CN109432504A - 一种成骨基因干预功能材料及其制备方法 - Google Patents

一种成骨基因干预功能材料及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109432504A
CN109432504A CN201811428149.4A CN201811428149A CN109432504A CN 109432504 A CN109432504 A CN 109432504A CN 201811428149 A CN201811428149 A CN 201811428149A CN 109432504 A CN109432504 A CN 109432504A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sirna
liposome
targeted molecular
bone
freeze
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811428149.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109432504B (zh
Inventor
赵彦涛
衷鸿宾
侯树勋
韩丽伟
胡先同
白玉龙
张看
李利
张春丽
章亚东
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital Chinese PLA General Hospital
Original Assignee
First Affiliated Hospital Chinese PLA General Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital Chinese PLA General Hospital filed Critical First Affiliated Hospital Chinese PLA General Hospital
Priority to CN201811428149.4A priority Critical patent/CN109432504B/zh
Publication of CN109432504A publication Critical patent/CN109432504A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109432504B publication Critical patent/CN109432504B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
    • A61L27/42—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having an inorganic matrix
    • A61L27/425—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having an inorganic matrix of phosphorus containing material, e.g. apatite
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/20—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/258—Genetic materials, DNA, RNA, genes, vectors, e.g. plasmids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
    • A61L2300/62—Encapsulated active agents, e.g. emulsified droplets
    • A61L2300/626—Liposomes, micelles, vesicles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明公开了一种成骨基因干预功能材料，由靶向分子‑脂质体‑siRNA与煅烧骨复合而成，靶向分子‑脂质体‑siRNA由耦合有靶向分子的脂质体包裹siRNA而成；并且公开了成骨基因干预功能材料的制备方法。靶向分子‑脂质体‑siRNA与煅烧骨复合而成的成骨基因干预功能材料与成骨界面亲和，在减少siRNA扩散降解的同时使siRNA定向作用于临近成骨界面的成骨细胞和骨母细胞，进而调节成骨细胞和骨母细胞的功能，提高局部成骨活性，获得优越的骨修复质量。

Description

一种成骨基因干预功能材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及医用材料领域，更具体的说是涉及一种成骨基因干预功能材料及其制备方法。
背景技术
RNA干扰(RNAinterference，RNAi)现象是一种自然存在的基因调控现象，与靶基因转录产物mRNA存在同源互补序列的小分子双链RNA(siRNA)进入细胞后，能在Dicer酶的作用后，特异性地结合并降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失。人们利用这一作用机制，通过精确设计siRNA实现基因转录后的调控可以最终引导和促进组织再生。
骨替代材料在体内扮演着引导骨组织再生的角色，具有调控基因表达作用的siRNA可以赋予骨替代材料在体内对成骨细胞系特定基因的精确调控能力，进而构建成一种全新意义的基因功能材料。然而，由于体液内广泛存在RNA降解酶，可以在短时间内破坏siRNA的结构完整性，使其迅速灭活、彻底降解，因此，siRNA进入体内之后，通常难以保证汇聚在靶组织局部发挥治疗作用；siRNA表面的负电荷也会对其通过细胞膜结构造成影响；此外，siRNA所接触的组织细胞都将可能是它的靶细胞，在这种情况下没有相应的mRNA被沉默，siRNA只能被RNA酶降解，成为无效的siRNA。因此，如何提供一种能够使siRNA精确靶向于骨组织成骨区域的材料是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种成骨基因干预功能材料及其制备方法，由靶向分子-脂质体-siRNA与煅烧骨复合而成的成骨基因干预功能材料与成骨界面亲和，在减少siRNA扩散降解的同时使siRNA定向作用于临近成骨界面的成骨细胞和骨母细胞，进而调节成骨细胞和骨母细胞的功能，提高局部成骨活性，获得优越的骨修复质量。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种成骨基因干预功能材料，由靶向分子-脂质体-siRNA与煅烧骨复合而成；
靶向分子-脂质体-siRNA由耦合有靶向分子的脂质体包裹siRNA而成；
靶向分子氨基酸序列为DSSDSSDSSDSSDSSDSS，SEQ ID NO：1；C端修饰C5H8NO3S；
siRNA正义链：5’-GGACUUGGYAGCAAGGAAA-3’，SEQ ID NO：2；5’端FAM荧光修饰，3’端修饰dTdT；
siRNA反义链：5’-UUUCCUUGCUACCAAGUCC-3’，SEQ ID NO：3；5’端FAM荧光修饰，3’端修饰dTdT。
CKIP-1蛋白具有负调控成骨功能的作用，因此，通过siRNA对原位成骨细胞CKIP-1编码基因实施精确沉默，可促进骨形成；脂质体包裹siRNA可有效避免RNA降解酶对siRNA的破坏，并且随着脂质体的降解，siRNA在成骨区域逐步释放，使得基因干预作用具有可持续性；靶向分子与脂质体耦合，并且与煅烧骨及成骨区域的低结晶度羟基磷灰石均有亲和作用，使siRNA靶向作用于成骨区域，避免siRNA大量扩散到体液中被RNA降解酶降解；煅烧骨作为材料的支架具有一定骨传导能力和可降解性，植入体内可缓慢释放siRNA。
一种成骨基因干预功能材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备脂质体
将DOTAP、DOPE、胆固醇、DSPE-mPEG2000和DSPE-PEG2000-MAL溶于氯仿，旋转蒸发仪中干燥成膜；添加PBS水化，过滤膜，得到脂质体；
(2)脂质体耦合靶向分子
靶向分子与脂质体耦合，冷冻干燥，得到冻干脂质体；
(3)耦合有靶向分子的脂质体包裹siRNA
冻干脂质体用DEPC水复溶后，添加siRNA进行孵育，滤膜过滤除菌，得到靶向分子-脂质体-siRNA；
(4)成骨基因干预功能材料的复合
煅烧骨与靶向分子-脂质体-siRNA复合过夜，冷冻干燥，得到冻干煅烧骨；将冻干煅烧骨与基质复合，压制，4℃保存备用。
优选地，步骤(1)中DOTAP、DOPE、胆固醇、DSPE-mPEG2000和DSPE-PEG2000-MAL按摩尔比42：15：38：3：2的比例溶于氯仿，旋转蒸发仪中干燥成膜；45-55℃水浴中添加0.01MpH7.4的PBS水化，形成多囊泡结构后，过0.45μm滤膜1次，过0.22μm滤膜2次，得到淡乳白色溶液即为脂质体。
进一步优选地，水浴温度为50℃。
DOTAP(1，2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷)、DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺)、胆固醇、DSPE-mPEG2000(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)和DSPE-PEG2000-MAL(二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺)以特定的比例混合，制得的脂质体沉淀少，囊泡均匀，对siRNA包封效果好，可逐渐降解达到缓释效果。
优选地，步骤(2)中靶向分子与DSPE-PEG2000-MAL的摩尔比为3：2，25±5℃下耦合1.5-2.5h。
进一步优选地，耦合时间为2h。
优选地，步骤(2)中冷冻干燥前，向耦合有靶向分子的脂质体中添加蔗糖，蔗糖在耦合有靶向分子的脂质体中质量分数为8-12％。
进一步优选地，蔗糖在耦合有靶向分子的脂质体中质量分数为10％.
优选地，步骤(3)中孵育时间20-30min，孵育温度25±5℃，孵育完成后0.22μm滤膜过滤除菌；冻干脂质体与DEPC水比例为0.1g/ml；siRNA与DEPC水复溶的脂质体比例为1μg：1ml。
进一步优选地，步骤(3)中孵育时间20min。
优选地，步骤(4)中煅烧骨与靶向分子-脂质体-siRNA以0.5g/ml比例复合。
优选地，步骤(4)中冷冻干燥方法如下：
向煅烧骨与靶向分子-脂质体-siRNA的复合物加入蔗糖，蔗糖在复合物中的质量分数为8-12％；4℃放置1-1.5h，-18℃放置10-12h，-40℃放置5-6h，然后冷冻干燥20-24h，得到冻干煅烧骨。
进一步优选地，降温程序为4℃放置1h，-18℃放置12h，-40℃放置5h，然后-40℃冷冻干燥24h。
冻干煅烧骨制备过程中蔗糖的添加及降温程序的控制均为降低降温过程对siRNA包裹结构的影响。
优选地，步骤(4)中的基质的制作方法如下：甘油、明胶、水按7：2：1质量比配置成甘油明胶，加水稀释10倍，添加壳聚糖30-35mg/ml，羟乙基淀粉20-25mg/ml，混合均匀；
基质与冻干煅烧骨按1：1质量比进行复合，复合后装入1ml或5ml注射器中，4℃保存备用。
基质中添加壳聚糖和羟乙基淀粉可进一步增加成骨基因干预功能材料的生物相容性，进而增加材料对成骨细胞的亲和性；此外，壳聚糖和羟乙基淀粉在材料内部形成的微交联结构可进一步减少siRNA的降解。
进一步优选地，壳聚糖浓度30mg/ml，羟乙基淀粉浓度20mg/ml。
优选地，壳聚糖分子量为20-35万Da，羟乙基淀粉分子量为15-60万Da。
进一步优选地，壳聚糖分子量为30万Da，羟乙基淀粉分子量40万Da。
优选地，煅烧骨的制备方法如下：
1)将牛松质骨切割成1cm×1cm×1cm的骨块，用高压水枪冲洗骨块，自然晾干；
2)900-950℃煅烧3-4h，蒸馏水清洗3次，PBS清洗直至pH为7-8为止，自然晾干；
3)研磨，过50目和24目筛，取中间颗粒待用。
进一步优选地，煅烧温度900℃，煅烧时间4h。
通过牛松质骨煅烧得到的煅烧骨主要成分为羟基磷灰石，其天然的骨结构具有良好的骨传导性和降解性，以特定粒径的煅烧骨颗粒制备得到成骨基因干预功能材料的支架，具有适宜的空隙，辅以其他原料增强缓释效果。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种成骨基因干预功能材料及其制备方法，得到的成骨基因干预功能材料未引入异源性细胞因子或细胞，使用安全，靶向性好，缓释作用佳，在体外及体内均可有效促进成骨分化。
附图说明
下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为脂质体外观。
图2附图为脂质体包裹效果验证实验电泳图；
其中，第一泳道为marker，其余泳道由左至右依次为单纯siRNA组孵育0.5、1、2、4、8、12、18、24h；脂质体包裹的siRNA组孵育0.5、1、2、4、8、12、18、24h。
图3附图为煅烧骨外观。
图4附图为体外毒性检测结果。
图5附图为大鼠颅骨成骨细胞CKIP-1蛋白编码基因的沉默效果验证实验结果。
图6附图为本发明材料对大鼠颅骨成骨细胞增殖活性影响。
图7附图为本发明材料对ALP mRNA表达的影响。
图8附图为本发明材料对COL1-αmRNA表达的影响。
图9附图为本发明材料对OC mRNA表达的影响。
图10附图为体内实验心脏切片染色结果；
其中，A为对照组，B为实验组。
图11附图为体内实验肝脏切片染色结果；
其中，A为对照组，B为实验组。
图12附图为体内实验脾脏切片染色结果；
其中，A为对照组，B为实验组。
图13附图为体内实验肺脏切片染色结果；
其中，A为对照组，B为实验组。
图14附图为体内实验肾脏切片染色结果；
其中，A为对照组，B为实验组。
图15附图为体内实验大脑切片染色结果；
其中，A为对照组，B为实验组。
图16附图为体内实验肌肉切片染色结果；
其中，A为对照组，B为实验组。
图17附图为体内实验大鼠颅骨切片染色结果；
其中，A为对照组，B为实验组。
图18附图为体内实验大鼠颅骨成骨比例。
图19附图为体内实验大鼠颅骨Micro-CT图；
其中，A为对照组，B为实验组。
具体实施方式
下面将结合本实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种成骨基因干预功能材料，由靶向分子-脂质体-siRNA与煅烧骨复合而成；靶向分子-脂质体-siRNA由耦合有靶向分子的脂质体包裹siRNA而成。
靶向分子由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，氨基酸序列为DSSDSSDSSDSSDSSDSS，SEQ ID NO：1；C端修饰C5H8NO3S。
siRNA由上海吉玛公司合成：
siRNA正义链：5’-GGACUUGGYAGCAAGGAAA-3’，SEQ ID NO：2；5’端FAM荧光修饰，3’端修饰dTdT；
siRNA反义链：5’-UUUCCUUGCUACCAAGUCC-3’，SEQ ID NO：3；5’端FAM荧光修饰，3’端修饰dTdT。
上述成骨基因干预功能材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备脂质体
将DOTAP、DOPE、胆固醇、DSPE-mPEG2000和DSPE-PEG2000-MAL按摩尔比42：15：38：3：2的比例溶于30ml氯仿中，旋转蒸发仪中干燥成膜；50℃水浴中添加适量0.01MpH 7.4的PBS将膜水化，形成多囊泡结构，过0.45μm滤膜1次，过0.22μm滤膜2次，得到淡乳白色溶液即为脂质体，如图1所示。
(2)脂质体耦合靶向分子
以靶向分子与DSPE-PEG2000-MAL摩尔比3：2的比例将靶向分子添加到脂质体中，25℃下耦合2h。
向耦合有靶向分子的脂质体中添加10％蔗糖，冷冻干燥，得到冻干脂质体。
(3)耦合有靶向分子的脂质体包裹siRNA
使用DEPC水将冻干脂质体复溶，冻干脂质体与DEPC水比例为0.1g/ml；添加siRNA进行孵育，siRNA与DEPC水复溶的脂质体比例为1μg：1ml，孵育时间20min，孵育温度25℃；孵育完成后0.22μm滤膜过滤除菌，得到靶向分子-脂质体-siRNA。
对脂质体的包裹效果进行验证。分别设置脂质体包裹的siRNA组和单纯siRNA组，两组分别与小牛血清孵育0.5、1、2、4、8、12、18、24h后，进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳条带以确定脂质体包裹siRNA的效果。
如图2所示，单纯siRNA组电泳条带色浅模糊，且与血清作用时间越长条带越浅，表明单纯siRNA与血清作用后，很快被血清中的酶降解；脂质体包裹的siRNA组条带色深清晰，且随时间的变化差异不明显，表明脂质体包裹的siRNA大部分被保护，未被血清中的酶降解，且在观察期内保护作用不随时间增加而减弱。
(4)成骨基因干预功能材料的复合
1)制备煅烧骨
将牛松质骨切割成1cm×1cm×1cm的骨块，用高压水枪冲洗骨块，自然晾干；900℃煅烧4h，蒸馏水清洗3次，PBS清洗直至pH为7-8为止，自然晾干；研磨，过50目和24目筛，得到50目筛上、24目筛下物，如图3所示。
2)制备冻干煅烧骨
煅烧骨与靶向分子-脂质体-siRNA以0.5g/ml比例复合过夜，向煅烧骨与靶向分子-脂质体-siRNA的复合物加入10％蔗糖，4℃放置1h，-18℃放置12h，-40℃放置5h，然后-40℃冷冻干燥24h。
3)制备成骨基因干预功能材料
甘油、明胶、水按7：2：1质量比配置成甘油明胶，加水稀释10倍，添加壳聚糖(30万Da)30mg/ml，羟乙基淀粉(40万Da)20mg/ml，混合均匀制得基质；
基质与冻干煅烧骨按1：1质量比进行复合，复合后分别装入1ml和5ml注射器中，压紧，4℃保存备用。
实施例2
对实施例1制得的成骨基因干预功能材料进行体外毒性检测。
按照ISO-10993规定，将制备好的成骨基因干预功能材料按1：10的质量比置于DMEM培养基浸提48h。将L929细胞接种到96孔板中，24h后取上述浸提液加10％胎牛血清，加入96孔板中，对照组加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，72h后MTT法检测细胞毒性。
如图4所示，实验组的细胞增值率达对照组的90％，细胞毒性评级为I级。
实施例3
验证实施例1制得的成骨基因干预功能材料对成骨细胞CKIP-1蛋白编码基因的沉默效果。
酶消化法原代培养大鼠颅骨成骨细胞，细胞传至第3代进行实验。将5ml注射器中的材料切成1mm的薄片，放入24孔板中，将大鼠颅骨成骨细胞接种到材料上，培养72h后将细胞消化收集，提取RNA，PCR检测CKIP-1mRNA的表达水平。如图5所示，实验组CKIP-1mRNA表达量明显低于对照组，沉默效率约为60％。
实施例4
验证实施例1所制成骨基因干预功能材料的成骨细胞增殖活性，及其对ALP、COL1-α、OC表达的影响。
大鼠颅骨成骨细胞传至第3代进行实验。将细胞接种于材料表面，48h后CCK-8法检测细胞的增殖活性；72h后提取细胞RNA，实时定量PCR检测细胞ALP、COL1-α、OC的mRNA表达水平。
如图6-9所示，实验组细胞增殖活性明显高于对照组；实验组ALP、COL1-α、OC mRNA表达量均高于对照组。
实施例5
通过大鼠颅骨缺损模型对实施例1所制成骨基因干预功能材料进行体内实验。
1)模型制作
选取成年SD大鼠，雄性，体重300g左右；3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，取俯卧位，颅顶处备皮，碘伏消毒；颅顶中线处开一条2cm左右的切口，分离骨膜，用取骨环钻于矢状缝左右各打一个直径5mm的缺损。将1ml注射器中的材料切成1mm的薄片，植入缺损中，缝合骨膜及皮肤；术后肌注青霉素8万单位，连注3天，常规饲养。术中严格无菌操作，缺损均由同一组人员完成，并且设置对照组，植入煅烧骨；实验组与对照组各20只大鼠。
2)主要组织器官病理评价
术后8周处死大鼠取主要脏器：心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑、肌肉，进行石蜡切片及HE染色，观察组织形态有无异常，评价材料的安全性。如图10-16，大鼠主要脏器无明显异常。
3)缺损修复情况的病理评价
术后第10周取材大鼠颅骨，福尔马林固定后，50％甲酸脱钙，制作石蜡切片，HE染色，观察缺损修复情况，如图17所示，实验组出现大量成骨，而对照组未出现成骨。
4)Micro-CT扫描
术后10周取材大鼠颅骨，80％乙醇固定后进行Micro-CT扫描，计算新生骨量及成骨比例。如图18-19所示，实验组新生骨量明显高于对照组。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国人民解放军总医院第一附属医院
<120> 一种成骨基因干预功能材料及其制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 1
Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp
1 5 10 15
Ser Ser
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<400> 2
ggacuuggya gcaaggaaa 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<400> 3
uuuccuugcu accaagucc 19

Claims (10)

1.一种成骨基因干预功能材料，其特征在于，由靶向分子-脂质体-siRNA与煅烧骨复合而成；
所述靶向分子-脂质体-siRNA由耦合有靶向分子的脂质体包裹siRNA而成；
所述靶向分子氨基酸序列为DSSDSSDSSDSSDSSDSS，SEQ ID NO：1；C端修饰C5H8NO3S；
所述siRNA正义链：5’-GGACUUGGYAGCAAGGAAA-3’，SEQ ID NO：2；5’端FAM荧光修饰，3’端修饰dTdT；
所述siRNA反义链：5’-UUUCCUUGCUACCAAGUCC-3’，SEQ ID NO：3；5’端FAM荧光修饰，3’端修饰dTdT。
2.根据权利要求1所述的一种成骨基因干预功能材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备脂质体
将DOTAP、DOPE、胆固醇、DSPE-mPEG2000和DSPE-PEG2000-MAL溶于氯仿，旋转蒸发仪中干燥成膜；添加PBS水化，过滤膜，得到脂质体；
(2)脂质体耦合靶向分子
靶向分子与脂质体耦合，冷冻干燥，得到冻干脂质体；
(3)耦合有靶向分子的脂质体包裹siRNA
冻干脂质体用DEPC水复溶后，添加siRNA进行孵育，滤膜过滤除菌，得到靶向分子-脂质体-siRNA；
(4)成骨基因干预功能材料的复合
煅烧骨与靶向分子-脂质体-siRNA复合过夜，冷冻干燥，得到冻干煅烧骨；将冻干煅烧骨与基质复合，压制，4℃保存备用。
3.根据权利要求2所述的一种成骨基因干预功能材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中DOTAP、DOPE、胆固醇、DSPE-mPEG2000和DSPE-PEG2000-MAL按摩尔比42：15：38：3：2的比例溶于氯仿，旋转蒸发仪中干燥成膜；45-55℃水浴中添加0.01M pH 7.4的PBS水化，形成多囊泡结构后，过0.45μm滤膜1次，过0.22μm滤膜2次，得到淡乳白色溶液即为脂质体。
4.根据权利要求2所述的一种成骨基因干预功能材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中靶向分子与DSPE-PEG2000-MAL的摩尔比为3：2，25±5℃下耦合1.5-2.5h。
5.根据权利要求2所述的一种成骨基因干预功能材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中冷冻干燥前，向耦合有靶向分子的脂质体中添加蔗糖，蔗糖在耦合有靶向分子的脂质体中质量分数为8-12％。
6.根据权利要求2所述的一种成骨基因干预功能材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中孵育时间20-30min，孵育温度25±5℃，孵育完成后0.22μm滤膜过滤除菌；冻干脂质体与DEPC水比例为0.1g/ml；siRNA与DEPC水复溶的脂质体比例为1μg：1ml。
7.根据权利要求2所述的一种成骨基因干预功能材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中煅烧骨与靶向分子-脂质体-siRNA以0.5g/ml比例复合。
8.根据权利要求2所述的一种成骨基因干预功能材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中冷冻干燥方法如下：
向煅烧骨与靶向分子-脂质体-siRNA的复合物加入蔗糖，蔗糖在复合物中的质量分数为8-12％；4℃放置1-1.5h，-18℃放置10-12h，-40℃放置5-6h，然后-40℃冷冻干燥20-24h，得到冻干煅烧骨。
9.根据权利要求2所述的一种成骨基因干预功能材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的基质的制作方法如下：甘油、明胶、水按7：2：1质量比配置成甘油明胶，加水稀释10倍，添加壳聚糖30-35mg/ml，羟乙基淀粉20-25mg/ml，混合均匀；
基质与冻干煅烧骨按1：1质量比进行复合，复合后装入1ml或5ml注射器中，4℃保存备用。
10.根据权利要求2所述的一种成骨基因干预功能材料的制备方法，其特征在于，所述煅烧骨的制备方法如下：
1)将牛松质骨切割成1cm×1cm×1cm的骨块，用高压水枪冲洗骨块，自然晾干；
2)900-950℃煅烧3-4h，蒸馏水清洗3次，PBS清洗直至pH为7-8为止，自然晾干；
3)研磨，过50目和24目筛，取中间颗粒待用。
CN201811428149.4A 2018-11-27 2018-11-27 一种成骨基因干预功能材料及其制备方法 Active CN109432504B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811428149.4A CN109432504B (zh) 2018-11-27 2018-11-27 一种成骨基因干预功能材料及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811428149.4A CN109432504B (zh) 2018-11-27 2018-11-27 一种成骨基因干预功能材料及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109432504A true CN109432504A (zh) 2019-03-08
CN109432504B CN109432504B (zh) 2021-11-16

Family

ID=65555014

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811428149.4A Active CN109432504B (zh) 2018-11-27 2018-11-27 一种成骨基因干预功能材料及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109432504B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111658821A (zh) * 2020-06-03 2020-09-15 深圳市百吉因生物科技有限公司 负载小干扰rna的胶原基骨修复材料及制备方法及在制备治疗骨质疏松骨折材料中的应用

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1765834A (zh) * 2005-09-08 2006-05-03 丁建明 一种增强陶瓷类生物支架机械强度的方法
CN1810304A (zh) * 2005-12-16 2006-08-02 高心 煅烧骨粉的制备方法在骨缺损修复中的用途
CN101507840A (zh) * 2009-03-25 2009-08-19 上海市肿瘤研究所 脂质体硫酸钙复合纳米人工骨、制备方法和应用
CN101616677A (zh) * 2006-10-03 2009-12-30 阿尔尼拉姆医药品有限公司 含脂质的制品
CN102552936A (zh) * 2011-12-01 2012-07-11 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种用于基因靶向传递的siRNA载体复合物及其制备方法
CN102824647A (zh) * 2011-06-13 2012-12-19 香港中文大学 基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送系统及其制备方法
CN104174033A (zh) * 2014-08-14 2014-12-03 武汉大学 一种骨靶向rna干扰复合物及其合成方法
WO2015027895A1 (zh) * 2013-08-26 2015-03-05 苏州瑞博生物技术有限公司 一种核酸和药物组合物及其应用
CN105078889A (zh) * 2015-07-15 2015-11-25 魏垒 一种用于治疗软骨疾病的脂质体递送系统及其制备方法
CN105327364A (zh) * 2015-12-15 2016-02-17 浙江理工大学 一种纳米羟基磷灰石-siRNA复合物及其制备方法
CN105983102A (zh) * 2015-02-09 2016-10-05 北京和理咨询有限公司 基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统及其制备方法
CN106535880A (zh) * 2014-05-30 2017-03-22 纽约州立大学研究基金会 促进骨形成的组合物和方法

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1765834A (zh) * 2005-09-08 2006-05-03 丁建明 一种增强陶瓷类生物支架机械强度的方法
CN1810304A (zh) * 2005-12-16 2006-08-02 高心 煅烧骨粉的制备方法在骨缺损修复中的用途
CN101616677A (zh) * 2006-10-03 2009-12-30 阿尔尼拉姆医药品有限公司 含脂质的制品
CN101507840A (zh) * 2009-03-25 2009-08-19 上海市肿瘤研究所 脂质体硫酸钙复合纳米人工骨、制备方法和应用
CN102824647B (zh) * 2011-06-13 2014-07-23 香港中文大学 基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送系统及其制备方法
CN102824647A (zh) * 2011-06-13 2012-12-19 香港中文大学 基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送系统及其制备方法
CN102552936A (zh) * 2011-12-01 2012-07-11 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种用于基因靶向传递的siRNA载体复合物及其制备方法
WO2015027895A1 (zh) * 2013-08-26 2015-03-05 苏州瑞博生物技术有限公司 一种核酸和药物组合物及其应用
CN106535880A (zh) * 2014-05-30 2017-03-22 纽约州立大学研究基金会 促进骨形成的组合物和方法
CN104174033A (zh) * 2014-08-14 2014-12-03 武汉大学 一种骨靶向rna干扰复合物及其合成方法
CN105983102A (zh) * 2015-02-09 2016-10-05 北京和理咨询有限公司 基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统及其制备方法
CN105078889A (zh) * 2015-07-15 2015-11-25 魏垒 一种用于治疗软骨疾病的脂质体递送系统及其制备方法
CN105327364A (zh) * 2015-12-15 2016-02-17 浙江理工大学 一种纳米羟基磷灰石-siRNA复合物及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GE ZHANG ET AL: "A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy", 《NATURE MEDICINE》 *
张令强等: "通过RNAi敲低CKIP-1表达、促进骨形成进行骨质疏松治疗", 《中国药理学与毒理学杂志》 *
曲兆明: "《口腔种植与牙周病诊治技术》", 30 September 2018, 天津科学技术出版社 *
陈燕玲等: "负载siRNA胶原/生物活性玻璃复合材料的成骨作用", 《南方医科大学学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111658821A (zh) * 2020-06-03 2020-09-15 深圳市百吉因生物科技有限公司 负载小干扰rna的胶原基骨修复材料及制备方法及在制备治疗骨质疏松骨折材料中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109432504B (zh) 2021-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6677813B2 (ja) マイクロｒｎａ遺伝子を介した新規な組織工学的な神経構築及びその神経欠陥修復における使用
CN109701038B (zh) 一种脑部靶向外泌体、其制备方法及应用
CN109152737A (zh) 结合基质的纳米囊泡及其用途
CN104353111B (zh) 一种用于腹壁缺损的生物修复材料及其制备方法
CN103495209B (zh) 自发荧光骨修复磁性缓释微球
Jin et al. Rapid Extracellular Matrix Remodeling via Gene‐Electrospun Fibers as a “Patch” for Tissue Regeneration
WO2021077856A1 (zh) 一种能够沉默Pcsk9蛋白的siRNA、其纳米递送系统及应用
CN106046135A (zh) 具有不同降解速度的丝素蛋白及应用
CN110917215B (zh) 复合体、组织修复材料及其制备方法和应用
CN103046225B (zh) 一种胶原蛋白膜的制备方法
CN106729984A (zh) 一种鱼胶原蛋白修复海绵及其制备方法
CN106039416A (zh) 壳聚糖—丝胶蛋白复合生物支架及其制备方法和应用
CN115429937B (zh) 一种软组织填充修复材料及其制备方法
CN111150882A (zh) 银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架及其制备方法与应用
CN107660220A (zh) 超支化聚合物和多聚复合物及包含其的dna或rna递送系统
CN108752604A (zh) 一种软组织填充材料及其制备方法与应用
CN112852876B (zh) 一种表达人表皮生长因子的家蚕丝腺重组表达载体及其制备方法和应用
Xing et al. Effects of nanoparticle-mediated growth factor gene transfer to the injured microenvironment on the tendon-to-bone healing strength
CN109432504A (zh) 一种成骨基因干预功能材料及其制备方法
CN107638405A (zh) 一种眼内递药组合物及其制备方法
CN105078889A (zh) 一种用于治疗软骨疾病的脂质体递送系统及其制备方法
CN105148325B (zh) 一种新的角膜组织修复材料及其制备方法
CN112251468B (zh) 一种线粒体靶向的基因编辑复合体、制备方法、应用及线粒体基因组编辑方法
CN113584082A (zh) CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在制备治疗遗传性感音神经性聋的药物中的应用
CN110624133B (zh) 一种用于神经修复的神经基质导管及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 100037, Fu Cheng Road, Beijing, Haidian District, No. 51

Applicant after: Fourth Medical Center, General Hospital of the Chinese PLA

Address before: 100037, Fu Cheng Road, Beijing, Haidian District, No. 51

Applicant before: THE FIRST AFFILIATED HOSPITAL,CHINESE PLA GENERAL Hospital

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant