（RFP）分子量大小一致的附近处出现一条明显的差异条带（图9A），利用红色荧光蛋白特异抗体进行western blot实验证实差异条带即为重组的红色荧光蛋白，结果说明重组红色荧光蛋白在丝腺成功地表达并能分泌至茧壳中（图9B），利用BandScan5.0软件以及Quantity One软件进行密度计算显示与hSRSV泳道中RFP的含量约占茧壳溶出总蛋白的21.2%，而hSRSE泳道中RFP的含量约占47%，与hSRSV表达的RFP相比提高了约2.14倍（图9A，B），结果证实Ser1PA能在转基因个体水平显著提高外源重组蛋白的表达量。

综上，通过利用hr3，IE1以及Ser1PA对丝胶1基础表达系统进行系统改进，提高其表达外源重组蛋白的效率，最终使重组红色荧光蛋白(RFP)在茧壳中的含量提高累计达31.5倍。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110> 西南大学

<120> 增强子Hr3

<160> 10

<210> 1

<211> 1002

<212> DNA

<213> 家蚕（Bombyx Batryticatus）

<220>

<223> 增强子Hr3

<400> 1

cgcgcggatc ttccagagat tcatgccatg gaaaaagaag ccgtgcccag tcacgtgtac 60

gccaacctga acacgcaatc caacgacggc gtcaaataca atcgttggtt gcacgctaaa 120

aatgaccaat acatggcgtg tcctgaagaa ttgtacgata acaacgaatt taaatgtaac 180

gtagaatcgg ataaattata ttatttggat aatttacaag aagattccat tgtataaaca 240

ttttatgtcg aaaacaaatg acatcagctt atgattcata cttaatcgtg cgttacaagt 300

agaattctac tcgtaaagcg agtttaattt ggaaaaacaa attagtcatt attaaacatg 360

ttaacaatcg tgtataaaat gacatcagtt taatgatgac atcatctctt gattatgttt 420

tacacgtaga attctactcg taaagccagt tcagttttga aaaacaaatg acatcatctc 480

ttgattatgt tttacaagta gaattctact cgtaaagccg gttcagtttt gaaaaacaaa 540

tgacatcatc tcttgactgt gttttacacg tagaattcta ctcgcaaagc aagtttagtt 600

ttgaaaaaca aatgacatca ttcagttttg aaaaacaaat gacatcatct cttgattgtg 660

ttttacacgt agaattctgc tcgtaaagcg agtttggttt tgaaaaacaa atgacatcat 720

ttcttaaatt cggttttgaa aaacgaatga catcatcttt tgattgtgtt ttacacgtag 780

aattctactc gtaaagcgag tttggttttg aaaaacaaat gacatcatct cttgattatg 840

ttttacacgt agaattctac tcgtaaagcg agttagtttt aaaaaacaaa tgacatcatc 900

ttagaggtag acccgtcttg gcgacgggtc tgctcatacg tcgttttgta tttgtcattg 960

cctcttttca cgacgctgcc atggcatgaa tcgtcgaacg gc 1002

<210> 2

<211> 698

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmAct4-57启动子

<400> 2

gtcgactcat cttgtcacac ctacatctta ctaatttcgt aagtagattt ttttttacac 60

gtataatgta tgtattcttt ccttaattaa cttattttga aacgaaataa ataggctatt 120

aatatttgga actaggttgc ggtcaatgtc aatgtctgtc tcaactttaa ttcagaatgc 180

cttgtgttcc gtagatgcca taaatcaatc aagatgcatc ttggattgtt gccaactcgc 240

agctacaaaa tttgtttcca agcctaagca tagtgctgta cccgttcccg tgtattcaaa 300

tcccgtataa tagtataata tactccgtaa atgtagtgtc actgcttgct gaaatgatat 360

tgcaagttcc gttgggaatc ttgccgttat caagcaatgc gatattagcg gtatggcggg 420

agggggacgc gcagactccc tctgctgtat taccatatat ggacacaaaa cttcgtgtat 480

tgtaccctag cgcgcgattg gaggagagtc tgcggcggcg gggcaggggc gccccgataa 540

ccggcctcat ttatatagtc cgccaagcgc actcaccaac attccacgaa gtgagcttgg 600

gtcgttgcgt tgtacagcaa taacgaagct gtgcaatagc aagttaattt atttatttat 660

aatagaacta tttaattaaa aactaattca agggatcc 698

<210> 3

<211> 761

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmAct4-114启动子

<400> 3

gtcgactcat cttgtcacac ctacatctta ctaatttcgt aagtagattt ttttttacac 60

gtataatgta tgtattcttt ccttaattaa cttattttga aacgaaataa ataggctatt 120

aatatttgga actaggttgc ggtcaatgtc aatgtctgtc tcaactttaa ttcagaatgc 180

cttgtgttcc gtagatgcta taaatcaatc aagatgcatc ttggattgtt gccaactcgc 240

agctacaaaa tttgtttcca agcctaagca tagtgctgta cccgttcccg tgtattcaaa 300

tcccgtataa tagtataata tactccgtaa atgtagtgtc actgcttgct gaaatgatat 360

tgcaagttcc gttgggaatc ttgccgttat caagcaatgc gatattagcg gtatggcggg 420

agggggacgc gcagactccc tctgctgtat taccatatat ggacacaaaa cttcgtgtat 480

tgtaccctag cgcgcgattg gaggagagtc tgcggcggcg gggcaggggc gccccgataa 540

ccggcctcat ttatatagtc cgccaagcgc actcaccaac attccacgaa gtgagcttgg 600

gtcgttgcgt tgtacagcaa taacgaagct gtgcaatagc aagttaattt atttatttat 660

aatagaacta tttaattaaa agtaagttat tttcattgtg tcttcaaata tattaagtga 720

ttgtgataac ggttaacggt tgttagagga ttggtggatc c 761

<210> 4

<211> 307

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FibHPA终止子

<400> 4

ttgcggccgc tttttaatat aaaataaccc ttgtttctta cttcgtcctg gatacatcta 60

tgtttttttt ttcgttaata aatgagagca tttaagttat tgtttttaat tacttttttt 120

tagaaaacag atttcggatt ttttgtatgc attttatttg aatgtactaa tataatcaat 180

taatcaatga attcatttat ttaagggata acaataatcc atgaattcac atgcacattt 240

aaaacaaaac taaattacaa taggttcata taaaaacaac aagtatgcct tctcaactaa 300

gaagctt 307

<210> 5

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FibLPA终止子

<400> 5

gcggccgcat aagaactgta aataatgtat atatataatt atataaaaga tatatataaa 60

ccatatacaa acatatatat atcattataa gacaatctac ctatataaaa acagactaaa 120

attaataatt atgtatactt taattgtgtt taggacattt tatgcaaatt gtgtttgcgt 180

taggattttt tttggaagtt ttttagatta tttatgaata tataaataaa tatacgttaa 240

tataatatat attatataaa tcaacgacac ggcttttcat tttggtgatg atcaatctta 300

ttgttcttct aattgatttt tttgtacaat aaagatgtat ccagttttcc agat 354

<210> 6

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ser1PA终止子

<400> 6

gcggccgcta caactaaaca cgacttggag tattccttgt agtgtttaag attttaaatc 60

ttacttaatg acttcgaacg attttaacga taactttctc tttgtttaac tttaatcagc 120

atacataaaa agccccggtt ttgtatcggg aagaaaaaaa atgtaattgt gttgcctaga 180

taataaacgt attatcaaag tgtgtggttt tcctttacca aagacccctt taagatgggc 240

ctaatgggct taagtcgagt cctttccgat gtgttaaata cacatttatt acactgatgc 300

gtcgaatgta cacttttaat aggatagctc cactaaaaat tattttattt atttaatttg 360

ttgcaccaaa actgatacat tgacgaaaag ctt 393

<210> 7

<211> 1755

<212> DNA

<213> 家蚕（Bombyx Batryticatus）

<220>

<223> 转录激活因子IE1

<400> 7

atgacgcaaa ttaattttaa cgcgtcgtac accagcgctc cgacgccgtc ccgagcgtcg 60

ttcgacaacg gctattcaga gttttgtgat aaacaacagc ccaacgacta tttgaattat 120

tataacaatc ccacgccgga tggagccgac acggtagtat ctgacagcga gactgcagca 180

gcttcaaact ttttggcaag cgtcaattcg ttaactgatg ataacgatat aatggaatgt 240

ttgctcaaga ccactgataa tctcggagaa gcagttagtt ctgcttatta ttcggaatcc 300

cttgagctgc ctgttgcgga gcaaccatcg cccagttctg cttataatgc ggaatctttt 360

gagcatcctg ttggtgtgaa ccaaccatcg gcaactggaa ctaaacggaa gctggacgaa 420

tacttggacg attcacaaag tgtggtgggc caatttaaca agaataaatt gaagcctaaa 480

tacaagaaaa gcacaattca aagctgtgca acccttgaac agacaattaa tcacaacacg 540

aacatttgca cggttgcttc aactcaagaa attacgcatt attttactaa tgattttgcg 600

ccgtatttga tgcgtttcga cgacaacgac tacaattcca acaggttctc cgaccatatg 660

tccgaaactg gttattacat gtttgtggtt aaaaaaagtg aagtaaagtc gtttgaaatt 720

atatttgcca agtacgtgag caatgtggta tacgaatata caaacaacta ttacatggta 780

gataatcgcg tgtttgtggt aacgtttgat aaaattagat ttatgatttc gtacaatttg 840

gttaaagaaa ccggcataga aattcctcat tctcaagatg tgtgcaacga cgagacggct 900

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acttcatatt ttaatttaga tatgtattac gcgcaaacca catttgtgac tctgttacaa 1020

tcgttgggcg aaagaaagtg tgggtttctt ttgagcaagt tgtacgaaat gtatcaagat 1080

aaaaatttat ttactttgcc tattatgctt agtcgtaaag agagtaatga aattgagact 1140

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tttgaattta attaa 1755

<210> 8

<211> 584

<212> PRT

<213> 家蚕（Bombyx Batryticatus）

<220>

<223> 转录激活因子IE1

<400> 8

Met Thr Gln Ile Asn Phe Asn Ala Ser Tyr Thr Ser Ala Pro Thr

1 5 10 15

Pro Ser Arg Ala Ser Phe Asp Asn Gly Tyr Ser Glu Phe Cys Asp

20 25 30

Lys Gln Gln Pro Asn Asp Tyr Leu Asn Tyr Tyr Asn Asn Pro Thr

35 40 45

Pro Asp Gly Ala Asp Thr Val Val Ser Asp Ser Glu Thr Ala Ala

50 55 60

Ala Ser Asn Phe Leu Ala Ser Val Asn Ser Leu Thr Asp Asp Asn

65 70 75

Asp Ile Met Glu Cys Leu Leu Lys Thr Thr Asp Asn Leu Gly Glu

80 85 90

Ala Val Ser Ser Ala Tyr Tyr Ser Glu Ser Leu Glu Leu Pro Val

95 100 105

Ala Glu Gln Pro Ser Pro Ser Ser Ala Tyr Asn Ala Glu Ser Phe

110 115 120

Glu His Pro Val Gly Val Asn Gln Pro Ser Ala Thr Gly Thr Lys

125 130 135

Arg Lys Leu Asp Glu Tyr Leu Asp Asp Ser Gln Ser Val Val Gly

140 145 150

Gln Phe Asn Lys Asn Lys Leu Lys Pro Lys Tyr Lys Lys Ser Thr

155 160 165

Ile Gln Ser Cys Ala Thr Leu Glu Gln Thr Ile Asn His Asn Thr

170 175 180

Asn Ile Cys Thr Val Ala Ser Thr Gln Glu Ile Thr His Tyr Phe

185 190 195

Thr Asn Asp Phe Ala Pro Tyr Leu Met Arg Phe Asp Asp Asn Asp

200 205 210

Tyr Asn Ser Asn Arg Phe Ser Asp His Met Ser Glu Thr Gly Tyr

215 220 225

Tyr Met Phe Val Val Lys Lys Ser Glu Val Lys Ser Phe Glu Ile

230 235 240

Ile Phe Ala Lys Tyr Val Ser Asn Val Val Tyr Glu Tyr Thr Asn

245 250 255

Asn Tyr Tyr Met Val Asp Asn Arg Val Phe Val Val Thr Phe Asp

260 265 270

Lys Ile Arg Phe Met Ile Ser Tyr Asn Leu Val Lys Glu Thr Gly

275 280 285

Ile Glu Ile Pro His Ser Gln Asp Val Cys Asn Asp Glu Thr Ala

290 295 300

Ala Gln Asn Cys Lys Lys Cys His Phe Val Asp Val His His Thr

305 310 315

Phe Lys Ala Ala Leu Thr Ser Tyr Phe Asn Leu Asp Met Tyr Tyr

320 325 330

Ala Gln Thr Thr Phe Val Thr Leu Leu Gln Ser Leu Gly Glu Arg

335 340 345

Lys Cys Gly Phe Leu Leu Ser Lys Leu Tyr Glu Met Tyr Gln Asp

350 355 360

Lys Asn Leu Phe Thr Leu Pro Ile Met Leu Ser Arg Lys Glu Ser

365 370 375

Asn Glu Ile Glu Thr Ala Ser Asn Asn Phe Phe Val Ser Pro Tyr

380 385 390

Val Ser Gln Ile Leu Lys Tyr Ser Glu Ser Val Lys Phe Pro Asp

395 400 405

Asn Pro Pro Asn Lys Tyr Val Val Asp Asn Leu Asn Leu Ile Val

410 415 420

Asn Lys Lys Ser Thr Leu Thr Tyr Lys Tyr Ser Ser Val Ala Asn

425 430 435

Leu Leu Phe Asn Asn Tyr Lys Tyr His Asp Asn Ile Ala Ser Asn

440 445 450

Asn Asn Ala Glu Asn Leu Lys Lys Val Lys Lys Glu Asp Gly Ser

455 460 465

Met His Ile Val Glu Gln Tyr Leu Thr Gln Asn Val Asp Asn Val

470 475 480

Lys Gly His Asn Phe Ile Val Leu Ser Phe Lys Asn Glu Glu Arg

485 490 495

Leu Thr Ile Ala Lys Lys Asn Glu Glu Phe Tyr Trp Ile Ser Gly

500 505 510

Glu Ile Lys Asp Val Asp Ala Ser Gln Val Ile Gln Lys Tyr Asn

515 520 525

Arg Phe Lys His His Met Phe Val Ile Ser Lys Val Asn Arg Arg

530 535 540

Glu Ser Thr Thr Leu His Asn Asn Leu Leu Lys Leu Leu Ala Leu

545 550 555

Ile Leu Gln Gly Leu Val Pro Leu Ser Asp Ala Ile Thr Phe Ala

560 565 570

Glu Gln Lys Leu Asn Cys Lys Tyr Lys Lys Phe Glu Phe Asn

575 580 584

<210> 9

<211> 678

<212> DNA

<213> 家蚕（Bombyx Batryticatus）

<220>

<223> 丝胶Ⅰ基因的启动子Pser1sp

<400> 9

gaaaacagca cacacactac ataccatgta tttgacgcac acacgcatgt atactattta 60

ttgtcaaact tttgttcttg acgtctgtgt tcaaactgag aatagattaa atattgtttg 120

tctttattaa tattttttaa tagtgtagtc ttggcgaaat ttgtgattat aaaagtataa 180

aatacaatca taatagtgta cgaacttaca attccaatta attatagtcg aatttcgact 240

actgcgggac ctctagtatt aataattctc tttaaaaaaa aacagagcat caaatactgc 300

acaaatgtca agcgggtctc aacgagccat gaataaatta gaaatcaatt aataacataa 360

aataggcaaa caaaataaaa ccatttacat agagaacgtt tgttgaacaa aaacaataac 420

ttgtatacat tgtttgcaca aatgtttgaa gcgaaaattt attactctct acgtaagctt 480

gatcaaactt cgttttcgta taaaacgcgt tggcccaacc actttggcat agtcgtctta 540

tcatcgggtc tctaaggatc aagcgatcca aagaccgcca acatgcgttt cgttctgtgc 600

tgcactttga ttgcgttggc tgcgctcagc gtaaaagcct tcggtcacca ccccggcaat 660

cgagatacag gatccatg 678

<210> 10

<211> 553

<212> DNA

<213> 家蚕（Bombyx Batryticatus）

<220>

<223> 丝胶Ⅰ基因的启动子Pser1

<400> 10

gaaaacagca cacacactac ataccatgta tttgacgcac acacgcatgt atactattta 60

ttgtcaaact tttgttcttg acgtctgtgt tcaaactgag aatagattaa atattgtttg 120

tctttattaa tattttttaa tagtgtagtc ttggcgaaat ttgtgattat aaaagtataa 180

aatacaatca taatagtgta cgaacttaca attccaatta attatagtcg aatttcgact 240

actgcgggac ctctagtatt aataattctc tttaaaaaaa aacagagcat caaatactgc 300

acaaatgtca agcgggtctc aacgagccat gaataaatta gaaatcaatt aataacataa 360

aataggcaaa caaaataaaa ccatttacat agagaacgtt tgttgaacaa aaacaataac 420

ttgtatacat tgtttgcaca aatgtttgaa gcgaaaattt attactctct acgtaagctt 480

gatcaaactt cgttttcgta taaaacgcgt tggcccaacc actttggcat agtcgtctta 540

tcatcgggtc atg 553

Claims (10)

1.增强子Hr3，其特征在于：由如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成。

2.增强子Hr3的制备方法，其特征在于：以BmNPV基因组作为模板，设计上游引物: 5'catgccatggaaaaagaagccgtgccca 3'，下游引物: 5'catgccatggcagcgtcgtgaaaagagg 3'，利用PCR扩增，得增强子hr3。

3.根据权利要求2所述的增强子Hr3的制备方法，其特征在于，扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，54℃退火30秒，72 ℃延伸45秒，共30个循环；最后72 ℃延伸10 分钟。

4.含有权利要求1所述的增强子Hr3的启动子。

5.根据权利要求4所述的启动子，其特征在于：将所述增强子Hr3通过NcoI限制性内切酶连接于如SEQ ID NO:2所述的启动子的上游，得含有增强子Hr3的启动子；或将所述增强子Hr3通过NcoI限制性内切酶连接于如SEQ ID NO:3所述的启动子的上游，得含有增强子Hr3的启动子。

6.含有权利要求1所述的增强子Hr3或含有权利要求4所述的启动子的重组载体。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体的终止子如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

8.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体具体为pBac[3xp3EGFP-hr3Pser1spRedsv40]，其中，含增强子Hr3、启动子Pser1sp、红色荧光蛋白基因Red和终止子SV40的表达框通过ASCI连接于转座子pBac[3xp3EGFPaf]转基因表达载体上。

9.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于：所述含有增强子Hr3的重组载体具体为pBac[3xp3EGFP-hr3Pser1spRedSer1PA]，具体为将pBac[3xp3EGFP-hr3Pser1spRedsv40]中终止子sv40被如SEQ ID NO:6所示的Ser1PA置换。

10.权利要求1所述的增强子Hr3在家蚕中制备重组外源蛋白的应用。

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