CN1405310A

CN1405310A - 用蚕表达人表皮生长因子生产药物的方法

Info

Publication number: CN1405310A
Application number: CN 01124123
Authority: CN
Inventors: 张耀洲; 金勇丰; 吴祥甫
Original assignee: ZHONGQI BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd ZHEJIANG
Current assignee: Is the source of Tang (Tianjin) Biotechnology Co. Ltd.
Priority date: 2001-08-15
Filing date: 2001-08-15
Publication date: 2003-03-26
Anticipated expiration: 2021-08-15
Also published as: CN1170927C

Abstract

本发明属于生物技术制药工程中的基因工程生产多肽类药物技术领域。本发明将人EGF基因克隆到家蚕杆状病毒(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus)转移载体pBacPAK8中，与线性化家蚕杆状病毒，在家蚕细胞中进行同源重组，获得带人表皮生长因子基因的重组家蚕杆状病毒BmBacEGF，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号为0593，用重组家蚕杆状病毒针刺接种家蚕幼虫和蛹体，使人表皮生长因子在家蚕幼虫和蛹中获得高效表达，将高效表达人表皮生长因子的幼虫和蚕蛹研制成口服药物，经动物试验表明对治疗消化性溃疡具有的显著作用，成为一种治疗消化性溃疡疾病的新方法。与现有技术相比，原料易得，生产成本低，治疗效果良好。

Description

用蚕表达人表皮生长因子生产药物的方法

技术领域

本发明涉及用蚕表达人表皮生长因子(Epidermal growth Factor，EGF)生产药物的方法。

背景技术

表皮生长因子(EGF)是由Cohen在1959年研究神经生长因子(nervegrowth factor，NGF)时偶然发现的，1962年从小鼠颌下腺中分离得到。体内体外实验证明它对多种组织来源的上皮细胞有促进增殖的功能，人的表皮生长因子最早由Gregory等于1975年从人尿中纯化到，通过研究发现和小鼠EGF具有相同的生物学活性。EGF最有潜力的用途是在临床应用上，EGF具有促进上皮再生的功能，可以用于促进外科手术伤口及其它创面的愈合，如皮肤移植、皮肤的擦伤、烧伤、糜烂等；促进角膜上皮细胞的增殖，用来治疗角膜损伤、溃疡、酸碱烧伤以及促进移植角膜的存活。EGF在人类胃肠道、十二指肠粘膜溃疡愈合过程中起着十分重要作用，对多种刺激引起的胃、十二指肠粘膜损伤均具有一定的保护和治疗作用。目前EGF主要是在大肠杆菌中表达(Yadwad等，1989；Shimizum等，1991)基本上为注射用药，生产成本高，市场上基本上没有口服剂型。家蚕杆状病毒表达系统(Bombyx moriNuclear polyhedrosis Virus)是真核表达系统，该技术自1983年Smith等首创以来，已有百种外源基因在该系统表达(《昆虫病毒分子生物学》，1998，547-578)，由于有家蚕淋巴血本身的大量蛋白的保护作用和一些未知机理的作用，家蚕表达的蛋白可以生产口服药物，并且由于EGF直接刺激上皮组织的增生，促进组织修复，因此口服EGF使其保持胃内高浓度性是临床消化性溃疡的另一条探索途径。

发明内容

为此，本发明用化学合成方法人工合成人EGF基因，克隆到pBluscriptSK，测序证明正确后将该基因克隆到家蚕杆状病毒(Bombyx mori Nuclearpolyhedrosis Virus)转移载体pBacPAK8中，与经AocI酶切后的线性化家蚕杆状病毒，在家蚕细胞中进行同源重组，获得带人表皮生长因子基因的重组家蚕杆状病毒BmBacEGF，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号为CGMCC NO：0593，用重组家蚕杆状病毒针刺接种家蚕幼虫和蛹体，使人表皮生长因子在家蚕幼虫和蛹中获得高效表达。将高效表达人表皮生长因子的幼虫和蚕蛹研制成口服药物，经动物试验表明对治疗消化性溃疡具有的显著作用。

本发明提供了用化学合成人EGF基因以及质粒pSK-EGF的构建。根据已知人EGF基因序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，VOL80，7462)，用DNA合成仪及亚磷酸三酯法合成4条编码EGF的寡聚核苷酸链，用聚丙烯酰胺-7mol/L尿素变性胶电泳分离纯化，寡聚核苷酸链的5’末端磷酸化、复性、链的延伸、连接、EcoRI内切酶酶切，并克隆入pBluscript SK的EcoRI位点，构建重组质粒pSK-EGF，经测序证明其核苷酸序列完全正确。

本发明还提供了含人EGF基因的杆状病毒转移质粒pBacEGF。将含有人EGF基因片段的质粒pSK-EGF经BamHI和EcoRV酶切后，低熔点胶回收基因片段与经BamHI和SmaI双酶切的转移载体pBacPAK-8(CLONTECH公司)连接，获得重组转移载体质粒pBacEGF(图1)，经酶切分析鉴定基因正确。

本发明还提供了含人EGF基因的重组昆虫杆状病毒BmBacEGF。将重组转移载体pBacEGF DNA与已线性化的病毒BmBacPAK6(申请人自行构建)DNA经AocI酶切线性化由脂质体介导共转染家蚕培养细胞，二者在细胞内可发生同源重组，待共转染5～7天后出现明显的病毒感染症状后，取上清进行噬斑筛选。再通过2轮的噬斑筛选和DNA点杂交筛选出含hEGF基因的重组病毒BmBacEGF(图2)，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号CGMCC NO：0593。

本发明还提供了人EGF基因在家蚕五龄幼虫和蛹中的表达产物。将重组杆状病毒BmBacEGF感染家蚕细胞进行病毒扩增，然后将扩增后的重组杆状病毒BmBacEGF注射至五龄家蚕幼虫和蛹体内，分别取24、48、72、96和120小时的家蚕和蛹血淋巴，经5000rpm 5分钟离心后取上清，稀释10倍后加等体积的2×蛋白上样缓冲液，取20ul进行20％的SDS-PAGE分析，Western杂交表明能与EGF抗体结合，分子量约为6KD。ELASA检测表明感染后第120小时每条蚕平均表达量为0.42mg，感染后第120小时每个蛹平均表达量为0.5mg(图3)。

本发明还对人EGF基因的表达产物进行了生物活性的鉴定。EGF的生物活性应用Balb/c3T3细胞，采用MTT结合酶联仪进行检测，用BmBacEGF穿刺接种五龄家蚕幼虫和蛹体，于感染后不同时间收集蚕血和蛹体血淋巴，高速离心后测血淋巴中的EGF的活性，在感染的第120小时后蚕血和蛹体血淋巴中的EGF ED₅₀(Effective dose 50：使细胞生长量达到最大值一半时EGF的浓度)分别为0.6ng/ml和0.88ng/ml。

本发明还对用高效表达EGF的家蚕幼虫和蛹制成口服药物进行动物实验。将高效表达人EGF的蚕蛹进行粗分离纯化研制成口服药物，以不同剂量喂服SD大鼠，三天后(每天一次)，用无水乙醇灌胃后发现，与对照组相比，大鼠胃粘膜受乙醇损伤的程度明显降低，其保护胃粘膜效果在50-200ug/kg.d^-1范围内呈量效关系(表1)，表明用表达hEGF的蚕幼虫和蛹制成口服药物有明显的抗乙醇损伤的胃粘膜保护作用，成为一种新型的治疗人消化性溃疡的口服药物。

综合所述，本发明的优点如下：由于hEGF分子中二硫键及其他多种官能团的存在，因而化学合成的产物纯度及产率无法满足工业化生产。目前hEGF的生产主要通过基因工程技术在大肠杆菌酵母中获得，但表达产物往往形成包涵体，分离纯化时涉及到蛋白质变性和复性问题，以及给后处理和纯化工艺带来繁衍的多步操作。为了克服上述困难，本发明以家蚕作为生物反应器，高效表达人表皮生长因子，表达量达到0.5mg/蛹，用表达hEGF的蚕幼虫和蛹制成口服药物，经动物试验，确定其对胃肠溃疡的治疗功能，为开发治疗消化道溃疡基因工程药物开辟一条新途径。

附图说明图1、含人EGF基因的家蚕杆状病毒转移载体pBacEGF(图注说明：3’FS/5’FS：苜蓿银纹夜蛾多角体病毒多角体启动子3’端/5’端旁侧序列；P：苜蓿银纹夜蛾多角体病毒多角体启动子；A(Polyhedin Poly A⁺signal)多角体蛋白基因聚腺苷酸化信号；M13 ori：M13噬菌体复制起始点；Amp：氨苄青霉素基因；ori：pUC复制起始点。)图2第二轮噬斑筛选的重组病毒的DNA点杂交结果(1、阳性对照2、阴性对照3、野生型病毒4、正常家蚕细胞DNA 5-8、重组病毒图3 BmBacEGF感染家蚕幼虫血淋巴中EGF含量

具体实施方式

本发明通过以下实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。实施例1、人EGF基因的人工化学合成以及大肠杆菌载体pSK-EGF的构建

据已报道的EGF基因序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，VOL80，7462)，用DNA合成仪及亚磷酸三酯法合成4条编码EGF的寡聚核苷酸链，用聚丙烯酰胺-7mol/L尿素变性胶电泳分离纯化，其序列分别为：寡聚核苷酸链1：5’-GGA ATT CGT TAA CTC CGA CTC CGA ATG TCC ATT GTCCCA CGA CGG TTA CTG TTT GCA CGA-3’，寡聚核苷酸链2：5’-AAGCTT TGG ACA AGT ACG CCT GTA ACT GTG TTG TTG GTT ACATCG GTG AAA GAT GTC AAT A-3，寡聚核苷酸链3：5’-GGA ATT CTCATT ATT CCC ACC ACT TCA AGT CTC TGT ATT GA ATC TTT CACCGA TGT-3，寡聚核苷酸链4：5’-GGC GTA CTT GTC CAA AGC TTCGAT GTA CAT ACA AAC ACC GTC GTG CAA ACA GTA ACCGTC-3’，寡聚核苷酸链的5’末端磷酸化、复性、链的延伸、连接、EcoRI内切酶酶切，并克隆入pBluscript SK(CLONTECH公司)质粒的EcoRI(宝灵曼公司)位点，构建重组质粒pSK-EGF，经测序证明其核苷酸序列完全正确。实施例2、人EGF基因的家蚕杆状病毒转移质粒的构建

将含有人EGF基因片段的质粒pSK-EGF经BamHI(宝灵曼公司)和EcoRV酶切后，用低熔点胶回收基因片段，并与经BamHI和SmaI双酶切的转移载体pBacPAK8(CLONTECH公司)连接，获得重组转移载体质粒pBacEGF(图1)，经酶切分析鉴定基因正确。实施例3、人EGF基因的重组杆状病毒的获得

取5ul含人EGF基因的家蚕杆状病毒转移质粒pBacEGF和6ul经AocI(宝灵曼公司)酶切线性化的修饰病毒BmBacPAK6(申请人自行构建)，加入100ul无血清的TC-100(GIBCOBRL公司)培养基混均。取6ulDosper(宝灵曼公司)加入100ul无血清的TC-100培养基混均。将事先培养在35mm平皿中的Bm N细胞(浙江大学生物化学研究所保存株)用无血清的TC-100培养基洗涤两次，并逐滴加入转移质粒和Dosper混合物，27℃培养4-5天，收取上清进行第一轮噬斑筛选。取5ul上清感染35mm平皿中的家蚕细胞，1小时后弃去上清加入等量混合的TC-100培养基和低熔点琼脂糖。4-5天后挑取噬斑，感染家蚕细胞3-4天，保存上清。取阳性克隆的上清进行第二轮噬斑筛选，细胞用NaOH裂解用于DNA点杂交(见图2)，以EGF基因作模板用随机引物探针标记试剂盒(宝灵曼公司)标记探针，杂交方法按照《分子克隆》(科学出版社，1995)。取阳性克隆的上清进行第二轮噬斑筛选(见图2)。取阳性克隆的上清感染家蚕细胞扩增，即可得到大量的含人EGF基因的重组杆状病毒BmBacEGF。该病毒能感染家蚕细胞，在显微镜下细胞呈发病状，可用EGF基因作探针通过DNA杂交检定。该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号为CGMCC NO：0593。实施例4、人EGF基因在家蚕幼虫和蛹中的表达

将重组杆状病毒BmBacEGF注射到五龄家蚕幼虫和蛹(Bombyx mori)(申请人自行饲养)中，每头注射2ul左右(滴度为1×10⁷/ml)，分别取24、48、72、96和120小时表达的家蚕淋巴血，5000rpm 5min离心后取上清，用PBSpH7.4稀释10倍后，加入等体积的2×蛋白质上样缓冲液(100Mm Tris.HCl，4％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)，煮沸变性取20ul进行SDS-PAGE电泳，与PVDF膜(宝灵曼公司)一起电转过夜，通过与一抗(鼠抗人EGF，深圳晶美公司)，二抗(羊抗鼠IgG，上海生物工程公司)杂交，结果表明，Western杂交条带分子量为6KD)左右。ELASA检测表明感染后第120小时每条蚕平均表达量为0.42mg，感染后第120小时每个蛹平均表达量为0.5mg(图3)。实施例5、蚕表达的人EGF的生物活性测定

EGF的生物活性应用Balb/c3T3细胞(中国生物制品检定所)，采用MTT结合酶联仪进行检测。取无菌96孔板一块，以1号孔为空白，2好孔为对照，加入培养基50ul，每一样品4个平行组，在1号孔与3号孔各加入待测样品50ul，从3号开始向右对半稀释；选对数生长期细胞一瓶，胰酶消化，细胞收集后用0.5％培养基洗一次，用0.5％培养基调整细胞数到所需浓度，每孔加入细胞悬液50ul(对照组各孔加50ul培养基)，37℃，5％ CO₂培养箱培养40-50小时，然后加MTT(Sigma公司)20ul，37℃，5％ CO₂继续培养4小时，加10％SDS-0.01NH₄Cl 100ul，过夜，酶标仪测OD值，λ＝490nm。结果表明，用BmBacEGF穿刺接种五龄家蚕幼虫和蛹体，于感染后不同时间收集蚕血淋巴，高速离心后测血淋巴中的EGF的活性，在感染的第120小时后蚕血和蛹体血淋巴中的EGF ED₅₀(Effective dose 50：使细胞生长量达到最大值一半时EGF的浓度)分别为0.6ng/ml和0.88ng/ml。实施例6、用高效表达人EGF的蚕蛹制成口服药物进行的动物实验

用高效表达人EGF的五龄家蚕幼虫、蛹体，4℃研磨经12000rpm高速离心后，取上清，再40000rpm超速离心，取上清冷冻干燥制成口服药物。实验动物为SD大鼠，购自浙江医学科学院动物中心，共50只，每只体重220-250g，随机分成5组，每组10只，分别为hEGF I组(50ug/kg.d^-1口服)，hEGFII组(100ug/kg.d^-1口服)，hEGF III组(200ug/kg.d^-1口服)，西咪替丁组(30mg/kg.d^-1口服)，对照组(0.9％生理盐水1ml，口服)。实验前3天起大鼠分别给予胃腔内灌注或皮下注射药物，所有药物均用0.9％生理盐水稀释，分一日3次，每次等容积灌鼠。实验前2天起禁食，但不禁水，空腹48小时后各鼠用无水乙醇1ml/只灌胃，灌乙醇1小时后取血，处死大鼠，解剖取出胃，用1％甲醛溶液固定。沿胃大弯侧剪开并展平，肉眼观察损伤情况，测量损伤长度，损伤程度以溃疡指数表达并做病理组织切片行光镜检查。损伤指数计分标准：线状损伤，每mm长度计1分，损伤宽度超过2mm者计分加倍，所有计分累加之和，作为每只大鼠胃粘膜损伤的溃疡指数(表1)。结果表明用表达hEGF的蚕幼虫和蛹制成口服药物有明显的抗乙醇损伤的胃粘膜保护作用，成为一种治疗人消化性溃疡的口服药物的新方法。

表1、用蚕表达EGF口服药物的动物实验结果

组别	只数	范围	溃疡指数	P值
组别	只数	范围	溃疡指数	P值	对照组	10	33～70	58
给药组(剂量为50ug/kg.d^-1hEGF)	10	10～67	50	＞0.05	对照组	10	33～70	58
给药组(剂量为50ug/kg.d^-1hEGF)	10	10～67	50	＞0.05	给药组(剂量为100ug/kg.d^-1hEGF)	10	11～53	43	＜0.01
给药组(剂量为200ug/kg.d^-1hEGF)	10	0～26	13	＜0.01	给药组(剂量为100ug/kg.d^-1hEGF)	10	11～53	43	＜0.01
给药组(剂量为200ug/kg.d^-1hEGF)	10	0～26	13	＜0.01	西咪替丁	10	30～55	35	＜0.05

注：P值为各用药组与对照组溃疡指数比较

Claims

1.一种用蚕表达人表皮生长因子制备药物的方法，其特征在于通过基因工程方法获得重组的带人表皮生长因子(EGF)基因的家蚕重组杆状病毒，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号为0593，并用该病毒接种家蚕幼虫和蛹进行表达人EGF，所获得的表达产物经冷冻干燥，以家蚕蛹为填充料配制成口服药物，成为一种治疗消化性溃疡疾病的新方法。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的人EGF基因的杆状病毒转移质粒pBacEGF的构建是通过化学合成人EGF基因，克隆到pSK的EcoRI位点，将人EGF基因片段克隆进入转移载体pBacPAK-8中，获得的重组转移载体质粒pBacEGF。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的人EGF基因的重组家蚕杆状病毒BmBacEGF的构建是通过重组转移载体pBacEGF与已线性化的病毒BmBacPAK6 DNA由脂质体介导共转染家蚕培养细胞，再通过2轮的噬斑和Southern杂交斑筛选获得纯化的重组病毒BmBacEGF，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号为0593。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的人EGF基因在家蚕五龄幼虫和蛹中的表达产物是通过重组杆状病毒BmBacEGF注射至五龄家蚕幼虫和蛹体内表达产生。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的口服药物是通过表达人EGF的家蚕五龄幼虫和蛹经冷冻干燥后制成的，通过动物试验表明用表达hEGF的蚕幼虫和蛹制成口服药物有明显的抗乙醇损伤的胃粘膜保护作用，成为一种治疗人消化性溃疡的口服药物的新方法。