CN103642807A - 增强型家蚕核型多角体病毒诱导型启动子En39k及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种增强型家蚕核型多角体病毒（BmNPV）诱导型启动子En39k及其应用，该启动子是以BmNPV延迟早期基因39k的启动子最优序列作为“母体”启动子，再串联BmNPV来源的hr3序列和PU序列作为增强元件而得到的重组启动子（SEQ ID No.1），具有很强的BmNPV诱导启动活性（约为ZL201010231957.9中所述BmNPV39k诱导型启动子的155倍），可以驱动外源基因在昆虫细胞或昆虫个体中经BmNPV感染或相关因子的诱导下高效表达，不但适用于基因功能分析等分子生物学理论研究，同时适用于利用基因工程技术进行的家蚕品种改良，特别适用于家蚕高效抗BmNPV品系的培育以及通过表达外源致死基因或标记基因以达到消除病害扩散的家蚕品种培育。

Description

增强型家蚕核型多角体病毒诱导型启动子En39k及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种病毒诱导型启动子及其应用。

背景技术

家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目昆虫。蚕丝业为世界经济、文化和社会发展做出了重要贡献。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclearpolyhedrosis virus,BmNPV）是蚕业生产上最常见且危害最严重的一类病原，其基因组为共价闭合环状双链DNA，基因组约为130kb。该病毒的39k基因为病毒复制的非必需基因。在前期研究工作中，发明人所在课题组发明了BmNPV39k诱导型启动子（ZL201010231957.9）。该启动子具有BmNPV诱导启动活性，能使细胞在受到BmNPV感染时启动外源基因的表达，但其启动活性有限，已不能满足现实需要，迫切需要更加高效的BmNPV诱导型启动子。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于对BmNPV39k诱导型启动子进行优化和改造，以增强其BmNPV诱导启动活性，并提供其在昆虫基因工程育种中的应用。

经研究，本发明提供如下技术方案：

1.增强型BmNPV诱导型启动子En39k，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.含有所述增强型BmNPV诱导型启动子En39k的重组表达载体。

可以在En39k启动子的下游连接结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA等构建重组表达载体，在BmNPV感染或相关因子的诱导下驱动结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因、天然小RNA或人工合成小RNA的表达。

优选方案一，所述重组表达载体为报告基因重组表达载体，所述报告基因由增强型BmNPV诱导型启动子En39k控制表达。报告基因包括但不限于：荧光素酶（luc）基因、红色荧光蛋白（DeRed）基因、绿色荧光蛋白（GFP）基因、增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因等。该重组表达载体可用于BmNPV诱导型启动子的相关研究。

优选方案二，所述重组表达载体为家蚕抗性基因重组表达载体，所述家蚕抗性基因由增强型BmNPV诱导型启动子En39k控制表达。该重组表达载体可用于家蚕抗BmNPV品系的基因工程育种，转基因家蚕在BmNPV感染或相关因子的诱导下可以高效表达抗性基因，增强蚕体抗性。

优选方案三，所述重组表达载体为shRNA载体，所述shRNA以BmNPV增殖必需基因为靶标，由增强型BmNPV诱导型启动子En39k控制表达。该重组表达载体可用于制备防治家蚕感染BmNPV的药物和家蚕抗BmNPV品系的基因工程育种，转基因家蚕在受到BmNPV感染或相关因子的诱导时引发BmNPV增殖必需基因的转录后沉默，达到抑制病毒增殖的目的。

所述BmNPV增殖必需基因优选为lef-1。

以BmNPV lef-1基因为靶标，shRNA的特异性靶位点干扰序列优选如SEQ ID No.13、SEQID No.14或SEQ ID No.15所示。所述shRNA由两条互补的单链寡核苷酸组成，两条互补单链寡核苷酸的序列优选如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18，SEQ ID No.19和SEQ ID No.20，或者SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示。

3.含有所述重组表达载体的微生物转化体。

4.所述增强型BmNPV诱导型启动子En39k在家蚕基因工程育种中的应用。

例如，利用En39k启动子驱动家蚕抗性基因的表达或利用En39k启动子驱动以BmNPV增殖必需基因为靶标的shRNA的表达，适用于家蚕高效抗BmNPV品系的基因工程育种；利用En39k启动子驱动外源致死基因或标记基因的表达，适用于以消除病害扩散为目的的家蚕品种培育。

本发明的有益效果在于：本发明从BmNPV基因组中克隆39k基因翻译起始位点前906bp至翻译起始位点后4bp序列片段作为“母体”启动子，命名为39kBase（ZL201010231957.9中所述BmNPV39k诱导型启动子为39k基因翻译起始位点前294bp至翻译起始位点ATG后15bp片段），并在“母体”启动子39kBase前插入串联的增强元件hr3序列和PU（polh-up）序列，构建了一种“重组启动子”。该“重组启动子”不仅保持了“母体”启动子对BmNPV感染的良好诱导启动活性，而且诱导启动活性得到了明显提高（约为ZL201010231957.9中所述BmNPV39k诱导型启动子的155倍），可以驱动外源基因在昆虫细胞或昆虫个体中经BmNPV感染或相关因子的诱导下高效表达，不但适用于基因功能分析等分子生物学理论研究，同时适用于利用基因工程技术进行的家蚕品种改良，特别适用于家蚕高效抗BmNPV品系的培育以及通过表达外源致死基因或标记基因以达到消除病害扩散的家蚕品种培育，具有很好的应用前景。由于BmNPV只感染家蚕，因此本发明的增强型BmNPV诱导启动子En39k对人畜以及植物安全无害。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为En39k启动子的核苷酸序列。

图2为39kBase启动子不同截短片段的启动子活性分析。

图3为重组载体PGL3-En39k-luc的构建示意图。

图4为重组载体PGL3-En39k-luc的酶切鉴定图，其中M为DNA marker，1-4分别为hr3片段酶切鉴定、PU片段酶切鉴定、39kBase片段酶切鉴定、En39k片段酶切鉴定，5为PGL3-En39k-luc。

图5为重组载体PGL3-En39k-DsRed的构建示意图。

图6为转染重组载体PGL3-En39k-DsRed的细胞感染BmNPV后不同时间（24h、48h、72h）的红色荧光发光情况，图中绿色荧光代表染BmNPV病毒粒子。

图7为分别转染重组载体pGL3-A4-DsRed、pGL3-39kBase-DsRed、PGL3-En39k-DsRed的细胞感染BmNPV72小时后的红色荧光发光情况。

图8为shRNA载体PIZ/V5-En39k-shRNA和报告载体PGL3-A4-luc-lef-1的构建模式图。

图9为荧光素酶检测细胞共转染shRNA载体PIZ/V5-En39k-shRNA和报告载体PGL3-A4-luc-lef-172h后的基因表达情况。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件进行。

实施例1、En39k启动子及其驱动的Luc报告基因重组载体的构建与En39k启动子的诱导启动活性检测

一、En39k启动子及其驱动的luc报告基因重组载体的构建

从美国国立生物技术信息中心（NCBI）下载BmNPV全基因组序列（NC001962.1），根据杆状病毒的级联调控特征，延迟早期基因启动子（β基因）受到立即早期基因（α基因）产物的激活调控作用，选择BmNPV延迟早期基因39k的启动子最优序列39kBase作为“母体”启动子序列。同时，选择BmNPV来源的hr3序列和PU（polh-up）序列作为增强元件，串联“母体”启动子，构建增强型BmNPV诱导型启动子En39k（图1，SEQ ID No.1）。具体如下：

1、“母体”启动子的选择与活性检测

根据BmNPV全基因组序列和BmNPV39k诱导型启动子序列（ZL201010231957.9），选取BmNPV39k基因翻译起始位点前906bp作为启动子候选区间，利用PCR技术对启动子5‘UTR进行分段缺失，以确定对BmNPV诱导启动活性最为有效的区段。

设计特异性引物如下：

下游引物39kBase-R：CCCAAGCTTCCATGTTTGATTTTTGTAAACCT（SEQ ID No.2），下划线为HindIII限制性内切酶识别位点；

上游引物39kBase-F：GGAAGATCTAAGGCTGTCTTGCTGTGTGC（SEQ ID No.3），下划线为BglII限制性内切酶识别位点；

上游引物39k419-F：GGAAGATCTATGTTAAAACCGCGACGC（SEQ ID No.4），下划线为BglII限制性内切酶识别位点；

上游引物39k-F：GGAAGATCTCTTGACCCGAAGCGAAATAC（SEQ ID No.5），下划线为BglII限制性内切酶识别位点。

以BmNPV全基因组为模板，分别采用引物对39kBase-F/39kBase-R、39k419-F/39kBaseR、39k-F/39kBase-R进行PCR扩增。PCR条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性50秒，56℃退火50秒，72℃延伸2分钟，30个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物纯化后获得的DNA片段分别命名为39kBase、39k419和39k（39k即ZL201010231957.9中所述BmNPV39k诱导型启动子）。将上述DNA片段分别通过T克隆连接至pMD19-T质粒，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素（Amp）的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，用含有Amp的LB培养基过夜培养后提取质粒，测序，将测序正确的阳性克隆质粒分别命名为pMD19-T-39kBase、pMD-T-39k419和pMD-T-39k。

分别将重组质粒pMD19-T-39kBase、pMD-T-39k419、pMD-T-39k进行BglII和HindIII双酶切，再与经HindIII和KpnI双酶切的双荧光素酶报告基因检测载体pGL3-Basic连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有Amp的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，用含有Amp的LB的培养基过夜培养后提取质粒，BglII和HindIII双酶切鉴定，将鉴定正确的阳性克隆质粒分别命名为pGL3-39kBase-luc、pGL3-39k419-luc和pGL3-39k-luc。

分别将重组质粒pGL3-39kBase-luc、pGL3-39k419-luc、pGL3-39k-luc和空载质粒pGL3-basic利用脂质体转染试剂瞬时转染家蚕卵巢细胞BmN-SWU1，再用BmNPV感染细胞，分别于感染后24h、48h、72h收集细胞，裂解，离心取上清，用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定裂解上清的PPL和PRL，计算相对荧光素酶活性，考察转染BmN-SWU1细胞在感染BmNPV后不同时间点39k不同截短启动子的启动活性。结果如图2所示，启动子片段39kBase在BmNPV感染后24h、48h和72h的活性明显高于启动子片段39k419和39k，约为启动子片段39k的10.5倍。因此，选择启动子片段39kBase作为“母体”启动子。

2、增强子hr3、PU序列的T克隆与测序

设计特异性引物如下：

上游引物hr3-F：CGGGGTACCATGATTCATACTTAATCGTGC（SEQ ID No.6），下划线部分为KpnI酶切位点；

下游引物hr3-R：TCCCCCGGGTTGTTTTTCAAAATTGAACTG（SEQ ID No.7），下划线部分为SmaI酶切位点；

上游引物PU-F：TCCCCCGGGACAAATTCCCTCCGGC（SEQ ID No.8），下划线部分为SmaI酶切位点；

下游引物PU-R：GGAAGATCTAATAATTACAAATAGGATTGAGG（SEQ ID No.9），下划线部分为BglII酶切位点。

以BmNPV全基因组为模板，采用hr3-F/hr3-R引物对PCR扩增hr3序列。PCR条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性50秒，52℃退火50秒，72℃延伸2分钟，30个循环；最后72℃延伸10分钟。以BmNPV全基因组为模板，采用PU-F/PU-R引物对PCR扩增PU序列。PCR条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性50秒，56℃退火50秒，72℃延伸3分钟，30个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物纯化后，分别通过T克隆与pMD19-T质粒连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有Amp的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，用含有Amp的LB培养基过夜培养后提取质粒，测序，将测序正确的阳性克隆质粒分别命名为pMD19-T-hr3和pMD19-T-PU。

3、En39k启动子及其驱动的luc报告基因重组载体的构建

将重组载体pMD19-T-PU用SmaI和BglII双酶切后，与同样经SmaI和BglII双酶切的重组载体pGL3-39kBase-luc连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有Amp的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，用含有Amp的LB的培养基过夜培养后提取质粒，SmaI和BglII双酶切鉴定，将鉴定正确的阳性克隆质粒命名为pGL3-PU-39k。

将重组载体pMD19-T-hr3用KpnI和SmaI双酶切后，与同样经KpnI和SmaI双酶切的重组载体pGL3-PU-39k连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有Amp的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，用含有Amp的LB的培养基过夜培养后提取质粒，SmaI和BglII双酶切鉴定（图4），将鉴定正确的阳性克隆质粒命名为pGL3-En39k-luc（图3）。

二、En39k启动子的诱导启动活性检测

将空载体PGL3-basic、重组载体pGL3-39k-luc，重组载体pGL3-39kBase-luc和pGL3-En39k-luc分别用脂质体转染试剂瞬时转染家蚕卵巢细胞BmN-SWU1，再用BmNPV感染细胞，于感染后72h收集细胞，裂解，离心取上清，用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定裂解上清的PPL和PRL，计算相对荧光素酶活性，考察转染BmN-SWU1细胞在感染BmNPV后En39k启动子活性。结果如表1所示，与39kBase和39k启动子相比，En39k启动子的BmNPV诱导启动活性大幅提高，感染72h后的启动活性约相当于39kBase启动子的15倍，39k启动子的155倍。

表1转染BmN-SWU1细胞在感染BmNPV后72h的相对荧光素酶活性

注：**代表与对照组相比P<0.01。

实施例2、En39k启动子驱动的DsRed报告基因重组载体的构建及DsRed基因表达活性检测

一、En39k启动子驱动的DsRed报告基因重组载体的构建

根据DsRed基因序列设计特异性引物，PCR扩增两端带有HindIII和XbaI酶切位点的DsRed片段（SEQ ID No.10），将该DNA片段通过T克隆连接至pMD19-T质粒构建重组载体pMD19-T-DsRed，再将其用HindIII和XbaI双酶切后，分别与同样经HindIII和XbaI双酶切的重组载体pGL3-39kBase-luc和pGL3-En39k-luc连接，以DsRed基因取代重组载体中的luc基因，构建重组载体pGL3-39kBase-DsRed和pGL3-En39k-DsRed（图5）。另以强组成型启动子A4取代重组载体pGL3-39kBase-DsRed中的39kBase启动子，构建重组载体pGL3-A4-DsRed。

二、DsRed基因表达活性检测

分别将重组载体pGL3-39kBase-DsRed、PGL3-En39k-DsRed、pGL3-A4-DsRed转染BmN-SWU1细胞，再对细胞进行BmNPV感染，观察转染Bm-SWU1细胞的荧光发光情况，分析En39k启动子的诱导转录表达活性。BmNPV感染采用修饰型BmNPV，其携带e-egfp基因，侵染BmN-SWU1细胞后表达绿色荧光蛋白，在荧光显微镜下发绿色荧光，绿色荧光强度即反应BmNPV的复制情况。

转染重组载体PGL3-En39k-DsRed的细胞感染BmNPV后不同时间（24h、48h、72h）的红色荧光发光情况结果如图6所示，pGL3-En39k-DsRed转染细胞的红色荧光强度随着时间延长逐步提高，说明En39k启动子的诱导转录表达活性随着时间延长病毒量的增加而逐步提高。

分别转染重组载体pGL3-39kBase-DsRed、PGL3-En39k-DsRed、pGL3-A4-DsRed的细胞感染BmNPV后72小时的红色荧光发光情况如图7所示，在未感染BmNPV的情况下，pGL3-39kBase-DsRed、pGL3-En39k-DsRed转染细胞均仅见极微弱的红色荧光，pGL3-A4-DsRed转染细胞有较强的红色荧光（A4为强组成型启动子）；而在感染BmNPV的情况下，pGL3-En39k-DsRed转染细胞的红色荧光强度明显高于pGL3-39kBase-DsRed和pGL3-A4-DsRed转染细胞；说明En39k启动子具有增强的诱导转录表达活性。

实施例3、En39k启动子驱动的BmNPV增殖必需基因lef-1shRNA载体的构建及RNA干扰效果检测

一、En39k启动子驱动的BmNPV lef-1基因shRNA载体的构建

根据En39k启动子序列设计如下引物：

上游引物En39k-F：TCGTCATGAATGATTCATACTTAATCGTGCGT（SEQ ID No.11），下划线部分为BspHI酶切位点；

下游引物En39k-R：CCCAAGCTTGTTTGATTTTTGTAAACCTTTGA（SEQ ID No.12），下划线部分为HindIII酶切位点。

以重组载体PGL3-En39k-luc为模板，PCR扩增En39k序列，用BspHI和HindIII双酶切后，与同样经BspHI和HindIII双酶切的载体PIZ/V5-His连接，获得重组载体PIZ/V5-En39k-His。

根据NCBI公布的BmNPV lef-1基因序列（GeneID：1488636）和shRNA设计原则，设计三条特异性靶位点干扰序列：Y1、Y2、Y3，同时将序列随机打乱后设计一个随机对照序列（random）：

Y1：GGATTCACGCCGACAAATATT（SEQ ID No.13）；

Y2：GCTATCCTGGTTATGGAATTG（SEQ ID No.14）；

Y3：GGCCGTACGTTTGTACATTCC（SEQ ID No.15）；

Random：GGCCTGTAGCTCAATATAACA（SEQ ID No.16）。

根据上述序列分别设计并合成配对的shRNA单链寡核苷酸片段（表2，SEQ ID No.17-24），退火形成shRNA双链寡核苷酸片段，再连接至PIZ/V5-En39k-His载体，获得En39k启动子驱动的BmNPV lef-1基因shRNA载体pIZ/V5-En39k-Y1、pIZ/V5-En39k-Y2、pIZ/V5-En39k-Y3（模式图如图8所示）以及对照载体pIZ/V5-En39k-Random。

表2shRNA单链寡核苷酸序列

注：斜体部分为茎环序列。

二、A4启动子驱动的BmNPV lef-1基因报告载体的构建

根据NCBI公布的BmNPV lef-1基因序列设计如下引物：上游引物lef-1-F：CTAG-TCTAGACGATGTTATTGTGCAATTATAC（SEQ ID No.25）；下游引物lef-1-R：CTAGTCTAGA-TTATGTGGTACTTTTTGTAGTCG（SEQ ID No.26）；下划线部分为XbaI酶切位点。采用上述引物PCR扩增BmNPV lef-1基因，用XbaI单酶切，再与同样经XbaI单酶切的pGL3-basic载体连接，获得重组载体pGL3-luc-lef-1。合成带有BglII和HindIII酶切位点的A4启动子，经BglII和HindIII双酶切后，与同样经BglII和HindIII双酶切的重组载体pGL3-luc-lef-1连接，获得重组载体pGL3-A4-luc-lef-1（模式图如图8所示）。

二、RNAi载体的RNA干扰效果检测

分别将重组载体pIZ/V5-En39k-Y1、pIZ/V5-En39k-Y2、pIZ/V5-En39k-Y3和pIZ/V5-En39k-Random，空载体PIZ/V5-His，与pGL3-A4-luc-lef-1和内参质粒P-IE1-Rlucp共转染BmN-SWU1细胞，再对细胞进行BmNPV感染，于感染后72h收集细胞，检测荧光素酶活性。

结果如图9所示，与未感染BmNPV的情况相比，BmNPV感染72小时后，pIZ/V5-En39k-Y1、pIZ/V5-En39k-Y2、pIZ/V5-En39k-Y3转染细胞的荧光素酶相对比值明显下降，说明三条特异性靶位点干扰序列Y1、Y2、Y3都能在mRNA水平抑制BmNPV lef-1基因的表达，抑制效果高达85%以上，其中Y3的抑制效果最好，高达90%，说明En39k启动子可以在家蚕细胞中驱动mRNA-shRNA融合转录本RNA的转录，诱导RNA干涉，实现对目的基因的特异性表达抑制。

上述实验结果证实En39k启动子为增强型BmNPV诱导型启动子，具有超强的BmNPV诱导转录表达活性，能使细胞在受到BmNPV感染时高效启动目的基因的表达。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.增强型家蚕核型多角体病毒诱导型启动子En39k，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.含有权利要求1所述增强型家蚕核型多角体病毒诱导型启动子En39k的重组表达载体。

3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，为报告基因重组表达载体，所述报告基因由增强型家蚕核型多角体病毒诱导型启动子En39k控制表达。

4.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，为家蚕抗性基因重组表达载体，所述家蚕抗性基因由增强型家蚕核型多角体病毒诱导型启动子En39k控制表达。

5.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，为shRNA载体，所述shRNA以家蚕核型多角体病毒增殖必需基因为靶标，由增强型家蚕核型多角体病毒诱导型启动子En39k控制表达。

6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述家蚕核型多角体病毒增殖必需基因为lef-1；所述shRNA的特异性靶位点干扰序列如SEQ ID No.13、SEQ ID No.14或SEQ IDNo.15所示。

7.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述shRNA由两条互补的单链寡核苷酸组成，两条互补单链寡核苷酸的序列分别如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18，SEQ ID No.19和SEQ ID No.20，或者SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示。

8.含有权利要求2-7任一项所述重组表达载体的微生物转化体。

9.权利要求1所述增强型家蚕核型多角体病毒诱导型启动子En39k在家蚕基因工程育种中的应用。

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