CN106535880A - 促进骨形成的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种用于促进骨形成或者减少骨损坏的方法。本公开还涉及用于促进间充质干细胞(MSC)募集至骨中受伤或外科手术介入的局部部位以促进愈合的方法。此外，本公开涉及用于减少或防止矿物质形成或骨生长、或者减少骨量的方法。本文公开的方法用于治疗如放射性骨坏死的病症。

Description

促进骨形成的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年5月30日提交的第62/005,359号的美国临时申请的优先权，其全部内容引入本文以供参考。

引入序列表以供参考

将创建于2015年5月11日并通过EFS-Web向美国专利商标局(United StatesPatent and Trademark Office)提交的、2KB的名为30878_SEQ.txt的ACSII文本文件中的序列表引入本文以供参考。

背景技术

骨形成和降解由负责骨形成的成骨细胞和负责骨再吸收的破骨细胞之间的生长因子信号传导严格地调控。将通过成骨细胞的骨形成与通过破骨细胞的降解相偶联近来已成为深入研究的主题；被鉴定为偶联因子的生长因子的列表不断扩大。将骨形成与骨再吸收相偶联需要成骨细胞和破骨细胞的募集以及同时其各自的祖细胞的募集。成骨细胞衍生自间充质干细胞(MSC)，而破骨细胞衍生自作为髓系(myeloid-lineage)一部分的单核细胞；然而，MSC或单核细胞如何从其在骨髓中的龛(niche)迁移到新骨形成部位仍然是未知的。目前对骨形成的空间和时间调控的理解提出，MSC从其骨髓龛迁移至骨内膜(endosteal)表面；在此MSC分化成产生新骨的成骨细胞。同时，单核细胞也从其骨髓龛中迁移至骨内膜表面；随后其在此分化成再吸收骨的破骨细胞。已知调节骨形成的生长因子包括TGFβ-、BMP-和典型Wnt-配体。来自单核细胞前体的破骨细胞和骨再吸收通过MSCF、OPG和RANK-配体的表达进行调控。同时，TGFβ-、BMP-和非典型Wnt-配体的表达也调控破骨细胞活性。然而，包括TGFβ-、BMP-和Wnt-配体的参与组织形成(patterning)的许多发育生长因子促进骨形成和再吸收。健康骨骼的维护需要不断的重塑，其中骨骼被连续地制造和破坏。

将植入物引入骨骼中引起生化级联反应，其驱动部分由巨噬细胞活性介导的促炎性应答，所述巨噬细胞衍生自髓系，并且可有助于骨骼或移植材料的降解。目前对植入物和移植材料进行选择，以使巨噬细胞应答最小化，同时使骨传导达到最佳并促进骨植入物的整合最大化。或者，作为提高骨骼整合的手段，已经采用了引入具有植入物的自体移植或者使用灭活骨组织植入物(自体移植)，来与植入物的材料性质相呼应；然而，这些途径经常是成问题的。理论上，材料可以被设计为既是自组织也是自组装的。

作为在创伤骨科操作中或在常规脊柱融合术操作中采用的辅助治疗方法，骨形成代表了在矫形外科手术中的持续挑战。特别地，这些辅助的骨生成疗法试图在外科手术介入部位提高健康骨骼的生长，同时减少骨骼的愈合时间。在过去的几十年中，已经进行了许多尝试，以使用多种具有成骨能力的生长因子，包括骨形态发生蛋白(BMP)。遗憾的是，旨在产生骨骼的基于BMP的疗法也带有患者的肿瘤发生的风险，尤其是那些可能经过X射线治疗或者具有初期未经检测的肿瘤的患者。进而，基于BMP的疗法无法用在具有活跃的肿瘤的患者中，这是特别遗憾的，因为这些患者在外科手术介入期间可显著得益于增加骨形成的疗法。

在矫形外科和骨骼愈合中，受损骨折的愈合继续表现出显著的挑战。已经报道有高达5-20％的骨折不愈合率。进展成不愈合的患者的治疗相关的发病率和成本可能相当可观。每年遇到的6,200,000例骨折中的大约10％难以愈合。存在多种帮助加速骨骼愈合的选择，其具有未经证实的疗效。髂嵴骨(Iliac crest bone)移植仍被看作最可靠的方法(金标准)，但是其具有与获取部位并发症相关的显著问题。基于生长因子(包括血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和甲状旁腺素(PTH))的疗法在细胞培养研究中已经显示出初步的成功；但是，在临床应用中其疗效仍然未经证实。另外的选择，如骨形态发生蛋白-2(BMP2)和BMP7，已在加速具有骨干骨折的骨折愈合中显示取得了成功。然而，存在与使用BMP相关的风险，包括增加的感染、增加的肿瘤生长风险和增加的局部骨质溶解的风险。多种与包括BMP的治疗有关的风险还排除了对具有其他病理学的患者使用BMP。

当处理复杂的矫形问题比如脊柱融合、骨折愈合和管理骨折不愈合时，作为矫形外科手术中的辅助，提高骨形成而不提高肿瘤生长风险的治疗能力是目前商业可用的生物制剂的限制。

在创伤骨科领域中，尤其是具有大的缺损和不愈合的开放性骨折，自体/同种异体骨移植是第一位的治疗选择。然而，作为最可靠方法使用以实现骨形成的自体获取骨移植，具有感染和供体部位疼痛的风险。当少见地使用其他同种异体骨移植替代物时，其显示出较差的愈合。对于脊柱外科手术而言，当使用这些移植选择以实现融合时，存在相同的限制。

来自尸体源的皮质骨和松质骨适合填充空间，并且主要是骨传导的，而没有显著的骨诱导能力。因此，用生物制剂，如PDGF、VEGF和BMP来提高愈合或脊柱融合的速度，并且其应用增加了治疗费用。然而，这些生物疗法在一系列细胞表型的发育期间刺激了增殖，这代表了固有的不可接受的肿瘤风险。

脱钙骨基质和磷酸钙替代物在促进骨骼愈合中并未显示出高的疗效，并且由于制造成本还具有与之相关的相当高的成本。

重组BMP2(rhBMP2)是由Medtronic商业开发的植入物，被称为INFUSE，其分为小型(对15mg/cm³的植入物，4.2mg BMP2与2个胶原海绵)、中型(对15mg/cm³的植入物，8.4mgBMP2与4个胶原海绵)、大型(对15mg/cm³的植入物，12mg BMP2与6个胶原海绵)以及大型-II(对15mg/cm³的植入物，12mg BMP2与1个胶原海绵)。对脊椎和颌面部应用而言，所有规格的INFUSE植入物均得到批准，而对骨折而言，仅有大型-II植入物得到了批准。INFUSE植入物通过以无菌盐水重组粉末状BMP2，然后将BMP2-盐水溶液加入胶原海绵中来施用；在此之后将植入物在外科手术介入期间进行局部递送。

重组BMP7(rhBMP7或OP1)是由Stryker商业开发的植入物，目前由Olympus拥有，被称为OP1。OP1植入物分为OP1-油灰(OP1-putty)(20mL小瓶中含有粉末状牛软骨和3.3mgBMP7)或OP1-植入物(1g粉末状牛软骨和3.3mg BMP7)。OP1-油灰被批准用于脊柱融合外科手术，而OP1-植入物被批准用于治疗骨折和骨折未愈合的外科手术。OP1-油灰或OP1-植入物通过首先以无菌盐水重组粉末状BMP7、然后将BMP7-盐水溶液加入胶原植入物中来施用；在此之后在外科手术介入期间将植入物进行局部递送。

阿片样生长因子受体(OGFR或ζ-阿片样受体)是非典型的核周阿片样受体，其不与典型的μ-、κ-和δ-阿片样受体(分别为OPRM、OPRK和OPRD)共享结构同源性，并且与典型的阿片样受体相比其以更低的效率与原生阿片样配体结合。阿片样生长因子(OGF或met-5脑啡肽；met5)是OGFR的原生配体。Met5衍生自激素原(pro-hormone)脑啡肽原(pro-enkephalin)(PENK)和较少程度的阿片促黑激素皮质素原(pro-opiomelanocortin)(POMC)，其首先通过激素原转化酶(PCSK1和PCSK2)然后通过羧肽酶E或D(CPE或CPD；脑啡肽转化酶)还原，以形成5个拷贝的met-5脑啡肽。在先的工作确认了met5在成骨细胞和骨祖细胞中的表达(Rosen等人，Proc Natl Acad Sci 88(9):3705-9，1991；Rosen等人，J BoneMiner Res.13(10):1515-20，1998；Elhassan等人，J Bone and Miner Res.，13(1):88-95，1998；Cheng等人，Mol Biol Cell.20(1):319-27，2009)。此外，Kuis等人确认了在外周血和脾脏的单核细胞中的met5(Kuis等人，J Clin Invest.88(3):817-24，1991)。然而，这些研究者无法确认OGFR信号传导在髓系间充质中的功能重要性。Elhassan等人(J Bone andMiner Res，13(1):88-95；1998)公开了met5在骨骼和关节组织中的存在。然而，met5与骨形成之间没有可表明的的联系。

发明内容

本文已经确认了阿片样生长因子信号传导的抑制促进了骨形成和/或降低了骨损坏。不意在受到任何具体理论的限制，据信，通过阿片样生长因子受体(OGFR)抑制阿片样生长因子信号传导有效促进了骨形成和/或减少了骨损坏。本文已经证明，通过向期望骨形成的部位直接局部施用阿片样生长因子(OGFR)信号传导通路的抑制剂，阿片样生长因子信号传导的抑制在动物中促进骨形成。还证明了需要向期望骨形成的部位直接施用阿片样生长因子(OGFR)信号传导通路抑制剂，以促进MSC分化成为成骨细胞，并防止单核细胞分化成破骨细胞，这导致矿物质化的增加并提高在骨骼受伤或外科手术部位处的骨形成。

因此，本发明涉及通过向需要其的动物将有效量的促进骨形成和/或降低骨损坏的阿片样生长因子受体的拮抗剂直接施用于期望骨形成的部位，用于促进骨形成或降低骨损坏的方法。

在一方面，本方法中采用的OGFR拮抗剂阻断阿片样生长因子与OGFR的结合。

在一些实施方式中，阻断阿片样生长因子(met5)与OGFR结合的OGFR拮抗剂是纳洛酮或者其功能性衍生物、纳曲酮或者其功能性衍生物、或者它们的组合。

在其他的实施方式中，OGFR拮抗剂衍生自氧吗啡酮并且结合至OGFR，其包括：纳洛酮、纳曲酮、烯丙吗啡、纳洛肼、左洛啡烷、纳美芬、cyprodime、塞克罗酚、环佐辛、奥昔啡烷、LY113878、MR2266、二丙诺啡、WIN 44,441-3、纳曲吲哚(naltindole)或norbinaltorphimine。

仍在其他的实施方式中，OGFR拮抗剂衍生自顺-3,4-二甲基-4-苯基哌啶并结合至OGFR，其包括：LY99335、LY25506、LY117413或LY255582。

在一些实施方式中，OGFR拮抗剂衍生自met5-脑啡肽或者亮氨酸-脑啡肽的肽，结合至OGFR，并且最低限度地包括以下的氨基酸序列作为靶向OGFR的手段：对衍生自met5-脑啡肽的那些而言为Tyr-Gly-Gly-Phe-Met(SEQ ID NO:1)，或者对衍生自亮氨酸-脑啡肽的那些而言为Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu(SEQ ID NO:2)。

仍在其他实施方式中，OGFR拮抗剂衍生自肽拮抗剂ICI174864(N,N-二烯丙基-Tyr-Aib-Aib-Phe-Leu-OH,SEQ ID NO:3；Aib＝氨基异丁基酸)或者生长激素抑制素类似物CTP(D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-NH₂，SEQ ID NO:4)。

在另一方面，本方法中采用的OGFR拮抗剂是一种扰乱在OGFR:251QSALDYFMFAVRCRHQRRQLVHFAWEHFRPRCKFVWGPQDKLRRFKPSSL(SEQ ID NO:5)中发现的核定位序列的分子。

仍在另一方面，本方法中采用的OGFR拮抗剂是直接针对OGFR基因并有效扰乱OGFR基因表达的小-发夹(sh)-RNA或者小-干扰(si)-RNA。

在另一方面，本公开提供用于促进间充质干细胞(MSC)募集至骨中受伤或外科手术介入的局部部位，以促进愈合同时抑制破骨细胞驱动的骨降解(或者再吸收)的方法。该方法是基于施用一定量的OGFR拮抗剂以促进骨形成，同时抑制骨降解。受伤(injury)可以为，例如，骨折或外科手术介入。在一些实施方式中，将OGFR拮抗剂局部地施用于受伤部位或者外科手术介入的部位。

附图说明

图1A-1I：(A)加入1μM至1mM之间的纳洛酮与骨诱导培养基大幅提高了要诱导成为成骨细胞的MSC培养物中的矿物富集(红色染色)。加入1μM至1mM之间的纳曲酮与骨诱导培养基也使矿物质增加，但是比纳洛酮程度小。(B)δ阿片样受体(OPRD)基因表达在成骨细胞(*＝p<0.001)和破骨细胞(*＝p<0.0084)中大幅降低，而(C)阿片样生长因子受体(OGFR)基因表达在成骨细胞(*＝p<0.02)和破骨细胞(*＝p<0.0001)中显著增加。(D)OGFR-配体met5-脑啡肽(met5)衍生自更大的被称为脑啡肽原(PENK)的前体蛋白。加入5或50μM的met5对培养物中的矿物质形成没有影响。(E)重要的是，向骨诱导培养基中加入5μM的met5对矿物富集没有影响，而加入50μM的met5略微减少了矿物质富集。然而，当将1mM纳洛酮与5μM或50μM的met5以及骨诱导培养基一起加入时，纳洛酮治疗能够消除met5的抗成骨作用。(F)与对照培养物相比，加入骨诱导培养基导致矿物质形成。与对照相比，BMP2增加了矿物质形成，而用纳洛酮(1mM)的一次治疗(1倍剂量)与用纳洛酮的两次治疗(2倍剂量)增加了矿物质形成(红色染色)。改变每种培养基的情况下用纳洛酮治疗(连续剂量)抑制矿物质形成。(G)向MSC培养物中加入纳洛酮减少了72小时和120小时的细胞数量(*＝p<0.017)。(H)向单核细胞培养物中加入纳洛酮也显著减少了细胞数量(*＝p<0.0001)。(I)与对照的破骨细胞培养物相比，要培养成为破骨细胞的单核细胞不受met5治疗的影响(TRAP染色为紫色)。加入1μM纳洛酮或者1μM纳曲酮没有显著减少破骨细胞的数量，而加入1mM纳洛酮或者1mM纳曲酮明显减少了破骨细胞的数量。

图2A-2E：(A)以OGFR shRNA转染的MSC表达显著更少的OGFR基因表达(*＝p<0.0085)，这在(B)核和胞质蛋白裂解物中OGFR的降低中得到支持。(C)此外，在OGFR缺陷型MSC中SMAD1基因的表达显著高于对照MSC和GFP转染的对照培养物(*＝p<0.0008)。(D)在OGFR缺陷型MSC中，相对于对照MSC和GFP转染的对照培养物，ID1基因表达也是增加的(*＝p<0.0217)。(E)相对于对照培养物和GFP转染的对照，在要诱导成为成骨细胞的OGFR缺陷型MSC中，成骨细胞特异性蛋白骨钙素(OCN)也显著增加(*＝p<0.0215)。

图3A-3G：(A)相对于对照PBS或met5治疗的缺损，在单皮质缺损(unicorticaldefects)中加入1mM纳洛酮的治疗使骨量(Bv/Tv)提高了1.53倍(*＝p<0.001)。(B)对照、纳洛酮或met5治疗组的缺损的μCT图像。(C)骨量(Bv/Tv)升高的同时骨小梁(trabecular)数量(TbN)增加(*＝p<0.047)。(D)相对于对照非外科手术组，在外科手术对照组(Sx对照)中以外科手术管理单皮质缺损增加了Bv/Tv(通过总体积校正的骨体积)，这与已在缺损中富集的骨量相对应(*＝p<0.034)。以牛胶原植入物和PBS或met5治疗的缺损与外科手术对照并无不同。然而，相对于非外科手术组，PBS(*＝p<0.0021)和met5(*＝p<0.0009)治疗组均得到了显著提高。相对于非外科手术对照，以BMP2、纳洛酮或纳曲酮治疗的缺损均得到增加(*＝p<0.0001)。当与外科手术对照组(X＝p<0.0005)、PBS治疗组(#＝p<0.0124)和met5治疗组(+＝p<0.011)相比，BMP2、纳曲酮和纳洛酮治疗组得到显著增加。BMP2治疗组的Bv/Tv与纳曲酮治疗组并无不同，而纳洛酮治疗组的Bv/Tv显著增加(0＝p<0.035)。(E)在外科手术对照(Sx对照)组、met5治疗组、BMP2治疗组、纳曲酮治疗组和纳洛酮治疗组中骨小梁厚度(TbTh)得到增加(*＝p<0.04)。仅有纳洛酮治疗组中的TbTh大于BMP2治疗组或纳曲酮治疗组(**＝p<0.0002)。(F)相对于SHAM外科手术对照组，胶原植入物在腰脊柱中增加了骨形成。然而，BMP2+胶原或者纳洛酮+胶原植入物相对于单独的胶原植入物增加了骨形成。(G)胶原植入物和纳洛酮+胶原植入物的腰椎骨融合量的μCT图像。

图4A-4D：(A)在成骨细胞(*＝p<0.018)、RDES尤因肉瘤(Ewing’sSarcoma)的骨肿瘤细胞(*＝p<0.0014)、Hs822t尤因肉瘤的骨肿瘤细胞(*＝p<0.0001)、Hs863t尤因肉瘤的骨肿瘤细胞(*＝p<0.039)和SaOS2骨肉瘤肿瘤细胞(*＝p<0.05)中观察到OGFR基因表达。(B)在加入1mM纳洛酮或1mM纳曲酮72小时之后，相对于对照培养物，SaOS2骨肉瘤细胞数量显著降低(*＝p<0.0001)。OGFR配体、met5对细胞数量没有影响。(C)Hs822t尤因肉瘤的骨肿瘤细胞系在培养基中贴壁。在加入1mM剂量的纳曲酮72小时之后，相对于对照培养物，Hs822t尤因肉瘤的骨肿瘤细胞数量减少(*＝p<0.0025)。纳曲酮对Hs822t肿瘤细胞数量没有影响。相反地，加入50mM的met5导致Hs822t肿瘤细胞数量的显著增加(X＝p<0.03)。(D)RDES尤因肉瘤的骨肿瘤细胞在培养基中松散地贴壁。在加入1mM剂量的纳洛酮或者1mM剂量的纳曲酮72小时之后，相对于对照培养物，RDES尤因肉瘤的骨肿瘤细胞数量显著减少(*＝p<0.0005)。加入met5对RDES肿瘤细胞数量没有影响。

具体实施方式

本文已经阐明，纳洛酮或纳曲酮在降低破骨细胞数量的同时增加了骨形成。在具有或不具有牛胶原载体的外科手术诱发单皮质缺损之后，或者在使用牛胶原载体融合后外侧脊柱(posterolateral vertebral)过程之后，通过在培养物中观察到的矿物质形成和用微型CT测量的骨形成，支持了增加的骨形成。外科手术模型引起包含丰富的白蛋白的损伤；这可以隔离纳洛酮和纳曲酮，从而支持这些OGFR拮抗剂延长的可用性。

在一方面，本发明提供一种用于促进骨形成和/或降低骨降解的方法。该方法包括向骨骼中受伤或者外科手术介入的局部部位施用一定量的OGFR拮抗剂。

如本文所用，“外科手术介入”包括修复骨折的外科手术程序，用于使脊椎骨融合(例如，脊柱融合)的外科手术程序，或者包括例如整合在全关节置换中的植入物、整合在骨折修复中使用的接骨螺钉、整合用于固定肌腱(anchor tendons)或韧带的接骨螺钉、或者整合任何为了机械地固定骨科外科手术部位而设计的骨科固定物的外科手术程序。

OGFR拮抗剂

“OGFR拮抗剂”意指任何抑制、阻止至少一种OGFR介导的生物活性，或者引起其中止的分子。

在一些实施方式中，OGFR拮抗剂是OGFR结合拮抗剂，即，干扰、阻断或者防止met5配体(OGF)与OGFR的相互作用或结合的分子。OGFR结合拮抗剂可以以两种方式起作用：第一，OGFR拮抗剂可以与met5配体竞争结合至细胞核膜表面上的OGFR，从而干扰、阻断或者防止met5配体与OGFR的结合，而不触发由met5配体与OGFR的结合诱发的下游信号传导。或者，OGFR结合拮抗剂可以以足够亲合力和特异性与PENK或者met5配体相结合或者使之分离，以大幅干扰、阻断或者防止met5配体与OGFR的结合，从而抑制、阻止至少一种OGFR介导的生物活性，或者引起其中止。总的来说，OGFR结合拮抗剂可以是大分子(例如抗体)或者小分子(例如分子量小于15kD、12kD、10kD或者甚至8kD的化合物)，并且可以为多肽、核酸或者合成小分子化合物。OGFR结合拮抗剂可以借助任何本领域技术人员容易选择的体外试验而确定。例如，OGFR拮抗剂可以用第5,882,944号美国专利、第6,007,986号美国专利或者第6,270,979号美国专利中所述的方法来确定。

在一个实施方式中，OGFR结合拮抗剂为纳洛酮或其功能性衍生物、纳曲酮或其功能性衍生物、或者它们的组合。

如本文所用的“功能性衍生物”是指与原始分子在结构上或功能上类似的衍生物或类似物(例如，保持纳曲酮或纳洛酮作为OGFR拮抗剂的功能)。纳洛酮和纳曲酮类似物可以使用如在March J.,Advanced Organic Chemistry,第三版.(1985)中所述的那些标准合成方法来合成。纳曲酮和纳洛酮功能性衍生物的实例包括盐形式，例如，纳洛酮盐酸盐二水合物或者纳曲酮盐酸盐。适于用在本方法中的纳曲酮和纳洛酮的功能性衍生物的其他实例包括：例如，在第2007/0197573A1号美国专利申请公开、第6,713,488号美国专利中公开的纳曲酮和纳洛酮的类似物。

在另一实施方式中，OGFR结合拮抗剂衍生自氧吗啡酮并与OGFR结合，其包括纳洛酮、纳曲酮、烯丙吗啡、纳洛肼、左洛啡烷、纳美芬、cyprodime、塞克罗酚、环佐辛、奥昔啡烷、LY113878、MR2266、二丙诺啡、WIN 44,441-3、纳曲吲哚或norbinaltorphimine。

仍在另一实施方式中，OGFR结合拮抗剂衍生自顺-3,4-二甲基-4-苯基哌啶并与OGFR结合，其包括：LY99335、LY25506、LY117413或LY255582。

在另一实施方式中，OGFR结合拮抗剂衍生自met5-脑啡肽或者亮氨酸-脑啡肽的肽，与OGFR结合，并且最低限度地包括以下氨基酸序列作为靶向OGFR的手段：对衍生自met5-脑啡肽的那些而言为Tyr-Gly-Gly-Phe-Met(SEQ ID NO:1)，或者对衍生自亮氨酸-脑啡肽的那些而言为Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu(SEQ ID NO:2)。

仍在另一实施方式中，OGFR结合拮抗剂衍生自肽拮抗剂ICI174864(N,N-二烯丙基-Tyr-Aib-Aib-Phe-Leu-OH,SEQ ID NO:3；Aib＝氨基异丁基酸)或者生长激素抑制素类似物CTP(D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-NH₂，SEQ ID NO:4)。

在其他实施方式中，作为对OGFR结合拮抗剂的替代，OGFR拮抗剂是一种扰乱在OGFR：251QSALDYFMFAVRCRHQRRQLVHFAWEHFRPRCKFVWGPQDKLRRFKPSSL(SEQ ID NO:5)中发现的核定位序列的分子。

仍在其他实施方式中，本方法中采用的OGFR拮抗剂是直接针对OGFR基因并有效扰乱OGFR基因表达的小-发夹(sh)-RNA或者小-干扰(si)-RNA。

本文所述的OGFR拮抗剂可以单独或以组合的方式进行施用。合适的组合包括，例如，纳洛酮和纳曲酮；纳洛酮和/或纳曲酮与另一OGFR结合拮抗剂或另一OGFR拮抗剂联合。

OGFR拮抗剂与其他活性剂的联合

本文所述的OGFR拮抗剂可以与一种或多种通过SMAD信号传导来促进骨形成或生长并且可以与OGFR拮抗剂协同增效的其它活性剂联合施用。这样的活性剂的实例包括但不限于，BMP分子(例如，BMP-2、BMP-4、BMP6和BMP-7)，其可以调节SMAD1/5/8信号传导。然后可以通过OGFR拮抗剂调节可以扩增MSC库的TGFβ分子。包括LY2109761并降低了TGFβ信号传导的TGFβ抑制剂，降低了抑制剂SMAD(SMAD6和SMAD7)的信号传导，然后与BMP信号传导拮抗并减少骨形成。例如，可以用期望的BMP分子、TGFβ分子或TGFβ抑制剂分子以及在本方法中使用的OGFR拮抗剂来灌注胶原植入物。

本文所述的OGFR可以与一种或多种促进骨形成或生长的其他活性剂联合施用。这样的活性剂的实例包括但不限于，一种或多种生长因子，如EGF、VEGF、PDGF、IGF、FGF、TGFα和细胞因子；细胞，如间充质干细胞、软骨细胞和骨髓细胞。例如，可以用期望的生长因子，如VEGF分子和本方法中使用的OGFR拮抗剂来灌注胶原植入物。OGFR拮抗剂还可以在治疗癌症患者中与化学治疗剂联合施用，以促进患者中的骨形成或者生长。

递送系统/载体

可以在具有或不具有载体的情况下局部施用本文所述的OGFR拮抗剂，以加速骨折修复或促进脊椎骨融合。在一些实施方式中，OGFR拮抗剂与载体联合或者密封在载体中以施用。

合适的载体可以为球状、微球或者纳米颗粒的形式，并且可以由天然和/或合成的生物相容性聚合物制得。合适的生物相容性聚合物的实例包括透明质酸、胶原、磷酸三钙、硫酸软骨素、聚丁酸盐、聚丙交酯、聚乙交酯和丙交酯/乙交酯共聚物，及其混合物或共聚物。合适的载体还包括非聚合物体系，如羧酸、脂肪酸、磷脂、氨基酸、如甾醇的脂类，水凝胶释放体系；硅橡胶体系；基于肽的体系；植入物等。

在一个实施方式中，载体为基于吸湿性胶原的载体(例如，胶原海绵、胶原支架、粉末状胶原、或者基于胶原的明胶水凝胶)。

在另一实施方式中，载体为基于亲水性水凝胶的载体(例如，聚丙交酯、聚乙交酯)，其允许OGFR拮抗剂(例如，纳洛酮或纳曲酮或其功能性衍生物)灌注至其中，以在一段时间内释放。

仍在另一实施方式中，载体为白蛋白、白蛋白的衍生物或片段，其保持了位于IA和IIA结构域之间界面处的纳洛酮/吗啡结合位点，和/或保持了围绕色氨酸(Trp)-214的纳洛酮结合位点，其与OGFR拮抗剂如纳洛酮或纳曲酮或其功能性衍生物结合并允许OGFR拮抗剂的缓释。

仍在另一实施方式中，例如甲基纤维素和插入凝胶，与如纳洛酮或纳曲酮或者其功能性衍生物在内的OGFR拮抗剂结合，并且允许OGFR拮抗剂的缓释。

在进一步的实施方式中，载体为牛胶原植入物。OGFR拮抗剂，例如纳洛酮或纳曲酮或者其功能性衍生物可以与牛胶原植入物，以与INFUSE(BMP2)或OP1-油灰或OP1-植入物相同的方式联合，这提供了牛胶原海绵、粉末状牛胶原、或者基于胶原的明胶构建物。纳洛酮、纳曲酮或其功能性衍生物的施用可以通过，例如以无菌盐水重组粉末状纳洛酮或纳曲酮或者其功能性衍生物、然后将OGFR拮抗剂-盐水溶液加入到胶原植入物中来实现；在此之后，将植入物局部递送至外科手术介入部位。

仍在另一实施方式中，载体为外科手术植入物，或者选自例如笼、螺钉、杆、板、可膨胀笼、锚(基于金属的、合成或生物降解的锚)的外科手术植入物递送系统。

在进一步的实施方式中，载体由片状或粉末状形式的β-磷酸三钙、黏固剂(聚甲基丙烯酸甲酯或“PMMA”)、或者例如油灰、糊剂、舟皿(boats)或注射配方形式的脱钙骨基质支架组成。

在另一实施方式中，载体为由PGA(聚乙交酯)-PLGA(聚丙交酯聚乙交酯共聚物)球构成的载体，其可以将OGFR拮抗剂密封，以提供即时的、延迟的或者持续的释放。

在另一实施方式中，载体为同种异体移植，例如皮质网状骨质(corticocancellous)同种异体移植、皮质片和结构性同种异体移植。

在另一方面，本公开提供一种用于促进间充质干细胞(MSC)募集至骨骼中受伤或外科手术介入的局部部位，以促进愈合同时抑制破骨细胞驱动的骨降解(或者再吸收)的方法。该方法基于施用一定量的本文所述的OGFR拮抗剂(例如，纳洛酮或纳曲酮或者其功能性衍生物)以在抑制骨降解的同时促进骨形成。

仍在另一方面，本公开基于施用本文所述的OGFR拮抗剂(例如，纳洛酮或纳曲酮或者其功能性衍生物)而提供一种治疗骨坏死或者放射性骨坏死的方法。

在一些实施方式中，本公开提供合适的剂量范围，通过其将纳洛酮(400ng/mL(1μM)至400μg/mL(1mM))和/或纳曲酮(378ng/mL(1μM)至378μg/mL(1mM))以1μM至1mM之间的剂量范围进行施用，这对通过减少破骨细胞形成而增加骨形成和/或降低骨降解是有效的。纳洛酮的具体剂量可以为，例如400ng/mL、800ng/mL、1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、400μg/mL，或者在任意所列剂量之间的量，只要这些剂量在1μM至1mM之间的范围内。这些剂量可以以单次给药或者多次给药进行递送。有效且精确的纳洛酮的总量将取决于受伤的程度或外科手术应用以及要使用的载体。例如，对于每个尺寸为2cm x 2cm x 0.25cm或者具有1cm³的纳洛酮或其功能性衍生物的胶原植入物(例如，灌注有1mM纳洛酮-盐水溶液的胶原)，推荐400μg/mL纳洛酮-盐水溶液或者任何等价剂量，即等同于400μg/cm³的纳洛酮-盐水溶液，其可以施用至受伤或局部外科手术部位，引起外科手术区域内大量的骨形成和对破骨细胞数量的抑制。具体的纳曲酮剂量可以为，例如，378ng/mL、756ng/mL、1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、378μg/mL、或者在任意所列剂量之间的量。有效且精确的纳曲酮的总量将取决于受伤的程度或外科手术应用以及要使用的载体。例如，对于每个尺寸为2cm x2cm x 0.25cm或者具有1cm³的纳曲酮或其功能性衍生物的胶原植入物(例如，灌注有1mM纳曲酮-盐水溶液的胶原)，需要378μg/mL的纳曲酮-盐水溶液或者任何等价剂量，即等同于378μg/cm³的纳曲酮-盐水溶液，其可以施用至受伤或局部外科手术部位，引起外科手术区域内大量的骨形成和对破骨细胞数量的抑制。

本说明书进一步通过以下实施例进行说明，其不应被解释为以任何方式进行限制。所有引用文献的内容(包括本申请通篇所引用的参考文献、发行的专利和公开的专利申请)在此清楚地引入以供参考。

实施例

实施例1.阿片样拮抗剂调节骨形成和再吸收

方法：从同意的成年患者(n＝6，平均年龄65)中收集人骨髓作为IRB规定的研究的一部分，所述患者经历了选择性原发股骨近端全髋关节置换术或者选择性原发股骨远端全膝关节置换术。人MSC衍生自衍生自每个收集的全骨髓抽吸物的细胞贴壁部分，而单核细胞群体从骨髓的非贴壁部分进行收集。单核细胞部分通过用100ng/mL人重组巨噬细胞集落刺激因子(MCSF；Wyeth)进行亚培养进行富集。在下面所述的平行实验中，从3星期(n＝10)和16星期(n＝20)龄的雄性小鼠中收集股骨，然后根据以下方法将骨髓从股骨中冲洗出来：在除去股骨的近端和远端之后，将21号针头插进股骨髓内管。然后将培养基小心地穿过股骨的近端，这迫使骨髓从骨中脱出。最终，用18号针头将骨髓颗粒机械地分离，然后穿过70μm的网式滤器。这些全骨髓抽吸物用于形成破骨细胞。将细胞保持在包含10％(v/v)的胎牛血清及1％的青霉素-链霉素-谷氨酰胺的杜尔伯科改良伊格尔培养物(DMEM)(PSG；Cellgro，Mediatech)中。重组人神经生长因子配体(NTN1和NTN4)在PBS(R&D System)中进行稀释。对此负责的IACUC委员会批准了本研究中描述的所有动物实验。

基因表达分析：检定了源自人骨髓的MSC、成骨细胞和脂肪细胞的基因表达中的改变。同时，检定了源自人单核细胞的破骨细胞的髓系细胞基因表达中的改变。基因数据来源于从至少三位患者中收集的两个独立形成的样本。用RNeasy Plus微型柱(Qiagen)来纯化mRNA，并用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)来合成cDNA。用定量PCR(qPCR)使用100ng用Fast Plus EvaGreen Master Mix(Biotium)混合的cDNA来分析基因表达。在每个GAPDH用作对照的实验中，阴性对照不包含模板，并且用GAPDH的化学合成序列的连续稀释(0、1、10和100毫微微克；Integrated DNA Technologies)产生标准曲线。用Pfaffl氏法对基因表达进行评估，其中用软件LinRegPCR(v2013.0)从荧光跨阈值曲线的线性区域来计算每个引物的效率(E)和初始基因产物浓度(N₀)。当对照基因GAPDH落入标准曲线且引物效率(E)经计算为E>＝1.8时，实验被认为是有效的。单一基因产物的存在用溶解曲线分析来证实，且产物大小使用基因产物凝胶电泳来证实。

通过蛋白质印迹分析的蛋白质表达：用含有2mM碘乙酰胺、2mM苯甲脒盐酸盐、0.1mM乙基马来酰亚胺、1％PMSF和Halt蛋白酶抑制剂混合物(Pierce Thermo Scientific)的冰RIPA缓冲液(Pierce Thermo Scientific)来溶解人MSC、成骨细胞和破骨细胞。从由三个患者样本形成的至少两个副本来分析蛋白质裂解物。用BCA蛋白测定试剂盒(Thermo)根据制造商的说明来检定总的蛋白质。将样品上样(20μg/孔)在具有Page Ruler预染色近红外蛋白梯(Page Ruler Pre-stained NIR Protein Ladder)(Bio-Rad)的10-20％的Mini-Protean Tris-Tricine预制胶(Bio-Rad)上，并且转移至硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上。在用具有OGFR第一抗体(Santa Cruz Biotechnologies)的5％的脱脂牛奶阻断的膜上鉴定OGFR。肌动蛋白(1:500)和δ-微管蛋白用作负载对照。用HRP共轭的微聚合物共轭的第二抗体(ImmPress试剂盒，Vector Labs)与Clarity Western ECL底物(Bio-Rad)共同来检测抗体。大鼠脑蛋白裂解物(mB)被用作阳性表达对照。

骨形成：MSC中的骨形成潜能通过化学诱导的矿物质形成来检定。将来自至少三位人类患者的MSC以每孔5x10³个细胞进行接种，并且在加入骨诱导培养基之前允许变成融合和交织。诱导培养物由DMEM构成，所述DMEM包含20％的FCS(v/v)和1％的PSG，补充有25μg/mL的抗坏血酸-2-磷酸盐(Sigma)、100nM地塞米松(Sigma)和如下剂量方案的β-甘油磷酸酯(BGP；Sigma)：用5mM BGP改变1倍培养基、用10mM BGP改变1倍培养基以及用20mM BGP改变1倍培养基。met5配体(0、[5μM]2.87μg，或[50μM]28.7μg；Sigma)、纳洛酮(0、400fg、400pg、400ng、400μg；Sigma)或者纳曲酮(0、378fg、378pg、378ng、378μg；Sigma)以如下方式加入：1)1倍，第一次加入骨诱导培养基，2)2倍，第一次和第二次加入骨诱导培养基以及3)具有每种后诱导培养基改变。借助第一次加入诱导培养物，阳性对照孔以25ng的人重组BMP2/BMP7配体(R&D System)进行处理。在矿物质结节出现之后，将细胞用70％的冰EtOH(Sigma)进行固定，然后用40mM茜素红-S(pH 4.2，Sigma)进行染色。对每个病人至少重复两次骨形成实验。

细胞数量检定：在加入1mM纳洛酮或1mM纳曲酮之后，借助MTT试验测定活细胞的数量。在72小时和120小时之后，向每个孔中加入MTT(5mg/ml(w/v)，Sigma)，孵育2小时，在此之后用500μL的DMSO(Sigma)将细胞裂解。在570nm下测量MTT，并通过使处理过的孔相对于来自未处理的孔的平均值标准化来确定疗法对细胞增殖的效果：细胞数量变化倍数＝100*[处理的细胞光学密度/对照平均光学密度]。

TRAP染色和破骨细胞数量检定：破骨细胞源自富集的人单核细胞群体或者未富集的小鼠全骨髓抽吸物。三位人类患者的骨髓样本与从3星期龄的小鼠(n＝10)骨髓收集的样本平行地进行检定。在met5配体([5μM]2.87μg，或者[50μM]28.7μg；Sigma)、纳洛酮(400ng或400μg；Sigma)或纳曲酮(378ng或378μg；Sigma)的存在下，通过借助25ng/mL MCSF和25ng/mL的人重组或小鼠RANK配体(R&DSystem)来培养1x10⁶的细胞，单核细胞部分被刺激成为破骨细胞。用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP；Sigma Leukocyte Acid Phosphatase Kit387-A)对破骨细胞进行染色并且在染色细胞TRAP阳性且具有至少三个细胞核时进行计数。通过Cavalieri抽样和改良分流技术来获得对破骨细胞数量的估算。

OGF受体的shRNA敲除：通过用可商购的再生蛋白shRNA-慢病毒转染MSC来抑制OGF受体的活性，或者以GFP慢病毒(Santa Cruz Biotechnologies)转染MSC作为对照。然后将MSC诱导变成成骨细胞，随后检定BMP-靶向基因(ID1、ID2、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5、SMAD6、SMAD7、SMAD8/9以及骨钙素(OCN))。

单皮质缺损模型：在建立单皮质缺损之后，用met5、纳洛酮或纳曲酮对雄性3星期龄的C57BL/6小鼠(每个治疗组n＝5)进行注射。简言之，在膝关节下方一点进行小的切口(大约3mm)，刚好位于胫骨前嵴上的胫骨粗隆下方的胫骨内侧。在年幼的动物中生长板清晰可见，并且将钻头置于该点下方大约1mm处。钻头产生了尺寸为300μm(直径)x 1mm(深度)的单皮质缺损。用具有33号钝针头的Hamilton Neuros RN 10μL注射器以不高于大约每秒0.1μL的速率将重悬浮于盐水中的2μL的met5(28.7μg)、纳洛酮(400μg)或纳曲酮(378μg)直接注射进入单皮质缺损中。左下肢胫骨用作反侧外科手术对照，其中动物接受单皮质缺损并且注射2μL盐水。外科手术5天之后将小鼠安乐死，收集后肢并且将胫骨固定用于免疫荧光、TRAP染色和OTC相关的骨生长。

将包含阿片样拮抗剂的胶原植入物植入单皮质缺损模型中：在本研究中使用的是雄性5星期龄的C57BL/6小鼠(对总计25只动物而言每个治疗组n＝5)。治疗组由以下组成：1)PBS+胶原海绵；2)met5+胶原海绵；3)BMP2+胶原海绵；4)纳曲酮+胶原海绵；5)纳洛酮+胶原海绵。通过在膝关节下方一点进行小的切口(大约3mm)，其刚好位于胫骨前嵴上的胫骨粗隆下方的胫骨内侧，对单皮质缺损进行外科手术施用。在5星期龄的雄性小鼠中生长板清晰可见，并且将钻头置于该点下方大约1mm处。钻头产生了尺寸为300μm(直径)x 1mm(深度)的单皮质缺损。制备牛胶原海绵植入物(Duraform)(大约1mm x 1mm)，然后浸入PBS、50μM(10μL中为28.7μg)的met-5脑啡肽(met5)、25ng BMP2、1mM纳曲酮(10μL中为378μg)或1mM纳洛酮(10μL中为400μg)(总计25只动物，每组n＝5)。向一组单独的未接受胶原海绵植入物的小鼠(n＝5；对皮质缺损的外科手术对照)施用单皮质缺损。同时，将一组单独的动物用作非外科手术对照。外科手术后7天将小鼠安乐死，收集后肢并且制备股骨用于微型CT(μCT)分析。

大鼠L5-L6椎骨的脊柱后外侧融合：20只雄性、1月龄的骨骼成熟的Sprague-Dawley大鼠在L5-L6椎骨处经历双侧腰椎后外侧脊柱融合术。治疗组由以下组成：1)假外科手术对照；2)胶原海绵植入物；3)BMP2+胶原海绵植入物；4)纳洛酮+胶原海绵植入物。在无菌条件下在L5-L6椎骨处中央形成2cm长的后部正中切口。在小平面关节侧面采用肌肉分离法，以暴露特定脊椎的横突。用高速1mm磨石剥离L5-L6椎骨的横突。制备植入物并将其植入椎旁肌层两侧的横突之间。制备牛胶原海绵植入物(大约1cm x 1cm)，然后浸入PBS、25ngBMP2、1mM纳洛酮(10μL中为400μg)中。2个月后将动物安乐死(对总计n＝20只大鼠，每个治疗组每个时间点大鼠为n＝5)，收集并准备脊椎用于微型CT(μCT)分析。

单皮质缺损的微型CT分析：用μCT图像系统(μCT40；Scanco Medical)获得股骨高分辨率图像。在45keV下以12μm的各向同性体素尺寸对股骨进行扫描。从轴向截面选择分析区域，以包括由骨内膜皮质壁划界的整个单皮质缺损。用Scanco软件来计算体积校正骨体积(骨体积/总体积；Bv/Tv)、骨小梁数量(TbN)和骨小梁厚度(TbTh)。

统计分析：用Prism统计软件(Graphpad)来分析数据。计算平均值和标准偏差。使用用于多重比较的Holm-Sidak事后(post-hoc)校正，通过单因素方差(one-way ANOVA)分析数据，将显著性设置为p<0.05。

结果：

纳洛酮和纳曲酮增加MSC向成骨细胞的分化和矿物质形成，同时减少破骨细胞的 数量：加入1μm和1mM之间的纳洛酮与骨诱导培养基大大增加了要诱导变成成骨细胞的MSC培养物中的矿物质富集(红色染色)(图1A)。加入1μm和1mM之间的纳曲酮与骨诱导培养基也使矿物质增加，但是比纳洛酮程度小(图1A)。δ阿片样受体(OPRD)基因表达在MSC中最多，在成骨细胞(p<0.0074)和破骨细胞(p<0.0084)中显著降低(图1B)。相对于MSC培养物，在成骨细胞(p<0.011)中和在破骨细胞(p<0.0001)中OGFR的基因表达增加(图1C)。在MSC和成骨细胞之间met5(PENK)基因表达没有差别；然而，在破骨细胞中PENK基因表达显著降低(p<0.0018)(图1D)。向骨诱导培养基中加入5μM met5(PENK)对矿物质富集没有影响，但是50μM的met5使矿物质富集略微降低(图1E)。然而，当将1mM纳洛酮与5μM或50μM met5以及骨诱导培养基加入时，纳洛酮治疗能够消除met5的抗骨形成作用(图1E)。从未观察到μ-阿片样受体、κ-阿片样受体、met5前体POMC和CPA1酶基因表达。在MSC、成骨细胞和破骨细胞中观察到了PCSK1、PCSK2、CPD和CPE基因表达，但是彼此没有明显的差别。在第一次“脉冲”剂量72小时之后加入单一、“脉冲”剂量的纳洛酮(1mM)或者双倍、“脉冲”剂量的纳洛酮(1mM)，引起了矿物质富集的大大增加，同时连续的纳洛酮剂量(例如，随着每种培养基的改变)轻微下降(图1F)。此外，我们发现，在72小时(p<0.0177)和120小时(p<0.0001)处加入1mM的纳洛酮抑制了MSC增殖，但是并未使其停止(图1G)。纳曲酮类似地降低了单核细胞培养物中的增殖(p<0.0001)(图1H)。与对照的破骨细胞培养物相比，要培养成为破骨细胞的单核细胞不受met5治疗的影响(TRAP染色为紫色)(图1I)。加入1μM纳洛酮或者1μM纳曲酮并没有显著减少破骨细胞数量，而加入1mM纳洛酮或者1mM纳曲酮大幅减少破骨细胞的数量。

OGFR表达的缺失导致骨形成转录调节子的表达的增加，同时骨钙素的表达增加。以OGFR shRNA转染的MSC显示出明显降低的OGFR基因表达(p<0.0085)(图2A)，这在核和胞质蛋白裂解物中的OGFR降低中得到了证实(图2B)。此外，在OGFR缺陷型MSC中，SMAD1基因表达明显高于在对照MSC中和在GFP转染的对照培养物中的表达(p<0.0008)(图2C)。与对照MSC和GFP转染的对照培养物相比，在OGFR缺陷型MSC中ID1基因表达也增加(p<0.0217)(图2D)。相对于对照培养物和GFP转染的对照，成骨细胞特异性蛋白骨钙素(OCN)在要诱导成为成骨细胞的OGFR缺陷型MSC中也显著增加(p<0.0215)(图2E)。

用纳洛酮或纳曲酮的治疗在动物模型的外科手术缺损中增加了骨形成。向小鼠股骨以外科手术施用单皮质缺损，然后用纳洛酮(1mM)或met5(50μM)进行治疗。纳洛酮增加了骨愈合，而met5没有效果(图3A和3B)。纳洛酮治疗使骨量(Bv/Tv)增加了1.53倍(p<0.001)(图3A)。我们测量到的升高的骨量是由增加1.2倍的骨小梁数量(TbN)驱动的(p<0.047)(图3C)。在外科手术施用7天之后，与非外科手术对照组相比，在外科手术对照组(Sx对照)中，如通过Bv/Tv测量的单皮质缺损的骨折愈合提高了25.6％(p<0.034)(图3D)。就骨折愈合而言，用PBS或met5与胶原植入物联合治疗的缺损与外科手术对照组没有显著的差别。然而，与胶原植入物偶联的PBS或met5治疗比非外科手术对照组高大约37％，这与在外科手术对照和非外科手术对照组之间观察到的差别是一致的(p<0.003)(图3D)。用BMP2和胶原植入物治疗缺损相对于PBS治疗组得到了32.4％的Bv/Tv增加，相对于外科手术对照组得到了55.6％的Bv/Tv增加(分别为p<0.0124和p<0.005)(图3D)。在BMP2治疗组和纳曲酮治疗组之间没有明显的差别。用纳曲酮和胶原植入物治疗的缺损相对于PBS治疗组使Bv/Tv增加了39.2％，相对于外科手术对照组使Bv/Tv增加了63.5％(分别为p<0.0043和p<0.0001)(图3D)。最后，用纳洛酮和胶原植入物治疗的缺损相对于PBS治疗的缺损使Bv/Tv增加了56.5％，相对于外科手术对照组使Bv/Tv增加了83.8％(p<0.0001)(图3D)。进而，相对于BMP2治疗组，纳洛酮治疗使缺损中的Bv/Tv增加了18.2％(p<0.035)(图3D)。骨小梁厚度是与Bv/Tv相关的结构参数，其在目标领域中涉及骨量。与对照的非外科手术组相比，在外科手术对照组(p<0.032)、met5(p<0.039)、BMP2(p<0.025)、纳曲酮(p<0.025)以及纳洛酮(p<0.001)组中缺损中骨小梁厚度显著增加(图3E)。相对于所有其他治疗组，用纳洛酮治疗缺损使骨小梁厚度增加了大约37％(p<0.001)(图3E)。此外，借助纳洛酮治疗缺损观察到的Bv/Tv中的增加似乎主要通过增加的骨小梁厚度驱动，而用BMP2或纳曲酮的治疗既通过骨小梁数量也通过骨小梁厚度增加了Bv/Tv。将纳洛酮灌注的胶原植入物加入至腰椎后外侧，相对于用胶原植入的脊椎或对照假外科手术组，得到了Bv/Tv的大大增加(图3F和3G)。

实施例2.尽管OGFR基因在肉瘤细胞中表达，但是OGFR拮抗剂不刺激肉瘤的肿瘤增殖

方法：从同意的成人患者中收集人骨髓作为IRB证明研究的一部分，所述患者经历了选择性原发股骨近端全髋关节置换术或者选择性原发股骨远端人工全膝关节置换术(n＝6，平均年龄65)。人MSC来自全骨髓抽吸物的贴壁部分。从ATCC获得尤因肉瘤肿瘤细胞(RDES、Hs822和Hs863)以及SaOS2骨肉瘤肿瘤细胞。细胞保持在含有10％的胎牛血清(v/v)和1％的青霉素-链霉素-谷氨酰胺的杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)中(PSG；Cellgro，Mediatech)。

基因表达分析：对源自人骨髓的MSC、成骨细胞和脂肪细胞在基因表达中的变化进行了检定。同时，还对源自人单核细胞的破骨细胞在髓样基因表达中的变化进行了检定。基因数据源自从至少三位患者中收集的两个独立形成的样本。用RNeasy Plus微型柱(Qiagen)来纯化mRNA，并用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)来合成cDNA。用定量PCR(qPCR)使用100ng用Fast Plus EvaGreen Master Mix(Biotium)混合的cDNA来分析基因表达。在每个GAPDH用作对照的实验中，阴性对照不包含模板，并且用GAPDH的化学合成序列的连续稀释(0、1、10和100毫微微克；Integrated DNA Technologies)产生标准曲线。用Pfaffl氏法对基因表达进行评估，其中用软件LinRegPCR(v2013.0)从荧光跨阈值曲线的线性区域来计算每个引物的效率(E)和初始基因产物浓度(N₀)。当对照基因GAPDH落入标准曲线且引物效率(E)经计算为E>＝1.8时，实验被认为是有效的。单一基因产物的存在用溶解曲线分析来证实，且产物大小使用基因产物凝胶电泳来证实。

细胞数量检定：在加入1mM纳洛酮或1mM纳曲酮之后，借助MTT试验测定活细胞的数量。在72小时和120小时之后，向每个孔中加入MTT(5mg/ml(w/v)，Sigma)，孵育2小时，在此之后用500μL的DMSO(Sigma)将细胞裂解。在570nm下测量MTT，并通过使处理过的孔相对于来自未处理的孔的平均值标准化来确定疗法对细胞增殖的效果：细胞数量变化倍数＝100*[处理的细胞光学密度/对照平均光学密度]。

统计分析：用Prism统计软件(Graphpad)来分析数据。计算平均值和标准偏差。使用用于多重比较的Holm-Sidak事后(post-hoc)校正，通过单因素方差(1-way ANOVA)或双因素方差(2-way ANOVA)对数据进行分析，将显著性设置为p<0.05。

结果：

骨肉瘤和尤因肉瘤肿瘤表达OGFR以及纳洛酮和纳曲酮抑制肿瘤增殖：在成骨细胞(p<0.018)、RDES尤因肉瘤的骨肿瘤细胞(p<0.0014)、Hs822t尤因肉瘤的骨肿瘤细胞(p<0.0001)、Hs863t尤因肉瘤的骨肿瘤细胞(p<0.039)和SaOS2骨肉瘤肿瘤细胞(p<0.05)中观察到OGFR基因表达(图4A)。在加入1mM纳洛酮或1mM纳曲酮72小时之后，与对照培养物相比，SaOS2骨肉瘤细胞数量显著减少(p<0.0001)。作为OGFR配体的met5对细胞数量没有影响(图4B)。Hs822t尤因肉瘤的骨肿瘤细胞系在培养基中贴壁。在加入1mM剂量的纳曲酮72小时之后，与对照培养物相比，Hs822t尤因肉瘤的骨肿瘤细胞数量减少(p<0.0025)。纳洛酮对Hs822t尤因肿瘤细胞数量没有影响。相反，加入50μM的met5引起了Hs822t肿瘤细胞数量的显著增加(p<0.03)(图4C)。RDES尤因肉瘤的骨肿瘤细胞松散地在培养基中贴壁。在加入剂量为1mM的纳洛酮或1mM纳曲酮72小时之后，与对照培养物相比，RDES尤因肉瘤的骨肿瘤细胞数量显著减少(p<0.0005)。加入met5对RDES肿瘤细胞数量没有影响(图4D)。

实施例1和2结果的总结

纳洛酮和纳曲酮通过减少破骨细胞的数量增加骨形成并降低骨再吸收(损坏)。

纳洛酮或纳曲酮灌注的胶原植入物在单皮质缺损或腰椎融合骨中增加骨形成。

尽管存在OGFR，但是纳洛酮或纳曲酮没有增加肉瘤肿瘤细胞的增殖。

序列表

<110> THAKUR, Nikhil A.

MARGULIES, Bryan S.

<120> 促进骨形成的组合物和方法

<130> 30878

<150> 62/005,359

<151> 2014-05-30

<160> 5

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 1

Tyr Gly Gly Phe Met

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 2

Tyr Gly Gly Phe Leu

1 5

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa 是 N, N-二烯丙基-酪氨酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (3)..(4)

<223> Xaa 是 Aib (氨基异丁基酸)

<220>

<221> L

<222> (6)..(6)

<223> Leu 是 Leu-OH

<400> 3

Xaa Tyr Xaa Xaa Phe Leu

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> F

<222> (1)..(1)

<223> 1位的 Phe 是 D-Phe

<220>

<221> MISC_特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa 是 Pen (青霉胺)

<220>

<221> T

<222> (8)..(8)

<223> Thr 是 Thr-NH2

<400> 4

Phe Cys Tyr Trp Lys Thr Xaa Thr

1 5

<210> 5

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 5

Gln Ser Ala Leu Asp Tyr Phe Met Phe Ala Val Arg Cys Arg His Gln

1 5 10 15

Arg Arg Gln Leu Val His Phe Ala Trp Glu His Phe Arg Pro Arg Cys

20 25 30

Lys Phe Val Trp Gly Pro Gln Asp Lys Leu Arg Arg Phe Lys Pro Ser

35 40 45

Ser Leu

50

Claims (15)

1.一种用于在受伤的部位或者外科手术介入的部位促进骨形成或者减少骨损坏的方法，所述方法包括施用有效量的促进骨形成或者减少骨损坏的OGFR拮抗剂。

2.一种用于促进间充质干细胞(MSC)募集至骨中受伤或者外科手术介入的局部部位以促进愈合的方法，所述方法包括施用有效量的促进骨形成同时抑制骨降解的OGFR拮抗剂。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述OGFR拮抗剂为纳洛酮、纳曲酮、其功能性衍生物、或者其组合。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述OGFR拮抗剂为抑制OGFR表达的siRNA或shRNA。

5.如权利要求3所述的方法，其中将纳洛酮、纳曲酮、其功能性衍生物、或者其组合局部施用于所述受伤的部位或外科手术介入的部位。

6.如权利要求5所述的方法，其中将纳洛酮、纳曲酮、其功能性衍生物、或者其组合与载体进行施用。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述载体为胶原海绵、粉末状胶原或胶原基明胶水凝胶形式的胶原基载体。

8.如权利要求6所述的方法，其中所述载体为白蛋白基载体。

9.如权利要求6所述的方法，其中所述载体为亲水性水凝胶基载体。

10.如权利要求6所述的方法，其中所述载体为外科手术植入物或者外科手术植入物递送系统。

11.如权利要求6所述的方法，其中所述载体由β-磷酸三钙、黏固剂、或者脱钙骨基质组成。

12.如权利要求6所述的方法，其中所述载体由PGA/PLGA球组成。

13.如权利要求5所述的方法，其中将纳洛酮、纳曲酮、其功能性衍生物、或者其组合与至少一种其他的促进骨形成或生长的活性剂联合施用。

14.如权利要求1或2所述的方法，其中所述受伤包括骨折。

15.如权利要求1或2所述的方法，其中所述外科手术介入选自骨折的外科手术修复、在脊柱融合中产生骨的外科手术程序、和促进矫形植入物或固定物与相邻骨的整合的外科手术程序。