CN108384788A - 具有黏附能力的表皮细胞生长因子及其编码基因、制备方法和应用 - Google Patents
具有黏附能力的表皮细胞生长因子及其编码基因、制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及创伤修复材料技术领域，特别涉及一种具有黏附能力的表皮细胞生长因子及其编码基因、制备方法和创伤修复材料。该DNA分子依次由编码YKYKY短肽的基因片段、编码甘氨酸柔性链的基因片段和编码EGF的基因片段连接而成。本发明通过黏附基团将EGF固定于材料表面，使其在保持EGF原有生物活性的基础上，具有了与多种创伤修复材料紧密结合的能力，以达到促进细胞在材料表面黏附、增殖及成皮分化的能力，从而增加其在患处作用的持续性和稳定性，减少了表皮细胞生长因子的用量，大大降低了其产生副作用的风险。
Description
技术领域
本发明涉及创伤修复材料技术领域，特别涉及一种具有黏附能力的表皮细胞生长因子及其编码基因、制备方法和创伤修复材料。
背景技术
由烧伤、机械性外伤、疾病并发症及药物副作用等因素引起的皮肤损伤是临床最常见的组织损伤，如果不及时处理，往往会发展成经久不愈的全皮层损伤，不仅影响美观，还会给患者的生活带来诸多的不便。表皮细胞生长因子(Epidermalgrowth factor，EGF)是目前在皮肤修复领域商品开发程度最高，应用最广的一种生长因子。大量研究表明，EGF对多种细胞的增殖和成熟都具有明显的促进作用，而担载EGF的创伤修复材料(纤维膜、可吸收医用棉、微载体等)也可以有效的促进皮肤组织的损伤修复。但是，由于EGF在游离状态下的半衰期较短，且极易被体液和血液冲刷稀释而流逝，因此很难保持其在患处作用的持续性和稳定性。而且，已有研究表明，EGF具有潜在的成瘤性，因此，大剂量或反复的滥用无疑会提高EGF产生副作用的风险。
通过一定方法，将EGF固定于创伤修复材料的内部或表面，使其稳定的发挥生物活性，对于创伤修复具有深远的意义。Itxaso Garcia-Orue等利用共混后静电纺丝的方法制备了混有EGF的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米纤维膜，有效的控制了EGF的释放，增强了其作用效果。Hyemin Kim等用共价结合的方法将EGF与透明质酸相连接，制成含有EGF的透明质酸贴片，应用于皮肤修复，也取得了良好的效果。
近几十年，越来越多的人开始关注天然胶粘剂的粘附机理以试图发展仿生粘合剂。海洋贻贝黏附蛋白中，含有大量的左旋3，4-二羟基苯丙氨酸(或L-多巴，L-DOPA)与赖氨酸(Lysine，K)单元。其中，L-DOPA在水溶液中能够氧化自我聚合形成薄膜，可以实现潮湿环境中对各种材料的超强附着，如金属、氧化物、合成高分子聚合物和陶瓷材料等，甚至典型的抗粘附性材料，如聚四氟乙稀(PTFE)，而赖氨酸也常用于与材料的黏附来改善材料的亲水性。
传统的用于材料表面固定生长因子等生物活性蛋白的方法有通过共价结合和物理吸附两种方法。然而，化学共价结合往往需要多步骤以及复杂的程序，比如需要通过预处理对材料表面进行活化，或者需要氧等离子、紫外等照射、亦或者添加其他化学物质。这种改性会明显改变材料的整体性质，甚至导致材料表面变性。此外，使用的化学品进行表面活化和固定化，例如N-羟基琥珀酰亚胺和马来酰亚胺通常易发生水解，这会导致在聚合物上表面蛋白质或肽的聚合。而物理吸附，作为另一种常用的固化蛋白，多肽及生长因子的方法，吸附效率较低。因此，一种简单、可靠、高效的蛋白表面固定方法对微载体表面进行改性将会有良好的应用前景。通过基因重组表达或固相合成制备含有材料黏附结构基团的生长因子，是目前较为先进的一种材料表面固定生长因子的方法。但是，现阶段制备的各种具有黏附基团的生长因子，绝大多数都只特异性对某些生物大分子(胶原、层黏连蛋白、透明质酸等)有黏附能力，而对于高分子材料、无机材料和金属材料等具有黏附能力的生长因子则鲜有报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种具有黏附能力的表皮细胞生长因子及其编码基因、制备方法和创伤修复材料。本发明制备的创伤修复材料，通过黏附基团将EGF固定于包括高分子材料、无机材料和金属材料等惰性材料在内的多种材料表面，使其在保持EGF原有生物活性的基础上，具有了与多种创伤修复材料紧密结合的能力，以达到促进细胞在材料表面黏附、增殖及成皮分化的能力。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种DNA分子，该DNA分子依次由编码YKYKY短肽的基因片段、编码甘氨酸柔性链的基因片段和编码表皮细胞生长因子(EGF)的基因片段连接而成。
其中，YKYKY短肽的氨基酸序列为Tyr-Lys-Tyr-Lys-Tyr。
在本发明中，该DNA分子可以为YKYKY-甘氨酸柔性链-EGF，也可以为EGF-甘氨酸柔性链-YKYKY。
本发明通过基因重组表达技术大量的制备了在氮末端含有YKYKY短肽的EGF，再通过酪氨酸酶促羟化反应，将YKYKY短肽中的酪氨酸转化为L-DOPA，从而得到在氮末端具有材料黏附基团的重组表皮细胞生长因子(DKDKD-EGF)。通过L-DOPA(含儿茶酚官能团)在微碱性环境下发生物理和化学交联，在材料的表面形成聚多巴层，从而实现EGF在多种组织工程材料表面的黏附。该方法可以用于制备黏附有表皮细胞生长因子的可吸收医用棉、创面敷料、细胞微载体、细胞培养板和人工皮肤移植物等。
作为优选，编码甘氨酸柔性链的基因片段为编码4～10个甘氨酸的基因片段。
优选地，编码甘氨酸柔性链的基因片段为编码6个甘氨酸的基因片段。
在本发明提供的实施例中，DNA分子的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了一种蛋白质，其氨基酸序列的结构基因的碱基序列为上述任一DNA分子。
本发明还提供了该蛋白质的制备方法，包括：将上述任一DNA分子插入质粒，再将重组质粒转入原核表达载体中，表达蛋白，得到蛋白质YKYKY-EGF。
在本发明提供的具体实施例中，质粒为pET15b质粒。
在本发明提供的具体实施例中，原核表达载体为BL21(DE3)型大肠杆菌。
在本发明提供的具体实施例中，表达蛋白后还包括纯化、复性的步骤。
本发明还提供了一种蛋白质，蛋白质YKYKY-EGF的YKYKY短肽中的1个或几个L-酪氨酸替换为L-DOPA。
作为优选，蛋白质YKYKY-EGF的YKYKY短肽中的3个L-酪氨酸替换为L-DOPA，得到DKDKD-EGF。
本发明还提供了该蛋白质DKDKD-EGF的制备方法，包括：蛋白质YKYKY-EGF在酪氨酸酶催化作用下得到。
作为优选，蛋白质DKDKD-EGF的制备方法具体为：将维生素C、PBS和蛋白质YKYKY-EGF混合，加入酪氨酸酶，24～26℃条件下静置1.5～2.5h。
在本发明提供的具体实施例中，该蛋白质的制备方法具体为：将维生素C、PBS和蛋白质YKYKY-EGF混合，加入酪氨酸酶，25℃条件下静置2h。
在本发明提供的具体实施例中，蛋白质DKDKD-EGF的制备方法具体为：将5mg/mL的维生素C溶液(pH7.0)，PBS(pH7.0)和100μg/mL的重组蛋白溶液(pH7.0)按照1:1:1的体积比例混合，并1U/μg重组蛋白的比例向混合溶液中加入酪氨酸酶，25℃条件下静置反应2h。
本发明还提供了一种黏附有表皮细胞生长因子的创伤修复材料，创伤修复材料为黏附有蛋白质DKDKD-EGF的载体材料。
作为优选，载体材料为可吸收医用棉、创面敷料、细胞微载体、细胞培养板或人工皮肤移植物。
在本发明提供的实施例中，载体材料为PLGA静电纺丝膜。
本发明还提供了该创伤修复材料的制备方法，将含有蛋白质DKDKD-EGF的溶液的pH值调至8.0～9.0，得到碱性蛋白溶液；将载体材料浸入碱性蛋白溶液中，在24～26℃条件下放置6～10h；
或者将含有蛋白质YKYKY-EGF的溶液、酪氨酸酶和载体材料混合，24～26℃条件下静置1.5～2.5h，pH值调至8.0～9.0，在24～26℃条件下放置6～10h。
在本发明提供的实施例中，创伤修复材料的制备方法为：将含有蛋白质DKDKD-EGF的溶液的pH值调至8.5，得到碱性蛋白溶液；将载体材料浸入碱性蛋白溶液中，在25℃条件下放置8h。
在本发明提供的另一实施例中，创伤修复材料的制备方法为：将含有蛋白质YKYKY-EGF的溶液、酪氨酸酶和载体材料混合，25℃条件下静置2h，pH值调至8.5，在25℃条件下放置8h。
作为优选，在24～26℃条件下放置6～10h后，还包括用PBS浸洗的步骤。
本发明提供了一种具有黏附能力的表皮细胞生长因子及其编码基因、制备方法和创伤修复材料。该DNA分子依次由编码YKYKY短肽的基因片段、编码甘氨酸柔性链的基因片段和编码EGF的基因片段连接而成。本发明具有的技术效果为：
本发明通过基因重组表达技术大量的制备了在氮末端含有YKYKY短肽的EGF，再通过酪氨酸酶促羟化反应，将YKYKY短肽中的酪氨酸转化为L-DOPA，从而得到在氮末端具有材料黏附基团的重组表皮细胞生长因子(DKDKD-EGF)。通过L-DOPA(含儿茶酚官能团)在微碱性环境下发生物理和化学交联，在材料的表面形成聚多巴层，从而实现EGF在多种组织工程材料表面的黏附。该方法可以用于制备黏附有表皮细胞生长因子的可吸收医用棉、创面敷料、细胞微载体、细胞培养板和人工皮肤移植物等。
本发明制备的创伤修复材料，通过黏附基团将EGF固定于材料表面，使其在保持EGF原有生物活性的基础上，具有了与多种创伤修复材料紧密结合的能力，以达到促进细胞在材料表面黏附、增殖及成皮分化的能力，从而增加其在患处作用的持续性和稳定性，减少了表皮细胞生长因子的用量，大大降低了其产生副作用的风险。
本发明可以实现EGF与包括高分子材料、无机材料和金属材料等惰性材料在内的多种材料的黏附，具有方法简单，高效的特点。避免了化学共价结合的复杂过程，及其可能导致的材料表面变性。
附图说明
图1为制备本发明创伤修复材料的工艺流程图；
图2为EGF、YKYKY-EGF、DKDKD-EGF(DOPA-EGF)三者对于PLGA静电纺丝膜黏附能力的比较；
图3为固定了DKDKD-EGF的PLGA静电纺丝膜对脐静脉内皮细胞增殖的影响；
图4为固定了DKDKD-EGF的PLGA膜对脐带间充质干细胞成皮分化的影响。
具体实施方式
本发明公开了一种具有黏附能力的表皮细胞生长因子及其编码基因、制备方法和创伤修复材料，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
表皮细胞生长因子(Epidermal growth factor，EGF)是人体内存在的一种生长因子，它的主要功能是促进皮肤细胞的分裂。研究表明：极微量的EGF即能强烈刺激细胞生长，抑制衰老基因表达，阻止皮肤衰老，使皮肤各组成份保持最佳生理状态。此外，它还能刺激细胞外一些大分子(如透明质酸和胶原蛋白等)的合成与分泌，滋润皮肤，是决定皮肤活力和健康的关键因素。
左旋3，4-二羟基苯丙氨酸(或L-多巴，L-DOPA)是人和动物体内合成去甲肾上腺素和多巴胺的前体之一，是经典不可替代的抗震颤麻痹药，是具有儿茶酷轻基的神经递质多巴胺前体，常用作帕金森病的药物治疗。左旋多巴在服用后，在脑内经多巴脱羧酶脱羧作用转变为多巴胺，从而发挥多巴胺替代治疗功效。
赖氨酸(Lysine，K)是人体必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。赖氨酸为碱性必需氨基酸。由于谷物食品中的赖氨酸含量甚低，且在加工过程中易被破坏而缺乏，故称为第一限制性氨基酸。
酪氨酸(tyrosine；Tyr，Y)的化学名称为2-氨基-3-对羟苯基丙酸，它是一种含有酚羟基的芳香族极性α-氨基酸。酪氨酸是人体的条件必需氨基酸和生酮生糖氨基酸。
甘氨酸(Glycine，缩写Gly)又名氨基乙酸，是内源性抗氧化剂还原性谷胱甘肽的组成氨基酸，机体发生严重应激时常外源补充，有时也称为半必需氨基酸。
本发明提供的具有黏附能力的表皮细胞生长因子及其编码基因、制备方法和创伤修复材料中所用序列、材料、试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1创伤修复材料的制备
本实施例的工艺流程图见图1，具体操作步骤如下：
1.设计并合成了如下的YKYKY-EGF基因序列(SEQ ID NO：1)，其中1-15位氨基酸为编码YKYKY短肽的基因序列，16-33位氨基酸为用于YKYKY短肽与EGF连接的甘氨酸柔性链，34-192位氨基酸为编码EGF的基因序列。
TACAAGTACAAATACGGCGGAGGAGGCGGGGGGAACTCTGACAGCGAATGCCCCCTTTCCCATGACGGG TATTGCCTCCACGATGGGGTCTGTATGTACATCGAGGCTCTGGACAAGTACGCCTGCAATTGCGTGGTGGGCTACAT TGGCGAGAGATGCCAGTACAGGGATCTGAAGTGGTGGGAGTTGCGG
将这段DNA序列插入到pET15b质粒中，酶切位点为Nde1和Xho1，再将重组质粒转入到BL21(DE3)型大肠杆菌当中，构建得到用于制备YKYKY-EGF的原核表达载体。通过表达、纯化和复性，得到YKYKY-EGF重组蛋白。
2.将5mg/mL的维生素C溶液(pH7.0)，PBS(pH7.0)和100μg/mL的重组蛋白溶液(pH7.0)按照1:1:1的比例混合，并1U/μg重组蛋白的比例向混合溶液中加入酪氨酸酶(Tyrosinase)，25℃条件下静置2h，得到在氮末端具有材料黏附基团的重组表皮细胞生长因子(DKDKD-EGF)。
3.将DKDKD-EGF混合溶液的酸碱度调至8.5，并将材料(可吸收医用棉、创面敷料、细胞微载体、细胞培养板、人工皮肤移植物等)浸没其中，25℃放置8h后，用PBS(pH7.0)充分浸洗。
试验例1黏附能力检测试验
检测EGF、YKYKY-EGF和DKDKD-EGF三者对于PLGA静电纺丝膜黏附能力，试验结果见图2。
试验结果表明本发明制得的DKDKD-EGF对PLGA静电纺丝膜具有较强的黏附能力。
试验例2细胞增殖试验
检测PLGA、PLGA+EGF、PLGA+DKDKD-EGF对脐静脉内皮细胞增殖的影响，试验结果见图3。
试验结果表明本发明固定了DKDKD-EGF的PLGA静电纺丝膜对脐静脉内皮细胞具有较强的促进增殖的作用。
试验例3成皮分化试验
检测PLGA、PLGA+EGF、PLGA+DKDKD-EGF对脐带间充质干细胞成皮分化的影响，试验结果见图4。
试验结果表明本发明固定了DKDKD-EGF的PLGA静电纺丝膜对脐带间充质干细胞具有较强的促进成皮分化的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院长春应用化学研究所
<120> 具有黏附能力的表皮细胞生长因子及其编码基因、制备方法和应用
<130> MP1800661
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 192
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tacaagtaca aatacggcgg aggaggcggg gggaactctg acagcgaatg ccccctttcc 60
catgacgggt attgcctcca cgatggggtc tgtatgtaca tcgaggctct ggacaagtac 120
gcctgcaatt gcgtggtggg ctacattggc gagagatgcc agtacaggga tctgaagtgg 180
tgggagttgc gg 192
Claims (10)
1.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子依次由编码YKYKY短肽的基因片段、编码甘氨酸柔性链的基因片段和编码表皮细胞生长因子的基因片段连接而成。
2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述编码甘氨酸柔性链的基因片段为编码4～10个甘氨酸的基因片段。
3.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
4.一种蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列的结构基因的碱基序列为权利要求1至3中任一项所述DNA分子。
5.如权利要求4所述蛋白质的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求1至3中任一项所述DNA分子插入质粒，再将重组质粒转入原核表达载体中，表达蛋白。
6.一种蛋白质，其特征在于，权利要求4所述蛋白质的YKYKY短肽中的1个或几个L-酪氨酸替换为L-DOPA。
7.如权利要求6所述蛋白质的制备方法，其特征在于，包括：权利要求4所述蛋白质在酪氨酸酶催化作用下得到。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，具体为：将维生素C、PBS和权利要求4所述蛋白质混合，加入酪氨酸酶，24～26℃条件下静置1.5～2.5h。
9.一种黏附有表皮细胞生长因子的创伤修复材料，其特征在于，所述创伤修复材料为黏附有如权利要求6所述蛋白质的载体材料。
10.如权利要求9所述创伤修复材料的制备方法，其特征在于，将含有权利要求6所述蛋白质的溶液的pH值调至8.0～9.0，得到碱性蛋白溶液；将载体材料浸入碱性蛋白溶液中，在24～26℃条件下放置6～10h；
或者将含有权利要求4所述蛋白质的溶液、酪氨酸酶和载体材料混合，24～26℃条件下静置1.5～2.5h，pH值调至8.0～9.0，在24～26℃条件下放置6～10h。
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