ES2881626T3 - Composiciones y procedimientos para favorecer la formación ósea - Google Patents

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Abstract

Antagonista del receptor del factor de crecimiento opioide (OGFR) para su uso en un procedimiento para favorecer la formación ósea o reducir la destrucción ósea en un sitio de lesión o de intervención quirúrgica, donde el antagonista del OGFR es un derivado de oximorfona que se selecciona del grupo que consiste en naloxona, naltrexona, una sal de las mismas, o una combinación de las mismas; nalorfina, naloxonazina, levalorfano, nalmefeno, ciprodima, ciclorfano, ciclazocina, oxilorfano, LY113878, MR2266, diprenorfina, WIN 44,441-3, naltindole y norbinaltorfimina y, además, donde el antagonista del OGFR se administra de forma local al sitio de la lesión o de la intervención quirúrgica.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y procedimientos para favorecer la formación ósea
Antecedentes
La formación y degradación ósea están estrechamente reguladas por la señalización del factor de crecimiento entre los osteoblastos responsables de la formación ósea y los osteoclastos responsables de la reabsorción ósea. El acoplamiento de la formación ósea por parte de los osteoblastos a la degradación por parte de los osteoclastos se ha convertido recientemente en un tema de intenso estudio y la lista de factores de crecimiento identificados como factores de acoplamiento continúa ampliándose. El acoplamiento de la formación ósea a la reabsorción ósea requiere el reclutamiento de osteoblastos y osteoclastos en paralelo con el reclutamiento de sus respectivas células progenitoras. Los osteoblastos se derivan de las células madre mesenquimales (MSC), mientras que los osteoclastos se derivan de los monocitos que forman parte del linaje mieloide. Sin embargo, aún se desconoce cómo las MSC o los monocitos migran desde su nicho en la médula ósea a los sitios de formación de hueso nuevo. La comprensión actual de la regulación espacial y temporal de la osteogénesis sugiere que las MSC migran desde su nicho en la médula ósea a la superficie endóstica, donde las MSC se diferencian en osteoblastos que producen hueso nuevo. Al mismo tiempo, los monocitos también migran desde su nicho en la médula ósea a la superficie endóstica, donde posteriormente se diferencian en osteoclastos que reabsorben hueso. Entre los factores de crecimiento que se sabe que regulan la formación ósea se encuentran los ligandos TGFp, BMP y Wnt canónicos. La formación de osteoclastos a partir de precursores de monocitos y la reabsorción ósea se regulan a través de la expresión de MSCF, OPG y el ligando RANK. En paralelo, la actividad de los osteoclastos también está regulada por la expresión de los ligandos TGFp, BMP y Wnt no canónicos. Sin embargo, muchos factores de crecimiento del desarrollo implicados en la formación de tejidos (patterning), incluyendo los ligandos TGFp, BMP y Wnt, favorecen la formación y la reabsorción ósea. El mantenimiento de un hueso sano requiere una remodelación constante, en la que el hueso se crea y destruye continuamente.
La introducción de un implante en el hueso provoca una cascada bioquímica que desencadena una respuesta proinflamatoria mediada, en parte, por la actividad de los macrófagos, que se derivan del linaje mieloide y pueden contribuir a la degradación del hueso o del material del implante. En la actualidad, los implantes y los materiales de los implantes se seleccionan para minimizar la respuesta de los macrófagos y, al mismo tiempo, ser óptimamente osteoconductores y favorecer la máxima integración hueso-implante. De manera alternativa, se ha empleado la introducción de autoinjertos con un implante o el uso de injertos de tejido óseo desvitalizado (autoinjertos) junto con las propiedades del material de un implante como medio para aumentar la osteointegración. Sin embargo, estos enfoques a menudo han resultado problemáticos. Lo ideal sería que los materiales se diseñaran para ser autoorganizados y autoensamblables.
La generación de hueso como enfoque terapéutico adyuvante empleado durante los procedimientos de traumatismo ortopédico o durante los procedimientos rutinarios de fusión espinal representa un desafío constante en la cirugía ortopédica. En particular, estas terapias osteogénicas adyuvantes buscan aumentar el crecimiento de hueso sano en el sitio de la intervención quirúrgica, en paralelo a la reducción del tiempo de consolidación del hueso. En las últimas décadas se han llevado a cabo varios intentos de utilizar una variedad de factores de crecimiento con potencial osteogénico, entre ellos, las proteínas morfogenéticas óseas (BMP). Lamentablemente, las terapias basadas en BMP destinadas a la osteogénesis también conllevan un riesgo de tumorigénesis en los pacientes, especialmente en aquellos que pueden haber recibido radioterapia o que tienen tumores incipientes no detectados. Además, las terapias basadas en BMP no pueden utilizarse en pacientes con tumores activos, lo que resulta especialmente desventajoso, ya que estos pacientes podrían beneficiarse enormemente de las terapias para aumentar la formación ósea durante la intervención quirúrgica.
La consolidación de fractura ósea alterada continúa presentando un reto importante en la cirugía ortopédica y la consolidación ósea. Se han notificado tasas de no consolidación de fracturas de hasta un 5-20 %. La morbilidad y los costes asociados con el tratamiento de pacientes que desarrollan pseudoartrosis pueden ser considerables. Aproximadamente el 10 % de los 6,2 millones de fracturas que se producen cada año son de difícil consolidación. Existen varias opciones para ayudar a acelerar la consolidación ósea, con una eficacia no demostrada. El injerto óseo de cresta ilíaca sigue considerándose el tratamiento de referencia (gold standard), pero presenta importantes problemas relacionados con la comorbilidad en el sitio de extracción. Las terapias basadas en factores de crecimiento, que incluyen el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y la hormona paratiroidea (PTH), han mostrado un éxito inicial en estudios de cultivo celular, pero su eficacia en aplicaciones clínicas sigue sin estar demostrada. Otras opciones, como la proteína morfogénica ósea 2 (BMP2) y la BMP7, han demostrado tener éxito en la aceleración de la consolidación de fracturas diafisarias. Sin embargo, existen riesgos asociados al uso de BMP, como el aumento de la infección, el aumento del riesgo de crecimiento tumoral y el aumento del riesgo de osteólisis local. Muchos de los riesgos asociados a los tratamientos que incluyen BMP también impiden el uso de BMP en pacientes con otras patologías.
La capacidad terapéutica de aumentar la formación ósea, como adyuvante durante la cirugía ortopédica, sin aumentar el potencial de crecimiento tumoral, constituye en la actualidad una limitación de los productos biológicos disponibles comercialmente, cuando se tratan problemas ortopédicos complejos tales como la fusión espinal, la consolidación de fracturas y el tratamiento de fracturas no consolidadas.
En el campo de los traumatismos ortopédicos, especialmente en el caso de fracturas abiertas con grandes defectos y pseudoartrosis, los injertos óseos autólogos/alogénicos son las principales opciones de tratamiento. Sin embargo, el injerto óseo de cosecha autógena, utilizado como tratamiento de referencia para lograr la formación ósea, conlleva riesgos de infección y dolor en el sitio donante. Otros sustitutos de injertos óseos alogénicos han mostrado una mala consolidación cuando se utilizan de forma individual. En el caso de las cirugías de columna vertebral, existen las mismas limitaciones cuando se utilizan estas opciones de injerto para logar la fusión.
El hueso cortical y esponjoso procedente de fuentes cadavéricas es adecuado para rellenar el espacio y es predominantemente osteoconductor sin un potencial osteoinductor significativo. De ahí que se utilicen agentes biológicos tales como PDGF, VEGF y BMP para aumentar las tasas de consolidación o fusión espinal, y su aplicación aumenta el coste del tratamiento. Sin embargo, estas terapias biológicas estimulan la proliferación durante el desarrollo en una serie de fenotipos celulares, lo que representa un riesgo tumoral inherente e inaceptable.
La matriz ósea desmineralizada y los sustitutos de fosfato cálcico no han mostrado una alta eficacia en la consolidación ósea acelerada y también llevan asociados costes significativos debido a los costes de producción.
La BMP2 recombinante (rhBMP2) es un implante desarrollado comercialmente por Medtronic, conocido como INFUSE, que se distribuye en formato pequeño (4,2 mg de BMP2 con 2x esponjas de colágeno para un implante de 15 mg/cm3), mediano (8,4 mg de BMP2 con 4x esponjas de colágeno para un implante de 15 mg/cm3), grande (12 mg de BMP2 con 6x esponjas de colágeno para un implante de 15 mg/cm3) y grande II (12 mg de BMP2 con 1x esponja de colágeno para un implante de 15 mg/cm3). Todos los tamaños del implante INFUSE están aprobados para aplicaciones espinales y maxilofaciales, mientras que solo el implante grande II está aprobado para fracturas. El implante INFUSE se administra reconstituyendo la BMP2 en polvo con solución salina estéril y luego añadiendo la solución salina de BMP2 a la esponja de colágeno, después de lo cual el implante se aplica de forma local durante la intervención quirúrgica.
La BMP7 recombinante (rhBMP7 u OP1) es un implante desarrollado comercialmente por Stryker y actualmente propiedad de Olympus, conocido como OP1. Los implantes OP1 se distribuyen como masilla OP1 (vial de 20 ml que contiene cartílago bovino en polvo y 3,3 mg de BMP7) o implante OP1 (1 g de cartílago bovino en polvo y 3,3 mg de BMP7). La masilla OP1 está aprobada para cirugías de fusión espinal, mientras que el implante OP1 está aprobado para el tratamiento de fracturas y la cirugía de fracturas no consolidadas. La masilla OP1 o el implante OP1 se administran reconstituyendo primero la BMP7 en polvo con solución salina estéril y luego añadiendo la solución salina de BMP7 al implante de colágeno, después de lo cual el implante se aplica de forma local durante la intervención quirúrgica.
El receptor del factor de crecimiento opioide (OGFR o receptor opioide Z) es un receptor opioide perinuclear no canónico que no comparte homología estructural con los receptores opioides q, k y 8 canónicos (OPRM, OPRK y OPRD, respectivamente) y se une a los ligandos opioides nativos de forma menos eficiente que los receptores opioides canónicos. El factor de crecimiento opioide (OGF o met5 encefalina; met5) es el ligando nativo del OGFR. Met5 se deriva de la prohormona proencefalina (PENK) y en menor medida de la proopiomelanocortina (POMC), que primero son reducidas por las prohormonas convertasas (PCSK1 y PCSK2) y luego la carboxipeptidasa E o D (CPE o CPD; encefalina convertasa) para formar cinco copias de met5 encefalina. Trabajos anteriores identificaron la expresión de met5 en osteoblastos y osteoprogenitores (Rosen y col., Proc Natl Acad Sci 88(9):3705-9, 1991; Rosen y col., J Bone Miner Res. 13(10):1515-20, 1998; Elhassan y col., J Bone and Miner Res., 13(1):88-95, 1998; Cheng y col., Mol Biol Cell. 20(1):319-27, 2009). Además, Kuis y col. identificaron met5 en monocitos de sangre periférica y bazo (Kuis y col., J Clin Invest. 88(3):817-24, 1991). Sin embargo, estos investigadores no lograron identificar el significado funcional de la señalización del OGFR en linajes mesenquimatosos de mieloides. Elhassan y col. (J Bone and Miner Res, 13(1):88-95, 1998) divulgan la presencia de met5 en tejidos óseos y articulares. Sin embargo, no existe un vínculo demostrable entre met5 y la formación ósea. El documento WO 97/39767 A1 divulga procedimientos para inducir la formación ósea utilizando la proteína leptina. El documento US 2012/100114 A1 divulga células madre mesenquimales, pretratadas con 2-cloro-5nitro-N-fenil-benzamida que exhiben características osteogénicas y soportes para la regeneración, reparación y reconstrucción de tejidos. Petrizzi, L. y col. (BMC Musculoskeletal Disorders 2007, (:43, p. 1-9) divulgan un estudio preliminar sobre el efecto de la naloxona parenteral, en asociación opcional con gluconato de calcio, sobre la consolidación ósea en un sistema modelo de "perforación de orificios" en ovinos. El documento US 2007/197573 A1 divulga composiciones y procedimientos en el tratamiento de trastornos metabólicos óseos utilizando antagonistas periféricos de receptores opioides. Kim D.H. y col. (Nature Review Genetics 8, 173-184, 2007) divulgan estrategias para silenciar enfermedades humanas utilizando interferencia de ARN. El documento WO 2006/044334 A2 divulga la promoción del crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago en un mamífero mediante la aplicación al hueso, periodonto, ligamento o cartílago de una composición que comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas. El documento US 2011/165218 divulga el uso de heparán sulfato 2 (HS-2) para el crecimiento y la regeneración óseos terapéuticos. Rose, FRAJ y col. (J. Pharmacy and Pharmacology, (2004), vol. 56, páginas 415 - 427) divulgan sistemas de suministro de factores de crecimiento óseo.
Sumario de la divulgación
La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.
Se ha confirmado en el presente documento que la inhibición de la señalización del factor de crecimiento opioide favorece la formación ósea y/o reduce la destrucción ósea. Sin pretender quedar ligado a teoría alguna en particular, se cree que la inhibición de la señalización del factor de crecimiento opioide a través del receptor del factor de crecimiento opioide (OGFR) es eficaz para favorecer la formación ósea y/o reducir la destrucción ósea. Se ha demostrado en el presente documento que la inhibición de la señalización del factor de crecimiento opioide favorece la formación ósea en un animal mediante la administración local de un inhibidor de la vía de señalización del factor de crecimiento opioide (OGFR) directamente en el sitio donde se desea la formación ósea. También se ha demostrado que la administración de un inhibidor de la vía de señalización del factor de crecimiento opioide directamente en el sitio donde se desea la formación ósea es necesaria para favorecer la diferenciación de m Sc en osteoblastos y para evitar la diferenciación de monocitos en osteoclastos, lo que conduce a un aumento de la mineralización y al aumento de la formación ósea en el sitio de la lesión ósea o de la intervención quirúrgica.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a medios para favorecer la formación ósea o reducir la destrucción ósea tal como se describe en las reivindicaciones adjuntas, mediante la administración a un animal que lo necesite de una cantidad de un antagonista del receptor del factor de crecimiento opioide, tal como se describe en las reivindicaciones, directamente en el sitio donde se desea la formación ósea.
En un aspecto, el antagonista del OGFR empleado en la presente invención bloquea la unión del factor de crecimiento opioide al OGFR.
En algunas realizaciones, el antagonista del OGFR que bloquea la unión del factor de crecimiento opioide (met5) al OGFR es naloxona o un derivado funcional de la misma, naltrexona o un derivado funcional de la misma, o una combinación de los mismos tal como se especifica en las reivindicaciones y en el presente documento a continuación.
En estas realizaciones, los antagonistas del OGFR son derivados de la oximorfona que se unen al OGFR e incluyen: naloxona, naltrexona, nalorfina, naloxonazina, levalorfano, nalmefeno, ciprodima, ciclorfano, ciclazocina, oxilorfano, LY113878, MR2266, diprenorfina, WIN 44,441-3, naltindole o norbinaltorfimina.
En otras realizaciones, los antagonistas del OGFR son derivados de la trans-3,4-dimetil-4-fenilpiperidina que se unen al OGFR e incluyen: LY99335, LY25506, LY117413 o LY255582.
También se divulgan antagonistas del OGFR derivados de los péptidos met5-encefalina o leu-encefalina que se unen al OGFR e incluyen, como mínimo, las siguientes secuencias de aminoácidos como medio para dirigirse al OGFR: Tyr-Gly-Gly-Phe -Met (SEQ ID NO: 1) para los derivados de met5-encefalina o Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu (SEQ ID NO: 2) para los derivados de leu-encefalina.
Además, se divulgan antagonistas del OGFR derivados del antagonista peptídico ICI174864 (N,N-dialil-Tyr-Aib-Aib-Phe-Leu-OH, SEQ ID NO: 3; Aib = ácido aminoisobutítico) o del análogo CTP de la somatostatina (D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-NH2 , SEQ ID NO: 4).
Otro antagonista del OGFR divulgado en el presente documento es una molécula que interrumpe la secuencia de localización nuclear que se encuentra dentro del OGFR: 251 QSALDYFMFAVRCRHQRRQLVHFAWEHFRPRCKFVWGPQDKLRRFKPSSL (SEQ ID NO: 5).
Un antagonista adicional del OGFR divulgado en el presente documento es un ARN de horquilla corta (ARNhc) o un ARN pequeño de interferencia (ARNip) dirigido contra el gen OGFR y eficaz para interrumpir la expresión del gen OGFR.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona medios para favorecer el reclutamiento de células madre mesenquimales (MSC) a un sitio local de lesión o intervención quirúrgica del hueso con el fin de favorecer la consolidación mientras se inhibe la degradación (o reabsorción) ósea inducida por los osteoclastos. Este aspecto se basa en la administración de una cantidad de un antagonista del OGFR para favorecer la formación ósea mientras se inhibe la degradación ósea tal como se describe en las reivindicaciones. La lesión puede ser, por ejemplo, una fractura ósea o una intervención quirúrgica. En algunas realizaciones, el antagonista del OGFR se administra de forma local al sitio de la lesión o de la intervención quirúrgica.
Descripción de los dibujos
Figuras 1A-1I: (A) la adición de entre 1 pM y 1 mM de naloxona y medios de osteoinducción aumentó sustancialmente la acumulación de minerales (tinción roja) en cultivos de MSC inducidos a convertirse en osteoblastos. La adición de entre 1 |jm y 1 mm de naltrexona y medios de osteoinducción también aumentó los minerales, pero en menor medida que la naloxona. (B) La expresión del gen del receptor opioide delta (OPRD) disminuyó sustancialmente en los osteoblastos (* = p<0,001) y los osteoclastos (* = p<0,0084) mientras que la expresión del gen del receptor del factor de crecimiento opioide (OGFR) (C) aumentó significativamente en los osteoblastos (* = p<0,02) y los osteoclastos (* = p<0,0001). (D) El ligando del OGFR, met5-encefalina (met5), se deriva de una proteína precursora más grande conocida como proencefalina (PENK). La adición de 5 o 50 jM de met5 no tuvo ningún efecto sobre la formación de minerales en el cultivo. (E) Es importante destacar que la adición de 5 jM de met5 (PENK) a los medios de osteoinducción no tuvo ningún efecto sobre la acumulación de minerales, mientras que la adición de 50 jm de met5 disminuyó ligeramente la acumulación de minerales. Sin embargo, cuando se añadió 1 mM de naloxona junto con 5 jM o 50 jM de met5 y medios de osteoinducción, el tratamiento con naloxona fue capaz de anular los efectos antiosteogénicos de met5. (F) La adición de medios de osteoinducción dio lugar a la formación de minerales en comparación con los cultivos de control. En comparación con los controles, BMP2 aumentó la formación de minerales, mientras que un tratamiento único (1x dosis) con naloxona (1 mM) y dos tratamientos (2x dosis) con naloxona aumentaron la formación de minerales (tinción roja). El tratamiento con naloxona en cada cambio de medios (dosis continua) suprimió la formación de minerales. (G) La adición de naloxona a los cultivos de MSC redujo el número de células a las 72 y 120 horas (* = p<0,017). (H) La adición de naloxona a los cultivos de monocitos también redujo significativamente el número de células (* = p<0,0001). (I) En comparación con los cultivos de osteoclastos de control, los monocitos cultivados para convertirse en osteoclastos no se vieron afectados por el tratamiento con met5 (tinción de TRAP de color púrpura). La adición de 1 jM de naloxona o 1 jM de naltrexona no redujo significativamente el número de osteoclastos, mientras que la adición de 1 mM de naloxona o 1 mM de naltrexona redujo sustancialmente el número de osteoclastos.
Figuras 2A-2E: (A) las MSC transfectadas con ARNhc OGFR expresaron significativamente menos la expresión del gen OGFR (* = p<0,0085), lo que se corroboró (B) con la disminución del OGFR en lisados de proteínas nucleares y citoplasmáticas. (C) Además, la expresión del gen SMAD1 en las MSC deficientes en OGFR fue significativamente mayor que en las MSC de control y en los cultivos de control transfectados con GFP (* = p<0,0008). (D) La expresión del gen ID1 también se incrementó en las MSC deficientes en OGFR en comparación con las MSC de control y los cultivos de control transfectados con GFP (* = p<0,0217). (E) La proteína específica de osteoblastos, osteocalcina (OCN), también aumentó significativamente en las MSC deficientes en OGFR inducidas a convertirse en osteoblastos en comparación con los cultivos de control y el control transfectado con GFP (* = p<0,0215).
Figuras 3A-3G: (A) la adición de 1 mM de tratamiento con naloxona aumentó la masa ósea (BV/TV) 1,53 veces (* = p<0,001) en los defectos unicorticales en comparación con los defectos de control tratados con PBS o met5. (B) Imágenes de jCT de los defectos de los grupos de control, de tratamiento con naloxona o con met5. (C) La elevada masa ósea (BV/TV) fue acompañada de un aumento de 1,2 veces del número trabecular (TbN) (* = p<0,047). (D) La administración quirúrgica de un defecto unicortical en el grupo de control quirúrgico (Control Sx) aumentó la BV/TV (fracción volumétrica ósea) en comparación con el grupo de control no quirúrgico, lo que corresponde a la masa ósea acumulada dentro el defecto (* = p<0,034). Los defectos tratados con implantes de colágeno bovino y PBS o met5 no se diferenciaron de los controles quirúrgicos. Sin embargo, tanto el grupo de tratamiento con PBS (* = p<0,0021) como el grupo de tratamiento con met5 (* = p<0,0009) mostraron un aumento significativo en comparación con el grupo de control no quirúrgico. Los defectos tratados con BMP2, naltrexona o naloxona aumentaron todos en comparación con los controles no quirúrgicos (* = p<0,0001). Los grupos de tratamiento con BMP2, naltrexona y naloxona mostraron un aumento significativo en comparación con el grupo de control quirúrgico (X = p<0,0005), el grupo de tratamiento con PBS (# = p<0,0124) y el grupo de tratamiento con met5 (+ = p<0,011). La BV/TV del grupo de tratamiento con BMP2 no fue diferente a la del grupo de tratamiento con naltrexona, mientras que la BV/TV del grupo de tratamiento con naloxona mostró un aumento significativo (0 = p<0,035). (E) El grosor trabecular (TbTh) aumentó en el grupo de control quirúrgico (Control Sx), el grupo de tratamiento con met5, el grupo de tratamiento con BMP2, el grupo de tratamiento con naltrexona y el grupo de tratamiento con naloxona (* = p<0,04). Solo el TbTh del grupo de tratamiento con naloxona fue mayor que el del grupo de tratamiento con BMP2 o el del grupo de tratamiento con naltrexona (** = p<0,0002). (F) El implante de colágeno aumentó la formación ósea en la columna lumbar en comparación con los controles quirúrgicos SHAM. Sin embargo, los implantes de BMP2 colágeno o de naloxona colágeno aumentaron la formación ósea con respecto a los implantes de colágeno solos.
(G) Imágenes de jCT de la masa de fusión ósea lumbar para implantes de colágeno e implantes de naloxona colágeno.
Figuras 4A-4D: (A) se observó la expresión del gen OGFR en osteoblastos (* = p<0,018), células tumorales óseas de sarcoma de Ewing RDES (* = p<0,0014), células tumorales óseas de sarcoma de Ewing Hs822t (* = p<0,0001), células tumorales óseas de sarcoma de Ewing Hs863t (* = p<0,039) y células tumorales de osteosarcoma SaOS2 (* =p<0,05). (B) Setenta y dos horas después de la adición de 1 mM de naloxona o 1 mM de naltrexona, el número de células de osteosarcoma SaOS2 disminuyó significativamente en comparación con los cultivos de control (* = p<0,0001). El ligando del OGFR, met5, no tuvo ningún efecto sobre el número de células. (C) La línea de células tumorales óseas de sarcoma de Ewing Hs822t se adhirió al cultivo. Setenta y dos horas después de la adición de una dosis de 1 mM de naltrexona, el número de células tumorales óseas de sarcoma de Ewing Hs822t disminuyó en comparación con los cultivos de control (* = p<0,0025). La naloxona no tuvo ningún efecto sobre el número de células tumorales Hs822t. Por el contrario, la adición de 50 mM de met5 dio lugar a un aumento significativo en el número de células tumorales Hs822t (X = p<0,03). (D) Las células tumorales óseas de sarcoma de Ewing RDES se adhirieron débilmente al cultivo. Setenta y dos horas después de la adición de una dosis de 1 mM de naloxona o de 1 mM de naltrexona, el número de células tumorales óseas de sarcoma de Ewing RDES disminuyó significativamente en comparación con los cultivos de control (* = p<0,0005). La adición de met5 no tuvo ningún efecto sobre el número de células tumorales RDES.
Descripción detallada
Se ha demostrado en el presente documento que la naloxona o la naltrexona aumentan la formación ósea al tiempo que disminuyen el número de osteoclastos. El aumento de la formación ósea queda respaldado por la formación de minerales observada en el cultivo y la formación ósea medida por micro-CT tras la inducción quirúrgica de un defecto unicortical con o sin un portador de colágeno bovino, o tras la fusión de apófisis vertebrales posterolaterales utilizando un portador de colágeno bovino. El modelo quirúrgico dio lugar a una lesión con abundante contenido de albúmina, que puede secuestrar la naloxona y la naltrexona, lo que respalda la disponibilidad prolongada de estos antagonistas del OGFR.
En un aspecto, la invención proporciona medios para favorecer la formación ósea y/o reducir la degradación ósea, incluyendo la administración de un antagonista del OGFR tal como se describe en las reivindicaciones a un sitio local de lesión o intervención quirúrgica en el hueso.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "intervención quirúrgica" incluye un procedimiento quirúrgico para reparar una fractura, un procedimiento quirúrgico utilizado para fusionar huesos vertebrales (por ejemplo, fusión espinal) o un procedimiento quirúrgico que incluye, por ejemplo, la integración de un implante durante una artroplastia total de la articulación, tornillos óseos utilizados durante la reparación de fracturas, tornillos óseos utilizados para anclar tendones o ligamentos, o cualquier hardware ortopédico diseñado para estabilizar mecánicamente el sitio quirúrgico ortopédico.
Antagonista del OGFR
Por "antagonista del OGFR" se entiende cualquier molécula que inhiba, suprima o provoque el cese de al menos una actividad biológica mediada por OGFR.
En general, un antagonista del OGFR es un antagonista de unión al OGFR, es decir, una molécula que interfiere con, bloquea o impide de otro modo la interacción o unión del ligando met5 (OGF) al OGFR. Un antagonista de unión al OGFR puede funcionar de dos maneras: en primer lugar, el antagonista del OGFR puede competir con el ligando met5 por la unión al OGFR en la superficie de la membrana nuclear, de este modo interfiriendo, bloqueando o impidiendo de otra forma la unión del ligando met5 al OGFR, sin desencadenar la señalización descendente que, de otro modo, sería inducida por la unión del ligando met5 al OGFR. De manera alternativa, un antagonista de unión al OGFR puede unirse o secuestrar a la PENK o al ligando met5 con suficiente afinidad y especificidad para interferir sustancialmente con, bloquear o impedir de otro modo la unión del ligando met5 al OGFR, inhibiendo, suprimiendo o provocando el cese de al menos una actividad biológica mediada por OGFR. En términos generales, los antagonistas de unión al OGFR pueden ser moléculas grandes (por ejemplo, anticuerpos) o moléculas pequeñas (por ejemplo, compuestos con un peso molecular inferior a 15 kD, 12 kD, 10 kD o incluso 8 kD) y pueden ser un polipéptido, un ácido nucleico o un compuesto sintético de molécula pequeña. Los antagonistas de unión al OGFR pueden identificarse con cualquier ensayo in vitro que un experto en la materia seleccione fácilmente. Por ejemplo, los antagonistas del OGFR pueden identificarse utilizando los procedimientos descritos en la patente de Estados Unidos n.° 5.882.944, la patente de Estados Unidos n.° 6.007.986 o la patente de Estados Unidos n.° 6.270.979.
En una realización, el antagonista de unión al OGFR es la naloxona o un derivado funcional de la misma, la naltrexona o un derivado funcional de la misma como se describe en las reivindicaciones, o una combinación de los mismos.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "derivado funcional" se refiere a un derivado o análogo que es estructural y funcionalmente análogo a la molécula de origen (por ejemplo, mantiene la función de la naltrexona o naloxona como antagonista del OGFR). La naloxona y los análogos de la naltrexona pueden sintetizarse utilizando procedimientos sintéticos estándar tales como los descritos en March J., Advanced Organic Chemistry, 3a Ed. (1985). Ejemplos de naltrexona y derivados funcionales de naloxona incluyen formas de sal, por ejemplo, hidrocloruro de naloxona dihidrato o hidrocloruro de naltrexona. Otros ejemplos de naltrexona y derivados funcionales de naloxona adecuados para su uso en los presentes procedimientos incluyen la naltrexona y los análogos de la naloxona divulgados en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2007/0197573 A1 y la patente de Estados Unidos n.° 6.713.488, por ejemplo.
En otra realización, un antagonista de unión al OGFR derivado de la oximorfona que se une al OGFR incluye naloxona, naltrexona, nalorfina, naloxonazina, levalorfano, nalmefeno, ciprodima, ciclorfano, ciclazocina, oxilorfano, MR22, difinorfano, WY11387844,441-3, naltindole o norbinaltorfimina.
También se divulga un antagonista de unión al OGFR que se deriva de la trans-3,4-dimetil-4-fenilpiperidina y se une al OGFR, que incluye LY99335, LY25506, LY117413 o LY255582.
También se divulgan antagonistas de unión al OGFR derivados de los péptidos met5-encefalina o leu-encefalina que se unen al OGFR e incluyen, como mínimo, las siguientes secuencias de aminoácidos como medio para dirigirse al OGFR: Tyr-Gly-Gly -Phe-Met (SEQ ID NO: 1) para los derivados de met5-encefalina o Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu (SEQ ID NO: 2) para los derivados de leu-encefalina.
Además, se divulgan antagonistas de unión al OGFR derivados del antagonista peptídico ICI174864 (N, N-dialil-Tyr-Aib-Aib-Phe-Leu-OH, SEQ ID NO: 3; Aib = ácido aminoisobutítico) o del análogo CTP de la somatostatina (D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-NH2 , SEQ ID NO: 4).
Se divulga un antagonista del OGFR que, en lugar de ser un antagonista de unión al OGFR, es una molécula que interrumpe la secuencia de localización nuclear que se encuentra dentro del OGFR: 251 QSALDYFMFAVRCRHQRRQLVHFAWEHFRPRCKFVWGPQDKLRRFKPSSL (SEQ ID NO: 5).
Un antagonista adicional del OGFR divulgado en el presente documento es un ARN de horquilla corta (ARNhc) o un ARN pequeño de interferencia (ARNip) dirigido contra el gen OGFR y eficaz para interrumpir la expresión del gen OGFR.
Los antagonistas del OGFR descritos en el presente documento pueden administrarse de forma individual o en combinación. Las combinaciones adecuadas incluyen, por ejemplo, naloxona y naltrexona; naloxona y/o naltrexona, en combinación con otro antagonista de unión al OGFR u otro antagonista del OGFR.
Combinación de antagonistas del OGFR con otros agentes activos
Los antagonistas del OGFR descritos en el presente documento pueden administrarse en combinación con uno o más de otros agentes activos que favorecen la formación o el crecimiento óseo a través de la señalización de SMAD, que pueden ser sinérgicos con los antagonistas del OGFR. Ejemplos de tales agentes activos incluyen, pero no se limitan a, moléculas de BMP (por ejemplo, BMP-2, BMP-4, BMP6 y BMP-7), que pueden regular la señalización de SMAD1/5/8. Las moléculas de TGFp que pueden ampliar los bancos de MSC y que pueden entonces ser reguladas por un antagonista del OGFR. Los inhibidores de TGFp, que incluyen LY2109761, y que reducen la señalización del TGFp, disminuyen la señalización del inhibidor SMAd (SMAD6 y SMAD7) y entonces antagonizan la señalización de la BMP y reducen la formación ósea. Por ejemplo, los implantes de colágeno pueden infundirse con una molécula de BMP, una molécula de TGFp o una molécula inhibidora del TGFp y un antagonista del OGFR deseables para su uso en los presentes procedimientos.
Los antagonistas del OGFR descritos en el presente documento pueden administrarse en combinación con uno o más de otros agentes activos que favorecen la formación ósea o el crecimiento óseo. Ejemplos de tales agentes activos incluyen, pero no se limitan a, uno o más factores de crecimiento, tales como EGF, VEGF, PDGF, IGF, FGF, TGFa y citoquinas; células, tales como células madre mesenquimales, condrocitos y células de la médula ósea. Por ejemplo, los implantes de colágeno pueden infundirse tanto con un factor de crecimiento deseable, tal como una molécula de VEGF, como con un antagonista del OGFR para su uso en los presentes procedimientos. También puede administrarse un antagonista del OGFR en combinación con un agente quimioterapéutico en el tratamiento de un paciente con cáncer para favorecer la formación o el crecimiento óseo en ese paciente.
Sistemas de suministro/portadores
Los antagonistas del OGFR descritos en el presente documento pueden administrarse de forma local, con o sin un portador, para acelerar la reparación de la fractura o favorecer la fusión del hueso vertebral. En algunas realizaciones, un antagonista del OGFR se combina o encapsula dentro de un portador para su administración. Los portadores adecuados pueden estar en forma de esferas, microesferas o nanopartículas, y pueden estar formados por polímeros naturales y/o sintéticos biocompatibles. Ejemplos de polímeros biocompatibles adecuados incluyen ácido hialurónico, colágeno, fosfato tricálcico, sulfato de condroitina, polibutirato, polilactida, poliglicólido y copolímeros lactida/glicólido, y mezclas o copolímeros de los mismos. Los portadores adecuados también incluyen sistemas no poliméricos tales como ácidos carboxílicos, ácidos grasos, fosfolípidos, aminoácidos, lípidos tales como esteroles, sistemas de liberación de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas basados en péptidos; implantes y similares.
En una realización, el portador es un portador higroscópico a base de colágeno (por ejemplo, esponja de colágeno, armazón de colágeno, colágeno en polvo o hidrogel de gelatina a base de colágeno).
En otra realización, el portador es un portador a base de hidrogel hidrófilo (por ejemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico), que permite la liberación de un antagonista del OGFR (por ejemplo, naloxona o naltrexona o un derivado funcional de las mismas) infundido en el mismo durante un periodo de tiempo.
En otra realización, el portador es albúmina, un derivado o fragmento de albúmina que mantiene el sitio de unión a la naloxona/morfina situado en la interfaz entre los dominios IA y IIA, y/o mantiene el sitio de unión a la naloxona alrededor del triptófano (Trp)-214, que se une a un antagonista del OGFR, tal como naloxona o naltrexona, o un derivado funcional de las mismas, y permite la liberación lenta del antagonista del OGFR.
En otra realización, por ejemplo, metilcelulosa y un gel de inserción, se unen a un antagonista del OGFR, tal como naloxona o naltrexona, o un derivado funcional de las mismas y permiten la liberación lenta del antagonista del OGFR.
En una realización adicional, el portador es un implante de colágeno bovino. Un antagonista del OGFR, por ejemplo, naloxona o naltrexona o un derivado funcional de las mismas, puede combinarse con un implante de colágeno bovino, de manera similar a INFUSE (BMP2) o a la masilla OP1 o al implante OP1, que se aplica con una esponja de colágeno bovino, colágeno bovino en polvo o una construcción de gelatina a base de colágeno. La administración de naloxona, naltrexona o un derivado funcional de las mismas se puede lograr, por ejemplo, reconstituyendo naloxona o naltrexona en polvo o un derivado funcional de las mismas con solución salina estéril y luego añadiendo la solución salina antagonista del OGFR al implante de colágeno, después de lo cual el implante puede aplicarse de forma local al sitio de la intervención quirúrgica.
En otra realización, el portador es un implante quirúrgico o un sistema de aplicación de implantes quirúrgicos seleccionado de entre, por ejemplo, jaulas, tornillos, varillas, placas, jaulas extensibles, anclajes (anclajes de base metálica, sintética o biodegradables).
En una realización adicional, el portador está compuesto por beta-fosfato tricálcico en forma de chips o en polvo, cemento (polimetilmetacrilato o "PMMA") o un armazón de matriz ósea desmineralizada en forma de, por ejemplo, masilla, pasta, botes o formulaciones inyectables.
En otra realización, el portador es un portador compuesto por esferas de PGA (ácido poliglicólico)-PLGA (ácido poliláctico glicólico), que puede encapsular un antagonista del OGFR para proporcionar una liberación inmediata, retardada o sostenida.
En otra realización, el portador es un aloinjerto tal como un aloinjerto corticoesponjoso, chips corticales y un aloinjerto estructural.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona medios para favorecer el reclutamiento de células madre mesenquimales (MSC) a un sitio local de lesión o intervención quirúrgica del hueso con el fin de favorecer la consolidación mientras se inhibe la degradación (o reabsorción) ósea inducida por los osteoclastos. Esto se basa en la administración de una cantidad de un antagonista del OGFR descrito en el presente documento (por ejemplo, naloxona o naltrexona o un derivado funcional de las mismas) para favorecer la formación ósea mientras se inhibe la degradación ósea.
En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona medios para tratar la osteonecrosis u osteorradionecrosis basándose en la administración de un antagonista del OGFR descrito en el presente documento (por ejemplo, naloxona o naltrexona o un derivado funcional de las mismas).
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un intervalo de dosificación adecuado, a través del cual la naloxona (400 ng/ml (1 j M) a 400 jg/ml (1 mM)) y/o la naltrexona (378-ng/ml (1 j M) a 378 jg/ml (1mM)) se administran en dosis que oscilan entre 1 j M y 1 mM y son efectivas para aumentar la formación ósea y/o disminuir la degradación ósea a través de la disminución de la formación de osteoclastos. Cantidades de dosis específicas de naloxona pueden ser, por ejemplo, 400 ng/ ml, 800 ng/ml, 1 mg/ml, 10 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 400 mg/ml o una cantidad entre cualquiera de las dosis enumeradas siempre que estas dosis oscilen entre 1 j M y 1 mM. Estas cantidades de dosificación pueden suministrarse en una sola administración o en múltiples administraciones. La cantidad total y precisa de naloxona que sea eficaz dependerá de la extensión de la lesión o de la aplicación quirúrgica y del portador que se vaya a utilizar. Por ejemplo, 400 jg/ml de solución salina de naloxona, o cualquier dosis equivalente, que sea igual a 400 jg/cm3 de solución salina de naloxona, se recomendaría para cada implante de colágeno con dimensiones de 2 cm x 2 cm x 0,25 cm o 1 cm3 de naloxona (por ejemplo, colágeno infundido con 1 mM de una solución salina de naloxona) o un derivado funcional de la misma, que puede administrarse a una lesión 0 sitio quirúrgico local que da lugar a una formación ósea sustancial y a la inhibición del número de osteoclastos dentro del área quirúrgica. Cantidades de dosis específicas de naltrexona pueden ser, por ejemplo, 378-ng/ml, 756-ng/ml, 1 jg/ml, 10 jg/ml, 50 jg/ml, 100 jg/ml, 378 jg/ml o una cantidad entre cualquiera de las dosis enumeradas. La cantidad total y precisa de naltrexona que sea eficaz dependerá de la extensión de la lesión o de la aplicación quirúrgica y del portador que se vaya a utilizar. Por ejemplo, 378 jg/ml de solución salina de naltrexona, o cualquier dosis equivalente, que sea igual a 378 jg/cm3 de solución salina de naltrexona, sería necesaria para cada implante de colágeno con dimensiones de 2 cm x 2 cm x 0,25 cm o 1 cm3 de naltrexona (por ejemplo, colágeno infundido con 1 mM de una solución salina de naltrexona) o un derivado funcional de la misma, que puede administrarse a una lesión o sitio quirúrgico local que da lugar a una formación ósea sustancial y a la inhibición del número de osteoclastos dentro del área quirúrgica.
La presente descripción se ilustra con más detalle mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1: los antagonistas de opioides regulan la formación y reabsorción ósea
Procedimientos: Se recogió médula ósea humana de pacientes adultos que prestaron su consentimiento para someterse a una artroplastia total de cadera femoral proximal primaria electiva o una artroplastia total de rodilla femoral distal primaria electiva (n = 6 , edad media de 65 años) como parte de un estudio aprobado por el IRB. Las MSC humanas se obtuvieron de la fracción adherente de células derivadas de cada aspirado de médula ósea completo recogido, mientras que la población de monocitos se recogió de la fracción no adherente de la médula ósea. La fracción de monocitos se enriqueció mediante subcultivo con 100 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos humanos recombinantes (MCSF; Wyeth). En los experimentos paralelos que se describen a continuación, se recogieron fémures de ratones macho de 3 semanas (n = 10) y 16 semanas (n = 20) de edad y, a continuación, se extrajo la médula ósea de cada fémur de acuerdo con el siguiente procedimiento: tras la extracción de los extremos proximal y distal del fémur, se introdujo una aguja de calibre 21 en el canal intramedular femoral. A continuación, se hizo pasar cuidadosamente el medio a través del extremo proximal del fémur, lo que obligó a la médula ósea a salir del hueso. Por último, el sedimento de médula ósea se disoció mecánicamente utilizando una aguja de calibre 18 y luego se hizo pasar a través de un filtro de malla de 70 pm. Estos aspirados de médula ósea completos se utilizaron para generar osteoclastos. Las células se mantuvieron en un medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía suero de ternero fetal al 10 % (v/v) y penicilina-estreptomicina-glutamina al 1 % (PSG; Cellgro, Mediatech). Se diluyeron ligandos de netrina recombinante humana (NTN1 y NTN4) en PBS (R&D Systems). El comité IACUC responsable aprobó todos los estudios con animales descritos en este trabajo.
Análisis de la expresión génica: se analizaron MSC, osteoblastos y adipocitos derivados de médula ósea humana para determinar los cambios en la expresión génica. En paralelo, también se analizaron osteoclastos derivados de monocitos humanos para determinar los cambios en la expresión génica mieloide. Los datos de los genes se obtuvieron a partir de dos muestras generadas de forma independiente y recogidas de al menos tres pacientes. El ARNm se purificó utilizando columnas RNeasy Plus Mini (Qiagen) y el ADNc se sintetizó utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad). La expresión génica se analizó mediante PCR cuantitativa (PCRq) utilizando 100 ng de ADNc mezclado con Fast Plus EvaGreen Master Mix (Biotium). En cada experimento, GAPDH sirvió como control, los controles negativos no contenían plantilla y se generó una curva estándar utilizando diluciones seriadas de la secuencia sintetizada químicamente de GAPDH (0, 1, 10 y 100 femtogramos; Integrated DNA Technologies). La expresión génica se evaluó mediante el procedimiento de Pfaffl, en el que la eficiencia de cada cebador (E) y la concentración inicial del producto génico (No) se calculan a partir de la región lineal de la curva umbral de cruce de fluorescencia utilizando el software LinRegPCR (v2013.0). Los experimentos se consideraron válidos cuando el gen de control GAPDH cayó dentro de la curva estándar y se calculó que las eficiencias del cebador (E) eran E>=1,8. La presencia de un único producto génico se confirmó mediante un análisis de la curva de fusión y el tamaño del producto se confirmó mediante electroforesis en gel del producto génico.
Expresión de proteínas mediante análisis de transferencia Western: se lisaron MSC, osteoblastos y osteoclastos humanos con tampón RIPA frío (Pierce Thermo Scientific) que contenía 2 mM de yodoacetamida, 2 mM de clorhidrato de benzamidina, 0,1 mM de etilmaleimida, PMSF al 1 % y el cóctel inhibidor de proteasas Halt (Pierce Thermo Scientific). Se analizaron lisados de proteínas de al menos dos réplicas generadas a partir de tres muestras de pacientes. La proteína total se analizó utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras se cargaron (20 pg/pocillo) en gel prefabricado Mini-Protean Tris-Tricine al 10-20 % (Bio-Rad) con la escalera de proteínas NIR preteñidas Page Ruler (Bio-Rad) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad). Se identificó OGFR en membranas bloqueadas utilizando leche desnatada al 5 % con un anticuerpo primario del OGFR (Santa Cruz Biotechnologies). Actina (1:500) y 8-tubulina sirvieron como controles de carga. Los anticuerpos se detectaron utilizando un anticuerpo secundario conjugado con micropolímero conjugado con HRP (kit ImmPress, Vector Labs) junto con el sustrato Clarity Western ECL (Bio-Rad). Se utilizaron lisados de proteínas de cerebro de ratón (mB) como controles de expresión positiva.
Osteogénesis: se analizó el potencial osteogénico de las MSC induciendo químicamente la formación de minerales. Se sembraron MSC de al menos tres pacientes humanos a razón de 5x103 células por pocillo y se dejó que confluyeran y se entretejieran antes de añadir el medio de osteoinducción. Los medios de inducción consistían en DMEM que contenía FCS al 20 % (v/v) y PSG al 1 % complementado con 25 pg/ml de 2-fosfato ascórbico (Sigma), 100 nM de dexametasona (Sigma) y el siguiente régimen de dosificación de p-glicerofosfato (BGP; Sigma): 1x cambio de medio con 5 mM de BGP, 1x cambio de medio con 10 mM de BGP y 1x cambio de medio con 20 mM de BGP. El ligando met5 (0, [5 pM] 2,87, o [50 pM] 28,7 pg; Sigma), la naloxona (0, 400 fg, 400 pg, 400 ng, 400 pg; Sigma) o la naltrexona (0, 378 fg, 378 pg, 378 ng, 378 pg; Sigma) se añadieron de la siguiente manera: 1) 1x, con la primera adición de medio de osteoinducción, 2) 2x, con la primera y segunda adición del medio de osteoinducción y 3) con cada cambio de medio posterior a la inducción. Los pocillos de control positivo se trataron con 25 ng del ligando la BMP2/BMP7 humana recombinante (R&D Systems) con la primera adición de medios de inducción. Tras la aparición de los nódulos minerales, las células se fijaron con EtOH enfriado en hielo al 70 % (Sigma) y luego se tiñeron con 40 mM de rojo de alizarina S (pH 4,2, Sigma). Los experimentos de osteogénesis se repitieron al menos dos veces para cada paciente.
Determinación del número de células: tras la adición de 1 mM de naloxona o 1 mM de naltrexona, se determinó el número de células viables con el ensayo MTT. Después de 72 horas y 120 horas, se añadió MTT (5 mg/ml (p/v), Sigma) a cada pocillo, se incubó durante 2 horas, tras lo cual las células se lisaron con 500 j l de DMSO (Sigma). El MTT se midió a 570 nm y los efectos de la terapia sobre la proliferación celular se determinaron normalizando los pocillos tratados con respecto a los valores medios de los pocillos no tratados: factor de cambio del número de células = 100*[densidad óptica de las células tratadas/densidad óptica media del control].
Tinción de TRAP y determinación del número de osteoclastos: los osteoclastos se obtuvieron de una población enriquecida de monocitos humanos o de aspirados de médula ósea de ratón completos no enriquecidos. Se analizaron tres muestras de médula ósea de pacientes humanos en paralelo con muestras recogidas de médula ósea de ratones de 3 semanas (n=10). Se estimuló la fracción de monocitos para que se convirtieran en osteoclastos cultivando 1x106 células con 25 ng/ml de MCSF y 25 ng/ml de ligando RANK recombinante humano o de ratón (R&D Systems) en presencia del ligando met5 ([5 jM ] 2,87 o [50 jM ] 28,7 jg; Sigma), naloxona (400 ng o 400 jg; Sigma) o naltrexona (378 ng o 378 jg; Sigma). Los osteoclastos se tiñeron con fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP; kit de fosfatasa ácida leucocitaria, Sigma 387-A) y se contaron cuando las células se tiñeron de TRAP positivo y tenían al menos tres núcleos. Las estimaciones del número de osteoclastos se obtuvieron mediante el muestreo de Cavalieri y una modificación de la técnica del fraccionador.
Silenciamiento por ARNhc del receptor del OGF: la actividad del receptor de OGF se inhibió mediante la transfección de las MSC con un lentivirus de ARNhc de neogenina disponible comercialmente o con un lentivirus de GFP como control (Santa Cruz Biotechnologies). A continuación, las MSC se indujeron a convertirse en osteoblastos y posteriormente se analizaron los genes diana de BMP (ID1, ID2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD5, SMAD6, SMAD7, SMAD8/9 y osteocalcina (OCN)).
Modelo de defecto unicortical: a ratones C57BL/6 machos de 3 semanas de edad (n=5 por grupo de tratamiento) se les inyectó met5, naloxona o naltrexona tras la creación de un defecto unicortical. Brevemente, se realizó una pequeña incisión (aproximadamente 3 mm) justo debajo de la articulación de la rodilla, situada en el lado medial de la tibia, justo debajo de la tuberosidad tibial en la cresta tibial. En animales jóvenes, la placa epifisaria es claramente visible y la broca se colocó aproximadamente 1 mm por debajo de este punto. La broca produjo un defecto unicortical con dimensiones de 300 jm de diámetro x 1 mm de profundidad. Se utilizó una jeringa Hamilton Neuros RN de 10 jL con una aguja de punta roma de calibre 33 para inyectar 2 jL de met5 (28,7 jg), naloxona (400 jg ) o naltrexona (378 jg ) resuspendidos en solución salina directamente en el defecto unicortical a una velocidad no superior a aproximadamente 0,1 j l por segundo. Las tibias de la extremidad izquierda sirvieron como controles quirúrgicos contralaterales, en los que los animales recibieron un defecto unicortical y se inyectaron 2 j l de solución salina. Los ratones fueron sacrificados 5 días después de la cirugía, se recogieron las extremidades traseras y se fijaron las tibias para inmunofluorescencia, la tinción de TRAP y el crecimiento óseo asociado a OTC.
Implantación de implantes de colágeno con antagonistas opioides en un modelo de defectos monocorticales: en este estudio se utilizaron ratones C57BL/6 macho de 5 semanas de edad (n=5 por grupo de tratamiento para un total de 25 animales). Los grupos de tratamiento consistieron en: 1) PBS esponja de colágeno; 2) met5 esponja de colágeno; 3) BMP2 esponja de colágeno; 4) naltrexona esponja de colágeno; 5) naloxona esponja de colágeno. Los defectos unicorticales se administraron quirúrgicamente a través de una pequeña incisión (aproximadamente 3 mm) practicada justo debajo de la articulación de la rodilla, situada en el lado medial de la tibia, justo debajo de la tuberosidad tibial en la cresta tibial. En ratones macho de 5 semanas de edad, la placa epifisaria es claramente visible y la broca se colocó aproximadamente 1 mm por debajo de este punto. La broca produjo un defecto unicortical con dimensiones de 300 jm de diámetro x 1 mm de profundidad. Se prepararon implantes de esponja de colágeno bovino (Duraform) (aproximadamente 1 mm x 1 mm) y luego se empaparon en PBS, 50 jM (28,7 jg en 10 jL), met-5 encefalina (met5), 25 ng de BMP2, 1 mM de naltrexona (378 jg en 10 jL ) o 1 mM de naloxona (400 jg en 10 jL ) (n=5 para cada grupo, 25 animales en total). Se aplicó un defecto unicortical a un grupo separado de ratones (n=5; controles quirúrgicos para el defecto cortical) que no recibieron un implante de esponja de colágeno. En paralelo, un grupo separado de animales sirvió como control no quirúrgico. Los ratones fueron sacrificados 7 días después de la cirugía, se recogieron las extremidades traseras y se prepararon las tibias para el análisis por micro CT (jCT).
Fusión espinal posterolateral de ratas en las vértebras L5-L6: 20 ratas Sprague-Dawley macho de 1 mes de edad, esqueléticamente maduras, fueron sometidas a fusión espinal posterolateral lumbar bilateral en las vértebras L5-L6. Los grupos de tratamiento consistirán en: 1) control de cirugía simulada; 2) implante de esponja de colágeno; 3) BMP2 implante de esponja de colágeno; 4) naloxona implante de esponja de colágeno. En condiciones asépticas, se realizó una incisión de 2 cm de longitud en la línea media posterior centrada en las vértebras L5-L6. Se utilizó un enfoque de separación muscular, lateral a las articulaciones facetarias, para exponer las apófisis transversas de una vértebra concreta. Se utilizó una fresa de 1 mm de alta velocidad para decorticar las apófisis transversas de las vértebras L5-L6. Los implantes se prepararon e implantaron entre las apófisis transversas bilateralmente en el lecho muscular paraespinal. Se prepararon implantes de esponja de colágeno bovino (de aproximadamente 1 cm x 1 cm) y luego se empaparon en PBS, 25 ng de BMP2, 1 mM de naloxona (400 jg en 10 jL). Los animales fueron sacrificados a los 2 meses (n=5 ratas por punto de tiempo por grupo de tratamiento para un total de n=20 ratas), se recogieron las columnas vertebrales y se prepararon para el análisis por micro CT (jCT).
Análisis por MicroCT de defectos unicorticales: se adquirieron imágenes de alta resolución de la tibia con un sistema de formación de imágenes jCT ( |j CT40; Scanco Medical). Las tibias se escanearon a 45 keV con un tamaño de vóxel isotrópico de 12 jm. Se seleccionó una región de análisis de las secciones axiales para incluir todo el defecto unicortical limitado por la pared cortical endóstica. La fracción volumétrica ósea (volumen óseo/volumen total; BV/TV), el número trabecular (TbN) y el grosor trabecular (TbTh) se calcularon utilizando el software Scanco.
Análisis estadísticos: se utilizó el software estadístico Prism (Graphpad) para analizar los datos. Se calcularon las medias y las desviaciones estándar. Los datos se analizaron mediante ANOVA de 1 vía utilizando la corrección posthoc de Holm-Sidak para comparaciones múltiples con una significación establecida en p <0,05.
Resultados:
La naloxona y la naltrexona aumentaron la diferenciación de las MSC en osteoblastos y la formación de minerales, al tiempo que disminuyeron el número de osteoclastos: la adición de entre 1 jM y 1 mM de naloxona y medios de osteoinducción aumentó de forma sustancial la acumulación de minerales (tinción roja) en los cultivos de MSC inducidos a convertirse en osteoblastos (Figura 1A). La adición de entre 1 jm y 1 mm de naltrexona y medios de osteoinducción también aumentó los minerales, pero en menor medida que la naloxona (Figura 1A). La expresión del gen del receptor opioide delta (OPRD) fue mayor en las MSC y disminuyó significativamente en los osteoblastos (p <0,0074) y los osteoclastos (p <0,0084) (Figura 1B). La expresión del gen OGFR aumentó en los osteoblastos (p <0,011) y en los osteoclastos (p <0,0001) en comparación con los cultivos de MSC (Figura 1C). La expresión del gen met5 (PENK) no fue diferente entre MSC y osteoblastos; sin embargo, la expresión del gen PENK disminuyó de forma significativa en los osteoclastos (p <0,0018) (Figura 1D). La adición de 5 jM de met5 (PENK) a los medios de osteoinducción no tuvo ningún efecto sobre la acumulación de minerales, mientras que la adición de 50 jM de met5 disminuyó ligeramente la acumulación de minerales (Figura 1E). Sin embargo, cuando se añadió 1 mM de naloxona junto con 5 jM o 50 jM de met5 y medios de osteoinducción, el tratamiento con naloxona fue capaz de anular los efectos antiosteogénicos de met5 (Figura 1E). No se observó la expresión génica del receptor j -opioide, del receptor K-opioide, del precursor de met5 POMC y de la enzima CPA1. Se observó la expresión génica de PCSK1, PCSK2, CPD y CPE en las MSC, los osteoblastos y los osteoclastos, pero no fueron significativamente diferentes entre sí. La adición de una dosis única de "pulso" de naloxona (1 mM) o una dosis doble de "pulso" de naloxona (1 mM) 72 horas después de la primera dosis de "pulso", provocó un aumento sustancial en la acumulación de minerales, mientras que la dosificación continua de naloxona (por ejemplo, con cada cambio de medio) se redujo ligeramente (Figura 1F). Además, puede observarse que la adición de 1 mM de naloxona suprimió, pero no detuvo, la proliferación de Ms C a las 72 horas (p <0,0177) y a las 120 horas (p <0,0001) (Figura 1G). De forma similar, la naloxona redujo la proliferación en los cultivos de monocitos (p <0,0001) (Figura 1H). Los monocitos cultivados para convertirse en osteoclastos no se vieron afectados por el tratamiento con met5 en comparación con los cultivos de osteoclastos de control (tinción de TRAP de color púrpura) (Figura 1I). La adición de 1 jM de naloxona o 1 jM de naltrexona no redujo de forma significativa el número de osteoclastos mientras que la adición de 1 mM de naloxona o 1 mM de naltrexona redujo sustancialmente el número de osteoclastos (Figura 1I).
La pérdida de la expresión del OGFR condujo a un aumento de la expresión de los reguladores transcripcionales osteogénicos en paralelo con un aumento de la expresión de la osteocalcina. Las MSC transfectadas con ARNhc OGFR mostraron una expresión génica del OGFR significativamente reducida (p <0,0085) (Figura 2A), lo que se corroboró con la disminución del OGFR en lisados de proteínas nucleares y citoplásmicas (Figura 2B). Además, en las MSC deficientes en OGFR, la expresión del gen SMAD1 fue significativamente mayor que en las MSC de control y en los cultivos de control transfectados con GFP (p <0,0008) (Figura 2C). La expresión del gen ID1 también se incrementó en las MSC deficientes en OGFR en comparación con las MSC de control y los cultivos de control transfectados con GFP (p <0,0217) (Figura 2D). La proteína osteocalcina específica de osteoblastos (OCN) también aumentó significativamente en las MSC deficientes en OGFR inducidas a convertirse en osteoblastos en comparación con los cultivos de control y el control transfectado con GFP (p <0,0215) (Figura 2E).
El tratamiento con naloxona o naltrexona aumentó la formación ósea en defectos quirúrgicos en un modelo animal. Se aplicaron quirúrgicamente defectos unicorticales a tibias de ratón que luego fueron tratadas con naloxona (1 mM) o met5 (50 jM). La naloxona aumentó la consolidación ósea mientras que met5 no tuvo ningún efecto (Figura 3A y 3B). El tratamiento con naloxona aumentó la masa ósea (BV/TV) 1,53 veces (p <0,001) (Figura 3A). La masa ósea elevada que se midió fue impulsada por un aumento de 1,2 veces en el número trabecular (TbN) (p <0,047) (Figura 3C). Siete días después de la administración quirúrgica, la consolidación de la fractura de un defecto unicortical, medida por BV/TV, aumentó un 25,6 % en el grupo de control quirúrgico (Control Sx) en comparación con los controles no quirúrgicos (p <0,034) (Figura 3D). Los defectos tratados con PBS o met5 en combinación con un implante de colágeno no fueron significativamente diferentes del grupo de control quirúrgico, con respecto a la consolidación de la fractura. Sin embargo, en el tratamiento con PBS o met5 en combinación con el implante de colágeno fue, aproximadamente, un 37 % mayor que el grupo de control no quirúrgico, lo que coincide con la diferencia observada entre los grupos de control quirúrgico y no quirúrgico (p <0,003) (Figura 3D). El tratamiento del defecto con BMP2 y el implante de colágeno produjo un aumento de la BV/TV del 32,4 % en comparación con el grupo tratado con PBS y del 55,6 % en comparación con el grupo de control quirúrgico (p <0,0124 y p <0,005, respectivamente) (Figura 3D). No hubo diferencias significativas entre el grupo tratado con BMP2 y el grupo tratado con naltrexona. Los defectos tratados con naltrexona y un implante de colágeno aumentaron la BV/TV en un 39,2 % en comparación con el grupo de tratamiento con p Bs y en un 63,5 % en comparación con el grupo de control quirúrgico (p <0,0043 y p <0,0001, respectivamente) (Figura 3D). Por último, los defectos tratados con naloxona y el implante de colágeno presentaron un aumento de la BV/TV del 56,5 % en comparación con los defectos tratados con PBS y del 83,8 % en comparación con el grupo de control quirúrgico (p <0,0001) (Figura 3D). Además, el tratamiento con naloxona aumentó la BV/TV en el defecto en un 18,2 % en comparación con el grupo de tratamiento con BMP2 (p <0,035) (Figura 3D). El grosor trabecular es un parámetro estructural relacionado con la BV/TV, que se relaciona con la masa ósea dentro del campo de interés. El grosor trabecular se incrementó significativamente dentro del defecto en los grupos de control quirúrgico (p <0,032), met5 (p <0,039), BMP2 (p <0,025), naltrexona (p <0,025) y naloxona (p <0,001) en comparación con el grupo de control no quirúrgico (Figura 3E). El tratamiento del defecto con naloxona aumentó el grosor trabecular aproximadamente un 37 % en comparación con todos los demás grupos de tratamiento (p <0,001) (Figura 3E). Además, el aumento de la BV/TV observado en el tratamiento de los defectos con naloxona parece deberse principalmente a un aumento del grosor trabecular, mientras que el tratamiento con BMP2 o naltrexona aumentó la BV/TV tanto a través del número trabecular como del grosor trabecular. La adición de un implante de colágeno infundido con naloxona a la columna lumbar posterolateral dio lugar a un aumento sustancial de la BV/TV en comparación con las columnas a las que se implantó colágeno o el grupo de cirugía simulada de control (Figuras 3F y 3G).
Ejemplo 2: los antagonistas del OGFR no estimulan la proliferación de tumores de sarcoma a pesar de la expresión del gen OGFR en células de sarcoma.
Procedimientos: se recogió médula ósea humana de pacientes adultos que prestaron su consentimiento para someterse a una artroplastia total de cadera femoral proximal primaria electiva o una artroplastia total de rodilla femoral distal primaria electiva (n=6, edad media de 65 años) como parte de un estudio aprobado por el IRB. Las MSC humanas se obtuvieron de la fracción adherente de aspirados de médula ósea completos. Las células tumorales de sarcoma de Ewing (RDES, Hs822 y Hs863) y las células tumorales de osteosarcoma SaOS2 se obtuvieron de ATCC. Las células se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía suero de ternero fetal al 10 % (v/v) y penicilina-estreptomicina-glutamina al 1 % (PSG; Cellgro, Mediatech).
Análisis de la expresión génica: se analizaron MSC, osteoblastos y adipocitos derivados de médula ósea humana para determinar los cambios en la expresión génica. En paralelo, también se analizaron osteoclastos derivados de monocitos humanos para determinar los cambios en la expresión génica mieloide. Los datos de los genes se obtuvieron a partir de dos muestras generadas de forma independiente y recogidas de al menos tres pacientes. El ARNm se purificó utilizando columnas RNeasy Plus Mini (Qiagen) y el ADNc se sintetizó utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad). La expresión génica se analizó mediante PCR cuantitativa (PCRq) utilizando 100 ng de ADNc mezclado con Fast Plus EvaGreen Master Mix (Biotium). En cada experimento, GAPDH sirvió como control, los controles negativos no contenían plantilla y se generó una curva estándar utilizando diluciones seriadas de una secuencia sintetizada químicamente de GAPDH (0, 1, 10 y 100 femtogramos; Integrated DNA Technologies). La expresión génica se evaluó mediante el procedimiento de Pfaffl, en el que la eficiencia de cada cebador (E) y la concentración inicial del producto génico (No) se calculan a partir de la región lineal de la curva de umbral de cruce de fluorescencia utilizando el software LinRegPCR (v2013.0). Los experimentos se consideraron válidos cuando el gen de control GAPDH cayó dentro de la curva estándar y se calculó que las eficiencias del cebador (E) eran E>=1,8. La presencia de un único producto génico se confirmó utilizando un análisis de la curva de fusión y el tamaño del producto se confirmó mediante electroforesis en gel del producto génico.
Determinación del número de células: tras la adición de 1 mM de naloxona o 1 mM de naltrexona, se determinó el número de células viables con el ensayo MTT. Después de 72 horas y 120 horas, se añadió MTT (5 mg/ml (p/v), Sigma) a cada pocillo, se incubó durante 2 horas, tras lo cual las células se lisaron con 500 pl de DMSO (Sigma). El MTT se midió a 570 nm y los efectos de la terapia sobre la proliferación celular se determinaron normalizando los pocillos tratados con respecto a los valores medios de los pocillos no tratados: factor de cambio del número de células = 100*[densidad óptica de células tratadas/densidad óptica media del control].
Análisis estadísticos: se utilizó el software estadístico Prism (Graphpad) para analizar los datos. Se calcularon las medias y las desviaciones estándar. Los datos se analizaron mediante ANOVA de 1 vía o de 2 vías utilizando la corrección post-hoc de Holm-Sidak para comparaciones múltiples con una significación establecida en p <0,05.
Resultados:
Los tumores de osteosarcoma y sarcoma de Ewing expresan el OGFR y la naloxona y la naltrexona inhiben la proliferación tumoral. Se observó expresión del gen OGFr en osteoblastos (p <0,018), células tumorales óseas de sarcoma de Ewing RDES (p <0,0014), células tumorales óseas de sarcoma de Ewing Hs822t (p <0,0001), células tumorales óseas de sarcoma de Ewing Hs863t (p <0,039) y células tumorales de osteosarcoma SaOS2 (p <0,05) (Figura 4A). Setenta y dos horas después de la adición de 1 mM de naloxona o 1 mM de naltrexona, el número de células de osteosarcoma SaOS2 disminuyó significativamente en comparación con los cultivos de control (p <0,0001). El ligando del OGFR, met5, no tuvo ningún efecto sobre el número de células (Figura 4B). La línea de células tumorales óseas de sarcoma de Ewing Hs822t se adhirió al cultivo. Setenta y dos horas después de la

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Antagonista del receptor del factor de crecimiento opioide (OGFR) para su uso en un procedimiento para favorecer la formación ósea o reducir la destrucción ósea en un sitio de lesión o de intervención quirúrgica, donde el antagonista del OGFR es un derivado de oximorfona que se selecciona del grupo que consiste en naloxona, naltrexona, una sal de las mismas, o una combinación de las mismas; nalorfina, naloxonazina, levalorfano, nalmefeno, ciprodima, ciclorfano, ciclazocina, oxilorfano, LY113878, MR2266, diprenorfina, WIN 44,441-3, naltindole y norbinaltorfimina y, además, donde el antagonista del OGFR se administra de forma local al sitio de la lesión o de la intervención quirúrgica.
2. Antagonista del OGFR para su uso en un procedimiento para favorecer el reclutamiento de células madre mesenquimales (MSC) a un sitio local de lesión o intervención quirúrgica del hueso con el fin de favorecer la consolidación, donde el antagonista del OGFR es un derivado de oximorfona que se selecciona del grupo que consiste en naloxona, naltrexona, una sal de las mismas, o una combinación de las mismas; nalorfina, naloxonazina, levalorfano, nalmefeno, ciprodima, ciclorfano, ciclazocina, oxilorfano, LY113878, MR2266, diprenorfina, WIN 44,441­ 3, naltindole y norbinaltorfimina y, además, donde el antagonista del OGFR se administra de forma local al sitio de la lesión o de la intervención quirúrgica.
3. Antagonista del OGFR para su uso según la reivindicación 1 o 2, donde el antagonista del OGFR se administra con un portador.
4. Antagonista del OGFR para su uso según la reivindicación 3, donde dicho portador es un portador a base de colágeno en forma de esponja de colágeno, colágeno en polvo o hidrogel de gelatina a base de colágeno.
5. Antagonista del OGFR para su uso según la reivindicación 3, donde el portador es un portador a base de albúmina.
6. Antagonista del OGFR para su uso según la reivindicación 3, donde el portador es un portador a base de hidrogel hidrófilo.
7. Antagonista del OGFR para su uso según la reivindicación 3, donde el portador es un implante quirúrgico o un sistema de aplicación de implantes quirúrgicos.
8. Antagonista del OGFR para su uso según la reivindicación 3, donde el portador está compuesto por beta-fosfato tricálcico, cemento o matriz ósea desmineralizada.
9. Antagonista del OGFR para su uso según la reivindicación 3, donde el portador está compuesto por esferas de PGA/PLGA.
10. Antagonista del OGFR para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde el antagonista del OGFR se administra en combinación con al menos otro agente activo que favorece la formación ósea o el crecimiento óseo, y donde el al menos otro agente activo se selecciona del grupo que consiste en un factor de crecimiento, una citoquina y una célula.
11. Antagonista del OGFR para su uso según la reivindicación 10, donde el al menos otro agente activo se selecciona del grupo que consiste en una molécula de BMP, una molécula de TGFp y un inhibidor del TGFp.
12. Antagonista del OGFR para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde la lesión comprende una fractura ósea.
13. Antagonista del OGFR para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde dicha intervención quirúrgica se selecciona de entre una reparación quirúrgica de fractura, un procedimiento quirúrgico para crear hueso en fusión espinal y un procedimiento quirúrgico para favorecer la integración de implantes o de materiales ortopédicos con hueso adyacente.
14. Antagonista del OGFR para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde el antagonista del OGFR es naloxona.
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