CN101616677A - 含脂质的制品 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了用于施予基于核酸的治疗剂的组合物和方法，所述组合物例如缔合复合物，如脂质体和脂质复合物(lipoplexes)。

Description

含脂质的制品
技术领域
本发明涉及用于施予基于核酸的治疗剂的组合物和方法，例如缔合复合物(association complex)，如脂质体和脂质复合物(lipoplexes)。
背景技术
使用基于核酸的治疗剂很有可能为目前常规医药不能解决的医学问题提供解决方案。随着越来越多的疾病相关基因位置和序列的确定，目前正在对针对多种疾病的基于核酸的治疗剂进行临床测试。
将核酸引入到细胞中的方法之一是使用直接显微注射的机械方法。然而，该方法通常不能有效地向受试者全身给药。
核酸治疗剂的全身递送需要将核酸传送至靶细胞，随后将核酸以能够按治疗方式起作用的形式完整地运送通过靶细胞膜。
在一些情况中，已经在临床上成功地使用病毒载体施予基于核酸的治疗剂。然而，尽管病毒载体具有将核酸运送通过细胞膜的固有能力，它们也会构成风险。此类风险之一涉及病毒基因序列随机整合进入患者的染色体中，潜在地破坏其基因组并有可能诱发恶性转化。另一个风险在于病毒载体可能通过突变或与野生型病毒的基因交换而回复成致病性基因型。
基于脂质的载体也已用于核酸治疗剂，并已通过以下两种方法之一进行配制。在一种方法中，将核酸引入到由阳离子脂质和中性脂质的混合物制成的预制脂质体或脂质复合物中。由此形成的复合物具有不确定的复杂结构，并且因血清的存在而使其转染效率显著下降。第二种方法包括使用不含中性脂质的单阳离子脂质或多阳离子脂质形成DNA复合物。这些复合物在乙醇存在的条件下制备，并且在水中不稳定。另外，这些复合物也受到血清的不利影响(参见，Behr，Acc.Chem.Res.26：274-78(1993))。
发明内容
本发明描述了包括多胺化合物或本文所述脂质部分的新型制品。
在一些实施方案中，本发明描述了包含一种或多种化合物或其药学上可接受的盐的制品，其中每种所述化合物分别具有式(I)定义的结构，
式(I)
其中
Xa和Xb在每次出现时分别独立地为C1-6亚烷基；
n为0、1、2、3、4或5；各个R独立地为H、
Figure G2007800447386D00022
其中，在所述制品中，至少约50％的式(I)化合物分子(例如，至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或基本全部)中的至少n+2个R基团不是H；
m为1、2、3或4；Y为O、NR2或S；
R1为烷基、烯基或炔基；其每一个任选被一个或多个取代基取代；和
R2为H、烷基、烯基或炔基；其每一个任选被一个或多个取代基取代；
前提是，如果n＝0，那么至少n+3个R基团不是H。
在一些实施方案中，当R不是H时，R为Ra，例如当R不是H时，R在每次出现时均为Ra。
在一些实施方案中，当R不是H时，R为Rb，例如当R不是H时，R在每次出现时均为Rb。
在一些实施方案中，当R不是H时，R为Rc，例如当R不是H时，R在每次出现时均为Rc。
在一些实施方案中，当R不是H时，R为Rd，例如当R不是H时，R在每次出现时均为Rd。
在一些实施方案中，当R不是H时，R为Re，例如当R不是H时，R在每次出现时均为Re。
在一些实施方案中，式(I)中n+2个R基团不是H。在一些实施方案中，式(I)中n+3个R基团不是H。在一些实施方案中，式(I)中n+4个R基团不是H。
在一些实施方案中，式(I)中n+1个R基团不是H。
在一些实施方案中，n＞0，且式(I)中NR的至少一个R为H。
在一些实施方案中，式(I)中NR2的至少一个R为H。
在一些实施方案中，至少80％的分子为一种结构异构体。例如，式(I)中n+2个R基团不是H，或式(I)中n+3个R基团不是H，或式(I)中n+4个R基团不是H。
在一些实施方案中，n为2或0。
在一些实施方案中，Xa和Xb为C2亚烷基。
在一些实施方案中，n为0，且Xb为亚乙基或亚丙基。
在一些实施方案中，n＞0，至少有一次出现的Xa不同。
在一些实施方案中，当R不为H时，R为
Figure G2007800447386D00031
例如，Y可以为O或NR2。在一些实施方案中，m为2。在一些实施方案中，Y为O或NR2，m为2。在一些实施方案中，m为1。在一些实施方案中，m为1，Y为O或NR2。
在一些实施方案中，R1在至少一次出现时为烷基，例如R1在每次出现时均为烷基。
在一些实施方案中，在至少一次出现时(例如在每次出现时)，R1为烷基，R2为H。
在一些实施方案中，在至少一次出现时(例如在每次出现时)，R1和R2为烷基。
在一些实施方案中，R1在至少一次出现时为烯基。
在一些实施方案中，R1在至少一次出现时为烯基。
在一些实施方案中，当R在至少一次出现时(例如在每次出现时)不是H时，R为Ra，Y为O或NH。在一些实施方案中，Y为O。在一些实施方案中，Y为NH。在一些实施方案中，R1为烷基，例如C10-30烷基或C12烷基。在一些实施方案中，n为2。在一些实施方案中，Xa在每次出现时均为C2亚烷基，Xb为C2亚烷基。在一些实施方案中，m为2。
在一些实施方案中，n为2，当R在至少一次出现时(例如在每次出现时)不是H时，R为Ra。在一些实施方案中，R1为烷基，例如C10-18烷基或C12烷基。在一些实施方案中，Y为O或Y为NH。在一些实施方案中，Xa在每次出现时均为C2亚烷基，Xb为C2亚烷基。在一些实施方案中，m为2。
在一些实施方案中，NR中的至少一个R为H，当R在至少一次出现时(例如在每次出现时)不是H时，R为Ra，Y为O或NH。在一些实施方案中，Y为O或Y为NH。在一些实施方案中，R1为烷基，例如C10-18烷基或C12烷基。在一些实施方案中，n为2。在一些实施方案中，Xa在每次出现时均为C2亚烷基，Xb为C2亚烷基。在一些实施方案中，m为2。
在一些实施方案中，n为2，NR中的至少一个R为H，当R在至少一次出现时(例如在每次出现时)不是H时，R为Ra，Y为O或NH。在一些实施方案中，R1为烷基，例如C10-18烷基或C12烷基。在一些实施方案中，Y为O或Y为NH。在一些实施方案中，Xa在每次出现时均为C2亚烷基，Xb为C2亚烷基。在一些实施方案中，m为2。
在一些实施方案中，NR2中的至少一个R为H，且R在至少一次出现时(例如在每次出现时)为Ra，且其中Y为O或NH。在一些实施方案中，Y为O或Y为NH。在一些实施方案中，R1为烷基，例如C10-30烷基、C10-18烷基或C12烷基。在一些实施方案中，n为2。在一些实施方案中，Xa在每次出现时均为C2亚烷基，Xb为C2亚烷基。在一些实施方案中，m为2。
在一些实施方案中，n为2，NR2中的至少一个R为H，且R在至少一次出现时(例如在每次出现时)为Ra，且其中Y为O或NH。在一些实施方案中，R1为烷基，例如C10-18烷基或C12烷基。在一些实施方案中，Y为O或Y为NH。在一些实施方案中，Xa在每次出现时均为C2亚烷基，Xb为C2亚烷基。在一些实施方案中，m为2。
在一些实施方案中，该制品包含下式之一或下式的混合物，其中除非在下式中另有说明，否则R不是H。
在一些实施方案中，该制品主要由下式之一或下式的混合物组成，在一些实施方案中，各个R均为
Figure G2007800447386D00053
在一些实施方案中，各个R均为
Figure G2007800447386D00054
在一些实施方案中，R1为C10-18烷基(例如，C12烷基)或C10-30烯基。
在一些实施方案中，R为
Figure G2007800447386D00055
在一些实施方案中，R1为C10-18烷基，例如，C12烷基。在一些实施方案中，R1为C12烷基，R2为H。
在一些实施方案中，n为0，X为亚丙基。在一些实施方案中，一个R为H，在一些实施方案中，当R在至少一次出现时(例如在每次出现时)不是H时，R为Ra。在一些实施方案中，R1为烷基，例如C10-30烷基或C12烷基。在一些实施方案中，Y为O或Y为NH。在一些实施方案中，m为2。
在一些实施方案中，式(I)为在一些实施方案中，R为在一些实施方案中，R1为C10-18烷基或C10-C30烯基。在一些实施方案中，R为
Figure G2007800447386D00058
在一些实施方案中，R1为C10-18烷基或C10-C30烯基，R2为H。
在一些实施方案中，
n为2；
Xa在每次出现时均为C2亚烷基，Xb为C2亚烷基；且
其中
各个R在至少一次出现时(例如在每次出现时)为H或
Figure G2007800447386D00061
m为2；
Y为NH或O；
R1为C12烷基。在一些实施方案中，至少80％的式(I)化合物分子为一种结构异构体。在一些实施方案中，Y为NH，例如其中至少80％的式(I)化合物分子为一种结构异构体。在一些实施方案中，R在5次出现时均为Ra。在一些实施方案中，在至少80％的式(I)化合物分子中，R在5次出现时均为Ra。在一些实施方案中，Y为NH。
在一些实施方案中，式(I)化合物为其无机盐或有机盐，例如其氢卤酸盐(例如其盐酸盐)。在一些实施方案中，盐酸盐的范围为从1当量HCl到n+2当量HCl。在一些实施方案中，式(I)化合物为有机酸盐，例如乙酸盐，如从1当量乙酸盐到n+2当量乙酸盐范围的乙酸盐；或甲酸盐，例如如从1当量甲酸盐到n+2当量甲酸盐范围的甲酸盐。
在一些实施方案中，式(I)化合物为水合物的形式。
在一些实施方案中，R1在至少一次出现时(例如在每次出现时)包含烯基部分，例如R1包含顺式双键。
一方面，本发明描述了包含式(I)化合物和核酸(例如，RNA(如siRNA或dsRNA)或DNA)的制品。在一些实施方案中，该制品还包括其他脂质，例如膜融合脂质(fusogenic lipid)或PEG-脂质。
在一些实施方案中，该制品包含小于11重量％的下式(III)：
式(III)
其中，X和n的定义与在上式(I)中类似。
在一些实施方案中，该制品包含小于90重量％的下式(IV)
Figure G2007800447386D00071
式(IV)
其中，Y和R1的定义与在上式(I)中类似。
在一些实施方案中，该制品包含多种式(I)的化合物。
在一些实施方案中，该制品包含下式化合物的混合物：
Figure G2007800447386D00072
式(I′)                           式(I″)
其中在式(I′)中，有5个R基团为Ra。在一些实施方案中，式(I′)和式(I″)以约1∶2至约2∶1的比例存在。
一方面，本发明描述了式(II)化合物的制备方法，
Figure G2007800447386D00073
式(II)
其中
Xa和Xb在每次出现时分别独立地为C1-6亚烷基；
n为0、1、2、3、4或5；且
其中
R分别独立地为H或
Figure G2007800447386D00074
m为2；
Y为O、NR2或S；
R1为烷基或烯基；
R2为H或C烷基或烯基；
所述方法包括在存在促进剂的条件下使式(III)的化合物
Figure G2007800447386D00081
式(III)
与式(IV)的化合物
Figure G2007800447386D00082
式(IV)
反应。
一方面，本发明描述了式(II)化合物的制备方法，
Figure G2007800447386D00083
式(II)
其中
Xa和Xb在每次出现时分别独立地为C1-6亚烷基；
n为0、1、2、3、4或5；且
其中
R分别独立地为H或
m为2；
Y为O、NR2或S；
R1为烷基或烯基；
R2为H或C烷基或烯基；
所述方法包括在存在淬灭剂的条件下使式(III)的化合物
Figure G2007800447386D00085
式(III)
与式(IV)的化合物
式(IV)
反应。
一方面，本发明描述了式(II)化合物的制备方法，
式(II)
其中
Xa和Xb在每次出现时分别独立地为C1-6亚烷基；
n为0、1、2、3、4或5；且
其中
R分别独立地为H或
Figure G2007800447386D00093
m为2；
Y为O、NR2或S；
R1为烷基或烯基；
R2为H或烷基或烯基；
所述方法包括使式(III)的化合物
式(III)
与式(IV)的化合物反应，
Figure G2007800447386D00095
式(IV)
其中，反应混合物包含约0.8～约1.2摩尔当量的式(III)的化合物，以及约3.8～约6.5摩尔当量的式(IV)的化合物。
在一些实施方案中，反应混合物包含约0.8～约1.2摩尔当量的式(III)的化合物，以及约5.5～约6.5摩尔当量的式(IV)的化合物。在一些实施方案中，反应混合物包含约1摩尔当量的式(III)的化合物，以及约6摩尔当量的式(IV)的化合物。在一些实施方案中，反应混合物包含约1摩尔当量的式(III)的化合物，以及约5摩尔当量的式(IV)的化合物。
一方面，本发明描述了式(II)化合物的制备方法，
Figure G2007800447386D00101
式(II)
其中
Xa和Xb在每次出现时分别独立地为C1-6亚烷基；
n为0、1、2、3、4或5；且
其中
R分别独立地为H或
Figure G2007800447386D00102
m为2；
Y为O、NR2或S；
R1为烷基或烯基；
R2为H或烷基或烯基；
所述方法包括在存在硼酸和水的条件下使式(III)的化合物
Figure G2007800447386D00103
式(III)
与式(IV)化合物反应的两步过程，
Figure G2007800447386D00111
式(IV)
其中，第一步涉及包含约0.8～约1.2摩尔当量的式(III)化合物以及约3.8～约4.2摩尔当量的式(IV)化合物的反应混合物，而第二步涉及添加约0.8～1.2摩尔当量的式(IV)的化合物。
一方面，本发明描述了式(II)化合物的制备方法，
式(II)
其中
Xa和Xb在每次出现时分别独立地为C1-6亚烷基；
n为0、1、2、3、4或5；且
其中
各个R独立地为H或
Figure G2007800447386D00113
m为2；
Y为O、NR2或S；
R1为烷基或烯基；
R2为H或烷基或烯基；
所述方法包括使式(III)的化合物
Figure G2007800447386D00114
式(III)
与式(IV)的化合物反应，
Figure G2007800447386D00121
式(IV)
并从反应混合物中分离至少一种式(II)的结构异构体，从而提供包含式(II)的结构异构体的基本纯化的制品。
在一些实施方案中，使用色谱分离法从反应混合物中分离式(II)的结构异构体。在一些实施方案中，所述色谱分离法使用快速硅胶(flash silica gel)分离异构体。在一些实施方案中，所述色谱分离法为使用硅胶分离异构体的重力分离法。在一些实施方案中，所述色谱分离法使用移动床色谱分离异构体。在一些实施方案中，所述色谱分离法使用液相色谱(LC)分离异构体。在一些实施方案中，所述色谱分离法使用正相HPLC分离异构体。在一些实施方案中，所述色谱分离法使用反相HPLC分离异构体。
在一些实施方案中，基本纯化的制品包含至少约80％的式(II)的结构异构体，例如至少约90％的式(II)的结构异构体，至少约95％的式(II)的结构异构体。
在另一方面，本发明描述了式(V)的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，
Figure G2007800447386D00122
式(V)
其中
Xa和Xb在每次出现时分别独立地为C1-6亚烷基；
n为0、1、2、3、4或5；且
其中
R分别独立地为H或
Figure G2007800447386D00123
m为1；
Y为O、NR2或S；
R1为烷基或烯基；
R2为H或烷基或烯基；
所述方法包括使式(III)的化合物
Figure G2007800447386D00131
式(III)
与式(VI)的化合物反应，
Figure G2007800447386D00132
Q＝Cl或Br或I
式(VI)
以提供式(V)的化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述其药学上可接受的盐为式(V)化合物的盐酸盐。
一方面，本发明描述了式(X)的化合物及其药学上可接受的盐，
Figure G2007800447386D00133
式(X)
其中
R1和R2分别独立地为H、任选被1-4个R5取代的C1-C6烷基、任选被1-4个R5取代的C2-C6烯基、或C(NR6)(NR6)2；
R3和R4分别独立地为烷基、烯基、炔基，且分别任选被氟、氯、溴、碘取代；
L1和L2分别独立地为-NR6C(O)-、-C(O)NR6-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-S-、-N(R6)C(O)N(R6)-、-OC(O)N(R6)-、-N(R6)C(O)O-、-O-N＝C-、OR、-OC(O)NH-N＝C-或-NHC(O)NH-N＝C-；
L1-R3和L2-R4可共同形成缩醛、缩酮或原酸酯(orthoester)，其中R3和R4的定义如上所述并且也可以为H或苯基；
R5为氟、氯、溴、碘、-OR7、-N(R8)(R9)、-CN、SR10、S(O)R10、S(O)2R10；
R6为H、C1-C6烷基；
R7为H或C1-C6烷基；
R8和R9分别独立地为H或C1-C6烷基；
R10为H或C1-C6烷基；
m为1、2、3、4、5或6；
n为0、1、2、3、4、5或6。
在一些实施方案中，该化合物为其无机盐，例如其氢卤酸盐，如其盐酸盐。在一些实施方案中，该化合物为其有机盐。
在一些实施方案中，R1和R2分别独立地为C1-C3烷基。
在一些实施方案中，R1为甲基。
在一些实施方案中，R2为甲基。
在一些实施方案中，R1和R2均为甲基。
在一些实施方案中，R1为H、甲基、乙基、异丙基或2-羟乙基。
在一些实施方案中，R2为H。
在一些实施方案中，R2为H、甲基、乙基、丙基或异丙基。
在一些实施方案中，R1为H、甲基、乙基、异丙基或2-羟乙基，R2为H、甲基、乙基、丙基或异丙基。
在一些实施方案中，m为1。
在一些实施方案中，n为1。
在一些实施方案中，m和n均为1。
在一些实施方案中，L1为-NR6C(O)-或-C(O)NR6-。
在一些实施方案中，L1为-OC(O)-或-C(O)O-。
在一些实施方案中，L1为S-S-。
在一些实施方案中，L1为-N(R6)C(O)N(R6)-。
在一些实施方案中，L1为-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-。
在一些实施方案中，L1为-O-N＝C-。
在一些实施方案中，L1为-OC(O)NH-N＝C-或-NHC(O)NH-N＝C-。
在一些实施方案中，L2为-NR6C(O)-或-C(O)NR6-。
在一些实施方案中，L2为-OC(O)-或-C(O)O-。
在一些实施方案中，L2为S-S-。
在一些实施方案中，L2为-N(R6)C(O)N(R6)-。
在一些实施方案中，L2为-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-。
在一些实施方案中，L2为-O-N＝C-。
在一些实施方案中，L2为-OC(O)NH-N＝C-或-NHC(O)NH-N＝C-。
在一些实施方案中，L1和L2均为-NR6C(O)-或-C(O)NR6-。
在一些实施方案中，L1和L2均为-OC(O)-或-C(O)O-。
在一些实施方案中，L1和L2均为S-S-。
在一些实施方案中，L1和L2均为-N(R6)C(O)N(R6)-。
在一些实施方案中，L1和L2均为-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-。
在一些实施方案中，L1为-NR6C(O)-，L2为-S-S-。
在一些实施方案中，L1为-OC(O)-，L2为-S-S-。
在一些实施方案中，L1为-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-，L2为-S-S-。
在一些实施方案中，L1为-N(R6)C(O)N(R6)-，L2为-S-S-。
在一些实施方案中，L1-R3和L2-R4共同形成缩醛、缩酮或原酸酯。
在一些实施方案中，R3和R4分别独立地为烷基。
在一些实施方案中，R3和R4分别独立地为C6-C28烷基。
在一些实施方案中，L1和L2独立地为-S-S-、-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-。
在一些实施方案中，R3为烷基。
在一些实施方案中，R4为烷基。
在一些实施方案中，R3为烯基。
在一些实施方案中，R4为烯基。
在一些实施方案中，R3和R4分别独立地为烯基，例如R3和R4分别独立地为C6-C30烯基或R3和R4分别为相同的烯基部分。
在一些实施方案中，R3和R4分别包括两个双键部分。在一些实施方案中，至少一个双键具有Z构型。在一些实施方案中，两个双键均具有Z构型。在一些实施方案中，R3和R4中的至少一个为下式(II)，
Figure G2007800447386D00161
式(II)
其中
x为1～8的整数；且
y为1～10的整数。在一些实施方案中，R3和R4均为式(II)。在一些实施方案中，至少一个双键具有E构型，例如两个双键均具有E构型。在一些实施方案中，R1和R2中的至少一个为下式(III)
Figure G2007800447386D00162
式(III)
其中
x为1～8的整数；且y为1～10的整数。
在一些实施方案中，R1和R2分别包括三个双键部分。在一些实施方案中，至少一个双键具有Z构型。在一些实施方案中，至少两个双键具有Z构型。在一些实施方案中，三个双键均具有Z构型。在一些实施方案中，R1和R2中的至少一个为下式(IV)
Figure G2007800447386D00163
式(IV)
其中
x为1～8的整数；且
y为1～10的整数。在一些实施方案中，R1和R2均为式(IV)。在一些实施方案中，至少一个双键具有E构型。在一些实施方案中，至少两个双键具有E构型。在一些实施方案中，三个双键均具有E构型。在一些实施方案中，R1和R2中的至少一个为下式(V)
Figure G2007800447386D00164
式(V)
其中
x为1～8的整数；且y为1～10的整数。在一些实施方案中，R1和R2均为式(V)。
在一些实施方案中，R1和R2分别为C1-C6烷基(例如，甲基)，L1和L1分别为-OC(O)-，R3和R4分别为烯基。在一些实施方案中，R3和R4相同。在一些实施方案中，R3和R4均包含两个双键(例如具有顺式连接)。在一些实施方案中，R3和R4为下式(II)，
Figure G2007800447386D00171
式(II)
其中
x为1～8的整数，例如5；且y为1～10的整数，例如4。
另一方面，本发明描述了包含式(X)化合物的制品。
一方面，本发明描述了包含式(X)化合物和核酸(例如，RNA(如siRNA或dsRNA)或DNA)的制品。在一些实施方案中，该制品还包括其他脂质，例如膜融合脂质或PEG-脂质。
一方面，本发明描述了式(X)化合物的制备方法，
Figure G2007800447386D00172
式(X)
其中
R1和R2分别独立地为C1-C6烷基，其任选被1-4个R5取代；
R3为烷基、烯基、炔基；
L1为-OC(O)-；
R5为-OR7、-N(R8)(R9)、-CN、SR10、S(O)R10、S(O)2R10；
R6为H、C1-C6烷基；
R7为H或C1-C6烷基；
R8和R9分别独立地为H或C1-C6烷基；
R10为H或C1-C6烷基；
m和n分别独立地为1、2、3、4、5或6；
所述方法包括在存在偶联剂的条件下使式(VI)的化合物
Figure G2007800447386D00181
式(VI)
与式(VII)的化合物反应，
Figure G2007800447386D00182
式(VII)
从而提供式(X)的化合物。
在一些实施方案中，所述偶联剂为碳二亚胺，例如EDCI。
一方面，本发明描述了下式(XV)的化合物，
Figure G2007800447386D00183
式(XV)
其中，
L1和L2分别独立地为连接键或C(O)；
R1和R2分别独立地为烷基、烯基或炔基；其每一个任选被一个或多个取代基取代；
X为-C(O)NH-、C(S)NH、-C(O)C1-3烷基C(O)NH-；或-C(O)C1-3烷基C(O)O-；
m为0～11的整数，和
n为1～500的整数。
在一些实施方案中，L1和L2均为连接键。
在一些实施方案中，L1和L2均为C(O)。
在一些实施方案中，R1和R2分别独立地为烷基，例如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C13烷基、C14烷基、C15烷基或C16烷基。在一些实施方案中，R1和R2均为烷基，例如长度相同的直链烷基，如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C13烷基、C14烷基、C15烷基或C16烷基。在一些优选的实施方案中，R1和R2均为C14烷基。
在一些实施方案中，式XV代表外消旋混合物。
在一些实施方案中，式XV的化合物具有例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的R对映异构体过量。在一些实施方案中，式XV代表光学纯‘R’异构体。
在一些实施方案中，式XV的化合物具有例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的S对映异构体过量。在一些实施方案中，式XV代表光学纯‘S’异构体。
在一些实施方案中，R1和R2分别独立地为烯基，例如R1和R2分别独立地为C6-C30烯基，或R1和R2分别为相同的烯基部分。在一些实施方案中，R1和R2分别包含单个双键，例如为E或Z构型的单个双键。
在一些实施方案中，R1和R2分别包含两个双键部分。在一些实施方案中，至少一个双键具有Z构型。在一些实施方案中，两个双键均具有Z构型。在一些实施方案中，R1和R2中的至少一个为下式(II)，
Figure G2007800447386D00191
式(II)
其中
x为1～8的整数；且
y为1～10的整数。在一些实施方案中，R1和R2均为式(II)。在一些实施方案中，至少一个双键具有E构型，例如两个双键均具有E构型。在一些实施方案中，R1和R2中的至少一个为下式(III)，
Figure G2007800447386D00192
式(III)
其中
x为1～8的整数；且y为1～10的整数。
在一些实施方案中，R1和R2分别包括三个双键部分。在一些实施方案中，至少一个双键具有Z构型。在一些实施方案中，至少两个双键具有Z构型。在一些实施方案中，三个双键均具有Z构型。在一些实施方案中，R1和R2中的至少一个为下式(IV)
Figure G2007800447386D00201
式(IV)
其中
x为1～8的整数；且
y为1～10的整数。在一些实施方案中，R1和R2均为式(IV)。在一些实施方案中，至少一个双键具有E构型。在一些实施方案中，至少两个双键具有E构型。在一些实施方案中，三个双键均具有E构型。在一些实施方案中，R1和R2中的至少一个为下式(V)
Figure G2007800447386D00202
式(V)
其中
x为1～8的整数；且
y为1～10的整数。在一些实施方案中，R3和R4均为式(V)。
在一些实施方案中，X为-C(O)NH-，从而提供下式(XV′)的化合物：
Figure G2007800447386D00203
式(XV′)
在一些实施方案中，R1和R2分别独立地为烷基，例如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C13烷基、C14烷基、C15烷基或C16烷基。在一些实施方案中，R1和R2均为烷基，例如长度相同的直链烷基，如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C13烷基、C14烷基、C15烷基或C16烷基。在一些实施方案中，R1和R2均为C14烷基。
在一些实施方案中，X为-C(O)C1-3烷基C(O)O-。
在一些实施方案中，m为1～10的整数，例如2～4的整数，或整数2。
在一些实施方案中，n为1～500的整数，例如40～400的整数，100～350的整数，40～50的整数或42～47的整数。
在一些实施方案中，所述化合物为式(XV′)的化合物，
Figure G2007800447386D00211
式(XV′)
其中，L1和L2均为连接键。在一些实施方案中，R1和R2分别独立地为烷基，例如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C14烷基、C15烷基或C16烷基。在一些实施方案中，R1和R2均为烷基，例如长度相同的直链烷基，如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C14烷基、C15烷基或C16烷基。在一些优选的实施方案中，R1和R2均为C14烷基。在一些实施方案中，m为1～10的整数，例如2～4的整数，或整数2。在一些实施方案中，n为1～500的整数，例如40～400的整数或40～50的整数。
在一些实施方案中，该化合物为式(XV′)的化合物，其中L1和L2均为连接键，R1和R2均为烷基(例如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，优选C14烷基)，n为约40～400的整数。
在一些实施方案中，该化合物具有下式(XVI)结构：
Figure G2007800447386D00212
式(XVI)
其中，重复PEG部分的平均分子量为2000，n值在42～47之间。
在一些实施方案中，式XV的化合物具有例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的R对映异构体过量。在一些实施方案中，式XVI的化合物为具有优选的‘R’绝对构型的立体异构体。
一方面，本发明描述了与胆固醇部分结合的PEG脂质。例如，下式(XX)的化合物：
Figure G2007800447386D00213
式(XX)
X为-C(O)NH-、C(S)NH、-C(O)C1-3烷基C(O)NH-；或-C(O)C1-3烷基C(O)O-；
m为0～11的整数，和
n为1～500的整数。
在一些实施方案中，与式(XX)中胆固醇相连的O为胆固醇的一部分。
在一些实施方案中，X为-C(O)NH-或-C(O)C1-3烷基C(O)O-。
在一些实施方案中，式(XX)的化合物为下式(XX′)。
Figure G2007800447386D00221
式(XX′)
一方面，本发明描述了与靶向部分(例如糖残基)结合的PEG脂质。例如，使用靶向部分在OMe末端修饰式(XV)或(XX)的化合物。在一些实施方案中，靶向部分通过接头(linker)与PEG部分结合。下式(XXI)和(XXII)提供了被靶向了的PEG脂质的实例。
在一些实施方案中，所述脂质为式(XXI)的化合物，
式(XXI)
其中，
L1和L2分别独立地为连接键或C(O)；
R1和R2分别独立地为烷基、烯基或炔基；其每一个任选被一个或多个取代基取代；
X和X′分别独立地为-C(O)NH-、-NHC(O)-、C(S)NH、C(S)NH、-C(O)C1-3烷基C(O)NH-、NHC(O)C1-3烷基C(O)-、-C(O)C1-3烷基C(O)O-、NHC(O)C1-3烷基-或C1-3烷基C(O)NH-；
m为0～11的整数，和
n为1～500的整数；
p为1～6的整数，例如p为3；
T为如糖基部分的靶向部分(例如，糖残基)。示例性的靶向部分包括
Figure G2007800447386D00231
在一些实施方案中，L1和L2均为连接键。
在一些实施方案中，L1和L2均为C(O)。
在一些实施方案中，R1和R2分别独立地为烷基，例如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C14烷基、C15烷基或C16烷基。在一些实施方案中，R1和R2均为烷基，例如长度相同的直链烷基，如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C14烷基、C15烷基或C16烷基。在一些实施方案中，R1和R2均为C14烷基。
在一些实施方案中，式(XXI)代表外消旋混合物。
在一些实施方案中，式(XXI)的化合物具有例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的R对映异构体过量。在一些实施方案中，式(XXI)代表光学纯‘R’异构体。
在一些实施方案中，式(XXI)的化合物具有例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的S对映异构体过量。在一些实施方案中，式(XXI)代表光学纯‘S’异构体。
在一些实施方案中，R1和R2分别独立地为烯基，例如R1和R2分别独立地为C6-C30烯基，或R1和R2分别为相同的烯基部分。在一些实施方案中，每个R1和R2包含单个双键，例如为E构型或Z构型的单个双键。
在一些实施方案中，R1和R2分别包含两个双键部分。在一些实施方案中，至少一个双键具有Z构型。在一些实施方案中，两个双键均具有Z构型。在一些实施方案中，R1和R2中的至少一个为下式(II)
式(II)
其中
x为1～8的整数；且
y为1～10的整数。在一些实施方案中，R1和R2均为式(II)。在一些实施方案中，至少一个双键具有E构型，例如两个双键均具有E构型。在一些实施方案中，R1和R2中的至少一个为下式(III)
式(III)
其中
x为1～8的整数；且y为1～10的整数。
在一些实施方案中，R1和R2分别包括三个双键部分。在一些实施方案中，至少一个双键具有Z构型。在一些实施方案中，至少两个双键具有Z构型。在一些实施方案中，三个双键均具有Z构型。在一些实施方案中，R1和R2中的至少一个为下式(IV)，
Figure G2007800447386D00242
式(IV)
其中
x为1～8的整数；且
y为1～10的整数。在一些实施方案中，R1和R2均为式(IV)。在一些实施方案中，至少一个双键具有E构型。在一些实施方案中，至少两个双键具有E构型。在一些实施方案中，三个双键均具有E构型。在一些实施方案中，R1和R2中的至少一个为下式(V)，
Figure G2007800447386D00243
式(V)
其中
x为1～8的整数；且
y为1～10的整数。在一些实施方案中，R3和R4均为式(V)。
在一些实施方案中，p为3。
在一些实施方案中，L为NHC(O)C1-6烷基(例如NHC(O)C3烷基)。
在一些实施方案中，式(XXI)的化合物为下式(XXI′)的化合物。
式(XXI′)
在一些实施方案中，所述脂质为式(XXII)的化合物，
Figure G2007800447386D00252
式(XXII)
其中，
X和X′分别独立地为-C(O)NH-、-NHC(O)-、C(S)NH、C(S)NH、-C(O)C1-3烷基C(O)NH-、NHC(O)C1-3烷基C(O)-、-C(O)C1-3烷基C(O)O-、NHC(O)C1-3烷基-或C1-3烷基C(O)NH-；
m为0～11的整数，和
n为1～500的整数。
p为1～6的整数，例如p为3；
T为如糖基部分的靶向部分(例如，糖残基)。示例性的靶向部分包括
Figure G2007800447386D00253
在一些优选的实施方案中，式(XXII)的化合物为下式(XXII′)的化合物。
Figure G2007800447386D00254
式(XXII′)
一方面，本发明描述了缔合复合物，其包含化合物制品和核酸，其中所述化合物制品包含本文所述的化合物(例如，式(I)的化合物或式(X)的化合物)，所述核酸为例如RNA(单链或双链RNA，例如siRNA或dsRNA或DNA)。在一些实施方案中，所述缔合复合物为脂质复合物或脂质体。在一些实施方案中，所述缔合复合物包括一个或多个其他组分，例如靶向部分、膜融合脂质、聚乙二醇化脂质(例如本文所述的PEG-脂质，如式(XV)、(XV′)或(XVI)的PEG-脂质)或结构性组分。在一些实施方案中，PEG-脂质为如本文所述的被靶向了的PEG-脂质，例如式(XXI)、(XXI′)、(XXII)或(XXII′)的化合物。
一方面，本发明描述了形成脂质体的方法，该方法包括在存在缓冲剂的条件下使包含本文所述化合物(例如本文所述的脂质，如式(I)或式(X)的化合物)的脂质制品与治疗剂相接触，其中所述缓冲剂：
具有足够的强度以使式I分子中所有的氨基充分质子化；
以100～300mM存在；
其存在浓度提供的质子化作用显著强于20mM的相同缓冲剂。
一方面，本发明描述了通过本文所述方法制备的脂质体。
一方面，本发明描述了形成脂质体的方法，该方法包括在包含至少约90％乙醇的混合物中使本文所述的脂质制品(例如包含式(I)化合物或式(X)化合物的脂质制品)与治疗剂相接触，并将所述脂质制品与治疗剂快速混合以提供直径小于约200uM的颗粒。在一些实施方案中，所述颗粒的直径小于约50uM。
一方面，本发明描述了形成脂质体的方法，该方法包括在存在缓冲剂的条件下使本文所述脂质制品(例如包含式(I)化合物或式(X)化合物的脂质制品)与治疗剂相接触，其中所述缓冲剂的浓度为约100mM～约300mM。
一方面，本发明描述了包含本文所述制品(例如包含式(I)化合物或式(X)化合物的脂质制品)和核酸的脂质体。在一些实施方案中，所述制品还包括聚乙二醇化的脂质，例如本文所述的PEG-脂质，例如式(XV)、(XV′)或(XVI)的PEG-脂质。在一些实施方案中，PEG-脂质为如本文所述的被靶向了的PEG脂质，例如式(XXI)、(XXI′)、(XXII)或(XXII′)的化合物。在一些实施方案中，所述制品还包括结构性部分，例如胆固醇。在一些实施方案中，缔合复合物的所述制品包括式(I)、(XV)的化合物和胆固醇。在一些实施方案中，所述核酸为siRNA，例如所述核酸为经修饰而具有降解抗性的siRNA，所述核酸为通过多糖骨架而被修饰的siRNA，或者所述siRNA靶向ApoB基因。
在一些实施方案中，所述脂质体还包含结构性部分和聚乙二醇化脂质(例如本文所述的PEG-脂质)，其中制品(例如包含式(I)化合物或式(X)化合物的脂质制品)、结构性部分(例如胆固醇)、聚乙二醇化脂质与核酸的重量比例为(8-22)∶(4-10)∶(4-12)∶(0.4-2.2)。在一些实施方案中，所述结构性部分为胆固醇。在一些实施方案中，所述比例为(10-20)∶(0.5-8.0)∶(5-10)∶(0.5-2.0)，例如15∶0.8∶7∶1。在一些实施方案中，脂质体的平均直径在10nm～750nm之间，脂质体的平均直径在30～200nm之间，或脂质体的平均直径在50～100nm之间。在一些实施方案中，该制品小于未反应脂质的15重量％。在一些实施方案中，所述制品(例如包含式(I)化合物或式(X)化合物的脂质制品)、结构性部分(如胆固醇)和PEG脂质的比例为约42/48/10(摩尔比例)。在一些实施方案中，总脂质与核酸(例如siRNA)的比例为约7.5重量％。
在一些实施方案中，本文所述的缔合复合物的总赋形剂与核酸的重量比为小于约15∶1，例如为约10∶1、约7.5∶1或约5∶1。
一方面，本文描述了包含多种脂质部分和治疗剂的缔合复合物的形成方法，所述方法包括：在乙醇和NaOAc缓冲水溶液中混合多种脂质部分以提供颗粒物；向颗粒物中添加治疗剂，从而形成缔合复合物。
在一些实施方案中，所提供的所述脂质部分存在于100％的乙醇溶液中。
在一些实施方案中，所述多种脂质部分包括阳离子脂质。
在一些实施方案中，阳离子脂质为本文所述的脂质，例如所述阳离子脂质为以下脂质之一或其混合物。
Figure G2007800447386D00281
在一些优选的实施方案中，所述阳离子脂质为
Figure G2007800447386D00282
在一些实施方案中，所述多种脂质部分包括PEG-脂质，例如具有以下结构的PEG-脂质：
其中，
L1和L2分别独立地为连接键或C(O)；
R1和R2分别独立地为烷基、烯基或炔基；其每一个任选被一个或多个取代基取代；
X为-C(O)NH-、C(S)NH、-C(O)C1-3烷基C(O)NH-；或-C(O)C1-3烷基C(O)O-；
m为0～11的整数，和
n为1～500的整数。
在一些优选的实施方案中，PEG-脂质为式(XVI)的PEG脂质，其中重复PEG部分的平均分子量为2000(例如n值在42～47之间)，或为下述脂质：
Figure G2007800447386D00291
在一些实施方案中，所述多种脂质部分包括结构性脂质，例如所述结构性脂质为胆固醇。
在一些实施方案中，PEG-脂质为如本文所述的靶向PEG-脂质，例如式(XXI)、(XXI′)、(XXII)或(XXII′)的化合物。
在一些实施方案中，所述方法还包括挤出包含颗粒的脂质，例如在添加治疗剂前进行挤出。
在一些实施方案中，所述治疗剂为核酸，例如siRNA，如经修饰而具有降解抗性的siRNA，通过多糖骨架而被修饰的siRNA，或者与亲脂部分结合的siRNA。在一些实施方案中，siRNA靶向ApoB基因。
在一些实施方案中，所述缔合复合物包含阳离子脂质、结构性脂质、PEG-脂质和核酸。在一些实施方案中，所述阳离子脂质、结构性脂质、PEG-脂质和核酸的摩尔比为(36-48)∶(42-54)∶(6-14)，例如(38-46)∶(44-52)∶(8-12)或约42∶48∶10。在一些实施方案中，总赋形剂与核酸的重量比为小于约15∶1，例如约10∶1，约7.5∶1或约5∶1。在一些优选的实施方案中，所述阳离子脂质具有以下结构：
Figure G2007800447386D00292
PEG-脂质为式(XVI)的PEG脂质，其中重复PEG部分的平均分子量为2000(例如n值在42～47之间)，或具有以下结构：
Figure G2007800447386D00293
所述结构性脂质为胆固醇，例如，其中所述阳离子脂质、结构性脂质和PEG-脂质的摩尔比为(38-46)∶(44-52)∶(8-12)，例如约42∶48∶10。在一些优选的实施方案中，总赋形剂与核酸的重量比小于约15∶1，例如约10∶1，约7.5∶1或约5∶1。
另一方面，本发明描述了由本文所述方法制备的缔合复合物。
另一方面，本发明描述了包含阳离子脂质、结构性脂质、PEG-脂质和核酸的缔合复合物，其中所述阳离子脂质为以下脂质之一或其混合物：
Figure G2007800447386D00301
所述PEG-脂质为式(XVI)的PEG脂质，其中重复PEG部分的平均分子量为2000(例如n值在42～47之间)，或具有以下结构：
Figure G2007800447386D00302
所述结构性脂质为胆固醇。在一些优选的实施方案中，所述核酸为siRNA。
在一些优选的实施方案中，所述阳离子脂质具有下式的结构：
Figure G2007800447386D00303
在一些优选的实施方案中，所述阳离子脂质、结构性脂质(如胆固醇)、PEG-脂质和核酸的摩尔比为(36-48)∶(42-54)∶(6-14)，例如(38-46)∶(44-52)∶(8-12)或约42∶48∶10。在一些优选的实施方案中，总赋形剂与核酸的重量比小于约15∶1，例如为约10∶1，约7.5∶1或约5∶1。
在一些实施方案中，本文所述的缔合复合物的平均直径或粒径小于约25000nm，例如约20～200nm，约60nm或约50nm。
在一些实施方案中，在本文所述缔合复合物中施用的核酸的血清半衰期(例如，在体外)至少为约4小时，例如至少约6小时、至少约8小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约1周、至少约2周或至少约3周。
一方面，本发明描述了包含本文所述制品的药学上可接受的组合物。
一方面，本发明描述了包含本文所述脂质体的药学上可接受的组合物。
一方面，本发明描述了哺乳动物的治疗方法，该方法包括向所述哺乳动物施用治疗量的药学上可接受的组合物，例如缔合复合物(如本文所述的脂质体)。
定义
术语“卤代”或“卤素”是指任意的氟、氯、溴或碘自由基。
术语“烷基”是指包含指定数量碳原子的直链或支链烃链。例如，C1-C36烷基是指该基团可以具有1～36(包括1和36)个碳原子。术语“卤代烷基”是指其一个或多个氢原子被卤素取代的烷基，并包括其所有氢原子均被卤素取代(例如，全氟烷基)的烷基部分。术语“芳基烷基”或“芳烷基”是指其烷基氢原子被芳基基团取代的烷基。芳烷基包括其多于一个氢原子被芳基基团取代的基团。“芳基烷基”或“芳烷基”的实例包括苯甲基、2-苯乙基、3-苯丙基、9-芴基、二苯甲基和三苯甲基基团。
术语“亚烷基”是指二价烷基，例如-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-。
术语“烯基”是指包含2～36个碳原子并具有一个或多个双键的直链或支链的烃链。烯基基团的实例包括但不限于烯丙基、丙烯基、2-丁烯基、3-己烯基和3-辛烯基基团。构成双键的碳原子之一可任选地为烯基取代基的连接点。术语“炔基”是指包含2～36个碳原子并以具有一个或多个三键为特征的直链或支链的烃链。炔基基团的实例包括但不限于乙炔基、炔丙基和3-己炔基。构成三键的碳原子之一可任选地为炔基取代基的连接点。
术语“取代基”是指在烷基、环烷基、烯基、炔基、杂环基、杂环烯基、环烯基、芳基或杂芳基基团的任意原子位置进行“取代”的基团。任何原子均可被取代。适合的取代基包括但不限于烷基(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12直链或支链烷基)，环烷基、卤代烷基(例如，诸如CF3的全氟烷基)，芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、杂环基、烯基、炔基、环烯基、杂环烯基、烷氧基、卤代烷氧基(例如，诸如OCF3的全氟烷氧基)、卤代、羟基、羧基、羧酸酯、氰基、硝基、氨基、烷氨基、SO3H、硫酸酯、磷酸酯、亚甲二氧基(-O-CH2-O-，其中氧原子与同一碳原子相连(偕二取代，geminal substitution))、亚乙二氧基、氧代、硫代(例如C＝S)、亚氨基(烷基亚氨基、芳基亚氨基、芳烷基亚氨基)、S(O)n烷基(n为0-2)、S(O)n芳基(n为0-2)、S(O)n杂芳基(n为0-2)、S(O)n杂环基(n为0-2)、胺(单胺、二胺、烷基胺、环烷基胺、芳烷基胺、杂芳烷基胺、芳基胺、杂芳基胺及其组合)、酯(烷基酯、芳烷基酯、杂芳烷基酯、芳基酯、杂芳基酯)、酰胺(单酰胺、二酰胺、烷基酰胺、芳烷基酰胺、杂芳烷基酰胺、芳基酰胺、杂芳基酰胺及其组合)、磺酰胺(单磺酰胺、二磺酰胺、烷基磺酰胺、芳烷基磺酰胺、杂芳基磺酰胺及其组合)。一方面，基团上的取代基独立地为上述取代基中任意一种或任意亚类。另一方面，取代基本身可被上述取代基中的任意一种取代。
本文所用术语“结构异构体”是指分子式相同但结构式不同的任意两种或多种化学化合物，例如丙醇和异丙醇。
本文所用术语“几何异构体”或“立体异构体”是指原子和连接键(即原子间的连接相同)的数量和种类相同，但原子空间排列不同的两种或多种化合物，例如双键的顺式和反式异构体、对映结构体和非对映异构体。
为了方便起见，下文提供了本说明书、实施例和权利要求书中使用的特定术语和短语的含义。如果某术语在本说明书其它部分中的用法与本节中提供的定义之间有明显差异，应以本节中的定义为准。
“G”、“C”、“A”和“U”通常分别代表包含作为碱基的鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶的核苷酸。然而，应理解的是术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可指如下文详述的修饰核苷酸，或代用替换部分(surrogate replacementmoiety)。技术人员熟知可将鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶替换成其它部分而基本不改变包含具有此类替换部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对性质。例如但不限于：包含作为其碱基的次黄嘌呤的核苷酸可与包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸进行碱基配对。因此，在本发明的核苷酸序列中，包含尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可被替换成包含如次黄嘌呤的核苷酸。包含此类替换部分的序列是本发明的实施方案。
本文所用的“靶序列”是指相应基因转录过程中形成的mRNA分子核苷酸序列中的连续部分，包括作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。靶区域是指靶基因中与RNAi试剂的一部分互补的片段。
本文所用术语“包含序列的链”是指包含核苷酸链的寡核苷酸，其中通过以标准的核苷酸命名法表示的序列来阐述该核苷酸链。
除非另有说明，否则在用于描述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的关系时，本文所用术语“互补”是指包含所述第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含所述第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双螺旋结构的能力，本领域技术人员可理解这一点。例如，此类条件可以是严格条件，其中所述严格条件可包括：400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)、1mM EDTA，在50℃或70℃下持续12-16小时，随后进行清洗。也可应用其它条件，例如可能在生物体内遇到的生理相关条件。本领域技术人员能够根据杂交核苷酸的最终应用决定最适合于两序列互补试验的系列条件。
这包括包含所述第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含所述第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在第一和第二核苷酸序列的全长范围内的碱基配对。本文中，这些序列可被称为彼此“完全互补”。然而，在本文中当提到所述第一序列与所述第二序列“基本互补”时，所述两个序列可完全互补或在杂交时形成一个或多个，但通常不超过4个、3个或2个错配碱基对，同时保留在与其最终应用最相关的条件下的杂交能力。但是，考虑到互补的定义，当两个寡核苷酸经设计而在杂交后形成一个或多个单链悬端时，这种悬端不应该被认做是错配。例如，在包含一条长度为21个核苷酸的寡核苷酸和另一条长度为23个核苷酸的寡核苷酸的寡核苷酸试剂中，较长寡核苷酸包含与较短寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，在本发明的目的下，这种情况也被称为“完全互补”。
只要其杂交能力能够满足上述需求，本文所用“互补”序列也可以包含或完全由非Watson-Crick碱基对形成和/或由非天然和修饰核苷酸形成的碱基对形成。
在本文中可以根据寡核苷酸试剂的正义链与反义链间的碱基配对，或寡核苷酸试剂的反义链与靶序列间的碱基配，使用术语“互补”、“完全互补”和“基本互补”，所述术语可根据其所处上下文进行理解。
本文所用的与信使RNA(mRNA)的“至少一部分基本互补”的多核苷酸是指于与目标mRNA的连续片段基本互补的多核苷酸。例如，如果多核苷酸的序列与编码ApoB的mRNA中的非中断片段基本互补，那么所述多核苷酸与ApoB mRNA的至少一部分互补。
本文所用的“寡核苷酸试剂”是指相对其靶标为反义的核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的单链寡聚物或多聚物，或RNA和DNA二者的单链寡聚物或多聚物，或其修饰物。该术语包括由天然存在的核酸碱基、糖和核苷间(骨架)共价连接构成的寡核苷酸，以及具有功能类似的非天然存在碱基的寡核苷酸。此类修饰或取代的寡核苷酸由于具有期望的性质，例如增加细胞摄取、增强对核酸靶标的亲和性，以及增强在核酸酶存在条件下的稳定性，因而通常优于天然形式。
寡核苷酸试剂包括靶向核酸(NAT)的寡核苷酸试剂和靶向蛋白质(PT)的寡核苷酸试剂。NAT和PT寡核苷酸试剂是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的单链寡聚物或多聚物，或RNA和DNA二者的单链寡聚物或多聚物，或其修饰物。该术语包括由天然存在的核酸碱基、糖和核苷间(骨架)共价连接构成的寡核苷酸，以及具有功能类似的非天然存在碱基的寡核苷酸。此类修饰或取代的寡核苷酸由于具有期望的性质，例如增加细胞摄取、增强对核酸靶标的亲和性，和/或增强在核酸酶存在的条件下的稳定性，因而通常优于天然形式。所设计的结合特异RNA或DNA靶标的NAT与靶核酸中的10个、20个或30个或更多个碱基基本互补，例如至少70％、80％、90％或100％互补，并且包括反义RNA、小RNA(microRNA)、antagomir和其他可调节表达的非双链结构。其他NAT寡核苷酸试剂包括外部指导序列(external guide sequence，EGS)寡核苷酸(oligozymes)、脱氧核糖核酸酶(DNAzyme)和核酶。NAT寡核苷酸试剂可靶向任何核酸，例如miRNA、miRNA前体、mRNA前体、mRNA或DNA。这些NAT寡核苷酸试剂可能通过或可能不通过Watson-Crick互补与其靶标结合。PT寡核苷酸试剂优选通过三维相互作用的方式与蛋白质靶标结合，从而调节蛋白质活性。其包括诱饵(decoy)RNA和适体(aptamer)等。
尽管不希望被理论束缚，但寡核苷酸试剂可通过多种机制(包括依赖切割或不依赖切割的机制)中的一个或多个而发挥作用。基于切割的机制可以为RNAse H依赖性和/或可包括RISC复合物的功能。不依赖切割的机制包括基于占据的转录休止(occupancy-based translational arrest)，例如可通过miRNA介导，或通过寡核苷酸试剂与蛋白质的结合(这与适体的行为类似)介导。也可通过改变对mRNA前体中剪接位点的选择，将寡核苷酸试剂用于改变基因的表达。抑制剪接也可导致非正常加工的信使的降解，从而下调基因的表达。
本文所用术语“双链RNA”或“dsRNA”是指核糖核酸分子的复合物，所述复合物具有双链结构，其包含两条反平行且如上所述的基本互补的核酸链。形成所述双链结构的两条链可以是同一条较大RNA分子的不同部分，或者是单独的RNA分子。如果所述两条链为单独的RNA分子，在文献中常将此类dsRNA称为siRNA(“小干扰RNA”)。如果所述两条链为一个较大分子的部分，并且由此通过形成双链结构的一条链的3’-末端与另一条链的5’-末端之间的非中断核苷酸链相连接，那么所述相连的RNA链被称为“发夹环”、“短发夹RNA”或“shRNA”。如果所述两条链通过形成双链结构的一条链的3’-末端及相应另一条链的5’-末端之间的非中断链之外的方式共价连接，那么所述连接结构被称为“接头”。所述RNA链可具有相同或不同数量的核苷酸。碱基对的最大数值为dsRNA中的最短链减去双链中存在的任何悬端后的核苷酸数目。除双链结构之外，dsRNA可包含一个或多个核苷酸悬端。此外，在本说明书中使用的“dsRNA”可包括对核糖核苷酸的化学修饰(包括对多个核苷酸的修饰，并包括本文公开的或本领域已知的所有修饰类型)。基于本说明书和权利要求书的目的，“dsRNA”涵盖用于siRNA类型分子的所有此类修饰。
本文所用“核苷酸悬端”是指当dsRNA的一条链的3’末端超过另一条链的5’末端或反之时从dsRNA的双链结构突出的一个或多个未配对核苷酸。“平端”或“平末端”是指在dsRNA的末端没有未配对的核苷酸，即没有核苷酸悬端。“平末端化的”dsRNA是指在其全长范围均为双链的dsRNA，即在此分子任一个末端均没有核苷酸悬端。为清楚起见，在确定siRNA是否具有悬端或被平端化时，不考虑结合到siRNA的3′-末端或5′-末端的化学帽或非核苷酸的化学部分。
术语“反义链”是指dsRNA中的一条链，其包含与靶序列基本互补的区域。本文所用术语“互补区”是指反义链上与本文所定义的序列(例如靶序列)基本互补的区域。如果互补区与靶序列不完全互补，则最能容许的错配发生在末端区域，并且如果存在错配，则通常位于末端区域，或者例如5′和/或3′末端的6、5、4、3或2个核苷酸之内。
本文所用术语“正义链”是指dsRNA中的一条链，其包含与所述反义链的一个区域基本互补的区域。
当术语“沉默”和“抑制表达”是针对靶基因时，它们在本文指至少部分抑制所述基因的表达，通过与第二细胞或细胞群相比可以从第一细胞或细胞群中分离的转录自所述基因的mRNA数量的减少来表示，其中所述第一细胞或细胞群中转录所述基因但其已经被处理从而抑制所述基因的表达，所述第二细胞或细胞群与所述第一细胞或细胞群基本相同但其没有作此处理(对照细胞)。抑制度通常用以下方式表示：
Figure G2007800447386D00361
或者，将抑制度表示为与基因转录在功能上相关的参数的减小，例如所述基因编码的细胞分泌蛋白质的量，或显示特定表型的细胞数量(例如凋亡细胞的数量)。理论上讲，可以组成型地或通过基因工程方法或任意合适的试验在表达所述靶标的任意细胞中测定基因沉默。然而，当需要参考以确定给定dsRNA是否以特定程度抑制所述基因的表达并因此属于本发明的范围时，以下实施例中提供的试验可作为此类参考。
例如，在某些情况下，通过施用本发明的双链寡核苷酸将所述基因的表达抑制至少约20％、25％、35％或50％。在一些实施方案中，通过施用本发明的双链寡核苷酸将所述基因抑制至少约60％、70％或80％。在一些实施方案中，通过施用本发明的双链寡核苷酸将所述基因抑制至少约85％、90％或95％。
本文所用术语“治疗”(“treat”，“treatment”)等是指可通过下调特定基因而介导的病理过程的缓解或减轻。在本发明的上下文中只要它涉及下文陈述的其它任意病症(除可通过下调所述基因介导的病理过程之外的病症)，术语因而介导的病理过程的缓解或减轻。在本发明的上下文中只要它涉及下文陈述的其它任意病症(除可通过下调所述基因介导的病理过程之外的病症)，术语“治疗”等表示缓解或减轻至少一种与所述病症相关的症状，或者减缓或逆转所述病症的进程。
本文所用短语“治疗有效量”和“预防有效量”是指对可通过下调所述基因介导的病理过程或可通过下调所述基因介导的病理过程的一个明显症状的治疗、预防或控制提供治疗效果的量。治疗有效的特定量可简单地由普通医务工作者来确定，并可根据本领域已知的因素进行改变，所述因素可以为例如可通过下调所述基因介导的病理过程的类型，患者的病史和年龄，可通过下调所述基因表达介导的病理过程的阶段，以及对可通过下调所述基因表达介导的病理过程的抗性药物的施用。在治疗受试者的上下文中，有效量足以产生治疗效果。本文所用术语“治疗效果”是指在患有细胞增殖性疾病患者的医疗中，促进或增强受试者的健康状态的任何效果。此类效果的非穷举性实例包括使患者的生命延长任意一段时间，降低或延缓疾病向肿瘤的发展，减少增生，降低肿瘤生长，延缓转移，减低癌细胞、肿瘤细胞或任何其他增生性细胞的增殖速度，在任何处理细胞中或受处理细胞影响的任何细胞中诱导凋亡，和/或减少受试者因所患病症而造成的疼痛。
本文所用“药物组合物”包含药理学有效量的寡核苷酸试剂和药学上可接受的载体。本文所用“药理学有效量”、“治疗有效量”或“有效量”是指能够产生有效的药理学、治疗性或预防性结果的RNA量。例如，如果认为使疾病或病症相关的可测量参数下降至少25％的给定临床治疗为有效治疗，那么用于治疗所述疾病或病症的药物的治疗有效量是将所述参数减少至少25％时所必需的量。
术语“药学上可接受的载体”是指施用治疗剂所用的载体。此类载体包括但不限于盐溶液、缓冲盐溶液、葡萄糖、水、甘油、乙醇和其组合，并在下文中有详细描述。所述术语明确地排除了细胞培养基。
以下附图和阐述对本发明的一个或多个实施方案进行了详细说明。本发明的其他特征、目标和优点将体现于说明书、附图和权利要求书中。
附图说明
图1：显示对多种ND98组合物的功效进行比较的柱形图。
图2：显示对多种ND98组合物的功效进行比较的柱形图。
图3：显示ND98的六尾化异构体(6-tailed isomer)功效的柱形图。
图4：显示对使用两种不同方法制备的缔合复合物的功效进行比较的柱形图。
图5：显示多种PEG脂质部分，包括链长度不同的那些PEG脂质部分。
图6：显示对缔合复合物的功效进行比较的柱形图。
图7：显示随着脂质/siRNA比例的减小对复合物的耐受性进行比较的柱形图。
图8：负载核酸的缔合复合物制备方法的流程图。
图9：显示以FVII和ApoB为两个靶标的siRNA功效的柱形图。
图10：负载核酸的缔合复合物制备方法的流程图。
图11：显示沉默试验中缔合复合物粒径对核酸功效影响的柱形图。
图12a和图12b：对未经配制和配制形式的核酸治疗剂的血清半衰期进行比较的柱形图。
图13：比较具有不同链长度的PEG脂质的缔合复合物功效的柱形图。
发明内容
本文描述了用于施予基于核酸的治疗剂(如siRNA)的脂质制品和给药系统。
阳离子脂质化合物和脂质制品
多胺脂质制品
申请人现已发现某些多胺脂质部分为核酸(如siRNA)的施予提供了期望的性质。例如，在一些实施方案中，使脂质部分与靶向VII因子的siRNA复合，并施用于如小鼠的动物。随后对分泌的血清VII因子水平进行定量(施用后24小时)，其中VII因子的沉默程度表示siRNA体内递送的程度。因此，优选提供增强的核酸(如siRNA)体内递送的脂质。特别地，申请人现已发现具有本文所述取代的多胺可具有递送siRNA的理想性质，例如生物利用度、生物降解性和耐受性。
在一个实施方案中，脂质制品包含具有多个取代基的多胺部分，例如与其相连的丙烯酰胺或丙烯酸酯取代基。例如，脂质部分可包括如下所示的多胺部分，
Figure G2007800447386D00391
其中，例如使用取代基取代一个或多个氢原子，所述取代基包括长链的烷基、烯基或炔基部分，并且，在一些实施方案中对所述取代基进行进一步的取代。Xa和Xb为亚烷基。在一些实施方案中，Xa和Xb具有相同的链长度，例如Xa和Xb均为亚乙基。在其他实施方案中，Xa和Xb具有不同的链长度。在一些实施方案中，多胺包括多个Xa部分时，Xa随一次或多次的出现而不同。例如，多胺为精胺时，Xa在一次出现时为亚丙基，而在另一次出现时为亚丁基，Xb为亚丙基。
申请人现已发现在一些情况下需要对多胺进行相对较高程度的取代。例如在一些实施方案中，申请人现已发现在所述制品中，如果至少80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％，、至少约97％、至少约98％、至少约99％或基本全部)的多胺中有至少n+2个氢原子被取代基取代，那么该多胺制品可提供期望的性质，例如用于核酸(如siRNA)的施用。
在一些情况下，需要(优选)多胺氮原子上的取代基存在一个或多个杂原子。
在一些实施方案中，制品包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure G2007800447386D00392
式(I)
Xa和Xb在每次出现时分别独立地为C1-6亚烷基；n为0、1、2、3、4或5；R分别独立地为H，
Figure G2007800447386D00393
其中，在所述制品中，至少约80％的式(I)化合物分子中的至少n+2个R基团不是H；m为1、2、3或4；Y为O、NR2或S；R1为任选被取代的烷基、烯基或炔基；和R2为任选被取代的H、烷基、烯基或炔基；前提是，如果n＝0，那么至少n+3个R基团不是H。
如上所述，该制品包括含对称和不对称多胺衍生物的分子。因此，Xa在每次出现时均为独立地，且Xb不受Xa的限制。例如，n＝2时，Xa既可以每次出现都相同，也可以每次出现都不同，或者在某些出现中相同而在一次或多次其他出现中不同。Xb不受Xa的限制，与每种多胺衍生物中Xa出现的次数无关。Xa不受Xb的限制，其每次出现时可以为亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基或亚己基。示例性的多胺衍生物包括衍生自N1，N1′-(乙烷-1，2-二基)二乙烷-1，2-二胺(N1，N1′-(ethane-1，2-diyl)diethane-1，2-diamine)、乙烷-1，2-二胺、丙烷-1，3-二胺、精胺、亚精胺、腐胺和N1-(2-氨基乙基)-丙烷-1，3-二胺的那些多胺。优选的多胺衍生物包括丙烷-1，3-二胺和N1，N1′-(乙烷-1，2-二基)二乙烷-1，2-二胺。
使用至少n+2个非H的R基团取代式(I)的多胺。通常每个非氢R基团包括烷基、烯基或炔基部分，其任选地被一个或多个取代基取代并通过接头与多胺衍生物的氮相连。适合的接头包括酰胺、酯、硫酯、砜、亚砜、醚、胺和硫醚。在很多情况下，接头部分通过亚烷基部分(例如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基)与多胺的氮相连。例如，酰胺或酯接头通过亚甲基或亚乙基部分与多胺的氮相连。
优选的胺取代基的实例如下所示：
Figure G2007800447386D00401
在通过亚乙基基团连接胺和接头-R1部分的情况下，可将1，4-共轭的前体丙烯酸酯或丙烯酰胺与多胺反应以提供取代的多胺。在通过亚甲基基团连接胺和接头-R1部分的情况下，可将包含α-卤代取代基的酰胺或酯(例如α-氯代部分)与多胺反应以提供取代的多胺。在优选的实施方案中，R2为H。
非H的R基团均需要如上提供的R1部分。通常，R1部分为长链部分，例如C6-C32烷基、C6-C32烯基或C6-C32炔基。
在一些优选的实施方案中，R1为烷基部分。例如，R1为C10-C18烷基，如C12烷基。特别优选的R基团的实例如下所示：
Figure G2007800447386D00411
包含式(I)化合物的试剂可以是多种式(I)化合物的混合物。例如，该制品可包含多胺部分取代程度不同的式(I)化合物的混合物。然而经选择，在本文所述制品中，至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或基本全部)式(I)化合物分子中的至少n+2个R基团不是H。
在一些实施方案中，制品包含具有两个氨基基团的多胺部分，其中在该混合物中至少80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或基本全部)的式(I)分子被3个非H的R基团取代。示例性的式(I)化合物如下所示：
在一些优选的实施方案中，R为
Figure G2007800447386D00413
在一些优选的实施方案中，R1为C10-18烷基或C10-C30烯基。
在一些实施方案中，制品包括具有三个或四个(如四个)氨基基团的多胺部分，其中至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或基本全部)的式(I)分子中有至少n+2个R基团不是H。下文中给出了具有4个氨基部分的式(I)化合物的实例。
所有(即n+4个)R基团都不是H的多胺部分的实例如下所示：
Figure G2007800447386D00421
在一些优选的实施方案中，R为
Figure G2007800447386D00422
在一些优选的实施方案中，R1为C10-18烷基(例如，C12烷基)或C10-30烯基。
五个(即n+3个)R基团都不是H的多胺部分的实例如下所示：
在一些优选的实施方案中，R为
Figure G2007800447386D00424
在一些优选的实施方案中，R1为C10-18烷基(例如，C12烷基)或C10-30烯基。
四个(即n+2个)R基团都不是H的多胺部分的实例如下所示：
Figure G2007800447386D00425
在一些优选的实施方案中，R为
在一些优选的实施方案中，R1为C10-18烷基(例如，C12烷基)或C10-30烯基。
在一些优选的实施方案中，所述多胺为以下异构体(1)或(2)的化合物，优选异构体(1)的化合物。
Figure G2007800447386D00432
异构体(1)
Figure G2007800447386D00433
异构体(2)
在一些实施方案中，包含式(I)化合物的所述制品包含具有式(I)结构的分子的混合物。例如，该混合物可包含具有相同多胺核和不同R取代基(例如非H的R取代程度不同)的分子。
在一些实施方案中，本文所述制品包含具有单个多胺核的式(I)化合物，其中多胺核的各个R分别为R或如下的单个部分：
因此，该制品包含具有式(I)结构的分子的混合物，其中所述混合物由具有不同数量的为H的R基团的式(I)多胺化合物和/或具有单个确定数量的非H的R基团的式(I)多胺化合物构成，其中所述式(I)化合物为多胺的结构异构体，例如上文所述的结构异构体。
在一些优选的实施方案中，所述制品包含式(I)的分子，其中至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或基本全部)的所述分子为一种结构异构体。
在一些实施方案中，所述制品包含两种或更多种式(I)化合物的混合物。在一些实施方案中，所述制品为同一化学式的结构异构体的混合物。在一些实施方案中，所述制品为式(I)化合物的混合物，其中所述化合物的R取代基的化学性质不同。例如，所述制品可包含以下化合物的混合物：
Figure G2007800447386D00441
式(I)
其中n为0，且R分别独立地为H或和
Figure G2007800447386D00443
式(I)
其中n为2，R分别独立地为H或
Figure G2007800447386D00444
在一些实施方案中，式(I)化合物为盐的形式，例如药学上可接受的盐。例如，可在阴离子和本文所述化合物上的带正电的取代基(如氨基)之间形成盐。适合的阴离子包括氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫酸根、硫酸氢根、硝酸根、磷酸根、柠檬酸根、甲磺酸根、三氟乙酸根、乙酸根、延胡索酸根、油酸根、戊酸根、马来酸根、草酸根、异烟酸根、乳酸根、水杨酸根、酒石酸根、丹宁酸根、泛酸根、酒石酸氢根、抗坏血酸根、琥珀酸根、龙胆酸根(gentisinate)、葡糖酸根、葡糖二酸根(glucaronate)、糖酸根、甲酸根、苯甲酸根、谷氨酸根、乙磺酸根、苯磺酸根、对甲苯磺酸根和双羟萘酸根(pamoate)。在一些优选的实施方案中，式(I)的化合物为氢卤酸盐，例如盐酸盐。
式(I)的化合物也可以以水合物(例如，(H2O)n)和溶剂化物的形式存在，这也包含在本公开的范围之内。
可生物切割的阳离子脂质
申请人现已发现可将包含一个或多个生物可切割部分的某些阳离子脂质(例如脂质体)用作缔合复合物中的组分，以递送核酸治疗剂(例如，dsRNA)。例如，本文公开了在体内可被切割的阳离子脂质，例如通过如酯酶、酰胺酶或二硫化物切割酶(disulfide cleaving enzyme)的酶而被切割。在一些情况下，对所述脂质进行化学切割，例如通过酸不稳定部分(如缩醛或缩酮)的水解进行化学切割。在一些实施方案中，所述脂质包含在体外被水解并随后被酯酶、酰胺酶或二硫化物切割酶中的一种或多种酶切割的部分。这可发生于如内涵体的细胞囊泡室中。另一种酸敏感性的可切割连接为在内涵体的酸性环境中被切割的β-硫代丙酸酯连接(Jeong等人，Bioconjugate chem.2003，4，1426)。
在一些实施方案中，本发明描述了式(X)的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure G2007800447386D00451
式(X)
其中
R1和R2分别独立地为H、任选地被1-4个R5取代的C1-C6烷基、任选地被1-4个R5取代的C2-C6烯基、或C(NR6)(NR6)2；
R3和R4分别独立地为烷基、烯基、炔基，并任选地被氟、氯、溴或碘取代；
L1和L2分别独立地为-NR6C(O)-、-C(O)NR6-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-S-、-N(R6)C(O)N(R6)-、-OC(O)N(R6)-、-N(R6)C(O)O-、-O-N＝C-、OR-OC(O)NH；或
L1-R3和L2-R4可共同形成缩醛或缩酮；
R5为氟、氯、溴、碘、-OR7、-N(R8)(R9)、-CN、SR10、S(O)R10、S(O)2R10；
R6为H、C1-C6烷基；
R7为H或C1-C6烷基；
R8和R9分别独立地为H或C1-C6烷基；
R10为H或C1-C6烷基；
m为1、2、3、4、5或6；
n为0、1、2、3、4、5或6。
在一些实施方案中，R1为H、低级烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)或取代烷基(例如2-羟乙基)。
在一些实施方案中，R2为H或低级烷基，例如甲基、乙基、丙基或异丙基。
在一些实施方案中，R1或R2与式(X)的氮形成quanadine部分。
L1-R3和L2-R4或其组合提供至少一个在体内被切割的部分。在一些实施方案中，L1-R3和L2-R4均可被生物切割。例如，L1-R3和L2-R4可独立地被酶切割(例如，被酯酶、酰胺酶或二硫化物切割酶切割)。在一些实施方案中，L1和L2为相同的化学部分，例如酯、酰胺或二硫化物。在其他情况下，L1和L2不同，例如，L1或L2之一为酯，而L1或L2中的另一个为二硫化物。
在一些实施方案中，L1-R3和L2-R4共同形成在体内被水解的缩醛或缩酮部分。
在一些实施方案中，L1-R3或L2-R4之一被酶切割。例如，L1-R3或L2-R4之一在体内被酶切，从而在脂质上提供可与剩余的L1-R3或L2-R4部分发生化学反应的游离羟基部分或游离胺。以下提供了示例性的实施方案：
Figure G2007800447386D00461
在一些优选的实施方案中，包含氨基甲酸酯或脲部分与酰胺、酯或二硫化物部分的组合。例如，所述脂质包含的酯部分在切割(例如酶切)后可与氨基甲酸酯或脲部分发生化学反应。L1和L2的一些优选组合包括：两个酰胺、两个酯、酰胺和酯、两个二硫化物、酰胺和二硫化物、酯和二硫化物、氨基甲酸酯和二硫化物，以及脲和二硫化物。以下提供了示例性的实施方案：
具有Z构型(两个双键)的酰胺和酯的连接
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝异丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
具有Z构型(三个双键)的酰胺和酯的连接
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝异丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
具有E构型(两个双键)的酰胺和酯的连接
Figure G2007800447386D00481
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝异丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
具有E构型(三个双键)的酰胺和酯的连接
Figure G2007800447386D00491
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝异丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
二硫化物的连接
Figure G2007800447386D00492
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝异丙基；I＝1～6，m＝6～28
具有不饱和烃基链、E构型和Z构型的二硫化物的连接
Figure G2007800447386D00501
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝异丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
具有饱和烃基链和不饱和烃基链的酰胺和二硫化物的连接
Figure G2007800447386D00511
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝异丙基；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，且R″＝H；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，且R″＝Me；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，且R″＝Et；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，且R″＝丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，且R″＝异丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
具有饱和烃基链和不饱和烃基链的酯和二硫化物的连接
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Me I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝异丙基；I＝1～6，m＝6～28
Figure G2007800447386D00522
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝异丙基；I＝1～6，m＝1～8，n＝1～10
具有烷基链的氨基甲酸酯或脲和二硫化物的连接
Figure G2007800447386D00531
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝异丙基；I＝1～6，m＝6～28
具有不饱和烃基链的氨基甲酸酯或脲和二硫化物的连接
Figure G2007800447386D00541
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝异丙基；I＝1～6，m＝6～28
具有不饱和烃基链的氨基甲酸酯或脲和二硫化物的连接
Figure G2007800447386D00551
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝6～28
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝异丙基；I＝1～6，m＝6～28
具有不饱和烃基链的氨基甲酸酯和脲的连接
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝H；I＝1～6，m＝1～10，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Me；I＝1～6，m＝1～10，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝Et；I＝1～6，m＝1～10，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝丙基；I＝1～6，m＝1～10，n＝1～10
R′＝H、Me、Et、丙基、异丙基或2-羟乙基，R″＝异丙基；I＝1～6，m＝1～10，n＝1～10
在一些实施方案中，所述脂质包含可被酸切割的肟或腙。
R3和R4通常为长链疏水部分，例如烷基、烯基或炔基。在一些实施方案中，R3或R4被卤代部分取代，例如以提供全氟烷基或全氟烯基部分。R3和R4彼此独立。在一些实施方案中，R3和R4二者相同。在一些实施方案中，R3和R4不同。
在一些实施方案中，R3和/或R4为烷基。例如R3和/或R4中的一个为C6～C30烷基或两者均为C6～C30烷基，例如为C10～C26烷基、C12～C20烷基或C12烷基。
在一些实施方案中，R3和/或R4为烯基。在一些优选的实施方案中，R3和/或R4包含2或3个双键。例如，R3和/或R4包含2个双键，或R3和/或R4包含3个双键。双键可分别独立地具有Z或E构型。以下提供了示例性的烯基部分：
Figure G2007800447386D00571
其中，x为1～8的整数；且y为1～10的整数。在一些优选的实施方案中，R3和/或R4为C6～C30烯基，例如C10～C26烯基、C12～C20烯基或C17烯基，例如具有两个双键，如具有Z构型的两个双键。R3和/或R4可相同或不同。在一些优选的实施方案中，R3和R4相同。
在一些实施方案中，R3和/或R4为炔基。例如，C6～C30炔基，如C10～C26炔基、C12～C20炔基。R3和/或R4可具有1～3个三键，例如一个、两个或三个三键。
在一些实施方案中，式(X)化合物为盐的形式，例如药学上可接受的盐。例如，可在阴离子和本文所述化合物上的带正电的取代基(如氨基)之间形成盐。适合的阴离子包括氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫酸根、硫酸氢根、硝酸根、磷酸根、柠檬酸根、甲磺酸根、三氟乙酸根、乙酸根、延胡索酸根、油酸根、戊酸根、马来酸根、草酸根、异烟酸根、乳酸根、水杨酸根、酒石酸根、丹宁酸根、泛酸根、酒石酸氢根、抗坏血酸根、琥珀酸根、龙胆酸根(gentisinate)、葡糖酸根、葡糖二酸根(glucaronate)、糖酸根、甲酸根、苯甲酸根、谷氨酸根、乙磺酸根、苯磺酸根、对甲苯磺酸根和双羟萘酸根(pamoate)。在一些优选的实施方案中，式(X)的化合物为氢卤酸盐，例如为盐酸盐。
式(X)的化合物也可以以水合物(例如，(H2O)n)和溶剂化物的形式存在，这也包含在本发明的公开范围之内。
PEG-脂质化合物
本申请人现已发现某些包含PEG的脂质部分可为核酸试剂(例如单链或双链的核酸，如siRNA)的施用提供理想的性质。例如，将包含PEG的脂质(如本文所述的脂质)和核酸部分(如siRNA)配制成缔合复合物中并施用于受试者时，所述脂质可提供增强的核酸部分的递送。例如，可通过基因沉默试验(例如FVII的沉默)评估所述增强的递送。特别地，本申请人现已发现式(XV)的PEG-脂质可具有用于递送siRNA的理想性质，包括改进的生物利用度、生物降解性和耐受性。
在一些实施方案中，PEG通过接头部分与包含两个疏水部分(如长链烷基部分)的结构相连。示例性的PEG-脂质如上所示，例如式(XV)、(XV′)和(XVI)所涵盖的那些。在一些优选的实施方案中，所述PEG-脂质具有如下结构：
Figure G2007800447386D00581
其中，手性中心的优选立体化学构型为‘R’，重复PEG部分的总平均分子量为约2000道尔顿。
在一些实施方案中，本文所述PEG脂质与靶向部分相连，例如糖基部分，如
Figure G2007800447386D00582
在一些实施方案中，靶向部分通过接头与PEG-脂质相连，例如通过本文所述的接头。被靶向了的PEG脂质化合物的实例为本文所述的式(XXI)、(XXI′)、(XXII)和(XXII′)的化合物。此类脂质的制备方法描述于例如实施例42和43中。
阳离子脂质化合物和包含阳离子脂质的制品的制备方法
本文所述的化合物可由商业渠道(例如，Asinex，俄罗斯莫斯科；Bionet，Camelford，英格兰；ChemDiv，SanDiego，CA；Comgenex，Budapest，匈牙利；Enamine，Kiev，乌克兰；IF Lab，乌克兰；Interbioscreen，俄罗斯莫斯科；Maybridge，Tintagel，UK；Specs，荷兰；Timtec，Newark，DE；Vitas-M Lab，俄罗斯莫斯科)获得，或使用可商购的起始原料和试剂通过如下所述的常规方法合成。
多胺脂质的制备方法
在一些实施方案中，可通过如下所示的式(III)多胺与式(IV)1，4-共轭系统的反应制备式(I)的化合物，
Figure G2007800447386D00591
式(III)
其中Xa、Xb和n的定义如上所述，
Figure G2007800447386D00592
式(IV)
其中Y和R1的定义如上所述。
在一些实施方案中，将式(III)和(IV)的化合物一起反应(在无溶剂的条件下反应)。例如，在高温下(例如，至少约60℃、至少约65℃、至少约70℃、至少约75℃、至少约80℃、至少约85℃或至少约90℃)将纯的式(III)和(IV)的化合物一起反应，优选约90℃下反应。
在一些实施方案中，在溶剂中(例如极性非质子溶剂，如乙腈或DMF)将式(III)和(IV)的化合物一起反应。例如，在约50℃～约120℃高温下将式(III)和(IV)的化合物在溶剂中一起反应。
在一些实施方案中，在存在自由基淬灭剂或清除剂(例如氢醌)的条件下将式(III)和(IV)的化合物一起反应。包含自由基淬灭剂的反应条件可以为无溶剂(neat)或在溶剂(例如极性非质子溶剂，如乙腈或DMF)中。反应可在高温(例如，无溶剂时在如90℃的高温；有溶剂时在如约50℃～约120℃的高温)下进行。本文所用术语“自由基淬灭剂”或“自由基清除剂”是指可吸收反应混合物中的自由基的化学部分。自由基淬灭剂/清除剂的实例包括氢醌、抗坏血酸、甲酚、硫胺、3，5-二叔丁基-4-羟基甲苯、叔丁基-4-羟基苯甲醚和包含硫醇的部分。
在一些实施方案中，在存在反应促进剂(例如，水或迈克尔加成反应促进剂(如乙酸、硼酸、柠檬酸、苯甲酸、对甲苯磺酸、五氟苯酚、苦味酸芳香酸)，盐(如重碳酸盐、重硫酸盐、一氢或二氢磷酸盐)，酚类、全卤代酚、硝基酚、磺酸、PTTS等)的条件下将式(III)和(IV)的化合物一起反应，所述反应促进剂优选硼酸，例如饱和硼酸水溶液。包含反应促进剂的反应条件可以为无溶剂或在溶剂中，例如极性非质子溶剂，如乙腈或DMF。反应可在高温(例如，无溶剂时在如90℃的高温；有溶剂时在如约50℃～约120℃的高温)下进行。本文所用术语“反应促进剂”是指在反应混合物中使用时可促进/增加反应速率的化学部分。
可改变式(III)化合物与式(IV)化合物的比例，以提供在式(III)的多胺上进行取代的可变性。通常，优选至少约50％的氢部分被非氢部分取代的多胺。因此，可选择式(III)化合物/式(IV)化合物的比例以提供具有相对较高的游离胺取代程度(例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或基本全部)的产物。在一些优选的实施方案中，在式(III)的多胺中n为0，式(III)化合物与式(IV)化合物的比例为约1∶3至约1∶5，优选为约1∶4。在一些优选的实施方案中，在式(III)的多胺中n为2，式(III)化合物与式(IV)化合物的比例为约1∶3至约1∶6，优选为约1∶5。
在一些实施方案中，式(III)化合物和(IV)化合物在两步反应过程中进行反应。例如，第一步的过程包括含有约0.8～约1.2摩尔当量的式(III)化合物和约3.8～约4.2摩尔当量的式(IV)化合物的反应混合物，而第二步的过程包括向所述反应混合物中添加约0.8～1.2摩尔当量的式(IV)的化合物。
反应完成后，可从所述反应混合物中分离得到具有式(I)结构的一种或多种产物。例如，可将式(I)化合物作为单个产物(例如一种结构异构体)或作为混合产物(例如多种结构异构体和/或多种式(I)的化合物)进行分离。在一些实施方案中，可使用色谱法(例如快速色谱(flash chromatography)、重力色谱法(例如使用硅胶对异构体进行重力分离)、柱色谱法(例如正相HPLC或RPHPLC)或移动床色谱法))分离和/或纯化一种或多种反应产物。在一些实施方案中，纯化反应产物以提供包含至少约80％(例如至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％)的一种化合物(如一种结构异构体)的制品。
在一些实施方案中，使用如HCl的酸处理游离胺产物以提供该产物的胺盐(例如盐酸盐)。在一些实施方案中，与相应的游离胺产物相比，盐产物具有改进的性质，例如操作性和/或贮存性。在一些实施方案中，与相应的游离胺相比，盐产物可阻止或降低分解产物(如N-氧化物或N-碳酸盐)的形成速率。在一些实施方案中，与相应的游离胺相比，盐产物可在治疗制品的应用中具有改进的性质。
在一些实施方案中，例如对反应混合物进一步处理，以纯化一种或多种产物或除去杂质(如未反应的起始原料)。在一些实施方案中，使用可捕获未反应的丙烯酰胺的固定化(如与聚合物结合)硫醇部分来处理反应混合物。在一些实施方案中，可对分离产物进行处理以进一步除去杂质，例如可使用捕获未反应的丙烯酰胺的固定化硫醇部分处理分离产物。
在一些实施方案中，可使用固定化(如与聚合物结合)的异硫氰酸盐处理反应产物。例如，可使用固定化异硫氰酸盐处理包含叔胺的反应产物，以从该产物中除去伯胺和/或仲胺。
在一些实施方案中，可通过如下所示的式(III)化合物与式(VI)化合物的反应来制备式(I)的化合物，
Figure G2007800447386D00611
式(III)
其中Xa、Xb和n的定义如上所述，
Figure G2007800447386D00612
式(VI)
其中Q为Cl、Br或I，Y和R1的定义如上所述。
在一些实施方案中，在无溶剂的条件下将式(III)和(VI)的化合物一起反应。在一些实施方案中，在存在一种或多种溶剂(例如极性非质子溶剂，如乙腈或DMF)的条件下将式(III)和(VI)的化合物一起反应。在一些实施方案中，使反应物(式(III)和(VI)的化合物)在高温下(例如，至少约50℃、至少约60℃、至少约70℃、至少约80℃、至少约90℃、至少约100℃)一起反应。
在一些实施方案中，该反应混合物还包括碱，例如碳酸盐，如K2CO3。
在一些实施方案中，反应混合物还包含催化剂。
在一些实施方案中，通过胺部分与活化酸(如酸酐或酸性卤化物(如酸性氯化物))的反应提供(VI)的化合物，从而制备(VI)的化合物。
可改变式(III)化合物与式(VI)化合物的比例，以提供在式(III)多胺上取代的可变性。通常，优选至少约50％的氢部分被非氢部分取代的多胺。因此，可选择式(III)化合物/式(VI)化合物的比例以提供具有相对较高的游离胺取代程度(例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％或基本全部)的产物。在一些优选的实施方案中，在式(III)的多胺中n为0，式(III)化合物与式(VI)化合物的比例为约1∶3至约1∶5，优选为约1∶4。在一些优选的实施方案中，式(III)的多胺中n为2，且式(III)化合物与式(VI)化合物的比例为约1∶3至约1∶6，优选为约1∶5。
在一些实施方案中，式(III)化合物和(VI)化合物在两步反应过程中进行反应。例如，第一步的过程包括具有约0.8～约1.2摩尔当量的式(III)化合物和约3.8～约4.2摩尔当量的式(VI)化合物的反应混合物，而第二步的过程包括向所述反应混合物中添加约0.8～1.2摩尔当量的式(VI)的化合物。
在一些实施方案中，在式(III)的多胺与式(IV)或式(VI)的化合物反应之前，使用保护基团选择性地保护式(III)中一个或多个胺部分，从而使终产物合成中的选择性提高。例如，在与式(IV)或式(VI)的化合物反应之前保护式(III)多胺的一个或多个伯胺，从而提供使式(IV)或式(VI)的化合物与仲胺反应的选择性。可采用其他保护基团的策略以提供对伯胺的选择性，例如使用可被选择性地除去的正交保护基团(orthogonal protectinggroup)。
反应完成后，可从所述反应混合物中分离得到具有式(I)结构的一种或多种产物。例如，可将式(I)化合物作为单个产物(例如一种结构异构体)或作为产物的混合物(例如多种结构异构体和/或多种式(I)的化合物)进行分离。在一些实施方案中，可使用色谱法(例如快速色谱、重力色谱法(例如使用硅胶对异构体进行重力分离)、柱色谱法(例如正相HPLC或RPHPLC)或移动床色谱法)分离和/或纯化一种或多种反应产物。在一些实施方案中，纯化反应产物以提供包含至少约80％(例如至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％)的单个化合物(如一种结构异构体)的制品。
在一些实施方案中，使用如HCl的酸来处理游离胺产物以提供该产物的胺盐(例如盐酸盐)。在一些实施方案中，与相应的游离胺产物相比，盐产物具有改进的性质，例如操作性和/或贮存性。在一些实施方案中，与相应的游离胺相比，盐产物可阻止或降低分解产物(如N-氧化物或N-碳酸盐的形成)的形成速率。在一些实施方案中，与相应的游离胺相比，盐产物可在治疗制品的应用中具有改进的性质。
在一些实施方案中，可使用区域选择性合成法制备多胺阳离子脂质。区域选择性合成法为在多胺骨架的氮上进行位点特异性烷基化提供了便利的方法，从而能够合成特异烷基化的目标衍生物。通常，首先使式(I)的化合物与选择性地与伯胺或末端胺反应的试剂发生反应，从而封闭或干扰伯胺或末端胺参与其他反应，并且可在目标化合物合成期间的适当阶段选择性地除去这些封闭物。在对式(I)化合物的末端胺进行封闭后，通过使用恰当摩尔比例的反应物和恰当的反应条件可利用正交胺保护基团选择性地封闭一个或多个仲胺。选择性的烷化、随后对封闭胺进行的选择性脱保护和对重新产生的胺的进一步烷化，以及所述反应顺序的恰当重复，可产生特异的目标产物。例如，在恰当的反应条件下使用伯胺特异性保护基团(如三氟乙酰胺)选择性地封闭三乙烯四胺(1)的末端胺，随后在存在碱(例如二异丙基乙胺)的条件下与过量的正交胺保护基团(例如，(Boc)2O)反应以封闭所有的末端胺(例如Boc)。选择性地除去末端保护基团，随后使用如丙烯酰胺烷化末端胺以提供化合物1的所有末端胺均被烷基化的衍生物。脱去对中间胺的保护，随后使用如计算量的丙烯酰胺进行烷基化，可获得部分烷基化的产物7。化合物7的另一种制备方法是使末端受保护的化合物1与计算量的正交胺保护基团(例如，(Boc)2O)反应以获得部分被保护的化合物1的衍生物。除去部分选择性地被保护的化合物1的末端胺保护基团，随后使用如丙烯酰胺烷化所有未受保护的胺，可获得所需的化合物7。
具有可生物切割部分的脂质的制备方法
在一些实施方案中，可通过式(XI)化合物与式(XII)化合物的反应制备式(X)的化合物，
式(XI)
Figure G2007800447386D00642
式(XII)
其中，R1、R2和R3的定义如上所述。
在一些实施方案中，在存在偶联剂(例如，碳二亚胺，如水溶性碳二亚胺，如EDCI)的条件下进行式(XI)化合物与式(XII)化合物的反应。
可使用其他化学反应和起始原料以提供具有两个连接基团L1和L2的式(X)的化合物。例如，可将式(XI)的羟基部分置换成胺部分以提供酰胺或脲连接基团的前体。
反应完成后，可从所述反应混合物中分离得到具有式(X)结构的一种或多种产物。例如，可将式(X)化合物作为单个产物(例如一种结构异构体)或作为产物的混合物(例如多种结构异构体和/或多种式(X)的化合物)进行分离。在一些实施方案中，可使用色谱法(例如快速色谱、重力色谱法(例如使用硅胶对异构体进行重力分离)、柱色谱法(例如正相HPLC或RPHPLC)或移动床色谱法)分离和/或纯化一种或多种反应产物。在一些实施方案中，纯化反应产物以提供包含至少约80％(例如至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％)的单个化合物(如一种结构异构体)的制品。
在一些实施方案中，使用如HCl的酸处理游离胺产物以提供该产物的胺盐(例如盐酸盐)。在一些实施方案中，与相应的游离胺产物相比，盐产物具有改进的性质，例如操作性和/或贮存性。在一些实施方案中，与相应的游离胺相比，盐产物可阻止或降低分解产物(如N-氧化物或N-碳酸盐的形成)的形成速率。在一些实施方案中，与相应的游离胺产物相比，盐产物可在治疗制品的应用中具有改进的性质。
PEG-脂质的制备方法
例如，可在适当的条件下进行甘油酯部分(例如，二肉豆蔻基甘油酯、二棕榈基甘油酯、或二硬脂酸甘油脂)与活化部分的反应以提供活化的中间产物，随后使活化的中间产物与具有反应性部分(例如胺或羟基基团)的PEG组分反应以获得PEG-脂质，从而制备PEG-脂质化合物。例如，首先在存在碱(例如三乙胺)的条件下使二烷基甘油酯(例如二肉豆蔻基甘油酯)与N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应，随后在存在碱(例如吡啶)的条件下使所形成的中间产物与PEG-胺(例如mPEG2000-NH2)反应以产生目标PEG-脂质。在这些条件下，PEG组分通过氨基甲酸酯连接与脂质部分相连。在另一个实例中，可通过例如将甘油酯部分(例如，二肉豆蔻基甘油酯、二棕榈基甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二肉豆蔻酰甘油酯、二棕榈酰甘油酯、或二硬脂酰甘油酯)与琥珀酸酐反应，随后活化产生的羧基，再通过活化中间产物与如具有胺或羟基基团的PEG组分的反应来获得PEG-脂质，从而制备PEG-脂质。在一个实施例中，在存在碱(如DMAP)的条件下使二肉豆蔻基甘油酯与琥珀酸酐反应，从而获得半琥珀酸酯。使用标准的羧基活化试剂(例如HBTU和二异丙基乙胺)活化由此获得的半琥珀酸酯的游离羧基部分，随后使活化羧基与如mPEH2000-NH2反应，从而获得PEG-脂质。在此方法中，PEG组分通过琥珀酸酯桥与脂质组分相连。
缔合复合物
本文所述的脂质化合物和脂质制品可用作缔合复合物(例如脂质体或脂质复合物)的组分。此类缔合复合物可用于施予基于核酸(例如，RNA，如单链或双链RNA，如dsRNA)的治疗剂。
本文公开的缔合复合物可用于包裹(package)寡核苷酸试剂，其中所述寡核苷酸制品能够通过靶向并结合核酸来改变基因的表达。寡核苷酸试剂可以为单链或双链，并可包含，例如dsRNA、mRNA前体、mRNA、小RNA(miRNA)、mi-RNA前体(pre-miRNA)、质粒或DNA，或与蛋白质相连(toa protein)。本文所述的寡核苷酸试剂可以为，例如dsRNA、小RNA、反义RNA、antagomir、诱饵RNA、DNA、质粒和适体。
缔合复合物可包含多个组分。在一些实施方案中，缔合复合物(如脂质体)可包含如核酸治疗剂(例如寡核苷酸式试剂，如dsRNA)的活性成分，如本文所述脂质的阳离子脂质。在一些实施方案中，所述缔合复合物可包含多种治疗剂，例如靶向不止一个基因或靶向相同基因的不同区域的两种或三种单链或双链核酸部分。缔合复合物中也可包含其他组分，包括PEG-脂质(如本文所述的PEG-脂质)或结构性组分(如胆固醇)。在一些实施方案中，所述缔合复合物还包含膜融合脂质或组分和/或靶向分子。在一些优选的实施方案中，所述缔合复合物为包含寡核苷酸试剂(如dsRNA)、本文所述的脂质(如式(I)或式(X)的化合物)、PEG-脂质(如本文所述的PEG-脂质，例如式(XV)的PEG-脂质)，以及结构性组分(如胆固醇)的脂质体。
单链核糖核酸
寡核苷酸试剂包括小RNA(MicroRNA，miRNA)。小RNA为非编码小RNA分子，其可通过抑制翻译或通过降解靶mRNA导致细胞中特定基因的转录后沉默。miRNA可与靶核酸完全互补或具有非互补区，从而在非互补区形成“突起”。非互补区(突起)的侧翼可以为充分互补区(regions of sufficientcomplementarity)，优选为完全互补，以形成双链。优选互补区的长度为至少8～10个核苷酸(例如，长度为8个、9个或10个核苷酸)。miRNA可通过抑制翻译而抑制基因表达，例如当小RNA与靶核酸不完全互补时；或者通过引发靶RNA降解而抑制基因表达，这被认为只有在miRNA与其靶标完全互补时才能发生。本发明还可包括在与其靶标结合时可能或可能不形成突起的miRNA的双链前体。
在优选的实施方案中，本文所述的寡核苷酸试剂能够靶向内源miRNA或miRNA前体。本文所述的寡核苷酸试剂可包含天然存在的核酸碱基、糖和核苷间(骨架)共价连接，以及具有功能类似的非天然存在部分的寡核苷酸。此类修饰或取代的寡核苷酸由于具有期望的性质，例如增加细胞摄取、增强对外源miRNA靶标的亲和性，和/或增强在核酸酶存在的条件下的稳定性，因而通常优于天然形式。经设计以结合特异外源miRNA的寡核苷酸试剂与靶miRNA中至少10个、20个或25个或更多的碱基基本互补，例如至少70％、80％、90％或100％互补。
miRNA或miRNA前体的长度可以为18～100个核苷酸，更优选长度为18～80个核苷酸。成熟的miRNA的长度可以为19～30个核苷酸，优选21～15个核苷酸，特别是21个、22个、23个、24个或25个核苷酸。小RNA前体的长度可以为70～100个核苷酸，并具有发卡构象。可通过将长miRNA前体特异加工为功能性miRNA的酶(被称为Dicer和Drosha)在体内由miRNA前体产生小RNA。可通过基于细胞的系统在体内合成，或可通过化学合成本发明所述的小RNA或miRNA前体。所合成的小RNA可包含修饰以使其具有所需的特性。例如，修饰可提高稳定性、与靶核酸杂交的热力学，对特定组织或细胞类型的靶向性或细胞穿透性(例如，通过依赖内吞或不依赖内吞的机制)。修饰还能够提高序列特异性，并由此减少脱靶(off-site targeting)。以下对合成方法和化学修饰进行更加详细的描述。
对于给定的正义链序列(例如，cDNA分子的正义链序列)，可根据Watson-Crick碱基配对法则设计miRNA。所述miRNA可与RNA(例如，miRNA、miRNA前体、mRNA前体或mRNA)的某部分互补。例如，miRNA可与mRNA或mRNA前体的编码区或非编码区(例如，mRNA前体或mRNA翻译起始位点的周边区域，如5′-UTR)互补。例如，miRNA寡核苷酸的长度可为约12～30个核苷酸，优选长度为约15～28个核苷酸(例如长度为16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸)。
特别地，本发明所述miRNA或miRNA前体可在与靶核酸不互补的内部区域(即非末端区域)中的核苷酸上具有化学修饰。例如，可将修饰核苷酸引入到形成突起的miRNA的所述区域中。所述修饰可包括如通过接头(例如，参见下文OT-I～OT-IV的图表)与miRNA相连的配体。例如，所述修饰可改进治疗性miRNA的药物动力学或稳定性，或改进miRNA与靶核酸的杂交性(例如杂交热力学)。在一些实施方案中，优选引入或束缚(tethered)到miRNA突起区域的修饰或配体的定位使其占据突起区域中的空间。例如，所述修饰可包括在核苷酸链上的修饰碱基或糖，或发挥嵌入剂(intercalator)作用的配体。这些修饰都优选定位于突起中。所述嵌入剂可以为芳族，例如多环芳族化合物或杂环芳族化合物。多环嵌入剂可具有堆叠能力，并可包含具有2、3或4个稠环的系统。可将下文所述的通用碱基引入到miRNA中。在一些实施方案中，优选引入或束缚到miRNA突起区域的修饰或配体的定位使其占据突起区域中的空间。这种定位有助于提高miRNA的杂交性质或者其他期望性质。
在一个实施方案中，miRNA或miRNA前体可包括氨基糖苷配体，其可使miRNA具有提高的杂交性质或提高的序列特异性。示例性的氨基糖苷包括糖基化聚赖氨酸、半乳糖苷化聚赖氨酸、新霉素B、妥布霉素(tobramycin)、卡那霉素A以及氨基糖苷的吖啶结合物(acridine conjugate)，例如新霉素-N-吖啶、新霉素-S-吖啶、新霉素-C-吖啶、妥布霉素-N-吖啶、和卡那霉素A-N-吖啶。使用吖啶类似物可提高序列特异性。例如，与DNA相比，新霉素B对RNA具有高亲和性和低序列特异性。吖啶类似物新霉素-S-吖啶对HIVRev-响应元件(RRE)具有提高的亲和性。在一些实施方案中，将氨基糖苷配体的胍类似物(胍基糖苷)束缚到寡核苷酸试剂上。在胍基糖苷中，氨基酸上的氨基基团被交换为胍基基团。胍基类似物的结合可增强寡核苷酸试剂的细胞穿透性。
在一个实施方案中，所述配体可包含通过切割靶核酸造成靶基因抑制的剪切基团(cleaving group)。优选以某种方式将剪切基团束缚到miRNA上以使其定位于突起区域内，从而使其能够接近并切割靶RNA。所述剪切基团可以为，例如博来霉素(例如，博来霉素-A5、博来霉素-A2、或博来霉素-B2)、芘、菲咯啉(例如邻菲咯啉)、多胺、三肽(例如lys-tyr-lys三肽)或金属离子螯合基团。金属离子螯合基团可包括，例如Lu(III)或EU(III)大环复合物，Zn(II)2，9-二甲基菲咯啉衍生物，Cu(II)三联吡啶或吖啶，其可通过游离金属离子(如Lu(III))促进在突起位点对靶RNA的选择性切割。在一些实施方案中，可将肽配体束缚到miRNA或miRNA前体上，从而促进对靶RNA的切割，例如在突起区域进行切割。例如，可将1，8-二甲基-1，3，6，8，10，13-六氮杂环十四烷(cyclam)与肽结合(例如通过氨基酸衍生物)以促进对靶RNA的切割。本文所述的方法和组合物包括通过依赖切割或不依赖切割的机制来抑制靶基因表达的miRNA。
可设计并合成miRNA或miRNA前体，使其含有的不互补区域(例如，长度为3、4、5或6个核苷酸的区域)的侧翼为充分互补的区域从而形成双链(例如，长度为7、8、9、10或11个核苷酸的区域)。
为了增加核酸酶抗性和/或对靶标的结合亲和性，miRNA序列可包含2′-O-甲基、2′-氟、2′-O-甲氧基乙基、′-O-氨基丙基、2′-氨基和/或硫代磷酸酯连接。引入锁核酸(LNA)、2-硫代嘧啶(例如2-硫代-U)、2-氨基-A、G-clamp修饰以及亚乙基核酸(ENA，例如2′-4′-乙烯桥接核酸)，也可增加对靶标的结合亲和性。在寡核苷酸骨架中引入呋喃糖也能减少核酸内切。可通过引入3′-阳离子基团或通过使用3′-3′连接调转3′-末端的核苷酸来进一步修饰miRNA或miRNA前体。在另一种选择中，可使用氨基烷基基团(如3′C5-氨基烷基dT)封闭3′-末端。其他3′-结合物可抑制3′-5′核酸外切。尽管不受理论的束缚，3′-结合物(如萘普生或布洛芬)可通过空间位阻阻断核酸外切酶与寡核苷酸3′-末端的结合，从而抑制核酸外切。即便是小烷基链、芳基基团或杂环结合物或修饰糖(D-核糖、脱氧核醣、葡萄糖等)也能够阻断3′-5′核酸外切酶。
可使用氨基烷基基团(例如5′-O-烷基氨基取代基)封闭5′-末端。其他5′-结合物可抑制5′-3′核酸外切。尽管不受理论的束缚，5′-结合物(如萘普生或布洛芬)可通过空间位阻阻断核酸外切酶与寡核苷酸5′-末端的结合，从而抑制核酸外切。即便是小烷基链、芳基基团或杂环结合物或修饰糖(D-核糖、脱氧核醣、葡萄糖等)也能够阻断3′-5′核酸外切酶。
在一个实施方案中，miRNA或miRNA前体包含提高靶向性的修饰，例如本文所述的靶向修饰。使miRNA分子靶向特定细胞类型的修饰的实例包括：碳水化合物糖类，如半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖；维生素，如叶酸；其他配体，如RGD和RGD模仿物；以及小分子，包括萘普生、布洛芬或其他已知的蛋白质结合分子。
可使用化学合成和/或使用本领域已知的方法通过酶连接反应构建miRNA或miRNA前体。例如，可使用天然存在的核苷酸化学合成miRNA或miRNA前体，或者可使用经设计以增加分子的生物学稳定性或增加miRNA或miRNA前体与靶核酸间形成的双链的物理稳定性的多种修饰核酸，例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。本文描述了其他适合的核酸修饰。也可使用表达载体由生物产生miRNA或miRNA前体，其中已将核酸反向亚克隆到所述表达载体中(即，插入核酸转录的RNA与目标靶核酸成反向)。
反义型寡核苷酸试剂
本文所述的单链寡核苷酸试剂包括反义核酸。“反义”核酸包括与编码基因表达产物的“正义”核酸互补的核苷酸序列，例如与双链cDNA分子的编码链互补的序列，或与RNA序列(例如mRNA前体、mRNA、miRNA或miRNA前体)互补的序列。因此，反义核酸可与正义靶核酸形成氢键。
对于给定的编码链序列(例如，cDNA分子的正义链序列)，可根据Watson-Crick碱基配对法则设计反义核酸。反义核酸分子可与RNA(例如mRNA前体或mRNA)编码或非编码区的一部分互补。例如，反义寡核苷酸可与mRNA前体或mRNA翻译起始位点的周边区域(如5′-UTR)互补。例如，反义寡核苷酸的长度可为约10～25个核苷酸(例如长度为11、12、13、14、15、16、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸)。反义寡核苷酸也可与mRNA或mRNA前体互补。
可使用化学合成和/或使用本领域已知的方法通过酶连接反应构建反义核酸。例如，可使用天然存在的核苷酸化学合成反义核酸(例如，反义寡核苷酸)，或者可使用经设计以增加分子的生物学稳定性或增加反义核酸与靶核酸间形成的双链的物理稳定性的多种修饰核酸，例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。本文描述了其他适合的核酸修饰。或者，可使用表达载体由生物产生反义核酸，其中已将核酸反向亚克隆到所述表达载体中(即，插入核酸转录的RNA与目标靶核酸成反向)。
反义试剂可仅包含核糖核酸，仅包含脱氧核糖核酸(例如寡聚脱氧核糖核酸)或既包含脱氧核糖核酸又包含核糖核酸。例如，仅由核糖核酸组成的反义试剂可与互补的RNA杂交，并阻止翻译器(translation machinery)接近靶RNA转录本，从而阻止蛋白质合成。仅包含脱氧核糖核酸的反义分子，或包含脱氧核糖核酸和核糖核酸的反义分子(例如，在反义试剂DNA序列的5′和3′末端的侧翼为RNA序列)可与互补的RNA杂交，并且随后对靶RNA进行酶切(例如使用RNAse H降解靶RNA)。靶RNA的降解阻止翻译的进行。侧翼RNA序列可包含2′-O-甲基化的核苷酸以及硫代磷酸酯连接，而内部DNA序列可包含硫代磷酸酯核苷酸间连接。需要通过RNAseH活性进行靶向时，内部DNA序列的长度优选为至少5个核苷酸。
为增加核酸酶抗性，可通过使用3′-3′连接调转3′-末端的核苷酸来进一步修饰反义试剂。在另一个选择中，可使用氨基烷基基团封闭3′-末端。
在一个实施方案中，反义寡核苷酸试剂包含提高靶向性的修饰，例如本文所述的靶向修饰。
诱饵型寡核苷酸试剂
本文所述寡核苷酸试剂可以为诱饵核酸，例如诱饵RNA。诱饵核酸类似于天然核酸，但诱饵核酸的修饰方式使其抑制或干扰天然核酸的活性。例如，诱饵RNA可模仿针对配体的天然结合域。因此，诱饵RNA与天然结合靶竞争与特异配体的结合。天然结合靶可以为内源核酸，例如miRNA前体、miRNA、mRNA前体、mRNA或DNA。例如，现已发现过表达的HIV转录激活应答(TAR)RNA可充当“诱饵”并有效结合HIV tat蛋白，从而抑制其与HIV RNA中编码的TAR序列的结合。
在一个实施方案中，诱饵RNA包括提高靶向性的修饰，例如本文所述的靶向修饰。
上文以及本文中其他部分所述的对miRNA和反义RNA的化学修饰也适合用于诱饵核酸。
适体型寡核苷酸试剂
本文所述的寡核苷酸试剂可以为适体。适体与非核酸配体(例如有机小分子或蛋白质，例如转录或反义因子)结合，随后改变(例如抑制)其活性。适体可折叠成特异的结构以介导对非核酸配体上靶向性结合位点的识别。适体可包含本文所述的任何修饰。
在一个实施方案中，适体包括提高靶向性的修饰，例如本文所述的靶向性修饰。
上文以及本文中其他部分所述的对miRNA和反义RNA的化学修饰也适合用于诱饵核酸。
以下附图和阐述对本发明的一个或多个实施方案进行了详细说明。本发明的其他特征和优点将体现于说明书、附图和权利要求书中。基于所有目的，本申请通过引用整体并入所有的引用文献、专利和专利申请。
一方面，本发明描述了antagomir。Antagomir为靶向小RNA的单链、双链、部分双链以及发卡结构的经化学修饰的寡核苷酸。
Antagomir包含与内源miRNA基本互补的至少12个或更多个连续核苷酸或基本由与内源miRNA基本互补的至少12个或更多个连续核苷酸组成，更具体地说，antagomir为包含与miRNA或miRNA前体核苷酸序列的靶序列基本互补的12个或更多个连续核苷酸的试剂。优选本发明所述的antagomir包括与miRNA靶序列充分互补以与其杂交的核苷酸序列，所述核苷酸序列为约12～25个核苷酸，优选为约15～23个核苷酸。更优选地，所述靶序列与表1中所示序列的差别不超过1、2或3个核苷酸，并且在一个实施方案中，antagomir为表2a-e中所示的试剂。在一个实施方案中，antagomir包括非核苷酸部分，例如胆固醇部分。所述非核苷酸部分可与例如寡核苷酸试剂的3′或5′末端相连。在优选的实施方案中，胆固醇部分与寡核苷酸试剂的3′末端相连。
例如，通过引入修饰(如核苷酸修饰)使antagomir对核酸降解保持稳定。在另一个实施方案中，antagomir在核苷酸序列3′或5′末端的至少第一个、第二个或第三个核苷酸间连接内含有硫代磷酸酯。在再一个实施方案中，antagomir包含2′-修饰核苷酸，例如2′-脱氧、2′-脱氧-2′-氟、2′-O-甲基、2′-O-甲氧基乙基(2′-O-MOE)、2′-O-氨基丙基(2′-O-AP)、2′-O-二甲基氨基乙基(2′-O-DMAOE)、2′-O-二甲基氨基丙基(2′-O-DMAP)、2′-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2′-O-DMAEOE)或2′-O-N-甲基乙酰氨基(2′-O-NMA)。在特别优选的实施方案中，antagomir包含至少一个2′-O-甲基修饰的核苷酸，并且在一些实施方案中，antagomir中的所有核苷酸均包含2′-O-甲基修饰。
例如在miRNA活性的异常或不良，或者与内源miRNA杂交的靶mRNA的活性不足与疾病或病变相关的情况下，可将与miRNA核苷酸序列基本互补的antagomir递送到细胞或人体中，以抑制或降低内源miRNA的活性。在一个实施方案中，本文所述的antagomir具有与miR-122(参见表1)基本互补的核苷酸序列，其与包括醛缩酶A mRNA、N-myc下游调控基因(Ndrg3)mRNA、包含IQ基序的GTPase活化蛋白-1(Iqgap1)mRNA、HMG-CoA-还原酶(Hmgcr)mRNA以及柠檬酸合酶mRNA等在内的多种RNA杂交。在优选的实施方案中，与miR-122基本互补的antagomir为antagomir-122(表2a-e)。现已发现醛缩酶A缺陷与包括溶血性贫血、先天多发性关节挛缩症(arthrogryposis complex congenita)、垂体异位症、横纹肌溶解症、高钾血症在内的多种病变相关。患醛缩酶A缺陷的病人还具有以下症状，包括生长发育延迟、脸面中部发育不全、肝肿大以及肌病性症状。因此，患有或经诊断为患有任意的这些病变或症状的病人为接受使用与miR-122杂交的antagomir治疗的候选人。
双链核糖核酸(dsRNA)
在一个实施方案中，本发明提供了包裹于缔合复合物(如脂质体)中，用于抑制细胞或哺乳动物中基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含具有互补区的反义链，所述互补区与该基因表达过程中形成的mRNA的至少一部分互补，并且所述互补区的长度小于30个核苷酸，通常为19-24个核苷酸，并且所述dsRNA在与表达所述基因的细胞接触时，可将所述基因的表达抑制至少40％。所述dsRNA包含两条充分互补从而杂交形成双链结构的RNA链。所述dsRNA中的一条链(反义链)包含与靶基因基本互补，或通常为完全互补的互补区，而另一条链(正义链)包含与所述反义链互补的区域，这样当在适当的条件下混合时所述两条链就会杂交并形成双链结构，其中所述靶基因衍生自基因表达期间形成的mRNA序列。通常，所述双链结构的长度为15-30个碱基对，更常见18-25个，还更常见19-24个，最常见为19-21个碱基对。类似地，与靶序列互补的区域的长度为15-30个碱基对，更常见18-25个，还更常见19-24个，最常见为19-21个碱基对。本发明的dsRNA还可以包含一个或多个单链核苷酸悬端。可通过下文进一步讨论的本领域已知的标准方法合成所述dsRNA，例如使用自动DNA合成仪(例如，可商购自Biosearch，Applied Biosystems，Inc)。
适合包裹进入本文所述缔合复合物的dsRNA可包含18～25个碱基对(例如21个碱基对)的双链结构。在一些实施方案中，dsRNA至少包含长度至少为21nt的一条单链。在其他实施方案中，dsRNA至少包含至少为15、16、17、18、19、20个或更多连续核苷酸的一个单链。
适合包裹进入本文所述缔合复合物的dsRNA可以包含与靶序列的一个或多个错配。在一个优选实施方案中，本发明的dsRNA包含不超过3个错配。如果所述dsRNA的反义链包含与靶序列的错配，则优选所述错配区域不位于互补区的中心。如果所述dsRNA的反义链包含与靶序列的错配，则优选所述错配区域被限定为自任一末端开始的5个核苷酸，例如在互补区5′-或3′-末端开始的5、4、3、2或1个核苷酸。
在一个实施方案中，dsRNA的至少一个末端具有1-4个，通常1个或2个核苷酸的单链核苷酸悬端。通常，所述单链悬端位于反义链的3′-末端，或者，可选择地位于正义链的3′-末端。所述dsRNA也可以具有平端，通常位于反义链的5′-末端。此类dsRNA具有提高的稳定性和抑制活性，因此能够以低剂量施用，即每天施用小于5mg/kg受体体重。通常，所述dsRNA的反义链在3′-末端具有核苷酸悬端，而5′-末端为平端。在另一个实施方案中，悬端中的一个或多个核苷酸被替代为核苷硫代磷酸酯。
在再一个实施方案中，对包裹在本文所述缔合复合物(例如脂质体)内的dsRNA进行化学修饰以增强稳定性。可通过本领域的常规方法合成和/或修饰此类核酸，例如那些描述于″Current protocols in nucleic acid chemistry″，Beaucage，S.L.et al.(Edrs.)，John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY，USA中的方法，以上文献通过引用并入本文。所述化学修饰可包括但不限于2′-修饰，对寡核苷酸中其它碱基或糖位点的修饰，向寡核苷酸链中引入非天然碱基，与配体或化学部分的共价连接以及将核苷酸间磷酸连接替换成如硫代磷酸酯的其它连接。可使用不只一种此类修饰。
可通过任意的多种熟知技术完成两条单独dsRNA链的化学连接，例如通过引入共价键、离子键或氢键、疏水相互作用、范德华或堆积相互作用；通过金属离子配位的方式或通过使用嘌呤类似物完成所述化学连接。此类经化学连接的dsRNA适合包裹在本文所述的缔合复合物中。通常，可用来修饰dsRNA的化学基团包括但不限于亚甲基蓝；双官能团，通常为双-(2-氯乙基)胺；N-乙酰-N′-(对乙醛酰苯甲酰基)胱胺；4-硫尿嘧啶和补骨脂素。在一个实施方案中，所述接头是六乙二醇接头。在这种情况下，可通过固相合成制备所述dsRNA，并根据标准方法(例如，Williams，D.J.和K.B.Hall，Biochem.(1996)35：14665-14670)并入六乙二醇接头。在特定的实施方案中，通过六乙二醇接头化学连接反义链的5′-末端和正义链的3′-末端。在另一个实施方案中，所述dsRNA中的至少一个核苷酸包含硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯基团。所述dsRNA末端的化学键通常通过三螺旋键形成。
在再一个实施方案中，可对两条单链中一个或两个末端的核苷酸进行修饰以防止或抑制细胞酶(例如，但不限于某些核酸酶)的降解活性。本领域中抑制细胞酶对核酸降解活性的已知技术包括但不限于2′-氨基修饰、2′-氨基糖修饰、2′-F糖修饰、2′-F修饰、2′-烷基糖修饰、2′-O-烷氧基烷基修饰(如2′-O-甲氧基乙基修饰)、无电荷和带电的骨架修饰、吗啉基修饰、2′-O-甲基修饰和氨基磷酸酯(参见，例如Wagner，Nat.Med.(1995)1：1116-8)。因此，所述dsRNA中核苷酸的至少一个2′-羟基基团被化学基团取代，通常被取代为2′-F或2′-O-甲基基团。同样，可对至少一个核苷酸进行修饰以形成锁核苷酸。此类锁核苷酸包含连接核糖的2′-氧和核糖的4′-碳的亚甲基桥。包含所述锁核苷酸的寡核苷酸描述于Koshkin，A.A.，et al.，Tetrahedron(1998)，54：3607-3630)和Obika，S.et al.，Tetrahedron Lett.(1998)，39：5401-5404)。向寡核苷酸中引入锁核苷酸可提高对互补序列的亲和力，并将解链温度提高若干度(Braasch，D.A.and D.R.Corey，Chem.Biol.(2001)，8：1-7)。
将配体与dsRNA结合可增强其细胞吸收性以及对特定组织的靶向性或由特定类型细胞的(例如，肝细胞)摄取。在某些情况下，使疏水性配体与dsRNA相结合从而促进对细胞膜的直接穿透或经肝细胞的吸收。或者，与dsRNA结合的配体是受体介导的内吞作用的底物。现已将这些方法用于促进反义寡核苷酸和dsRNA试剂的细胞穿透。例如，现已将胆固醇与多种反义寡核苷酸结合，从而产生与其非结合类似物相比更具活性的化合物。参见M.Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002，12，103。与寡核苷酸结合的其它亲脂性化合物包括1-芘丁酸、1，3-双-O-(十六烷基)甘油和甲醇。用于受体介导的内吞作用的配体的一个实例是叶酸。叶酸通过叶酸受体介导的内吞作用进入细胞。带有叶酸的dsRNA化合物可通过叶酸受体介导的内吞作用被有效地运输到细胞中。Li及其同事报道将叶酸结合到寡核苷酸的3′-末端导致所述寡核苷酸的细胞摄取增加8倍(Li，S.；Deshmukh，H.M.；Huang，L.Pharm.Res.1998，15，1540)。与寡核苷酸结合的其它配体包括聚乙二醇、糖簇(carbohydrate cluster)、交联剂、卟啉结合物、运载肽和例如胆固醇的脂质。对siRNA的其他化学修饰已描述于Manoharan，M.RNAinterference and chemically modified small interfering RNAs.Current Opinion inChemical Biology(2004)，8(6)，570-579。
在某些情况下，阳离子配体与寡核苷酸的结合提高了对核酸酶的抗性。阳离子配体的代表性实例是丙基铵和二甲基丙基铵。令人感兴趣的是，有报道称当阳离子配体分散于整个寡核苷酸时，所述寡核苷酸保持了其对mRNA的高结合亲和力。参见M.Manoharan Antisense & Nucleic Acid DrugDevelopment 2002，12，103及其参考文献。
可使用具有反应性官能团侧链(pendant reactive functionality)的dsRNA(例如，将连接分子连接到dsRNA而得到的dsRNA)来合成与配体结合的本发明dsRNA。这种反应性寡核苷酸可直接与商购的配体反应，其中所述配体经合成而具有多种保护基团，或该配体具有与其结合的连接部分。在一些优选实施方案中，本发明的方法通过使用已经适当地与配体结合并且可进一步结合固体支持物的核苷单体来促进与配体结合的dsRNA的合成。可根据本发明方法的一些优选实施方案，通过选定的血清结合配体与位于核苷或寡核苷酸5′-位的连接部分之间的反应来制备此类任意结合到固体支持物上的配体-核苷结合物。在某些情况下，首先通过长链氨基烷基基团将单体构件单元(monomer building block)共价结合到可控孔度玻璃支持物上，从而制备3′-末端结合有芳烷基配体的dsRNA。随后，通过标准固相合成技术使结合在固体支持物上的单体构件单元与核苷酸相结合。所述单体构件单元可以是核苷或适合于固相合成的其它有机化合物。
可通过熟知的固相合成技术便捷且常规制备用于本发明结合物内的dsRNA。有多个供货商销售用于此类合成的设备，包括例如AppliedBiosystems(Foster City，CA)。可额外地或任选地采用其它本领域已知的合成技术。还已知使用类似技术制备其它寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。
可在以下美国专利中找到关于合成特定修饰寡核苷酸的教导：美国专利第5,138,045号和第5,218,105号，涉及结合多胺的寡核苷酸；美国专利第5,212,295号，涉及用于制备具有手性磷连接的寡核苷酸的单体；美国专利第5,378,825号和第5,541,307号，涉及具有修饰骨架的寡核苷酸；美国专利第5,386,023号，涉及骨架经修饰的寡核苷酸和其通过还原性偶联的制备方法；美国专利第5,457,191号，涉及基于3-氮杂嘌呤环系统的修饰核碱基及其合成方法；美国专利第5,459,255号，涉及基于N-2取代嘌呤的修饰核碱基；美国专利第5,521,302号，涉及具有手性磷连接的寡核苷酸的制备方法；美国专利第5,539,082号，涉及肽核酸；美国专利第5,554,746号，涉及具有β-内酰胺骨架的寡核苷酸；美国专利第5,571,902号，涉及合成寡核苷酸的方法和材料；美国专利第5,578,718号，涉及具有烷硫基基团的核苷，其中所述基团可用作接头以与结合至所述核苷其它各位点的部分连接；美国专利第5,587,361号和第5,599,797号，涉及具有高手性纯度的硫代磷酸酯键的寡核苷酸；美国专利第5,506,351号，涉及制备2′-O-烷基鸟嘌呤核苷和包括2，6-二氨基嘌呤化合物的相关化合物的方法；美国专利第5,587,469号，涉及具有N-2取代嘌呤的寡核苷酸；美国专利第5,587,470号，涉及具有3-氮杂嘌呤的寡核苷酸；美国专利第5,223,168号和美国专利第5,608,046号，均涉及结合有4′-去甲基核苷的类似物；美国专利第5,602,240号和第5,610,289号，涉及骨架经修饰的寡核苷酸类似物；美国专利第6,262,241号和第5,459,255号，特别涉及2′-氟-寡核苷酸的合成方法。
在本发明的与配体结合的dsRNA以及具有序列特异性连接核苷的配体分子中，可使用标准核苷酸或核苷前体，或者已经具有连接部分的核苷酸或核苷结合物前体，已经具有连接分子的配体-核苷酸或核苷-结合物前体，或者具有配体的非核苷构件单元在合适的DNA合成仪上组装寡核苷酸和寡聚核苷。
在使用已经具有连接部分的核苷酸结合物前体时，通常要完成序列特异性连接核苷的合成，随后使配体分子与连接部分反应以形成结合有配体的寡核苷酸。先前已描述过具有多种分子(例如，类固醇、维生素、脂质和报告分子)的寡核苷酸结合物(参见Manoharan等人，PCT申请WO 93/07883)。在优选的实施方案中，通过使用衍生自配体-核苷结合物的亚磷酰胺以及可商购并常规用于寡核苷酸合成的标准亚磷酰胺和非标准亚磷酰胺在自动合成仪上合成本发明的寡核苷酸或连接核苷。
包裹在本文所述缔合复合物中的dsRNA可包含一个或多个经修饰的核苷，例如核苷中的2′-O-甲基、2′-O-乙基、2′-O-丙基、2′-O-烯丙基、2′-O-氨基烷基或2′-脱氧-2′-氟代基团。此类修饰可增强与所述寡核苷酸的杂交性质。此外，包含硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸具有增强的核酸酶稳定性。因此，官能化的连接核苷可进一步包括硫代磷酸酯骨架和2′-O-甲基、2′-O-乙基、2′-O-丙基、2′-O-氨基烷基、2′-O-烯丙基或2′-脱氧-2′-氟代基团中的一种或两种。例如，可在PCT公开WO 200370918中找到本领域已知的一些寡核苷酸修饰的总结表。
在一些实施方案中，使用DNA合成仪制备在5′-末端具有氨基基团的官能化核苷序列，并随后与选定配体的活性酯衍生物反应。所述活性酯衍生物为本领域技术人员所熟知。代表性的活性酯包括N-羟基琥珀酰亚胺酯、四氟酚酯、五氟酚酯和五氯酚酯。所述氨基基团与所述活性酯发生反应生成寡核苷酸，其中所述选定配体通过连接基团结合到5′-位点。5′-末端的氨基基团可使用5′-氨基-修饰剂C6试剂制备。在一个实施方案中，可通过使用配体-核苷亚磷酸酰胺将配体分子结合到寡核苷酸的5′-位点，其中所述配体直接地或通过接头间接地连接到5′-羟基基团。通常在自动合成程序结束时使用此类配体-核苷亚磷酸酰胺以获得在5′-末端具有配体的配体结合的寡核苷酸。
修饰的核苷间连接键或骨架的实例包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基膦酸烷基酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3′-5′连接键的硼烷磷酸酯及其2′-5′连接的类似物，以及具有反极性的那些类似物(其中相邻核苷单位配对的连接由3′-5′变成5′-3′或由2′-5′变成5′-2′)。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。
涉及制备上述含磷原子连接键的代表性美国专利包括但不限于美国专利第3,687,808号、第4,469,863号、第4,476,301号、第5,023,243号、第5,177,196号、第5,188,897号、第5,264,423号、第5,276,019号、第5,278,302号、第5,286,717号、第5,321,131号、第5,399,676号、第5,405,939号、第5,453,496号、第5,455,233号、第5,466,677号、第5,476,925号、第5,519,126号、第5,536,821号、第5,541,306号、第5,550,111号、第5,563,253号、第5,571,799号、第5,587,361号、第5,625,050号和第5,697,248号，所述各专利均通过引用并入本文。
其中(即，寡聚核苷中)不包含磷原子的经修饰的核苷间连接键或骨架的实例具有通过短链烷基或环烷基糖间连接键、混合的杂原子和烷基或环烷基糖间连接键，或者一个或多个短链杂原子或杂环糖间连接键形成的骨架。这些骨架包括具有吗啉代连接键(部分由核苷的糖部分形成)的骨架；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；formacetyl和thioformacetyl骨架；methyleneformacetyl和thioformacetyl骨架；含有烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚胺和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其它具有混合的N、O、S和CH2组成部分的骨架。
与上述寡聚核苷的制备相关的代表性美国专利包括但不限于美国专利第5,034,506号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,214,134号、第5,216,141号、第5,235,033号、第5,264,562号、第5,264,564号、第5,405,938号、第5,434,257号、第5,466,677号、第5,470,967号、第5,489,677号、第5,541,307号、第5,561,225号、第5,596,086号、第5,602,240号、第5,610,289号、第5,602,240号、第5,608,046号、第5,610,289号、第5,618,704号、第5,623,070号、第5,663,312号、第5,633,360号、第5,677,437号和第5,677,439号，所述各专利均通过引用并入本文。
在某些情况下，可通过非配体基团修饰缔合复合物(如脂质体)中包含的寡核苷酸。现已将多种非配体分子与寡核苷酸结合以改善所述寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取，而且可从科技文献中获得进行此类结合的方法。这些非配体部分包括脂质部分，例如胆固醇(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86：6553)，胆酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1994，4：1053)；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660：306；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3：2765)；硫代胆固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.，1992，20：533)；脂肪族链，例如，十二烷基二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人，EMBOJ.，1991，10：111；Kabanov等人，FEBS Lett.，1990，259：327；Svinarchuk等人，Biochimie，1993，75：49)；磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-磷酸酯(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651；Shea等人，Nucl.Acids Res.，1990，18：3777)；多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人，Nucleosides & Nucleotides，1995，14：969)或金刚烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651)；棕榈基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264：229)或十八胺或己胺-羰基氧基胆固醇部分(Crooke等人，Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277：923)。上文已经列出了教导此类寡核苷酸结合物的制备方法的代表性美国专利。典型的结合方法包含合成在序列中一个或多个位点具有氨基接头的寡核苷酸。随后，使用合适的偶联剂或活化试剂使氨基基团与将要被结合的分子反应。所述结合反应可在寡核苷酸仍结合在固体支持物时进行，或者在寡核苷酸被切割至溶液相后进行。通常通过HPLC纯化寡聚核苷酸结合物以获得纯的结合物。
上述修饰适合用于本文所述的寡核苷酸试剂。
膜融合脂质
术语“膜融合”(fusogenic)是指脂质或其他给药系统与细胞膜融合的能力。所述膜可以为质膜或环绕细胞器(如内涵体、细胞核等)的膜。适合的膜融合脂质的实例包括，但不限于二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、DODAC、DODMA、DODAP或DLinDMA。在一些实施方案中，缔合复合物包含与脂质相连的小分子(如咪唑部分)，以用于如内涵体的释放。
PEG或PEG-脂质
在阳离子脂质和膜融合脂质之外，缔合复合物还包含双层稳定性组分(BSC)，例如ATTA-脂质或PEG-脂质。示例性的脂质如下：例如WO05/026372所述的与二烷氧基丙基偶联的PEG(PEG-DAA)，如美国专利申请第20030077829号和第2005008689号所述的与二酰基甘油偶联的PEG(PEG-DAG)，与磷脂酰乙醇胺(PE)偶联的PEG(PEG-PE)或与神经酰胺结合的PEG，或其混合物(参见美国专利第5,885,613号)。在优选的实施方案中，所述缔合复合物包括本文所述的PEG-脂质，例如式(XV)、(XV′)或(XVI)的PEG-脂质。在一个优选的实施方案中，BSC为抑制SPLP聚集的结合脂质。适合的结合脂质包括，但不限于PEG-脂质结合物、ATTA-脂质结合物、阳离子聚合物-脂质结合物(CPL)或其混合物。在一个优选的实施方案中，SPLP包含PEG-脂质结合物或ATTA-脂质结合物以及CPL。
PEG为聚乙二醇，是带有两个末端羟基基团的乙烯基PEG重复单元的水溶性聚合物。通过其分子量对PEG进行分类，例如PEG 2000的平均分子量为约2,000道尔顿，而PEG 5000的平均分子量为约5,000道尔顿。PEG可商购自Sigma Chemical Co.及其他公司，并且包括例如以下：单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(MePEG-TRES)和单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。此外，单甲氧基聚乙二醇-乙酸(MePEG-CH2COOH)特别适合用于制备PEG-脂质结合物(包括，例如PEG-DAA结合物)。
在优选的实施方案中，PEG的平均分子量为约550道尔顿～约10,000道尔顿，更优选为约750道尔顿～约5,000道尔顿，更优选为约1,000道尔顿～约5,000道尔顿，更优选为约1,500道尔顿～约3,000道尔顿，且再更优选为约2,000道尔顿，或约750道尔顿。PEG可任选地被烷基、烷氧基、酰基或芳基基团取代。PEG可与脂质直接结合或通过接头部分与脂质相连。可使用适合偶联PEG和脂质的任何接头部分，其包括，例如不含酯的接头部分以及含酯的连头部分。在优选的实施方案中，接头部分为不含酯的接头部分。本文所用术语“不含酯的接头部分”是指不包含羧酸酯键(--OC(O)--)的接头部分。适合的不含酯的接头部分包括，但不限于酰胺(--C(O)NH--)、氨基(--NR--)、羰基(--C(O)--)、氨基甲酸酯(--NHC(O)O--)、脲(--NHC(O)NH--)、二硫化物(--S--S--)、醚(--O--)、琥珀酰(--(O)CCH2CH2C(O)--)、琥珀酰亚胺(--NHC(O)CH2CH2C(O-)NH--)、醚、二硫化物等以及其组合(例如包含氨基甲酸酯接头部分和酰胺接头部分的接头)。在优选的实施方案中，使用氨基甲酸酯接头将PEG与脂质偶联。
在其他实施方案中，使用含酯的接头部分将PEG与脂质偶联。适合的含酯的接头部分包括，例如碳酸酯(--OC(O)O--)、琥珀酰、磷酸酯(--O--(O)POH--O--)、磺酸酯及其组合。
靶向试剂
在一些实施方案中，所述缔合复合物包含靶向试剂。例如，靶向制品可包含在缔合复合物(如脂质体)的表面，从而有助于将缔合复合物导向到体内的靶区域。靶向试剂的实例为半乳糖、甘露糖和叶酸。靶向试剂的其他实例包括小分子受体、肽和抗体。在一些实施方案中，靶向试剂与治疗剂部分(如寡核苷酸试剂)结合。在一些实施方案中，靶向部分与缔合复合物的脂质组分直接相连。在一些实施方案中，靶向部分通过PEG与脂质组分直接相连，优选使用平均分子量为2000amu的PEG。在一些实施方案中，靶向试剂是未结合的，例如在缔合复合物的表面上。
结构性组分
在一些实施方案中，所述缔合复合物包含改进复合物(如脂质体)结构的一种或多种组分。在一些实施方案中，可使治疗剂(如dsRNA)与亲脂性化合物(如胆固醇)相连(如结合)，从而为dsRNA提供亲脂性锚(lipophilicanchor)。在一些实施方案中，dsRNA与亲脂性部分(如胆固醇)的结合可改进缔合复合物的包裹效率。
缔合复合物的性质
缔合复合物(如脂质体)通常为水动力学直径(hydrodynamic diameter)在约25nm～500nm范围内的颗粒。在一些优选的实施方案中，缔合复合物的水动力学直径小于500nm，例如约25～约400nm，例如约25nm～约300nm，优选为约120nm或以下。
在一些实施方案中，缔合复合物中全部赋形剂与RNA的重量比小于约20∶1，例如约15∶1。在一些优选的实施方案中，该重量比小于10∶1，例如约7.5∶1。
在一些实施方案中，缔合复合物的pKa使该缔合复合物在内涵体的环境发生质子化(例如，促进复合物的破裂)，但在生理环境中不会发生质子化。
在一些实施方案中，缔合复合物提高了寡核苷酸(如dsRNA)的体内递送。可使用基因沉默试验，例如测量VII因子沉默的试验，来测量寡核苷酸的体内递送。
VII因子的体内沉默试验
对C57BL/6小鼠进行生理盐水或多种脂质制品的尾静脉注射。以10μL/g动物体重的注射体积施用用脂质配制的不同剂量siRNA(Lipid-formulatedsiRNA)。施用24小时后，通过眼球后放血(retroorbital bleed)收集血清样品。根据制造商所述的方法，使用显色诊断试剂盒(Coaset Factor VII Assay Kit，DiaPharma)测定血清内VII因子的浓度。
缔合复合物的制备方法
在一些实施方案中，通过在存在溶剂和缓冲剂的条件下使治疗剂(如寡核苷酸)和脂质接触来制备缔合复合物。在一些实施方案中，溶剂中包含多种脂质，例如一种或多种阳离子脂质(例如含多胺的脂质或包含本文所述生物可切割部分的脂质)、PEG-脂质、靶向性脂质或膜融合脂质。
在一些实施方案中，所述缓冲剂的强度足以使含胺脂质(例如本文所述的脂质，如式(I)或式(X)的脂质)中几乎所有的胺发生质子化。
在一些实施方案中，所述缓冲剂为乙酸盐缓冲剂，例如乙酸钠(pH约为5)。在一些实施方案中，缓冲剂在溶液中存在的浓度为约100mM～约300mM。
在一些实施方案中，所述溶剂为乙醇。例如，在一些实施方案中，混合物包含至少约90％的乙醇，或100％的乙醇。
在一些实施方案中，所述方法包括将混合物挤出，从而提供粒径为水动力学直径小于约500nm(例如约25nm～约300nm的尺寸，例如在一些优选的实施方案中，粒径在约40-120nm的范围)的缔合复合物。在一些实施方案中，该方法不包括混合物的挤出。
在一个实施方案中，使本文所述脂质的溶液与含胆固醇、PEG、乙醇和25mM乙酸盐缓冲剂的溶液混合以提供pH约为5的混合物，从而制备脂质体。将该混合物温和涡旋振荡，并向该混合物中添加蔗糖。随后，再将混合物涡旋振荡直至蔗糖溶解。向该混合物中添加含siRNA的乙酸盐缓冲剂溶液，温和涡旋振荡约20分钟。随后，通过至少一个滤器(例如两个200nm滤器)在40℃挤出该混合物(例如，至少约10次，例如11次或以上)，并使用PBS在pH 7.4、室温下透析约90分钟。
在一个实施方案中，制备脂质体时不需要挤出脂质体混合物。在100％乙醇、水和浓度为约100mM～约300mM的乙酸盐缓冲剂(pH约为5)中，将本文所述的脂质与胆固醇、PEG和siRNA组合。将该组合物在90％乙醇中快速混合。完成后，使用浓度为约100mM～约300mM的乙酸盐缓冲剂(pH约为5)对混合物进行透析(或进行超滤处理)以除去乙醇，随后使用PBS进行透析(或进行超滤处理)以改变缓冲条件。
可在不存在治疗剂(如单链或双链核酸)的条件下形成缔合复合物，并在形成后使用一种或多种具有治疗活性的单链或双链核酸部分对其进行处理以提供负载的缔合复合物，即负载有治疗活性核酸的缔合复合物。核酸可被捕获至缔合复合物内部或吸附到缔合复合物的表面，或同时出现上述两种情况。例如，可使用上述缔合复合物(如脂质体)的制备方法形成不含治疗剂(例如核酸，如单链或双链RNA，如siRNA)的缔合复合物。在形成缔合复合物后，使用治疗剂(如siRNA)处理该复合物以提供负载的缔合复合物。
在一个实施方案中，提供包含阳离子脂质、胆固醇和PEG-脂质的乙醇(例如，100％乙醇)，并使其与缓冲水溶液(例如NaOAc水溶液)组合，以提供无负载的缔合复合物，其中，所述阳离子脂质如式(I)所示的脂质，优选下式的阳离子脂质
Figure G2007800447386D00841
所述PEG-脂质例如本文所述的PEG-脂质，如以下PEG-脂质
Figure G2007800447386D00842
缓冲水溶液随后，任选地挤出缔合复合物，以使缔合复合物的粒径分布更均匀。随后，使用溶于乙醇(例如35％乙醇)的治疗剂(例如siRNA)处理该缔合复合物，从而提供负载的缔合复合物。在一些实施方案中，随后通过除去乙醇的方法(例如透析)处理该缔合复合物。
缔合复合物的表征
通过类似的方式表征由任意上述方法制备的缔合复合物。首先通过目视检查表征缔合复合物。通常，优选的缔合复合物为没有凝聚物或沉淀物的浅白色透明溶液。使用Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern，USA)通过动态光散射测量脂质-纳米颗粒的粒径和粒径分布。优选颗粒的粒径为20-300nm，更优选为40-100nm。在一些优选的实施方案中，粒径呈单峰分布。使用染料排斥试验评估制品中总siRNA的浓度，以及被捕获的片段。在存在或不存在分解制品的表面活性剂(0.5％Triton-X100)的条件下，将配制的siRNA样品与结合RNA的染料Ribogreen(Molecular Probes)一起温育。参照标准曲线，通过含表面活性剂的样品的信号来测定制品中的总siRNA。从总siRNA含量中减去“游离”siRNA含量(通过不含表面活性剂的信号测量)测定被捕获的片段。被捕获的siRNA的百分数通常＞85％。
缔合复合物的使用方法以及包含该缔合复合物的组合物
包含寡核苷酸试剂的药物组合物
组装到缔合复合物中的寡核苷酸试剂能够以单链或双链的构型被施用于，例如细胞或人。双链构型的寡核苷酸试剂与基本互补的寡核苷酸链结合。以双链的构型递送寡核苷酸试剂可赋予寡核苷酸某些优点，例如增强其对核酸酶的抗性。
在一个实施方案中，本发明提供了包含如本文所述的包裹在缔合复合物(如脂质体)中的寡核苷酸试剂和药学上可接受的载体的药物组合物。所述包含所包裹的寡核苷酸试剂的药物组合物可用于治疗与靶基因的表达或活性相关的疾病或病变，例如可通过下调基因表达而介导的病理过程。可基于给药方式配制此类药物组合物。一个实例是配制成通过非肠道给药递送至特定器官/组织(例如肝脏)的组合物。
以足够抑制靶基因表达的剂量施用本发明所述的药物组合物。
通常，所包裹的寡核苷酸试剂的合适剂量为所递送的寡核苷酸制品为每天0.01～5.0mg/kg受体体重，通常为每天1μg/kg体重～1mg/kg体重。药物组合物可以每天施用一次，或者可以在一天内以适当的间隔分两个、三个或多个亚剂量施用寡核苷酸试剂，或者通过连续输注或通过控释制品递送给药。在这种情况下，每个亚剂量中所包含的寡核苷酸试剂必须相对较少以达到每天的总剂量。也可将剂量单位组合以用于数天的给药，例如使用常规持续释放制品以在数天内提供所包裹的寡核苷酸试剂的持续释放。持续释放制品是本领域所熟知的技术。
熟练的技术人员可以理解某些因素可能影响有效治疗受试者所需要的剂量和时间，所述因素包括但不限于疾病或病变的严重程度、先期治疗、受试者的综合健康度和/或年龄以及存在的其它疾病。此外，使用治疗有效量的组合物对受试者进行的治疗可以包括单次治疗或一系列治疗。如本文其它部分所述，可以使用常规方法学或者使用合适的动物模型在体内检测的基础上评估包裹于缔合复合物中的单个寡核苷酸试剂的有效量和体内半衰期。
随着小鼠遗传学的进展，已经产生了用于研究多种人类疾病的多种小鼠模型。此类模型可用于包裹于亲脂性组合物中的寡核苷酸试剂的体内检测以及确定治疗有效剂量。
可使用任何方法向哺乳动物施用包裹于缔合复合物(例如脂质体)中的寡核苷酸试剂。例如，可直接服用、口服或经胃肠外(例如，通过皮下、心室内、肌肉或腹膜内注射或通过静脉点滴)施用。可快速施用(例如，通过注射)或在一段时间内进行施用(例如，通过慢速输注或施用缓释制品)。
可将包裹于缔合复合物中的寡核苷酸试剂制备成组合物，例如灭菌和未灭菌的水溶液、在常规溶剂(例如，醇类)中的非水溶液、或者液态或固态油基质中的溶液。此类溶液也可包含缓冲剂、稀释剂和其它适合的添加剂。在经胃肠外、鞘内或心室内施用时，可将寡核苷酸试剂制备成组合物(例如灭菌水溶液)，所述组合物也可包含缓冲剂、稀释剂和其它适合的添加剂(例如，促透剂、载体化合物和其它药学上可接受的载体)。
可在药学上可接受的载体或稀释剂中制备包裹于缔合复合物中的寡核苷酸试剂。所述“药学上可接受的载体”(本文中也称为“赋形剂”)为药学上可接受的溶剂、悬浮剂或任意其它药学上的惰性载体。所述药学上可接受的载体可以是液体或固体，并可根据所计划的施用方式进行选择以提供所需的体积、稠度和其它相关的输送性质和化学性质。通常的药学上可接受的载体包括但不限于例如水、盐溶液、粘合剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填料(例如，乳糖和其它糖、明胶或硫酸钙)、润滑剂(例如，淀粉、聚乙二醇或乙酸钠)、崩解剂(例如，淀粉或淀粉乙醇酸钠)和湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)。
实施例
实施例1：化合物3、4和4、5的合成和纯化：在迈克尔加成反应条件 下对三乙烯四胺进行烷基化——方法1(路线1)
路线1a
Figure G2007800447386D00871
a(i)90℃，无溶剂，5天
在350mL的耐压瓶中装入N-十二烷基丙烯酰胺1(84g，0.35mol)[Slee，Deborah H.；Romano，Suzanne J.；Yu，Jinghua；Nguyen，Truc N.；John，Judy K.；Raheja，Neil K.；Axe，Frank U.；Jones，Todd K.；Ripka，William C.Journal ofMedicinal Chemistry(2001)，44(13)，2094-2107]，并通过温和加热容器在氩气氛中熔化该固体。向该熔化物化物中添加三乙烯四胺2(10.2g，0.07mol)，并将该混合物在90℃加热5天。在无溶剂条件下，三乙烯四胺2与丙烯酰胺1的迈克尔加成反应产生两种五烷基化产物和一种六烷基化产物，以及少量低烷基化产物。通过以CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(90∶5∶5)为洗脱剂的TLC分析反应混合物。TLC显示起始丙烯酰胺1几乎完全被消耗。将反应混合物溶解于二氯甲烷(40mL)，装载到预填硅胶柱中，并使用洗脱剂CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(48∶1∶1至8∶1∶1)分离该混合物。为了实现完全分离，可使用相同条件的多个柱，并获得下列纯产物。将所需的五加成产物3和4与六加成产物5一起分离。在对粗反应混合物的TLC和LC-MS中，还检测到该反应混合物中的一些较低的加成产物。
N-十二烷基-3-((2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-{2-[(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-2-{(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-[2-(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基氨基)-乙基]-氨基}-乙基-氨基)丙酰胺。分离得到浅黄色泡沫状的两种五烷基化衍生物之一，即化合物3(异构体I)(12g，13％)。MS m/z 672(M+2H/2)，448(M+3H/3).1H NMR CDCl3δ0.87(t，J＝6.5Hz，15H)，1.20-1.39(m，92H)，1.46-1.57(m，12H)，2.20-2.50(m，16H)，2.60-2.78(m，10H)，3.10-3.25(m，12H)，6.98(bs，3H)，7.41(bs，1H)，7.63(bs，1H)，8.85(bs，1H).13C NMR CDCl3δ14.33，22.90，27.37，29.59，29.67，29.88，29.89，29.92，32.13，39.74，172.77。
(3-[(2-{2-[{2-双-(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-氨基]-乙基}-(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-氨基]-乙基氨基}-乙基)-(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-氨基]-N-十二烷基-丙酰胺)。分离得到白色粉末状第二种五烷基化衍生物，即化合物4(异构体II)(13.7g，14％)。MS m/z 672(M+2H/2)，448(M+3H/3).1HNMRδCDCl3δ0.87(t，J＝6.5Hz，15H)，1.20-1.39(m，92H)，1.44-1.54(m，12H)，2.30-2.45(m，8H)，2.46-2.54(m，8H)，2.55-2.85(m，10H)，3.15-3.30(m，12H)，6.98(bs，3H)，7.41(bs，1H)，7.63(bs，1H)，8.85(bs，1H).13C NMR CDCl3δ14.33，22.89，27.28，27.38，29.59，29.69，29.88，29.89，29.92，32.13，39.65，39.74，50.84，172.63，172.75，172.81。
与此同时，还分离得到化合物3和4(11.6g，12％)比例为2∶3(3∶4)的纯混合物。
3-[{2-[{2-[双-(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-氨基]-乙基}-(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-氨基]-乙基}-(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-氨基]-乙基}-(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-氨基]-N-十二烷基-丙酰胺。分离得到奶油色粉(cream powder)状的六烷基化产物5(16.3g，17％)。MS m/z 792(M+2H/2)，528(M+3H/3).1H NMR DMSO-d6δ0.87(t，J＝7Hz，18H)，1.15-1.40(m，112H)，1.45-1.53(m，12H)，2.20-2.35(m，12H)，2.37-2.50(m，12H)，2.64-2.78(m，12H)，3.10-3.25(m，12H)，7.26(bs，4H)，7.64(bs，2H).13C NMR CDCl3δ14.32，22.89，27.34，27.38 29.59，29.69，29.90，29.92，32.13，39.77，50.85，172.80。
实施例2：化合物3、4和4的合成和纯化：在迈克尔加成反应条件下对 三乙烯四胺进行烷基化——方法2(路线2)
在另一个试验中，为了防止原料丙烯酰胺1在高温下聚合，向反应混合物中添加自由基淬灭剂苯醌。
路线2a
Figure G2007800447386D00891
a(i)90℃，催化量(15mg)的苯醌，5天
在该方法中，采用与方法1(实施例1)类似的反应，区别在于向反应混合物中添加自由基淬灭剂苯醌。在150mL的耐压瓶中装入N-十二烷基丙烯酰胺1(24g，100mmol)，并加入15mg苯醌，并通过温和加热容器在氩气氛中熔化固体丙烯酰胺。向该熔化物化物中添加三乙烯四胺2(2.9g，20mmol)，并将该混合物在90℃加热5天。通过以CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(90∶5∶5)为洗脱剂的TLC分析反应混合物。TLC显示起始丙烯酰胺1几乎完全被消耗。将反应混合物溶解于二氯甲烷(40mL)中，并按照实施例1的描述分离所需产物3、4和5。此时观察到六加成产物的量略有增加。
化合物3：分离得到浅黄色泡沫状的五加成产物，即异构体I(3.4g，13％)。该化合物的分析数据和光谱数据与方法1获得的化合物3的数据相同。
化合物4：分离得到白色粉末状五加成产物，即异构体II(3.9g，14％)。该化合物的分析数据和光谱数据与方法1获得的化合物4的数据相同。还分离可异构体3和4的纯混合物(1.9g，7％)。
化合物5：分离得到奶油色粉状的六加成产物5(6.9g，26％)。该化合物的分析数据和光谱数据与方法1获得的化合物5的数据相同。
实施例3：化合物3、4和4的合成和纯化：在迈克尔加成反应条件下对 三乙烯四胺进行烷基化——方法3(路线3)
在该方法中，在存在如硼酸的促进剂的条件下进行迈克尔加成反应(Chaudhuri，Mihir K.；Hussain，Sahid；Kantam，M.Lakshmi；Neelima，B.Tetrahedron Letters(2005)，46(48)，8329-8331.)，以提高反应速率。
路线3a
Figure G2007800447386D00901
a(i)90℃，硼酸水溶液，2天
在该方法中，采用与方法1(实施例1)类似的反应，区别在于向反应混合物中添加迈克尔加成反应促进剂，即饱和硼酸水溶液。通过温和加热容器在氩气氛中熔化150mL耐压瓶中的N-十二烷基-丙烯酰胺1(24g，100mmol)，并加入3mL硼酸水溶液。向该熔化物化物中添加三乙烯四胺2(2.9g，20mmol)，并将该混合物在90℃加热2天。通过以CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(90∶5∶5)为洗脱剂的TLC分析反应混合物。TLC显示起始丙烯酰胺1几乎完全被消耗。将反应混合物溶解于二氯甲烷(100mL)中，搅拌溶液和固体碳酸氢钠，并在旋转蒸发器中过滤并浓缩有机层。使用CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(48∶1∶1至8∶1∶1)通过柱色谱(硅胶)纯化该粗产物。为了实现完全分离，可使用相同条件的多个柱，并获得下列纯产物。在该反应条件下，增加了化合物4(异构体II)和六加成产物5的产量。
化合物3：分离得到浅黄色泡沫状五加成产物3，即异构体I(3.1g，11％)。该化合物的分析数据和光谱数据与方法1获得的化合物3的数据相同。
化合物4：分离得到白色粉末五加成产物4，即异构体II(5.7g，20％)。该化合物的分析数据和光谱数据与方法1获得的化合物4的数据相同。还分离得到异构体3和4的纯混合物(2.1g，7％)。
化合物5：分离得到奶油色粉状六加成产物5(7.6g，28％)。该化合物的分析数据和光谱数据与方法1获得的化合物5的数据相同。
实施例4：化合物3和4的合成和纯化：在迈克尔加成反应条件下对三 乙烯四胺进行烷基化——方法4(路线4)
在另一个试验中，为了使六加成产物5的形成最小化，尝试使用了溶剂。
路线4a
Figure G2007800447386D00911
a(i)90℃，乙腈或DMF，5天
在该方法中，采用与方法1(实施例1)和方法2(实施例2)类似的反应，区别在于在存在溶剂的条件下，在90℃搅拌进行反应。在150mL的耐压瓶中，将N-十二烷基-丙烯酰胺1(10g，41.8mmol)溶解于20mL乙腈或DMF中。向该溶液中添加三乙烯四胺2(1g，6.8mmol)，并将该混合物在90℃加热5天。通过以CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(90∶5∶5)为洗脱剂的TLC分析反应混合物。TLC显示仅形成少量的所需五加成产物。该反应的主要产物为四加成产物和高极性的较低加成产物的混合物。
实施例5：从反应混合物和/或分离产物3、4和5中分离未反应的丙烯 酰胺
为了从反应混合物中除去未反应的丙烯酰胺1，使用乙酸乙酯或DMF稀释反应混合物，并与聚苯乙烯或带有硫醇(thiol或mercaptan)的聚合物一起搅拌以捕获所有的丙烯酰胺。向溶液中添加固定化的硫醇，在室温下温和摇动并滤去固体。固定化硫醇与丙烯酰胺的迈克尔加成反应可捕获所有未反应的丙烯酰胺。也可在分离各个所需异构体后，在同一条件下完全除去作为污染物的痕量丙烯酰胺。将分离产物3(或4或5)溶解于DMF或乙酸乙酯，并与固定的丙烯酰胺淬灭剂一起温和摇动，过滤并在真空中蒸发滤液，从而产生不含丙烯酰胺污染的纯化合物3(或4或5)。
实施例6：从化合物5中分离伯胺和仲胺污染物
在对化合物5进行柱色谱分离后，为了除去痕量的伯胺和仲胺污染物，将所述化合物溶解于乙酸乙酯或DMF中，并在室温下与固定或结合于固体的异硫氰酸酯一起搅拌过夜。过滤除去固体并蒸发滤液，从而获得不含任何伯胺或仲胺污染的纯化合物5。
实施例7：从化合物3和4分离伯胺污染物
反应完成后，在三乙胺的二氯甲烷溶液中，使用四氯苯酐在室温下处理反应混合物，蒸发溶剂并将残留物与乙酸乙酯一起搅拌，滤去固体并浓缩滤液以获得不含伯胺污染物的产物。
表1  产物3和4的合成方法
  方法   温度   促进剂   溶剂   自由基淬灭剂   备注
  1   90℃   无   无   无   所形成化合物3和4的组合分离产率为39％。分离的六加成产物5为17％。反应完成需要6天。
  2   90℃   无   无   苯醌   使用苯醌抑制丙烯酰胺1的聚合。化合物3和4的组合产率为34％。然而还分离了26％的化合物5。反应时间与方法1相同。
  3   90℃   硼酸   无   无   反应速率提高。反应在两天内完成。化合物3和4的组合产率为38％。还分离了28％的化合物5。
  4   80-120℃   无   DMF   无   反应非常缓慢。仅形成较低的加成产物。
实施例8：产物3、4和5的盐酸盐的制备方法
为了改进操作简便性并增加上述化合物的稳定性，将其转化成其对应的盐酸盐6、7和8。
化合物3的盐酸盐(6)：将胺3(9.4g)溶解于100mL热的无水1，4-二噁烷中，并加入100mL含4M HCl的二噁烷，将混合物在室温下搅拌过夜。向混合物中通入氮气1小时以除去过量的HCl，并将剩余的溶液浓缩至～10mL。向此非均匀混合物中添加100mL EtOAc∶己烷(1∶1)，并过滤沉淀产物，使用乙酸乙酯(50mL)和己烷(100mL)清洗，并在真空中干燥所得粉末，以获得奶油色粉状的纯产物6(9.99g，96％)。1H NMR CDCl3δδ0.83(t，J＝6.5Hz，15H)，1.20-1.39(m，92H)，2.64-2.70(m，8H)，2.90-3.10(m，16H)，3.25-3.45(m，12H)，3.46-3.64(m，4H)，5.20-6.0(bs，2H)，8.05-8.15(m，5H)，10.(bs，3H).13C NMR CDCl3δ13.83，22.04，26.48，28.69，28.79，28.90，29.04，31.26，38.71，168.38，168.53。元素分析：C81H163N9O5·4HCl·3H2O计算值：C，63.05；H，11.30；N，8.17；Cl，9.19。实测值：C，63.13；H，11.06；N，8.21；Cl，9.21。
路线5a
Figure G2007800447386D00931
a(i)含4M HCl的1，4-二噁烷，室温，12小时
化合物7：
使用与上述由化合物3获得化合物6类似的方法将胺4(13.7g，10.2mmol)转化成对应的盐酸盐7。分离得到白色粉末状四盐酸7(14.6，96％)。1H NMR CDCl3δ0.82(t，J＝6.5Hz，15H)，1.20-1.41(m，92H)，2.52-2.72(m，8H)，2.90-3.10(m，16H)，3.25-3.45(m，12H)，3.46-3.64(m，4H)，5.20-6.0(bs，2H)，8.05-8.15(m，5H)，10.(bs，3H).13C NMR CDCl3δ8.42，13.84，22.04，26.48，28.69，28.79，29.00，31.26，45.44，168.53，168.60.元素分析：C81-H163N9O5·4HCl·2H2O计算值：C，63.79；H，11.30；N，8.17；Cl，9.34.实测值：C，63.78；H，11.04；N，8.40；Cl，9.73。
路线6a
Figure G2007800447386D00941
a(i)含4M HCl的1，4-二噁烷，室温，12小时
化合物8：
使用与上述获得化合物6类似的方法将胺5(13.7g，1.2mmol)转化成对应的盐酸盐8。分离白色粉末状四盐酸盐8(1.3g，96％)。1H NMR DMSO-d6δ0.87(t，J＝7Hz，18H)，1.13-1.30(m，112H)，1.35-1.53(m，12H)，2.10-2.25(m，12H)，2.30-2.40(m，12H)，2.60-2.76(m，12H)，3.10-3.25(m，12H)，7.26(bs，4H)，7.64(bs，2H)，10.1(bs，4H)。
路线7a
Figure G2007800447386D00942
a(i)含4M HCl的1，4-二噁烷，室温，12小时
实施例9：选择性保护三乙烯四胺上的氨基基团以定向合成化合物3和4
步骤1：化合物10的制备：在连续搅拌下，在冰浴上冷却含三乙烯四胺2(20.55g，140.52mmol，购自于Sigma-Aldrich)的乙腈(500mL)。向搅拌的溶液中添加三氟乙酸乙酯(35.20mL，295.09mmol)并搅拌20小时。减压除去溶剂和挥发物，并在高真空下干燥获得白色固体状化合物9(44.4g，94％)。由此获得的产物可不经进一步纯化而用于下一步的反应(Wender P.A.et al.Organic Letters，2005 7，4815)。
将粗化合物9(23.70g，70mmol)溶解于乙腈(400mL)中，并在冰浴上搅拌。向反应混合物中添加N-(苯甲氧基羰基氧基)琥珀酸酯(Z-OSu，43.73g，175mmol，购自Novabiochem)和三乙胺(23.40mL，210mmol)，并搅拌过夜。除去溶剂并将残留物萃取到二氯甲烷(DCM)中，连续使用水(两次)和盐水清洗，使用无水硫酸钠干燥。在真空中除去溶剂，并通过硅胶柱色谱(梯度洗脱，30-70％EtOAc/己烷)纯化由此获得的残留物，从而获得白色固体状化合物10(38.2g，89％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)＝9.60-9.50(m，2H)，7.40-7.20(m，10H)，5.02(s，4H)，3.40-3.20(m，12H).MS：C26H28F6N4O6计算值：606.19，实测值：607.2(M+)。
步骤2：化合物11的制备：在室温下将化合物10(12.60g，20.78mmol)悬浮在甲醇(MeOH，150mL)中，并在连续搅拌下向悬浮液中添加含8M甲胺的乙醇溶液(40ml)。在室温下搅拌1小时后所有固体均溶入溶液中，将混合物加热至50℃并搅拌8小时。通过TLC监测反应。减压除去所有溶剂，并通过硅胶柱色谱(梯度洗脱，10％MeOH/DCM至10∶10∶80MeOH∶TEA∶DCM)纯化残留物，获得浅黄色粘性液体状产物11(7.80g，91％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝7.80-7.40(m，10H)，5.02-4.94(m，4H)，3.45-3.05(m，8H)，2.70-2.55(m，4H)，2.20(bs，4H).MS：C22H30N4O4计算值：414.23，实测值：415.20(M+)。
步骤3：化合物13的制备：按照步骤1关于合成化合物9的描述，通过与1.1摩尔当量三氟乙酸乙酯(8.80mL，77.10mmol)反应，由三乙烯四胺100(10.25g，70.09mmol)制备化合物12。将由此获得的粗品12溶解于无水DCM(400ml)中并冷却至0℃。添加(Boc)2O(53.53mmol，245.31mmol)和三乙胺(48ml，350mmol)，并将反应混合物搅拌过夜。通过TLC监测反应的进程。在真空中除去溶剂，将残留物萃取到DCM中，用水和盐水清洗，并干燥。除去DCM并通过硅胶色谱(梯度洗脱，50％EtOAc/己烷至EtOAc)纯化残留物，从而获得白色固体状所需产物13(34.20g，92％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝9.51-9.38(m，1H)，6.82(bs，1H)，3.30-3.00(m，12H)，1.58-1.30(s，27H).MS：C23H41F3N4O7计算值：542.29，实测值：543.4(M+)。
步骤4：化合物14的制备：在存在水(1mL)的条件下，将含化合物13(25g，47.32mmol)的MeOH(200mL)溶液与K2CO3(50g)一起在50℃搅拌过夜。通过TLC监测反应的进程。滤去固体K2CO3，用MeOH清洗，合并洗液，并在真空中除去溶剂。通过硅胶柱色谱纯化所得残留物，从而获得白色固体状所需产物14(10.2g，50％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝6.83(bs，1H)，2.95-3.30(m，12H)，2.62-2.50(m，2H)，1.25-1.45(m，27H).MS：C21H42N4O6计算值：446.31，实测值：447.4(M+)。
路线8a
Figure G2007800447386D00961
a选择性地保护三乙烯四胺的氮
步骤5：化合物15的制备：将化合物9(23.0g，68.02mmol)溶解于乙腈/二氯甲烷(1∶1，300mL)的混合物中，并冷却至0℃。向溶液中添加Z-Osu(17.00g，69mmol)并搅拌10分钟。随后向反应混合物中添加三乙胺(23.40mL，210mmol)并搅拌过夜。在真空中除去溶剂和三乙胺并将残留物萃取到DCM中，用水(两次)和盐水清洗，并干燥。除去溶剂后，通过硅胶柱色谱(先后使用20-60％EtOAc/己烷，和5％MeOH/DCM进行洗脱)纯化残留物，从而获得白色固体状所需产物15(13.3g)以及副产物10(8.5g)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝9.60(bs，1H)，9.30(bs，1H)，7.40-7.28(m，5H)，5.01(s，2H)，3-40-3.10(m，8H)，2.70-2.50(m，4H).MS：C18H22F6N4O4计算值：472.15，实测值：473.1(M+)。
步骤6：化合物16的制备：根据步骤2的描述，使用甲胺(50ml，含8M甲胺的EtOH溶液)处理化合物15(13.4g，28.38mmol)，从而获得无色液体状化合物16(6.10g，79％)。由此获得的产物无需进一步的纯化即可用于下一步的反应。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝7.45-7.20(m，6H)，5.07(s，2H)，3.45-2.90(m，8H)，2.60-2.30(m，4H).MS：C14H24N4O2计算值：280.19实测值：281.2(M+)。
路线9a
Figure G2007800447386D00971
a选择性封闭三乙烯四胺的单个仲氮
实施例10：五烷基化单异构体4的合成——方法1
步骤1：化合物11与N-十二烷基丙烯酰胺的反应：将二胺11(1.00g，2.41mmol)和N-十二烷基丙烯酰胺(3.47g，14.50mmol)一起装入压力管中，并在90℃加热5天。通过TLC监测反应。一旦反应结束，将混合物溶解于二氯甲烷中并通过快速色谱进行纯化，从而获得产物17、18和19。
步骤2：化合物20的制备：将化合物19(2.00g，1.46mmol)溶解于乙酸乙酯和甲醇的混合物(1∶2，15ml)中，并向其中添加2当量的乙酸。在压力(50psi)下，以钯/碳(0.200g，10％wt)为催化剂氢化混合物，从而获得所需的产物20。
步骤3：单个异构体4的制备：将化合物20(1.50g，1.36mmol)和丙烯酰胺1(0.325mmol，1.36mmol)溶解于甲苯(4mL)并在90℃加热数天，以形成化合物4。通过TLC监测反应的进程。反应完成后，将混合物冷却至室温，溶解于DCM并通过快速硅胶柱色谱纯化，从而获得所需产物4。
路线10
Figure G2007800447386D00981
实施例11：五烷基化的单个异构体4的合成——方法2
步骤1：化合物21的制备：将化合物16(1.0g，3.56mmol)和N-十二烷基丙烯酰胺(6.00g，7当量)一起装入压力管中，并加热以获得化合物21。通过TLC监测反应的进程。在反应完成后，将混合物溶解于DCM中，并通过快速硅胶柱色谱纯化，从而获得所需产物21。
步骤2：由化合物21制备化合物4：将化合物21(2.00g，1.35mmol)溶解于乙酸乙酯和甲醇的混合物(1∶2，15ml)中，并向其中添加2当量的乙酸。压力(50psi)下在钯-碳(0.200g，10％wt)上氢化混合物，从而获得所需的单个异构体4。
路线11
Figure G2007800447386D00991
实施例12：五烷基化一种异构体3的合成——方法1
步骤1：化合物22的制备：将化合物14(5.06g，11.30mmol)和N-十二烷基丙烯酰胺(2.94g，12.43mmol)加入甲苯中，并在90℃加热5天。检查TLC，结果表明形成了产物。将反应混合物直接装载到预填硅胶柱中，并通过快速色谱(5％MeOH/DCM)纯化以获得化合物22(4.82g，62％)。1HNMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝8.17(bs，1H)，6.60(bs，1H)，3.30-2.95(m，12H)，2.70(t，J＝5.80Hz，2H)，2.60(t，J＝6.00Hz，2H)，2.18(t，J＝6.40Hz，2H)，1.35(m，29H)，1.26-1.15(m，18H)，0.83(t，J＝6.00Hz，3H).MS：C36H71N5O7计算值：685.54，实测值：686.5(M+)。
步骤2：化合物23的制备：将化合物22(4.75g，6.92mmol)溶解于二氯甲烷(100mL)中，并冷却至0℃。向溶液中添加Z-Osu(2.59g，1.5当量)并搅拌10分钟。随后将反应混合物与三乙胺(2.82mL，20.76mmol)一起搅拌过夜。在真空中除去溶剂和三乙胺，并将残留物萃取到二氯甲烷中，连续使用水(两次)和盐水清洗，并使用无水硫酸钠干燥。除去溶剂后，通过快速硅胶柱色谱(5-10％MeOH/DCM)纯化残留物，从而获得所需的化合物23(5.33g，94％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)＝7.49-7.25(m，5H)，5.11(s，2H)，3.60-3.02(m，14H)，2.45-45(m，4H)，1.50-1.35(m，27H)，1.24-1.20(m，18H)，0.87(t，J＝6.00Hz，3H).MS：C44H77N5O9计算值：819.57，实测值：820.7(M+)。
步骤3：化合物24的制备：向含化合物23(5.30g，6.50mmol)的二噁烷(100ml)溶液中添加含4MHCl的二噁烷(50mL)。随后将反应混合物搅拌过夜。产物在反应过程中沉淀。在真空中除去溶剂和HCl以获得白色固体。将残留物加入含过量三乙胺的MeOH中，并将悬浮液搅拌1小时以获得均质溶液。在真空中除去溶剂并将残留物与EtOAc一起研磨，滤去三乙胺盐酸盐。在真空中蒸发合并的滤液，从而获得粘性液体24(3.30g，98％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝7.37-7.28(m，5H)，5.05(s，2H)，3.60-3.20(m，4H)，3.10-2.70(m，10H)，2.40-2.20(m，4H)，1.40-1.30(m，2H)，1.25-1.17(m，18H)，0.81(t，J＝6.00Hz，3H).MS：C29H53N5O3计算值：519.41，实测值：520.4(M+)。
步骤4：化合物25的制备：将化合物24(1.00g，1.925mmol)和N-十二烷基丙烯酰胺(3.70g，8当量)一起装入压力管中，并在高温下加热以形成所需的化合物25。通过TLC监测产物的形成，随后通过快速硅胶柱色谱纯化以获得纯化合物25。
步骤5：化合物3的制备：将化合物25(2.00g，1.35mmol)溶解于乙酸乙酯和甲醇的混合物(1∶2，15ml)中，并向其中添加2当量的乙酸。压力50psi)下，在钯-碳(0.200g，10％wt)上(氢化混合物，从而获得所需产物3。
路线12
Figure G2007800447386D01001
实施例13：五烷基化单个异构体3的合成——方法2
步骤1：化合物26的制备：向含化合物22(4.80g，7.00mmol)和K2CO3(9.67g，10当量)的DMF(100mL)悬浮液中添加苄基溴(1.25ml，1.5当量)并将混合物搅拌过夜。通过TLC监测反应的进程。滤除固体，使用MeOH和乙酸乙酯清洗。减压浓缩合并的滤液，并通过硅胶柱色谱(50-100％EtOAc/己烷)纯化由此获得的残留物，从而获得所需的产物26(3.30g，61％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝7.77(bs，2H)，7.28-7.23(m，5H)，6.85-6.70(m，1H)，3.59(s，2H)，3.20-2.20(m，18H)，1.35(s，27H)，1.30-1.23(m，2H)，1.20-1.15(m，18H)，6.81(t，J＝6.00Hz，3H).MS：C43H77N5O7计算值：775.58，实测值：776.5(M+)。
步骤2：化合物27的制备：将含化合物26(3.30g，4.25mmol)的二噁烷(50ml)与含4M HCl的二噁烷(50mL)搅拌过夜。在反应的过程中发现形成白色沉淀物。在真空中除去溶剂和酸，并将由此获得的白色残留物复溶于含过量三乙胺的甲醇中。随后减压蒸发均质溶液以获得白色残留物。将残留物与EtOAc一起研磨，并滤去三乙胺盐酸盐。在真空中蒸发滤液以获得粘性液体状所需化合物27(2.36g，99％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝8.05(t，J＝5.5Hz，1H)，7.40-7.20(m，5H)，3.58(s，2H)，3.10-2.30(m，18H)，1.40-1.30(m，2H)，1.25-1.15(m，18H)，0.82(t，J＝6.00Hz，3H).MS：C28H53N5O计算值：475.43，实测值：498.4(M+Na)。
步骤3：化合物28的制备：在压力管中混合无溶剂的化合物27(1.00g，2.10mmol)和N-十二烷基丙烯酰胺(4.0g，8当量)，加热至高温以形成化合物28。通过TLC和LC-MS检测化合物28的形成。在反应完成后，通过色谱纯化分离产物，从而获得纯的化合物28。
步骤4：由化合物28制备化合物3：将化合物28(2.00g，1.40mmol)溶解于乙酸乙酯和甲醇的混合物(1∶2，15ml)中，并向其中添加6当量的乙酸。在压力(50psi)下，在钯-碳(0.200g，10％wt)上氢化混合物，从而获得化合物3。
路线13
实施例14：异构体3的汇集合成(convergent)——方法1
步骤1：化合物30、31和32的制备：在5mL水中加入乙二胺29(0.978ml，14.63mmol)、N-十二烷基丙烯酰胺(7.00g，29.26mmol)和硼酸(100mg)，并在90℃加热4天。通过TLC分析确认丙烯酰胺的彻底消耗。将反应混合物溶于DCM，用水和碳酸氢盐清洗，并使用硫酸钠干燥。除去DCM并通过硅胶柱色谱(2∶2∶96至10∶10∶80％MeOH/TEA/DCM)纯化残留物，从而得到化合物30(1.86g)，1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝7.05(bs，2H)，3.21(q，J＝6.30Hz，4H)，2.87(t，J＝6.00Hz，4H)，2.73(s，4H)，2.34(t，J＝6.00Hz，4H)，1.57(bs，2H)，1.49-1.45(m，4H)，1.28-1.19(m，40H)，0.87(t，J＝6.8Hz，6H)MS：C32H66N4O2计算值：538.52，实测值：539.50(M+)；化合物31(3.50g)，1HNMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝8.20(bs，1H)，3.20-2.15(m，22H)，1.36-1.30(m，6H)，1.25-1.15(m，30H)，0.81(t，J＝6.00Hz，9H)，MS：C47H95N5O3计算值：777.74，实测值：778.7(M+)；和化合物32(1.75g)，1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝3.23-2.15(m，28H)，1.35-1.45(m，8H)，1.26-1.15(m，40H)，0.82(t，J＝6.00Hz，12H).MS：C62H124N6O4计算值：1016.97，实测值：1018.0(M+)。
步骤2：化合物33的制备：将化合物31(1.55g，2mmol)和K2CO3(2.76g，20mmol)加入DMF中。向其中添加氯乙醛缩二甲醇(0.453ml，4.00mmol)并搅拌24小时。通过TLC监测反应，滤去K2CO3，并用MeOH清洗。减压除去溶剂并对残留物进行色谱纯化，从而获得化合物33。
步骤3：化合物34的制备：将化合物33(2.00g，2.31mmol)加入MeOH和DCM的混合物中，向其中添加PTSA(2.0当量)，并将混合物搅拌过夜。使用碳酸氢钠溶液中和该溶液，用DCM萃取并干燥。通过色谱分离纯化化合物，从而获得所需产物34。
步骤4：从化合物34制备单个异构体3：将化合物34(2.00g，2.43mmol)和化合物30(1.31g，2.43mmol)加入DCM中，向其中添加活化的分子筛并搅拌3小时。通过TLC监测反应。反应一旦结束，立即除去溶剂。将残留物溶解于THF中，并加入三乙酰氧基硼氢化钠(5当量)和乙酸，并搅拌过夜。除去溶剂并用DCM萃取，对残留物进行色谱分离，从而获得纯异构体3。
路线8
Figure G2007800447386D01031
实施例15：异构体3的汇集合成——方法2
也可通过以下方式制备所需的单异构体3：通过选择性地保护化合物30中的一个氮原子以获得化合物35。随后，在还原性条件下使化合物35与醛34反应以获得化合物36。对化合物36进行酸处理，从而获得所需的化合物3。
路线15
Figure G2007800447386D01041
实施例16：异构体3的汇集合成——方法3
还可以由单苄基乙二胺37制备所需的单异构体3。使用化合物1对化合物37进行烷基化，从而获得化合物38、39和40的混合物。在还原性条件下使化合物40与醛34反应，从而获得化合物41。对化合物41进行氢解，从而获得所需的化合物3。
路线16
Figure G2007800447386D01042
实施例17：异构体4的汇集合成——方法1
步骤1：化合物43的制备：通过温和加热容器在氩气氛中熔化150mL耐压瓶中的N-十二烷基-丙烯酰胺1(16.4g，68.8mmol)，并加入3mL硼酸水溶液。向该熔化物化物中添加Boc-保护的乙二胺42(5g，31.2mmol)，并将该混合物在90℃加热过夜。通过以CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(90∶5∶5)为洗脱剂的TLC分析反应混合物。TLC显示起始丙烯酰胺1几乎完全被消耗。将反应混合物溶解于二氯甲烷(100mL)中，搅拌溶液和固体碳酸氢钠，并在旋转蒸发器中过滤并浓缩有机层。使用CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(48∶1∶1至8∶1∶1)通过柱色谱(硅胶)纯化该粗产物。该反应的主要产物为双加成产物43。还发现少量的单加成物。
步骤2：化合物44的制备：在二噁烷(50mL)中加入化合物43(2.00g，3.13mmol)，向其中添加HCl(20mL，含4M HCl的二噁烷溶液)，并搅拌过夜。除去溶剂，从而获得化合物44。
步骤3：从化合物34和化合物44制备单异构体4：将化合物34(2.00g，2.43mmol)和化合物44(1.31g，2.43mmol)加入DCM中，向其中添加活化的分子筛并搅拌3小时。通过TLC监测反应。反应一旦结束，立即除去溶剂。将残留物溶解于THF中，加入三乙酰氧基硼氢化钠(5当量.)和乙酸，并搅拌过夜。除去溶剂，用DCM萃取，对残留物进行色谱分离，从而获得纯异构体4。
路线17
Figure G2007800447386D01051
实施例18：将N-十二烷基丙烯酰胺对1，3-二氨基丙烷的加成，随后将酰 胺还原为胺
为了研究阳离子脂质中电荷数量的作用，对丙烯酰胺1与1，3-二氨基丙烷45的迈克尔加合物(Michael adduct)进行了研究。
路线18a
Figure G2007800447386D01061
a(i)90℃，硼酸水溶液，16小时；(ii)含4M HCl的1，4-二噁烷，室温，12小时；和(iii)BH3
步骤1：化合物46、47和48的合成：通过温和加热容器在氩气氛中熔化150mL耐压瓶中的N-十二烷基-丙烯酰胺1(15.4g，64mmol)，并加入3mL硼酸水溶液。向该熔化物中添加1，3-二氨基丙烷44(1.58g，21mmol)，并将该混合物在90℃加热过夜。通过以CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(90∶5∶5)为洗脱剂的TLC分析反应混合物。TLC显示起始丙烯酰胺1几乎完全被消耗。将反应混合物溶解于二氯甲烷(100mL)中，搅拌溶液和固体碳酸氢钠，并在旋转蒸发器中过滤并浓缩有机层。使用CH2Cl2∶MeOH∶NEt3(48∶1∶1至8∶1∶1)通过柱色谱(硅胶)纯化该粗产物。该反应中的主要产物为三加成产物46。还分离了少量的四加成物47和双加成物48。
N-十二烷基-3-{(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-[3-(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基氨基)-丙基]-氨基}-丙酰胺46。分离得到白色粉末状三加成产物46(5.7g，35％)。MS m/z 793(MH+).1H NMR CDCl3δ0.87(t，J＝6.6Hz，9H)，1.20-1.30(m，60H)，1.42-1.66(m，6H)，2.33(t，J＝6Hz，4H)，2.38-2.46(m，4H)，2.60-2.70(m，4H)，2.84(t，2H)，3.15-3.28(m，6H)，6.65(bs，1H)，6.99(bs，3H).
4-[{3-[双-(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-氨基]-丙基}-(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)氨基]-N-十二烷基-丁酰胺47。还分离了少量的四加成产物47。
N-十二烷基-3-[-(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基氨基)-丙基氨基]-丙酰胺48。分离得到奶油色粉状的双加成物48(1.6g，10％)。MS m/z 553(MH+).1HNMR CDCl3δ0.89(t，J＝6.6Hz，6H)，1.10-1.20(m，40H)，1.42-1.66(m，4H)，2.20(t，J＝6Hz，4H)，2.55(t，4H)，2.60(t，4H)，3.00(m，4H)，8.00(bs，2H).
步骤2：将胺4、35和36转化成其对应的盐酸盐49、50和51。
使用与实施例8所述的类似方法将胺46(5.5g)转化成对应的盐酸盐49，分离得到白色粉末状二盐酸盐49(5.73g，92％)。1H NMR DMSO-d6δ0.88(t，J＝7Hz，9H)，1.17-1.30(m，66H)，1.35-1.45(m，6H)，2.10-2.25(m，2H)，2.55-2.70(m，6H)，2.95-3.15(m，10H)，3.20-3.35(m，6H)，8.16(t，1H)，8.24(t，1H)，9.15(bs，1H)，10.65(bs，1H).
在与实施例8所述的类似方法中，使用4M HCl处理胺47，从而获得二盐酸盐50。
在与实施例8所述的类似方法中，使用4M HCl处理胺48，从而获得二盐酸盐51。
步骤3：将胺46、47和48还原为胺52、53和54：使用过量的乙硼烷将胺46在THF中回流过夜，随后使用4M HCl处理，从而获得多胺52的盐酸盐。
对47和48进行类似的处理，从而获得作为其各自盐酸盐的对应还原产物53和54。
实施例19：将多酰胺3、4和5还原成对应的多胺化合物
使用大量过量的乙硼烷将化合物3在THF中回流过夜，从而获得对应的还原产物55。反应完成后，在进行检验(work-up)前使用4M HCl处理反应混合物，并分离产物(其盐酸盐)。同样分别由对应的前体4和5获得盐酸盐56和57。
路线19a
Figure G2007800447386D01081
a(i)BH3·THF，回流
实施例20：多胺烷基脂质——将酰胺还原为胺
由化合物32制备多胺60：在THF(20ml)中加入化合物32(1.02g，1mmol)，向其中添加BH3·THF(60ml，含1M BH3的THF)，并回流2天。通过TLC监测反应。除去THF获得白色残留物，使用1M HCl处理该残留物，并将其萃取到DCM中。对粗产物的色谱分离获得纯化合物60。
从化合物30和31制备多胺58和59：在化合物60的制备中所述的类似条件下还原酰胺30和31，从而分别获得化合物58和59。
路线20
Figure G2007800447386D01082
实施例21：多酰胺-多胺烷基的合成——使用卤代烷对胺进行烷基化
步骤1：化合物62的制备：在冰浴上冷却含氯乙酰氯(10.31mL，129.37mmo)的DCM(200mL)溶液，并在1小时的时间内向其中滴加包含TEA(36.70ml，269.5mmol)的十二胺61(20.00g，107.81mmol)的二氯甲烷溶液。此时反应混合物变为黑褐色，在0℃下再继续搅拌1小时。通过烧结漏斗过滤反应混合物，使用EtOAc清洗，用氯仿稀释，并依次使用水、碳酸氢钠溶液、1M HCl和盐水进行清洗。使用硫酸钠干燥有机层。除去溶剂，并通过硅胶柱色谱(5-50％EtOAc/己烷)纯化残留物，从而获得棕色固体状化合物62(26.00g，92％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝6.59(bs，1H)，4.03(s，2H)，3.25(q，J＝6.00Hz，2H)，1.54-1.49(m，2H)，1.45-1.15(m，18H)，0.86(t，J＝6.00Hz，3H).MS：C14H28ClNO计算值：261.19，实测值：262.20(M+)。
步骤2：化合物63、64和65的制备：将三乙烯四胺2(1.00g，6.83mmol)和氯乙酰胺62(10.00g，5.5当量)一起加入到CH3CN/DMF(1∶3)的混合物中，向其中添加K2CO3(9.43g，10当量)和KI(50mg)，并在85℃加热3天。将反应混合物过滤以除去固体，用DCM清洗，在真空中除去溶剂并色谱分离粗残留物，从而获得纯产物63、64和65。
路线21
Figure G2007800447386D01101
实施例22：多酰胺-多胺烷基的合成——使用卤代烷和支链氨基烷基对 胺进行烷基化
步骤1：化合物67的制备：在DCM(100mL)中加入氯乙酰氯(4.05mL，51mmol)并冷却至0℃。在1小时的时间内向其中滴加N，N-双十二烷基胺66(15.00g，42.41mmol)和TEA(14.43ml，2.5当量)的二氯甲烷溶液。此时反应混合物变为黑褐色，在添加完成后，在室温下将反应混合物搅拌24小时。通过烧结漏斗过滤反应混合物，使用EtOAc清洗，用氯仿稀释，并依次使用水、碳酸氢钠溶液、1M HCl和盐水进行清洗。使用硫酸钠干燥有机层。在真空中除去溶剂并通过硅胶柱色谱(5-50％EtOAc/己烷)纯化残留物，从而获得棕色液体状所需化合物67(12.5g，69％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝4.04(s，2H)，3.30(m，4H)，1.50-1.45(m，2H)，1.40-1.20(m，18H)，0.87(t，J＝6.00Hz，3H).MS：C26H52ClNO计算值：430.15，实测值：431.2(M+)。
步骤2：化合物68、69和70的制备：将三乙烯四胺2(0.500g，6.83mmo1)和氯乙酰胺67(8.10g，5.5当量)一起加入到CH3CN/DMF(1∶3)的混合物中，向其中添加K2CO3(4.72g，10当量)和KI(30mg)，并在85℃加热3天。将反应混合物过滤以除去不溶的固体，用DCM清洗，除去溶剂并色谱分离残留物，从而获得化合物68、69和70。
路线22
Figure G2007800447386D01111
实施例23：N，N-二烷基丙烯酰胺对多胺的加成
为了研究向阳离子脂质添加更多疏水链的效果，使用双十二烷基胺作为丙烯酰胺的前体。
路线23a
Figure G2007800447386D01121
a(i)丙烯酰氯，-10～0℃，DIPEA，CH2Cl2，4小时；(ii)90℃，无溶剂，5天；和(iii)HCl/二噁烷
步骤1：N，N-双十二烷基丙烯酰胺71的合成
在-10℃下，于20分钟的时间内向含双十二烷基胺66(25g，70.7mmol)和二异丙基乙胺(18g，141mmol)的无水CH2Cl2(700mL)溶液中滴加含丙烯酰氯(7.68g，85mmol)的CH2Cl2(100mL)溶液。添加完成后，将反应混合物在0℃搅拌4小时，此后，反应混合物的TLC显示反应完成。使用饱和NaHCO3溶液(200mL)、水(200mL)、盐水(100mL)清洗反应混合物，并使用Na2SO4干燥。浓缩有机层获得产物71(28.4g，100％)，并将其直接用于下一步。1H NMR CDCl3δ0.94(t，J＝6.5Hz，6H)，1.05-1.69(m，40H)，3.15-3.60(dt，4H)，5.64(d，1H)，6.36(d，1H)，6.63(m，1H)。
步骤2：三乙烯四胺2与化合物71的反应
使用胺2处理丙烯酰胺71，在常规检查(work-up)和柱纯化后，分离得到迈克尔加成反应产物72、73和74。
步骤3：盐酸盐75、76和77的合成：按照实施例8的描述，将所得的各个单化合物加入到二噁烷中，向该溶液中添加含4M HCl的二噁烷，并搅拌，从而获得对应的盐酸盐。
实施例24：在迈克尔加成反应的条件下使用单不饱和N-烷基丙烯酰胺对 多胺进行烯基化
为了研究烷基链中双键的作用，使用油胺作为丙烯酰胺79的前体。
路线24a
a(i)丙烯酰氯，-10～0℃，DIPEA，CH2Cl2，4小时；(ii)90℃，无溶剂，5天；和(iii)HCl/二噁烷
步骤1：化合物79的合成：在-10℃下，于20分钟的时间内向含油胺78(26.75g，100mmol)和三乙胺(20g，200mmol)的无水CH2Cl2(200mL)溶液中滴加含丙烯酰氯(9.9g，110mmol)的CH2Cl2(100mL)溶液。添加完成后，将反应混合物在0℃搅拌4小时，此后，反应混合物的TLC显示反应完成。使用饱和NaHCO3溶液(200mL)、水(200mL)、盐水(100mL)清洗反应混合物，并使用Na2SO4干燥。浓缩有机层获得产物79(32g，100％)，并将其直接用于下一步。1H NMR CDCl3δ0.91(t，J＝6.5Hz，3H)，1.05-1.35(m，24H)，1.42(t，2H)，1.96(m，4H)，5.31(t，1H)，5.33-5.36(m，1H)，5.54(dd，1H)，6.02(dd，1H)，6.18(dd，1H)，8.03(bs，1H)。
步骤2：化合物79与三乙烯四胺的反应
使用三乙烯四胺2处理丙烯酰胺79，在对迈克尔加成反应产物进行常规检查和柱纯化后获得了纯的化合物80、81和82。
步骤3：盐酸盐83、84和85的合成：按照实施例8的描述，将所得的各个单化合物(80、81或82)加入到二噁烷中，向溶液中添加含4M HCl的二噁烷，并搅拌，从而获得对应的盐酸盐。
实施例25：在迈克尔加成反应的条件下使用单不饱和N-烷基丙烯酰胺对 二胺进行烯基化
路线25a
Figure G2007800447386D01141
a(i)90℃、硼酸水溶液、16小时；和(ii)HCl/二噁烷
参照与实施例24类似的方法，使用二胺45处理丙烯酰胺79，在常规检查和柱纯化后，分离得到迈克尔加成反应产物86、87和88。使用含HCl的二噁烷处理由此获得的游离胺，分别获得对应的盐酸盐89、90和91。
实施例26：在迈克尔加成反应的条件下使用多不饱和N-烷基丙烯酰胺对 多胺进行烯基化
为了研究多不饱和在烷基链中的作用，使用亚油胺(linoleylamine)92作为丙烯酰胺93的前体。
路线26a
Figure G2007800447386D01151
a(i)丙烯酰氯，-10～0℃，DIPEA，CH2Cl2，4小时；(ii)90℃，无溶剂，5天；和(iii)HCl/二噁烷
步骤1：化合物93：参照与实施例24中步骤1类似的方法，使用丙烯酰氯处理亚油胺92并分离得到对应的丙烯酰胺93。
步骤2：化合物93与三乙烯四胺的反应
根据实施例3的描述，在存在硼酸的条件下，使用三乙烯四胺2处理丙烯酰胺93，在对迈克尔加成反应产物进行常规检查和柱纯化后获得了纯的化合物94、95和96。
步骤3：盐酸盐97、98和99的合成：按照实施例8的描述，将所得的各化合物(94、95或96)分别加入到二噁烷中，向溶液中添加含4M HCl的二噁烷，并搅拌，从而获得对应的盐酸盐。
实施例27：在迈克尔加成反应的条件下使用多不饱和N-烷基丙烯酰胺对 二胺进行烯基化
路线27a
Figure G2007800447386D01161
a(i)90℃、硼酸水溶液、16小时；和(ii)HCl/二噁烷
参照与实施例3类似的方法，在存在硼酸的条件下使用二胺45处理丙烯酰胺93，在常规检查和柱纯化后，分离得到迈克尔加成反应产物100、101和102。使用含HCl的二噁烷处理由此获得的游离胺分别获得了对应的盐酸盐103、104和105。
实施例28：在迈克尔加成反应的条件下使用烷基丙烯酸酯对多胺进行烯 基化
路线28a
Figure G2007800447386D01162
a(i)甲醇-水，40℃或甲醇、水、硼酸，室温
方法1：在40℃下，将n-十二烷基丙烯酸酯(106)与三乙烯四胺2一起在甲醇-水中搅拌以获得化合物107、108和109。通过色谱分离来分离产物。
方法2：在40℃下，将n-十二烷基丙烯酸酯(106)与三乙烯四胺2一起在存在硼酸的甲醇-水中搅拌以获得化合物107、108和109。通过色谱分离来分离产物。
实施例29：在迈克尔加成反应的条件下使用烷基丙烯酸酯对二胺进行烯 基化
路线29a
Figure G2007800447386D01171
a(i)甲醇-水，40℃或甲醇、水、硼酸，室温
方法1：在40℃下，将n-十二烷基丙烯酸酯(106)与三乙烯四胺2一起在甲醇-水中搅拌以获得化合物110、111和112。通过色谱分离来分离产物。
方法2：在40℃下，将n-十二烷基丙烯酸酯(106)与三乙烯四胺2一起在存在硼酸的甲醇-水中搅拌以获得化合物110、111和112。通过色谱分离来分离产物。
实施例30：十八烷-9，12-二烯酸-3-二甲氨基-2-十八烷-9，12-二烯酰氧-丙 酯3的合成
Figure G2007800447386D01172
在室温下，向亚油酸(25g，89.1mmol)的无水DMF(60mL)溶液中添加二异丙基乙胺(17mL，100mml)并搅拌，随后添加3-(二甲氨基)-1，2-丙二醇(4.8g，40.5mmol)和EDCI(17.25g，89.9mmol)，并将该混合物在室温下搅拌过夜。反应混合物的TLC(洗脱剂：含20％EtOAc的己烷)显示反应完成。将反应混合物倾入冰水中，并使用乙酸乙酯(2x100mL)萃取。使用水(100mL)、饱和NaHCO3(100mL)清洗所合并的有机层，并使用Na2SO4干燥。浓缩有机层获得粗产物，并通过柱色谱(硅胶，洗脱剂：含20％EtOAc的己烷)纯化。混合包含纯产物的部分并进行浓缩。分离澄清液体状的纯酯(5.7g，22％)。MS m/z 645(M+H).1H NMR CDCl3δ0.88(t，J＝6.3Hz，6H)，1.20-1.39(m，28H)，1.61(t，J＝4.9Hz，12H)，2.03-2.08(m，8H)，2.26-2.38(m，10H)，2.44-2.56(m，2H)，2.76(t，J＝6.3Hz，4H)，4.09(dd，J＝6.1Hz & 11.9Hz，1H)，4.36(dd，J＝3.3 & 11.9Hz，1H)，5.29-5.34(m，1H)，5.34-5.41(m，8H).13C NMR CDCl3δ14.30，22.79，25.08，25.10，25.83，27.40，29.26，29.30，29.34，29.42，29.55，29.83，31.73，34.32，34.58，46.01，59.37，64.02，128.08，128.24，130.21，130.42，173.39，173.65.
实施例31：使用挤出法制备脂质体的示例性方法
在100％乙醇中，制备ND98(120mg/ml)、胆固醇(25mg/ml)和C16-PEG-Cer-2000(100mg/ml)的母液。贮存于-20℃。制备制品前在37℃的水浴中加热(由于胆固醇需要一段时间才能完全溶解，加热时间达30分钟是有益的)。
2X2ml制备
向15ml的Falcon管中添加：
1)125ul脂质
2)200ul胆固醇
3)70ul PEG
4)5ul 100％乙醇
5)600ul 25mM乙酸钠，pH 5
6)在旋涡混合器中温和混合(调定为5)
7)添加20mg蔗糖
8)再次旋涡振荡直至蔗糖溶解
9)添加1ml新制备(在新Falcon管中)的含1mg/ml siRNA的25mM乙酸钠溶液(＝100ul的10mg/ml siRNA+900ul的25mM乙酸钠)。
10)轻柔地旋涡振荡(调定为1，使用Falcon管固定转接器)20分钟
11)15分钟后(剩5分钟时)，清洗挤出器
12)在40℃通过两个200nm滤器挤出11次
13)在3,500MWCO Pierce盒中，室温条件下，使用pH 7.4的PBS透析90分钟
实施例32：不使用挤出法制备脂质体的示例性方法
在100％乙醇中，制备ND98(120mg/ml)、胆固醇(25mg/ml)和C16-PEG-Cer-2000(100mg/ml)的母液。贮存于-20℃。制备制品前在37℃的水浴中加热(由于胆固醇需要一段时间才能完全溶解，加热达30分钟是有益的)。
向15ml的Falcon管中添加：
1)125ul脂质
2)200ul胆固醇
3)70ul PEG
4)495ul 100％乙醇
5)100ul水
6)制备1ml含1mg/ml siRNA的100-300mM乙酸钠，pH～5
7)将含脂质的90％乙醇与含siRNA的乙酸盐缓冲液快速混合
8)使用100-300mM乙酸钠(pH～5)进行透析(或使用超滤法)以除去乙醇
9)使用PBS进行透析(或使用超滤法)以改变缓冲条件
实施例33：对脂质体样品中RNA进行定量的示例性方案
可使用以下方案以量化：(1)捕获siRNA的比例，和(2)脂质体中siRNA的总量。
材料：
RiboGreen(Molecular Probes)
2％Triton X-100
TE缓冲剂
方案(以96孔板为例)：
1.在TE缓冲剂中稀释待测样品，使siRNA浓度为～2ug/mL(0.4～4ug/mL)。标记样品的稀释比。
2.将每种样品50uL加入到2个孔中(例如，将样品加入到微孔板的2行孔中)。
3.向2个样品孔之一(例如，上一行样品)添加50uL TE缓冲剂。该样品将用于测定“游离”siRNA。
4.向2个样品孔中的另一个(例如，下一行样品)添加50uL 2％TritonX-100。该样品将用于测定“总”siRNA。
5.通过使用已知量的待定量siRNA制备标准siRNA稀释液。由50uL 4ug/mL开始进行2倍稀释。向每个标准样品稀释液中添加50uL 2％TritonX-100。
6.在室温下温育15分钟。
7.向所有样品中添加100uL稀释的RiboGreen。以1∶100的稀释比稀释待用的RiboGreen。
8.使用FITC设定在荧光计(Victor2)上对微孔板进行读数。
计算：
孔内终体积为200uL。
RiboGreen的终稀释比为1∶200。
Triton X-100为0.5％。
标准品为从1ug/mL开始的稀释液。
绘制标准曲线，进行线性回归分析。
测定捕获％＝100*(1-“游离”信号/“总”信号)
测定[siRNA]：首先使用标准曲线将“总”信号转化成浓度，再乘以稀释倍数。
实施例34：配制到脂质体中的脂质部分的比较
通过测定脂质向靶标递送siRNA部分的相对能力能够检测脂质组合物的有效性。例如，靶标的沉默说明siRNA被递送到细胞中。本申请人比较了多种脂质体复合物，其分别包含以下脂质部分之一以及用以沉默VII因子(FVII)的siRNA。
首先，使用未纯化的反应混合物。通过在不同的ND∶98单体比例(ND∶98＝1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1和6∶1)下合成产品，产生不同的ND98反应混合物。ND98是通过如上所示比例(即ND∶98＝1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1和6∶1)的ND与胺98的反应产生的，其中ND的结构如下：
Figure G2007800447386D01211
胺98的结构如下：
以ND98∶胆固醇∶FED2000-CerC16∶siRNA＝15∶0.8∶7∶1(重量比)的比例配制脂质体。ND∶98比为1∶1和2∶1配制的脂质体在配制过程中发生沉淀，因此没有进行进一步的表征。
以下表1提供了使用不同单体比例(数字表示ND与单体98的比值)的脂质体的平均粒径和捕获百分比。
表1
  Z-平均粒径(nm)   捕获％
  ND983   56   ＞95
  ND984   56   ＞95
  ND985   81   93
  ND986   72   74
图1提供了在不同单体比例下使用2mg/kg siRNA的试验剂量进行FVII沉默试验的结果。该结果表明ND98五尾部分和/或ND98六尾部分为活性种类，也是ND986∶1制备中最为丰富的种类。如上所述，五尾部分是指在化合物中，起始原料胺98的5个氢原子与原料丙烯酰胺部分ND反应。如上所述，六尾部分是指在化合物中，原料胺98上的6个氢原子与丙烯酰胺部分ND反应。因此，“尾”的数量表示原料胺上发生反应的氢原子的数量。
实施例35：优选脂质异构体的确定
本申请人纯化了ND98脂质产物。ND98脂质部分为ND与胺98反应所得的脂质部分，其中ND的结构如下所示：
胺98的结构如下：
Figure G2007800447386D01222
申请人检测了混合的ND98四尾异构体(即其中4个胺基氢与上述ND丙烯酰胺发生了反应)、单个ND98五尾结构异构体(即其中已经有5个胺基氢原子与上述ND丙烯酰胺反应)。五尾异构体的两个实例如下所示：
Figure G2007800447386D01223
使用以下组分配制经纯化的ND98产物的脂质体，所述组分的比例如下所示：ND98∶胆固醇∶PEG2000-CerC16∶siRNA＝15∶5∶7∶1(重量比)。
以下表2提供了使用不同单体比例(数字表示ND与单体98的比值)的脂质体的平均粒径和捕获百分比。
表2
  Z-平均粒径(nm)   捕获％
  ND981   88   ＞95
  ND982   104   86
  ND983   115   86
  ND984   92   ＞95
出于表2和图2的目的：ND981＝五尾化(异构体I)；ND982＝五尾化(异构体I+II)；ND983＝五尾化(异构体II)；ND984＝四尾化。
施予脂质体时siRNA剂量为2.5mg/kg，并评估FVII的沉默。图2显示了四尾异构体混合物、单个五尾异构体(即异构体I和II)，以及五尾异构体混合物(即异构体I和II)的结果。
实施例36：优选的ND98异构体的测定
制备并纯化六尾ND98的纯化异构体。ND98的结构与上述实施例34和35的描述相对应。六尾是指胺98的所有氢原子都已与ND起始原料发生反应。采用该脂质为起始原料，按照以下比例ND98∶胆固醇∶PEG2000-CerC16∶siRNA＝15∶5∶7∶1(重量比)制备脂质体。图3证明了ND98六尾异构体在siRNA递送中的有效性，由此有效地沉默FVII。
实施例37：使用不同ND98脂质起始原料的脂质体的粒径
将多种具有ND98结构(如以上实施例34和35所示)的脂质起始原料配制成脂质体。测定脂质体的粒径，其结果如下表3所示：
  制品   颗粒直径(nm)
  ND983(实施例1)   56
  ND984(实施例1)   56
  ND985(实施例1)   81
  ND986(实施例1)   72
  ND981(实施例2)   88
  ND982(实施例2)   104
  ND983(实施例2)   115
  ND984(实施例2)   92
  六尾化ND98(实施例3)   127
实施例38：挤出游离的脂质体制品
使用ND98脂质制备脂质体复合物。该制品具有以下比例：ND98∶胆固醇∶PEG2000-CerC16∶siRNA＝15∶5∶7∶1(重量比)。基本按照以上实施例32的描述，不进行挤出来制备脂质体。制备出两个样品，第一样品：100mM＝在100mM乙酸钠中制备siRNA并在100mM乙酸盐中进行第一透析步骤；第二样品：300mM＝在300mM乙酸钠中制备的siRNA并在300mM乙酸盐中进行第一透析步骤。
图4显示了FVII沉默试验的结果，证明使用不同方法制备的制品的相对活性。
实施例39：阳离子脂质7的区域选择性合成——方案1
路线31a
Figure G2007800447386D01241
a阳离子脂质7的区域选择性合成——方法1
步骤1.化合物9的制备：连续搅拌下，在冰浴上冷却含三乙烯四胺1(48.83g，0.334mmol，购自于Sigma-Aldrich)的无水乙腈(500mL)。向该溶液中添加三氟乙酸乙酯(79.6mL，0.668mol)，并在添加完成后将反应混合物加热至室温并搅拌20小时。减压除去溶剂和挥发物并将残留物溶解于最低量的温二氯甲烷(100mL)中，并在搅拌下向其中添加冷己烷。在冰上冷却沉淀产物并过滤，从而获得白色固体(112.2g，99％)。
步骤2.(2-{叔丁氧羰基-[2-(2，2，2-三氟-乙酰氨基)乙基]-氨基}-2-(2，2，2-三氟-乙酰氨基)乙基]-氨基甲酸叔丁酯113的合成
将三氟乙酰胺9(112.2g，0.332mol)溶解于CH2Cl2/THF(600mL/100mL)中，向其中添加二异丙基乙胺(129.25g，1mol)并在冰浴上搅拌。向反应混合物中滴加含二碳酸二叔丁酯(145g，0.664mol，购自Sigma Aldrich)的CH2Cl2(100mL)，并搅拌过夜。除去溶剂，并将残留物与NaHCO3的饱和溶液(400mL)一起搅拌，使用己烷(100mL)清洗并在45℃真空干燥过夜，从而获得白色固体状的双Boc-化合物(167g，94％)。1H NMR for 113(DMSO-d6，400MHz)δ＝9.60-9.40(m，2H)，3.35-3.15(m，12H)，1.36(s，18H)MS：C15H24F6N4O4计算值：438.17，实测值：439.20(M+)MS：C20H32F6N4O6计算值：538.22，实测值：539.20(M+)。
步骤3.(2-氨基-乙基)-{2-[(2-氨基-乙基)-叔丁氧羰基-氨基]-乙基}氨基甲酸叔丁酯的合成
在不锈钢压力反应器中加入乙酰胺113(167g，0.31mol)，并向其中加入含甲胺(33wt.％)的乙醇(200ml)溶液。将混合物加热至90℃并搅拌24小时。通过质谱监测反应。减压除去所有溶剂，并在80℃对残留物进行高真空处理，从而获得粘性液体状的产物114(103g，96％)，该化合物无需进一步的纯化即可用于下一步反应。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝3.20-3.00(m，4H)，2.62-2.38(m，8H)，1.32(s，9H).MS：C11H26N4O2计算值：246.21，实测值：246.20(M+)。
步骤4.迈克尔加成反应产物115的合成
向压力反应器中一起加入二胺114(103g，0.297mmol)、N-十二烷基丙烯酰胺(356g，1.487mol)和饱和的硼酸水溶液(30mL)，并在90℃加热4天。通过TLC和质谱监测反应。将反应混合物萃取到二氯甲烷(DCM)中，依次使用NaHCO3溶液和盐水清洗，并使用无水硫酸钠干燥。在真空中除去溶剂，并通过硅胶柱色谱(梯度洗脱，先为乙酸乙酯，然后为3-10％MeOH/DCM)纯化由此获得的残留物，从而获得浅黄色固体状的化合物115(228g，59％)。MS：C76H150N8O8计算值：1303.16，实测值：1304.20(M+)。
步骤5.二胺116的制备
将含4M HCl的二噁烷(500mL)添加到含双boc-化合物115(228g，0.175mol)的甲醇(100mL)溶液中，并将该混合物在室温下搅拌2天。通过质谱监测反应。在起始双Boc-化合物完全消失后，过滤沉淀的盐酸盐，用THF(100mL)清洗并干燥，从而获得白色粉末状的纯盐(178g，93％)。使用饱和NaHCO3(1L)处理上述盐，并使用二氯甲烷(3x600mL)进行萃取。干燥并浓缩所合并的有机萃取物，从而分离白色固体状的四聚体(164g，85％)。MS：C66H134N8O4计算值：1103.05，实测值：1104.10(M+)。
步骤6.化合物117的合成向压力反应器中一起加入化合物116(164g，149mmol)、N-十二烷基丙烯酰胺(35.6g，149mmol)和饱和的硼酸水溶液(30mL)，并在90℃加热3天。通过TLC和质谱监测反应的进程。将反应混合物萃取到二氯甲烷(DCM)中，依次使用NaHCO3溶液和盐水清洗，并使用无水硫酸钠干燥。在真空中除去溶剂，并通过硅胶(2Kg)柱色谱(梯度洗脱，0∶5∶95至10∶10∶80％TEA/MeOH/DCM)纯化由此获得的残留物，从而获得浅黄色固体状的化合物117(83.8g，42％)。MS：C76H150N8O8计算值：1303.16，实测值：1304.20(M+)。通过TLC(定性)、HPLC和质谱对该材料和可信样品进行比较。MS：C81H163N9O5计算值：1342.28，实测值：1343.30(M+).
步骤7.盐酸盐7的合成
将胺117(54g，40mmol)溶解于乙醇(100mL)中，向其中添加200mL含2M HCl的醚，并将该混合物在室温下搅拌过夜。向反应混合物中通入氮气，并使排出物通过干燥剂进入到10％的KOH溶液中。30分钟后，将反应混合物浓缩至干，将残留物复溶于500mL无水乙醇中，并在旋转蒸发器中浓缩该混合物。重复此过程一次，并将由此获得的残留物在43℃的真空炉中干燥过夜。分离奶油色粉状的纯产物(59.5g，99％)。
实施例40：阳离子脂质7的区域选择性合成——方案2
方法1：
步骤1：连续搅拌下，在冰浴上冷却带顶置式搅拌器的5L四口烧瓶中的含三乙烯四胺1(200g，1.37mol，购自Sigma-Aldrich)的乙腈(2L)。向搅拌的所述溶液中添加三氟乙酸乙酯(388.5mL，2.74mmol)并搅拌20小时。减压除去溶剂和挥发物，将残留物与DCM/己烷的混合物一起研磨并过滤，从而获得白色固体状的化合物101(429g，93％)。由此获得的产物无需进一步的纯化即可用于下一步的反应。MS：C10H16F6N4O2计算值：338.12，实测值：339.0(M+)。
步骤2：将粗化合物101(427g，1.26mol)溶解于溶剂混合物(3L，THF/DCM(1∶2))中，并在冰水浴上搅拌。向反应混合物中添加二碳酸二叔丁酯((Boc)2O，270g，1.26mol，购自Sigma Aldrich)和DIEA(500mL，2.86mol)，并搅拌过夜。除去溶剂并将残留物萃取到二氯甲烷(DCM，1000mL)中，依次使用NaHCO3溶液(500mL)、水(500mLx2)和盐水清洗，使用无水硫酸钠干燥。在真空中除去溶剂，并将由此获得的残留物与DCM/己烷(2∶1)一起研磨并过滤。除去溶剂并在高真空下干燥残留物，从而获得粘性液体状的化合物102(523g)。
通过硅胶色谱(梯度洗脱，先为乙酸乙酯，随后为3-10％MeOH/DCM)纯化一部分化合物102，从而获得粘性液体状的化合物102(102.00g)。化合物102的1H NMR：(DMSO-d6，400MHz)δ＝9.60-9.10(m，3H)，3.35-3.25(m，4H)，3.25-3.20(2，2H)，3.20-3.10(m，2H)，2.68-2.58(m，4H)，1.35(s，9H).MS：C15H24F6N4O4计算值：438.17，实测值：439.20(M+)。
步骤3：室温下，在压力反应器中将纯化的化合物102(102.0g，233.40mmol)溶解于乙醇/甲胺(400ml，含33wt％甲胺的EtOH溶液)。将该混合物加热至90℃，并搅拌2天。通过质谱监测反应。减压除去所有溶剂，并在80℃对残留物进行高真空处理，从而获得粘性液体状的产物103(58.00g，99％)，该化合物无需进一步的纯化即可用于下一步反应。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝3.20-3.00(m，4H)，2.62-2.38(m，8H)，1.32(s，9H).MS：C11H26N4O2计算值：246.21，实测值：247.20(M+)。
步骤4：在压力反应器中一起加入三胺103(56.00g，227.64mmol)、N-十二烷基丙烯酰胺(327.00g，1365mol)和饱和的硼酸水溶液(50mL)，并在90℃加热6天。通过TLC和质谱监测反应。将反应混合物萃取到二氯甲烷(DCM)中，连续使用NaHCO3溶液(400mL)清洗，并使用无水硫酸钠干燥。在真空中除去溶剂，并通过硅胶柱色谱(梯度洗脱，先为乙酸乙酯，然后为3-10％MeOH/DCM)纯化由此获得的残留物，从而获得浅黄色固体状的化合物104(186g，57％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝7.20(bs，1H)，7.05(bs，1H)，6.85(bs，1H)，6.74(bs，1H)，3.25-3.03(m，12H)，2.80-2.60(m，8H)，2.55-2.21(m，12H)1.52-1.45(m，10H)，1.42(s，9H)，1.34-1.20(m，100H)，0.87(t，J＝6.5Hz，15H).MS：C86H171N9O7计算值：1442.33，实测值：1443.30(M+)。
步骤5：向化合物105(184.00g，127.23mmol)的二噁烷(300ml)溶液中添加含4M HCl的二噁烷(400mL)。随后将反应混合物搅拌过夜。通过质谱监测反应。使氮气通过所述溶液，从而除去过量的HCl。在真空中除去溶剂并将残留物与甲醇(500mLX3)共蒸发3次，从而获得浅黄色粘性固体状的四盐酸盐7(186.00g，98％)。通过TLC(定性)、HPLC和质谱对该材料和可信样品进行比较。MS：C81H163N9O5计算值：1342.28，实测值：1343.30(M+)。
方法2
按照方法1中步骤1和步骤2的描述制备化合物102。方法1中步骤2获得的粗产物无需进一步的纯化即可用于下一步反应。
步骤1：室温下，在压力反应器中将化合物102(103.45g，238.90mmol，来自方法1步骤2的粗化合物)溶解于乙醇/甲胺(400ml，含33wt％甲胺的EtOH溶液)。将该混合物加热至90℃，并搅拌2天。通过质谱监测反应。减压除去所有溶剂，并在水浴上于80℃对残留物进行高真空处理，从而获得浅黄色粘性液体在的产物103(63.50g)，该化合物无需进一步的纯化即可用于下一步反应。
步骤4：按照方法1中步骤4的描述，将三胺103(63.50g，238mmol)、N-十二烷基丙烯酰胺(320.00g，1338mol)和饱和的硼酸水溶液(50mL)一起加入到压力反应器中，并在90℃加热6天。通过TLC和质谱监测反应。将反应混合物萃取到二氯甲烷(DCM)中，连续使用NaHCO3溶液(400mL)清洗，并使用无水硫酸钠干燥。在真空中除去溶剂，并通过硅胶柱色谱(梯度洗脱，先为乙酸乙酯，然后为3-10％MeOH/DCM)纯化由此获得的残留物，从而获得浅黄色固体状的化合物104(65.2g，20％)。
步骤5：向化合物105(65.00g，45mmol)中添加含2M HCl的醚(800mL)。随后将反应混合物搅拌过夜。通过质谱监测反应。使氮气通过溶液，从而除去过量的HCl。在真空中除去溶剂，并将残留物与甲醇(500mLX3)共蒸发3次，从而获得浅黄色粘性固体状的四盐酸盐7(66g，98％)。通过TLC(定性)、HPLC和质谱对该物质和可信样品进行比较。MS：C81H163N9O5计算值：1342.28，实测值：1343.30(M+)。
方法3
按照方法1中步骤1和步骤2的描述制备化合物102。由方法1的步骤2获得的粗产物无需进一步纯化即可用于下一步反应。
步骤3：室温下，将化合物102(105.20g，240mmol，来自方法1的粗化合物)溶解于压力反应器中的乙醇/甲胺(400ml，33wt％甲胺的EtOH溶液)中。将该混合物加热至90℃，并搅拌2天。通过质谱监测反应。减压除去所有溶剂，并在80℃水浴上对残留物进行高真空处理，从而获得浅黄色粘性液体状的产物103(64.70g)，该化合物无需进一步的纯化即可用于下一步反应。
步骤4：向压力反应器中一起加入三胺103(64.70g，240mmol)、N-十二烷基丙烯酰胺(370.00g，1569mol)和饱和的硼酸水溶液(50mL)，并在90℃加热6天。通过TLC和质谱监测反应。将反应混合物萃取到二氯甲烷(DCM)中，连续使用NaHCO3溶液(400mL)清洗，并使用无水硫酸钠干燥。在真空中除去溶剂，并通过硅胶柱色谱(梯度洗脱，先为乙酸乙酯，然后为3-10％MeOH/DCM)纯化由此获得的残留物，从而获得浅黄色固体状的化合物104(192g)。
步骤5：按照实施例40方法1中步骤5的描述，从化合物104获得所需盐酸盐化合物7。化合物7：194g(98％)，为四盐酸盐。通过TLC(定性)、HPLC和质谱对该材料和可信样品进行比较。MS：C81H163N9O5计算值：1342.28，实测值：1343.30(M+)。
实施例41：配制到具有不同PEG-脂质部分的多种缔合复合物中的siRNA 活性的比较
可以通过测定脂质将siRNA部分递送到靶标的相对能力来检测脂质组合物的有效性。例如，靶标的沉默说明siRNA被递送到细胞中。本申请人已对缔合复合物进行了比较，其中所述缔合复合物包含图5中所示的13种不同PEG-脂质部分之一以及用以沉默VII因子(FVII)的siRNA。
使用以下方法合成PEG-脂质1～13：
路线1a
a路线1：mPEG2000-1，2-二-O-烷基-sn3-氨基甲酰甘油酯
化合物5的制备：将1，2-二-O-十四烷基-sn-甘油酯1(30g，61.80mmol)和N，N′-琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC，23.76g，1.5当量)加入到二氯甲烷(DCM，500mL)中，并在冰水混合物上搅拌。向搅拌溶液中添加三乙胺(25.30mL，3当量)，随后在室温下将反应混合物搅拌过夜。通过TLC监测反应的进程。使用DCM(400mL)稀释反应混合物并使用水(2X500mL)、NaHCO3水溶液(500mL)清洗有机层，随后进行标准检查。在室温下，将所得残留物在高真空中干燥过夜。干燥后，将由此获得的粗碳酸酯3溶解于二氯甲烷(500mL)中，并在冰浴上搅拌过夜。在氩气氛中，向搅拌的溶液中添加mPEG2000-NH24(103.00g，47.20mmol，购自日本NOF Corporation)和无水吡啶(80mL，过量)。随后，在室温下将反应混合物搅拌过夜。在真空中除去溶剂和挥发物，将残留物溶解于DCM(200mL)中，并载入装有乙酸乙酯的硅胶柱中。所述硅胶柱首先使用乙酸乙酯洗脱，随后使用含5-10％甲醇的二氯甲烷进行梯度洗脱，从而获得白色固体状的所需PEG-脂质5(105.30g，83％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.20-5.12(m，1H)，4.18-4.01(m，2H)，3.80-3.70(m，2H)，3.70-3.20(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.10-2.01(m，2H)，1.70-1.60(m，2H)，1.56-1.45(m，4H)，1.31-1.15(m，48H)，0.84(t，J＝6.5Hz，6H).MS范围的实测值：2660-2836。
化合物4b的制备：将1，2-二-O-十六烷基-sn-甘油酯1b(1.00g，1.848mmol)和DSC(0.710g，1.5当量)一起加入到二氯甲烷(20mL)中，并在冰水混合物中冷却至0℃。向其中添加三乙胺(1.00mL，3当量)并搅拌过夜。通过TLC跟踪反应，由DCM稀释，使用水(2次)和NaHCO3溶液清洗，并使用硫酸钠干燥。减压除去溶剂，并使残留物2b在高真空中过夜。该化合物无需进一步纯化即可直接用于下一步反应。在氩气氛中，将MPEG2000-NH23(1.50g，0.687mmol，购自日本NOF Corporation)和来自上一步的化合物2b(0.702g，1.5当量)溶解于二氯甲烷(20mL)中。将反应冷却至0℃。向其中添加吡啶(1mL，过量)并搅拌过夜。通过TLC监测反应。在真空中除去溶剂和挥发物，并通过色谱(先后使用乙酸乙酯和5-10％MeOH/DCM进行梯度洗脱)纯化残留物，从而获得白色固体状的所需化合物4b(1.46g，76％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.17(t，J＝5.5Hz，1H)，4.13(dd，J＝4.00Hz，11.00Hz，1H)，4.05(dd，J＝5.00Hz，11.00Hz，1H)，3.82-3.75(m，2H)，3.70-3.20(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.05-1.90(m，2H)，1.80-1.70(m，2H)，1.61-1.45(m，6H)，1.35-1.17(m，56H)，0.85(t，J＝6.5Hz，6H).MS范围的实测值：2716-2892。
化合物4c的制备：将1，2-二-O-十八烷基-sn-甘油酯1c(4.00g，6.70mmol)和DSC(2.58g，1.5当量)一起加入到二氯甲烷(60mL)中，并在冰水混合物中冷却至0℃。向其中添加三乙胺(2.75mL，3当量)并搅拌过夜。通过TLC跟踪反应，由DCM稀释，使用水(2次)和NaHCO3溶液清洗，并使用硫酸钠干燥。减压除去溶剂，并使残留物在高真空中过夜。该化合物而无需进一步纯化即可直接用于下一步反应。在氩气氛中，将MPEG2000-NH23(1.50g，0.687mmol，购自日本NOF Corporation)和来自上一步的化合物2c(0.760g，1.5当量)溶解于二氯甲烷(20mL)中。将反应冷却至0℃。向其中添加吡啶(1mL，过量)并搅拌过夜。通过TLC监测反应。在真空中除去溶剂和挥发物，并通过色谱(先后使用乙酸乙酯和5-10％MeOH/DCM进行梯度洗脱)纯化残留物，从而获得白色固体状的所需化合物4c(0.92g，48％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.22-5.15(m，1H)，4.16(dd，J＝4.00Hz，11.00Hz，1H)，4.06(dd，J＝5.00Hz，11.00Hz，1H)，3.81-3.75(m，2H)，3.70-3.20(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，1.80-1.70(m，2H)，1.60-1.48(m，4H)，1.31-1.15(m，64H)，0.85(t，J＝6.5Hz，6H).MS范围的实测值：2774-2948。
路线2a
Figure G2007800447386D01331
a路线2：mPEG2000-1，2-二-O-烷基-sn3-琥珀酰甘油酯
化合物6a的制备：将1，2-二-O-十四烷基-sn-甘油酯1a(1.00g，2.06mmol)、琥珀酸酐(0.416g，2当量)和DSC(0.628g，2.5当量)一起加入到二氯甲烷(20mL)中，并搅拌过夜。通过TLC跟踪反应，由DCM稀释，使用冷的稀柠檬酸、水清洗，并使用硫酸钠干燥。减压除去溶剂，并使残留物在高真空中过夜。该化合物无需进一步纯化即可直接用于下一步反应。在氩气氛中，将MPEG2000-NH23(1.50g，0.687mmol，购自日本NOFCorporation)、来自上一步的化合物5a(0.660g，1.12当量)和HBTU(0.430g，1.13mmol)溶解于二氯甲烷/DMF(2∶1，20mL)的混合物中。向其中添加DIEA(0.358mL，3当量)并搅拌过夜。将反应混合物转移到大烧瓶中，并减压除去溶剂和挥发物。将残留物在高真空中干燥过夜，并通过色谱(先后使用乙酸乙酯和5-10％MeOH/DCM进行梯度洗脱)纯化，从而获得白色固体状的所需化合物6a(0.822g，43％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝6.34-6.30(m，1H)，4.16(dd，J＝4.00Hz，11.00Hz，1H)，4.08(dd，J＝5.00Hz，11.00Hz，1H)，3.82-3.78(m，2H)，3.70-3.30(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.64(t，J＝7.00Hz，2H)，2.43(t，J＝6.80Hz，2H)，1.76-1.72(m，2H)，1.56-1.48(m，4H)，1.34-1.16(m，48H)，0.85(t，J＝6.5Hz，6H).MS范围的实测值：2644-2804。
化合物6b的制备：将1，2-二-O-十六烷基-sn-甘油酯1b(1.00g，1.848mmol)、琥珀酸酐(0.369g，2当量)和DMAP(0.563g，2.5当量)一起加入到二氯甲烷(20mL)中，并搅拌过夜。通过TLC跟踪反应，由DCM稀释，使用冷的稀柠檬酸、水清洗，并使用硫酸钠干燥。减压除去溶剂，并使残留物在高真空中过夜。该化合物无需进一步纯化即可直接用于下一步反应。在氩气氛中，将MPEG2000-NH23(1.50g，0.687mmol，购自日本NOFCorporation)、来自上一步的化合物5b(0.66g，1.03mmol)和HBTU(0.400g，1.05mmol)溶解于二氯甲烷/DMF(2∶1，20mL)的混合物中。向其中添加DIEA(0.358mL，3当量)并搅拌过夜。将反应混合物转移到大烧瓶中，并减压除去溶剂和挥发物。将残留物在高真空中干燥过夜，并通过色谱(先后使用乙酸乙酯和5-10％MeOH/DCM进行梯度洗脱)纯化，从而获得白色固体状的所需化合物6b(0.300g，16％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝6.33-6.28(m，1H)，4.18(dd，J＝4.00Hz，11.00Hz，1H)，4.08(dd，J＝5.00Hz，11.00Hz，1H)，3.82-3.76(m，2H)，3.70-3.30(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.65(t，J＝7.08Hz，2H)，2.44(t，J＝6.83Hz，2H)，1.76-1.68(m，2H)，1.57-1.48(m，4H)，1.32-1.17(m，56H)，0.86(t，J＝6.6Hz，6H).MS范围的实测值：2640-2822。
化合物6c的制备：将1，2-二-O-十八烷基-sn-甘油酯1c(5.00g，8.37mmol)、琥珀酸酐(1.70g，2当量)和DMAP(2.55g，2.5当量)一起加入到二氯甲烷(50mL)中，并搅拌过夜。通过TLC跟踪反应，由DCM稀释，使用冷的稀柠檬酸、水清洗，并使用硫酸钠干燥。减压除去溶剂，并使残留物在高真空中过夜。该化合物无需进一步纯化即可直接用于下一步反应。在氩气氛中，将MPEG2000-NH23(1.50g，0.687mmol，购自日本NOFCorporation)、来自上一步的化合物5c(0.718g，1.03mmol)和HBTU(0.410g，1.08mmol)溶解于二氯甲烷/DMF(2∶1，20mL)的混合物中。向其中添加DIEA(0.350mL，3当量)并搅拌过夜。将反应混合物转移到大烧瓶中，并减压除去溶剂和挥发物。将残留物在高真空中干燥过夜，并通过色谱(先后使用乙酸乙酯和5-10％MeOH/DCM进行梯度洗脱)纯化，从而获得白色固体状的所需化合物6c(1.1g，56％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝6.38-6.33(m，1H)，4.19(dd，J＝4.00Hz，11.00Hz，1H)，4.07(dd，J＝5.00Hz，11.00Hz，1H)，3.81-3.74(m，2H)，3.70-3.20(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.63(t，J＝7.03Hz，2H)，2.43(t，J＝6.87Hz，2H)，1.76-1.68(m，2H)，1.57-1.48(m，4H)，1.32-1.17(m，64H)，0.86(t，J＝6.60Hz，6H).MS范围的实测值：2680-2922。
路线3a
Figure G2007800447386D01351
a路线3：mPEG2000-1，2-二-O-烷基-sn3-琥珀酰甘油酯
化合物8a的制备：在氩气氛中，将1，2-二-O-十四烷基-sn-甘油酯1a(0.300g，0.618mmol)、MPEG-琥珀酸酯7(1.00g，0.476mmol，购自日本NOFCorporation)、DCC(0.127g，1.3当量)和DMAP(0.058g，0.476mmol)加入到二氯甲烷(20mL)中，并搅拌过夜。通过TLC监测反应。搅拌过夜后，将反应混合物冷却至0℃，并滤去沉的固体。减压除去溶剂和挥发物，并通过色谱(先后使用EtOAc和5-10％DCM/MeOH进行梯度洗脱)纯化所得残留物，从而获得白色固体状的所需化合物8a(0.590g，48％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝4.25-4.18(m，2H)，4.08(dd，J＝5.60Hz，11.50Hz，1H)，3.80-3.73(m，2H)，3.70-3.30(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，1.56-1.47(m，4H)，1.30-1.15(m，48H)，0.85(t，J＝6.60Hz，6H).MS范围的实测值：2440-2708。
化合物8b的制备：在氩气氛中，将1，2-二-O-十六烷基-sn-甘油酯1b(0.334g，0.618mmol)、MPEG-琥珀酸酯7(1.00g，0.476mmol，购自日本NOFCorporation)、DCC(0.127g，1.3当量)和DMAP(0.058g，0.476mmol)加入到二氯甲烷(20mL)中，并搅拌过夜。通过TLC监测反应。搅拌过夜后，将反应混合物冷却至0℃，并滤去沉的固体。减压除去溶剂和挥发物，并通过色谱(先后使用EtOAc和5-10％DCM/MeOH进行梯度洗脱)纯化所得残留物，从而获得白色固体状的所需化合物8b(0.930g，74％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝4.25-4.17(m，2H)，4.09(dd，J＝5.50Hz，11.50Hz，1H)，3.81-3.73(m，2H)，3.70-3.30(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，1.58-1.47(m，4H)，1.30-1.17(m，56H)，0.86(t，J＝6.60Hz，6H).MS范围的实测值：2452-2760。
化合物8c的制备：在氩气氛中，将1，2-二-O-十八烷基-sn-甘油酯1c(0.369g，0.618mmol)、MPEG-琥珀酸酯7(1.00g，0.476mmol，购自日本NOFCorporation)、DCC(0.127g，1.3当量)和DMAP(0.058g，0.476mmol)加入到二氯甲烷(20mL)中，并搅拌过夜。通过TLC监测反应。搅拌过夜后，将反应混合物冷却至0℃，并滤去沉淀的固体。减压除去溶剂和挥发物，并通过色谱(先后使用EtOAc和5-10％DCM/MeOH进行梯度洗脱)纯化所得残留物，从而获得白色固体状的所需化合物8c(0.960g，75％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝4.27-4.20(m，2H)，4.10(dd，J＝5.80Hz，11.50Hz，1H)，3.83-3.74(m，2H)，3.70-3.35(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，1.54-1.46(m，4H)，1.30-1.17(m，64H)，0.86(t，J＝6.60Hz，6H).MS范围的实测值：2508-2816。
路线4a
Figure G2007800447386D01361
a路线4：mPEG2000-1，2-二-O-酰基-sn3-琥珀酰甘油酯
化合物10a的制备：在氩气氛中，将1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油9a(0.317g，0.618mmol)、MPEG-琥珀酸酯7(1.00g，0.476mmol，购自日本NOFCorporation)、DCC(0.127g，1.3当量)和DMAP(0.058g，0.476mmol)加入到二氯甲烷(20mL)中，并搅拌过夜。通过TLC监测反应。搅拌过夜后，将反应混合物冷却至0℃，并滤去沉淀的固体。减压除去溶剂和挥发物，并通过色谱(先后使用EtOAc和5-10％DCM/MeOH进行梯度洗脱)纯化所得残留物，从而获得白色固体状的所需化合物10a(0.960g，78％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.26-5.20(m，1H)，4.30-4.08(m，6H)，3.81-3.73(m，2H)，3.70-3.40(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.65-2.60(m，4H)，2.35-2.28(m，4H)，1.63-1.52(m，4H)，1.30-1.15(m，44H)，0.86(t，J＝6.60Hz，6H).MS范围的实测值：2468-2732.
化合物10b的制备：在氩气氛中，将1，2-二棕榈酰-sn-甘油9b(0.352g，0.618mmol)、MPEG-琥珀酸酯7(1.00g，0.476mmol，购自日本NOFCorporation)、DCC(0.127g，1.3当量)和DMAP(0.058g，0.476mmol)加入到二氯甲烷(20mL)中，并搅拌过夜。通过TLC监测反应。搅拌过夜后，将反应混合物冷却至0℃，并滤去沉淀的固体。减压除去溶剂和挥发物，并通过色谱(先后使用EtOAc和5-10％DCM/MeOH进行梯度洗脱)纯化所得残留物，从而获得白色固体状的所需化合物10b(1.02g，81％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.26-5.19(m，1H)，4.30-4.05(m，6H)，3.80-3.40(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.65-2.60(m，4H)，2.33-2.24(m，4H)，1.63-1.50(m，4H)，1.30-1.15(m，52H)，0.85(t，J＝6.60Hz，6H).MS范围的实测值：2524-2792。
化合物10c的制备：在氩气氛中，将1，2-二硬脂酰-sn-甘油9c(0.387g，0.618mmol)、MPEG-琥珀酸酯7(1.00g，0.476mmol，购自日本NOFCorporation)、DCC(0.127g，1.3当量)和DMAP(0.058g，0.476mmol)加入到二氯甲烷(20mL)中，并搅拌过夜。通过TLC监测反应。搅拌过夜后，将反应混合物冷却至0℃，并滤去沉淀的固体。减压除去溶剂和挥发物，并通过色谱(先后使用EtOAc和5-10％DCM/MeOH进行梯度洗脱)纯化所得残留物，从而获得白色固体状的所需化合物10c(1.04g，80％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.26-5.19(m，1H)，4.30-4.05(m，6H)，3.80-3.40(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.66-2.59(m，4H)，2.31-2.26(m，4H)，1.63-1.52(m，4H)，1.30-1.15(m，52H)，0.85(t，J＝6.60Hz，6H).MS范围的实测值：2540-2844。
路线5a
Figure G2007800447386D01371
a路线5：胆甾醇基-mPEG2000
化合物13的制备：在氩气氛中，将MPEG2000-OH 11(6.00g，3mmol，购自Sigma-Aldrich)、胆固醇半琥珀酸酯12(1.50g，3.08mmol)和HBTU(1.23g，3.23mmol)溶解于二氯甲烷/DMF(2∶1，100mL)的混合物中。向其中添加DIEA(1.60mL，3当量)并搅拌过夜。减压除去溶剂和挥发物。将残留物在高真空中干燥过夜，并通过色谱(先使用乙酸乙酯，然后使用5-10％MeOH/DCM进行梯度洗脱)纯化，从而获得白色固体状的所需化合物13(5.05g，68％)。1H NMR(CDCl3，400MHζ)δ＝5.35-5.25(m，1H)，4.60-4.50(m，1H)，4.22-4.18(m，2H)，3.80-3.76(m，2H)，3.72-3.40(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.64-2.56(m，4H)，2.31-2.20(m，3H)，2.01-0.8(m，44H).MS范围的实测值：2390-2654。
实施例42：靶向PEG-脂质
Figure G2007800447386D01381
化合物19的制备：
步骤1：将化合物14(2.00g，1.01mmol)和氯甲酸胆固醇酯15(0.453g，1.01mmol)一起加入到二氯甲烷(20mL)中。在冰水浴中冷却该混合物。加入三乙胺(0.448ml)并将反应混合物搅拌过夜。通过TLC监测反应。除去溶剂，并通过硅胶色谱(先后为乙酸乙酯和5-10％MeOH/DCM)纯化残留物，从而获得所需的化合物16(1.10g，45.40％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.35(m，1H)，5.15(m，1H)，3.40-3.85(m，O-CH2-CH2-O)，3.10-3.25(m，10H)，0.80-2.38(m，44H，Cholesterol).MS范围的实测值：2220-2490。
步骤2：将化合物16(1.00g，0.417mmol)、化合物17(0.235g，0.542mmol)和HBTU(0.190g，0.5mmol)加入到DCM/DMF(20mL，2∶1)的混合物中。向其中添加DIEA并搅拌过夜。通过TLC监测反应，减压除去溶剂，并通过色谱(5-10％MeOH/DCM)纯化残留物，从而获得所需的化合物18(1.02g，87％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ＝7.52(d，J＝8.06Hz，1H)，7.33(t，J＝7.02Hz，1H)，7.25(t，J＝7.32Hz，1H)，5.27(m，1H)，5.18(d，J＝3.2Hz，1H)，4.92(dd，J＝3.17，11.23Hz，1H)，4.43(m，1H)，3.60-4.02(m，5H)，3.20-3.55(m，O-CH2-CH2-O)，2.90-3.10(m，10H)，2.05(s，3H)，1.96(s，3H)，1.84(s，3H)，1.77(s，3H)，0.80-2.38(m，44H，胆固醇).MS范围的实测值：2680-2990。
步骤3：将化合物18(1.02g，0.362mmol)溶解于MeOH/DCM的混合物中(10mL)，向其中添加含0.5M NaOMe的甲醇溶液(过量)并搅拌过夜。通过TLC监测反应的进程。使用AcOH中和该混合物。在真空中除去溶剂，并通过色谱(5-10％MeOH/DCM)纯化残留物，从而获得化合物19(280mg，30％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.38(m，1H)，4.02-4.06(m，7H)，3.30-3.80(m，O-CH2-CH2-O)，3.20-3.29(m，8H)，2.08(s，3H)，0.80-2.38(m，44H，胆固醇).MS范围的实测值：2600-2900。
实施例43：靶向PEG-脂质
化合物23的制备：
步骤1：将化合物14(2.00g，1.01mmol)和化合物20(0.453g，1.01mmol)一起加入到二氯甲烷(20mL)中。在冰水浴中冷却该混合物。加入吡啶(1mL，过量)并将反应混合物搅拌过夜。通过TLC监测反应。除去溶剂，并通过硅胶色谱(先后为乙酸乙酯和5-10％MeOH/DCM)纯化残留物，从而获得所需的化合物21(400mg，15％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.20(m，1H)，4.05-4.20(m，2H)，3.20-3.80(m，O-CH2-CH2-O)，1.70-1.82(m，4H)，1.50-1.61(m，2H)，1.18-1.38(m，60H)，0.87(t，J＝6.30Hz，6H).MS范围的实测值：2400-2750。
步骤2：将化合物21(0.415g，0.159mmol)、化合物17(0.100g，1.3当量)和HBTU(0.90g，1.15当量)加入到DCM/DMF(20mL，2∶1)的混合物中。向其中添加DIEA(0.2mL)并搅拌过夜。通过TLC监测反应，减压除去溶剂，并通过色谱(3-10％MeOH/DCM)纯化残留物，从而获得所需的化合物22(0.450g，94％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝6.21(d，J＝8.70Hz，1H)，5.33(d，J＝2.70Hz，1H)，5.15-5.20(m，2H)，4.55(d，J＝8.15Hz，1H)，4.01-4.20(m，4H)，3.20-3.90(m，O-CH2-CH2-O)，2.14(s，3H)，2.03(s，3H)，1.99(s，3H)，1.93(s，3H)，1.70-1.82(m，4H)，1.50-1.61(m，4H)，1.17-1.38(m，60H)，0.86(t，J＝6.32Hz，6H).MS范围的实测值：2800-3200。
步骤3：将化合物22(0.450g，0.359mmol)溶解于MeOH/DCM的混合物中(5mL)，向其中添加含0.5M NaOMe的甲醇溶液(过量)并搅拌过夜。通过TLC监测反应的进程。使用AcOH中和该混合物。在真空中除去溶剂，并通过色谱(5-10％MeOH/DCM)纯化残留物，从而获得化合物23(365mg，85％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.18(m，1H)，4.05-4.20(m，4H)，3.20-3.90(m，O-CH2-CH2-O)，2.05(s，3H)，1.71-1.80(m，4H)，1.50-1.61(m，4H)，1.17-1.38(m，60H)，0.87(t，J＝6.32Hz，6H).MS范围的实测值：2760-3000。
如图6所示，在施用于受试者时，该制品可提供不同程度的FVII沉默。例如，制品3提供了相对高程度的FVII沉默，制品5、6和12同样如此。
实施例44：小鼠对制品LNP01给药的耐受性
按照实施例45的描述制备组分为ND98∶胆固醇∶PEG-C14＝42∶48∶10(摩尔比)的空脂质体。随后，向预制并挤出的空脂质体中添加不同量的siRNA，从而获得初始总赋形剂∶siRNA的比例为30∶1、20∶1、15∶1、10∶1和5∶1(重量比)的制品。以5∶1的初始总赋形剂∶siRNA比例进行制备的制品导致制品中siRNA过量，即脂质的负载能力饱和。随后，使用100,000MWCO膜及5体积的PBS通过切向流过滤除去过量的siRNA。然后，通过尾静脉注射以10mg/kg siRNA的剂量将所得制品施用于C57BL/6小鼠。通过测量制品施用后24小时和48小时动物的体重增量来评估制品的耐受性，其结果显示于图7中。
实施例45：首先形成未负载的复合物，再使用siRNA处理未负载的复 合物从而形成缔合复合物，并施用包含两种治疗剂的所述缔合复合物
按照以下方式制备具有两种不同核酸部分的缔合复合物。在乙醇中制备ND98、胆固醇和PEG-C14的母液，其中ND98、胆固醇和PEG-C14的浓度分别为133mg/mL、25mg/mL和100mg/mL。随后将脂质母液混合以产生摩尔比为42∶48∶10的ND98∶胆固醇∶PEG-C14。再将该混合物添加到缓冲水溶液中，从而在35％乙醇、100mM乙酸钠(pH 5)中自发形成脂质纳米颗粒。随后，使用挤出机(Lipex，Northern Lipids)使未负载的脂质纳米颗粒两次通过0.08μm膜(Whatman，Nucleopore)，从而获得大小为20-100nm的囊泡(unimodal vesicle)。然后，以7.5∶1(重量比)的总赋形剂∶siRNA比例，向预成形的未负载囊泡中添加适量的含siRNA的35％乙醇。然后，将所得混合物在37℃温育30分钟以使siRNA负载到脂质纳米颗粒中。温育后，通过使用PBS进行透析或切向流过滤来除去乙醇并置换缓冲剂。终制品通过0.2μm的滤器进行过滤除菌。图8提供了用以说明赋形剂和治疗剂的添加顺序的流程图。
按照实施例44的描述，配制比例为1∶1的靶向ApoB和VII因子的siRNA的混合物。按照实施例31的描述，分别单独配制相同的ApoB-和VII因子-靶向性siRNA。随后，按10μL/g动物体重的注射体积施用不同剂量的所述三种制品。施用后48小时，通过眼球后放血收集血清样品，处死动物并取出肝脏。根据制造商所述的方法，使用显色诊断试剂盒(Coaset Factor VII AssayKit，DiaPharma)测定血清VII因子的浓度。使用分支DNA(bDNA)试验(Quantigene，Panomics)测定肝脏中ApoB和VII因子的mRNA水平，其结果显示于图9中。没有观察到两种治疗剂之间发生抑制的证据。实际上证明两种治疗剂在施用时均有效。
实施例46：使用预制囊泡制备缔合复合物的方法
脂质母液的制备
在乙醇中制备类脂质ND98·4HCl(lipidoid ND98·4HCl，MW 1487)、胆固醇和PEG-C14的母液，其中ND98、胆固醇和PEG-C14的浓度分别为133mg/mL、25mg/mL和100mg/mL。在50℃加热母液以促进脂质溶解到溶液中。
空囊泡的制备
按照下述体积混合脂质母液，从而获得42∶48∶10的ND98∶胆固醇∶PEG-C14摩尔比。同样根据下表列出的体积制备水性混合物。
Figure G2007800447386D01421
随后，在磁力搅拌板上快速搅拌的同时，向水混合物中添加乙醇脂质混合物。一经混合即可自发形成类脂质囊泡。随后，将所得囊泡挤过(2次)0.08μm的膜(Whatman，Nucleopore)，从而确定空囊泡的大小。所有操作均在室温下进行。
空囊泡对siRNA的负载
通过将脱盐的双链siRNA溶解于50mM乙酸钠(pH 5)中，以制备浓度为10mg/mL的siRNA母液。将适当体积的此siRNA母液与适当体积的乙醇混合，从而获得含siRNA的35体积％乙醇稀释溶液(参见下表)。
siRNA的稀释
  siRNA母液(mg/mL)   siRNA(50nM NaOAc)   乙醇   总计
  10   180.000   96.923   276.923
在磁力搅拌板上快速搅拌的同时，向623mL空囊泡混合物中添加277mLsiRNA稀释溶液。然后，将所得组合混合物在37℃温育30分钟以负载siRNA。
超滤和末次0.2μm过滤
温育后，将900mL负载的纳米颗粒混合物稀释到1.8L PBS中，从而获得2.7L稀释混合物。随后，将该稀释混合物浓缩至～1L，并使用利用双层100,000MWCO筒的Sartorius TFF系统通过10体积PBS的切向流过滤进行渗滤。不向所述筒施加背压，并将泵速设定为300rpm。置换缓冲剂后，将所得溶液浓缩至约2mg/mL siRNA。
使该溶液通过0.2μm的滤器(Whatman，Polycap 36AS)，从而进行末次过滤。
图10显示了说明此方法的流程图。
实施例47：粒径对效力影响的比较
基本按照实施例46所述的方法形成缔合复合物。然而，因为要基于大小评价复合物，所以使用不同的挤出膜，产生直径分别为150nm、85nm、60nm和50nm的颗粒。负载到所述复合物中的siRNA靶向VII因子。
在VII因子沉默试验中对该颗粒进行评价，证明相对于150nm、85nm和60nm的颗粒，50nm的颗粒最为有效。试验结果显示于图11中。
实施例48：未配制的核酸试剂与配制到缔合复合物中的核酸试剂的半衰 期比较
于37℃在人血清中评价配制到缔合复合物中的siRNA在体外的半衰期。按照实施例46的描述制备缔合复合物。出于比较的目的，还在人血清中对未配制的siRNA进行了体外评价。对于配制siRNA和未配制siRNA，还评价了通过HPLC测定的全长产物的百分比。如图12所示，配制siRNA在人血清中的体外半衰期显著延长。
实施例49：具有不同链长的PEG脂质的缔合物的效力比较
按照实施例46的描述制备缔合复合物，其中PEG脂质的烷基链的长度不同。对链长为10、11、12、13、14、15和16的烷基进行评价，并比较其在VII因子沉默试验中的效力。如图13所示，根据试验中的测量，13、14和15的链长显示了最佳的沉默结果。
现已描述了本发明的多个实施方案。然而，应理解可进行多种改进而不脱离本发明的精神和范围。因此，其他实施方案也在权利要求书的范围之内。

Claims (354)

1.一种制品，其包含一种或多种化合物或其药学上可接受的盐，每个所述化合物独立地具有式I所示的结构，
Figure A2007800447380002C1
式(I)
其中
Xa和Xb在每次出现时分别独立地为C1-6亚烷基；
n为0、1、2、3、4或5；R分别独立地为H，
Figure A2007800447380002C2
Ra                Rb              Rc             Rd               Re
其中，在所述制品中，至少约80％的式(I)化合物分子中的至少n+2个R基团不是H；
m为1、2、3或4；Y为O、NR2或S；
R1为烷基、烯基或炔基；其每一个任选被一个或多个取代基取代；和
R2为H、烷基、烯基或炔基；其每一个任选被一个或多个取代基取代；
条件是，如果n＝0，则至少n+3个R基团不是H。
2.如权利要求1所述的制品，其中R不是H时，R为Ra。
3.如权利要求1所述的制品，其中R不是H时，R为Rb。
4.如权利要求1所述的制品，其中R不是H时，R为Rc。
5.如权利要求1所述的制品，其中R不是H时，R为Rd。
6.如权利要求1所述的制品，其中R不是H时，R为Re。
7.如权利要求1所述的制品，其中式(I)中n+2个R基团不是H。
8.如权利要求1所述的制品，其中式(I)中n+3个R基团不是H。
9.如权利要求1所述的制品，其中式(I)中n+4个R基团不是H。
10.如权利要求1所述的制品，其中n＞0，式(I)中NR的至少一个R为H。
11.如权利要求1所述的制品，其中式(I)中NR2的至少一个R为H。
12.如权利要求1所述的制品，其中至少80％的分子为一种结构异构体。
13.如权利要求12所述的制品，其中式(I)中n+2个R基团不是H。
14.如权利要求12所述的制品，其中式(I)中n+3个R基团不是H。
15.如权利要求12所述的制品，其中式(I)中n+4个R基团不是H。
16.如权利要求1所述的制品，其中在至少约90％的式(I)化合物分子中，至少n+2个R基团不是H。
17.如权利要求1所述的制品，其中在至少约95％的式(I)化合物分子中，至少n+2个R基团不是H。
18.如权利要求1所述的制品，其中在至少约99％的式(I)化合物分子中，至少n+2个R基团不是H。
19.如权利要求1所述的制品，其中n为2。
20.如权利要求1所述的制品，其中n为0。
21.如权利要求1所述的制品，其中Xa和Xb为C2亚烷基。
22.如权利要求1所述的制品，其中n为0，Xb为亚乙基或亚丙基。
23.如权利要求1所述的制品，其中n＞1，至少有一个Xa不同。
24.如权利要求1所述的制品，其中R不是H时，R为
Figure A2007800447380003C1
25.如权利要求24所述的制品，其中Y为O或NR2。
26.如权利要求24所述的制品，其中m为2。
27.如权利要求24所述的制品，其中Y为O或NR2，m为2。
28.如权利要求24所述的制品，其中m为1。
29.如权利要求1所述的制品，其中至少有一次出现的R1为烷基。
30.如权利要求1所述的制品，其中R1每次出现时均为烷基。
31.如权利要求1所述的制品，其中R1为烷基，R2为H。
32.如权利要求1所述的制品，其中R1和R2为烷基。
33.如权利要求1所述的制品，其中至少有一次出现的R1为烯基。
34.如权利要求1所述的制品，其中至少有一次出现的R1为烯基。
35.如权利要求1所述的制品，其中R不是H时，R为Ra，并且其中Y为O或NH。
36.如权利要求35所述的制品，其中Y为O。
37.如权利要求35所述的制品，其中Y为NH。
38.如权利要求35所述的制品，其中R1为烷基。
39.如权利要求38所述的制品，其中R1为C10-30烷基。
40.如权利要求39所述的制品，其中R1为C12烷基。
41.如权利要求35所述的制品，其中n为2。
42.如权利要求41所述的制品，其中Xa每次出现均为C2亚烷基，且Xb为C2亚烷基。
43.如权利要求35所述的制品，其中m为2。
44.如权利要求1所述的制品，其中n为2，且R不是H时，R为Ra。
45.如权利要求44所述的制品，其中R1为烷基。
46.如权利要求45所述的制品，其中R1为C10-18烷基。
47.如权利要求46所述的制品，其中R1为C12烷基。
48.如权利要求44所述的制品，其中Y为O。
49.如权利要求44所述的制品，其中Y为NH。
50.如权利要求44所述的制品，其中Xa每次出现均为C2亚烷基，且Xb为C2亚烷基。
51.如权利要求44所述的制品，其中m为2。
52.权利要求1的制品，其中NR中的至少一个R为H，且R不是H时，R为Ra，并且其中Y为O或NH。
53.如权利要求52所述的制品，其中Y为O。
54.如权利要求52所述的制品，其中Y为NH。
55.如权利要求52所述的制品，其中R1为烷基。
56.如权利要求55所述的制品，其中R1为C10-30烷基。
57.如权利要求56所述的制品，其中R1为C12烷基。
58.如权利要求52所述的制品，其中n为2。
59.如权利要求58所述的制品，其中Xa每次出现均为C2亚烷基且Xb为C2亚烷基。
60.如权利要求52所述的制品，其中m为2。
61.如权利要求1所述的制品，其中n为2，NR中的至少一个R为H，且R不是H时，R为Ra，并且其中Y为O或NH。
62.如权利要求61所述的制品，其中R1为烷基。
63.如权利要求62所述的制品，其中R1为C10-18烷基。
64.如权利要求63所述的制品，其中R1为C12烷基。
65.如权利要求61所述的制品，其中Y为O。
66.如权利要求61所述的制品，其中Y为NH。
67.如权利要求61所述的制品，其中Xa每次出现均为C2亚烷基，且Xb为C2亚烷基。
68.如权利要求61所述的制品，其中m为2。
69.如权利要求1所述的制品，其中NR2中的至少一个R为H，R为Ra，并且其中Y为O或NH。
70.如权利要求69所述的制品，其中Y为O。
71.如权利要求69所述的制品，其中Y为NH。
72.如权利要求69所述的制品，其中R1为烷基。
73.如权利要求72所述的制品，其中R1为C10-30烷基。
74.如权利要求73所述的制品，其中R1为C12烷基。
75.如权利要求69所述的制品，其中n为2。
76.如权利要求69所述的制品，其中Xa每次出现均为C2亚烷基，且Xb为C2亚烷基。
77.如权利要求69所述的制品，其中m为2。
78.如权利要求1所述的制品，其中n为2，NR2中的至少一个R为H，R为Ra，并且其中Y为O或NH。
79.如权利要求78所述的制品，其中R1为烷基。
80.如权利要求79所述的制品，其中R1为C10-18烷基。
81.如权利要求80所述的制品，其中R1为C12烷基。
82.如权利要求78所述的制品，其中Y为O。
83.如权利要求78所述的制品，其中Y为NH。
84.如权利要求78所述的制品，其中Xa每次出现均为C2亚烷基，且Xb为C2亚烷基。
85.如权利要求78所述的制品，其中m为2。
86.如权利要求1所述的制品，其中n为0，X为亚丙基。
87.如权利要求86所述的制品，其中一个R为H。
88.如权利要求86所述的制品，其中R不是H时，R为Ra。
89.如权利要求86所述的制品，其中R1为烷基。
90.如权利要求89所述的制品，其中R1为C10-30烷基。
91.如权利要求90所述的制品，其中R1为C12烷基。
92.如权利要求86所述的制品，其中Y为O。
93.如权利要求86所述的制品，其中Y为NH。
94.如权利要求86所述的制品，其中m为2。
95.如权利要求1所述的制品，其中
n为2；
Xa在每次出现时均为C2亚烷基，且Xb为C2亚烷基；并且
其中
各个R为H或式
Figure A2007800447380006C1
表示的Ra；
m为2；
Y为NH或O；
R1为C12烷基。
96.如权利要求95所述的制品，其中至少80％的式(I)化合物分子为一种结构异构体。
97.如权利要求95所述的制品，其中Y为NH。
98.如权利要求97所述的制品，其中至少80％的式(I)化合物分子为一种结构异构体。
99.如权利要求98所述的制品，其中R在5次出现中为Ra。
100.如权利要求95所述的制品，其中在至少80％的式(I)化合物分子中，R在5次出现中为Ra。
101.如权利要求100所述的制品，其中Y为NH。
102.如权利要求95所述的制品，其中式(I)的化合物为其无机盐或其有机盐。
103.如权利要求102所述的制品，其中式(I)的化合物为其氢卤酸盐。
104.如权利要求103所述的制品，其中式(I)的化合物为其盐酸盐。
105.如权利要求1所述的制品，其中所述盐酸盐包括的范围为从1当量HCl至n+2当量HCl。
106.如权利要求1所述的制品，其包含式(I)化合物的水合物。
107.如权利要求1所述的制品，其中式(I)的化合物为有机酸的盐。
108.如权利要求107所述的制品，其中所述盐为乙酸盐。
109.如权利要求108所述的制品，其中所述乙酸盐包括的范围为从1当量乙酸盐到n+2当量乙酸盐。
110.如权利要求107所述的制品，其中所述盐为甲酸盐。
111.如权利要求108所述的制品，其中所述甲酸盐包括的范围为从1当量甲酸盐到n+2当量甲酸盐。
112.如权利要求1所述的制品，其中R1包含烯基部分。
113.如权利要求112所述的制品，其中R1包含顺式双键。
114.如权利要求1所述的制品，其中所述制品包含小于11重量％的
Figure A2007800447380007C1
式(III)
其中，X和n如权利要求1中式(I)的定义。
115.如权利要求1所述的制品，其中所述制品包含小于90重量％的
Figure A2007800447380007C2
式(IV)
其中，Y和R1如权利要求1中式(I)的定义。
116.如权利要求1所述的制品，其包含多种式(I)的化合物。
117.如权利要求116所述的制品，其包含下式化合物的混合物：
Figure A2007800447380008C1
式(I′)  式(I″)
其中，在式(I′)中，至少5个R基团为Ra。
118.如权利要求117所述的制品，其中式(I′)和式(I″)的存在比例为约1∶2～约2∶1。
119.式(II)化合物的制备方法，
Figure A2007800447380008C2
式(II)
其中
Xa和Xb在每次出现时分别独立地为C1-6亚烷基；
n为0、1、2、3、4或5；且
其中
每个R分别独立地为H或下式表示的Ra：
Figure A2007800447380008C3
m为2；
Y为O、NR2或S；
R1为烷基或烯基；
R2为H或C烷基或烯基；
所述方法包括在存在促进剂的条件下使式(III)的化合物
式(III)
与式(IV)的化合物
Figure A2007800447380009C1
式(IV)
反应。
120.式(II)化合物的制备方法，
Figure A2007800447380009C2
式(II)
其中
Xa和Xb在每次出现时分别独立地为C1-6亚烷基；
n为0、1、2、3、4或5；且
其中
每个R分别独立地为H或下式表示的Ra：
Figure A2007800447380009C3
m为2；
Y为O、NR2或S；
R1为烷基或烯基；
R2为H或C烷基或烯基；
所述方法包括在存在淬灭剂的条件下使式(III)的化合物
Figure A2007800447380009C4
式(III)
与式(IV)的化合物
Figure A2007800447380009C5
式(IV)
反应。
121.式(II)化合物的制备方法，
Figure A2007800447380010C1
式(II)
其中
Xa和Xb在每次出现时分别独立地为C1-6亚烷基；
n为0、1、2、3、4或5；且
其中
每个R分别独立地为H或下式表示的Ra：
Figure A2007800447380010C2
m为2；
Y为O、NR2或S；
R1为烷基或烯基；
R2为H或烷基或烯基；
所述方法包括使式(III)的化合物
式(III)
与式(IV)的化合物反应，
Figure A2007800447380010C4
式(IV)
其中，所述反应混合物包含约0.8～约1.2摩尔当量的式(III)化合物以及约3.8～约6.5摩尔当量的式(IV)化合物。
122.如权利要求121所述的方法，其中所述反应混合物包含约0.8～约1.2摩尔当量的式(III)的化合物以及约5.5～约6.5摩尔当量的式(IV)化合物。
123.如权利要求122所述的方法，其中所述反应混合物包含约1摩尔当量的式(III)的化合物以及约6摩尔当量的式(IV)化合物。
124.如权利要求121所述的方法，其中所述反应混合物包含约1摩尔当量的式(III)化合物以及约5摩尔当量的式(IV)化合物。
125.式(II)化合物的制备方法，
式(II)
其中
Xa和Xb在每次出现时分别独立地为C1-6亚烷基；
n为0、1、2、3、4或5；且
其中
每个R分别独立地为H或下式表示的Ra：
m为2；
Y为O、NR2或S；
R1为烷基或烯基；
R2为H或烷基或烯基；
所述方法包括在存在硼酸和水的条件下使式(III)的化合物
Figure A2007800447380011C3
式(III)
与式(IV)的化合物反应的两步工艺，
Figure A2007800447380011C4
式(IV)
其中，第一步涉及包含约0.8～约1.2摩尔当量的式(III)化合物以及约3.8～约4.2摩尔当量的式(IV)化合物的反应混合物，第二步涉及添加约0.8～1.2摩尔当量的式(IV)化合物。
126.式(II)化合物的制备方法，
Figure A2007800447380012C1
式(II)
其中
Xa和Xb在每次出现时分别独立地为C1-6亚烷基；
n为0、1、2、3、4或5；且
其中
每个R分别独立地为H或下式表示的Ra：
Figure A2007800447380012C2
m为2；
Y为O、NR2或S；
R1为烷基或烯基；
R2为H或烷基或烯基；
所述方法包括使式(III)化合物
Figure A2007800447380012C3
式(III)
与式(IV)化合物反应，
Figure A2007800447380012C4
式(IV)
并从反应混合物中分离至少一种式(II)的结构异构体，从而提供包含式(II)的结构异构体的基本纯化的制品。
127.如权利要求126所述的方法，其中使用色谱分离法是从反应混合物中分离式(II)的结构异构体。
128.如权利要求127所述的方法，其中所述色谱分离法是使用快速硅胶柱色谱分离异构体。
129.如权利要求128所述的方法，其中所述色谱分离法是使用硅胶通过重力分离异构体。
130.如权利要求128所述的方法，其中所述色谱分离法是使用移动床色谱分离异构体。
131.如权利要求128所述的方法，其中所述色谱分离法是使用液相色谱(LC)分离异构体。
132.如权利要求131所述的方法，其中所述色谱分离法是使用正相HPLC分离异构体。
133.如权利要求131所述的方法，其中所述色谱分离法是使用反相HPLC分离异构体。
134.如权利要求126所述的方法，其中所述基本纯化的制品包含至少约80％的式(II)的结构异构体。
135.如权利要求134所述的方法，其中所述基本纯化的制品包含至少约90％的式(II)的结构异构体。
136.如权利要求135所述的方法，其中所述基本纯化的制品包含至少约95％的式(II)的结构异构体。
137.式(V)化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，
Figure A2007800447380013C1
式(V)
其中
Xa和Xb在每次出现时分别独立地为C1-6亚烷基；
n为0、1、2、3、4或5；且
其中
每个R分别独立地为H或下式表示的Ra：
Figure A2007800447380013C2
m为1；
Y为O、NR2或S；
R1为烷基或烯基；
R2为H或烷基或烯基；
所述方法包括使式(III)化合物
Figure A2007800447380014C1
式(III)
与式(VI)化合物反应，
Q＝Cl或Br或I
式(VI)
以提供式(V)的化合物或其药学上可接受的盐。
138.如权利要求137所述的方法，其中所述其药学上可接受的盐为式(V)化合物的盐酸盐。
139.式(X)的化合物和其药学上可接受的盐，
Figure A2007800447380014C3
式(X)
其中
R1和R2分别独立地为H、任选被1-4个R5取代的C1-C6烷基、任选被1-4个R5取代的C2-C6烯基、或C(NR6)(NR6)2；
R3和R4分别独立地为烷基、烯基、炔基，并分别任选地被氟、氯、溴或碘取代；
L1和L2分别独立地为-NR6C(O)-、-C(O)NR6-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-S-、-N(R6)C(O)N(R6)-、-OC(O)N(R6)-、-N(R6)C(O)O-、-O-N＝C-、OR、-OC(O)NH-N＝C-或-NHC(O)NH-N＝C-；
L1-R3和L2-R4可共同形成缩醛、缩酮或原酸酯，其中R3和R4的定义如上所述并且也可以为H或苯基；
R5为氟、氯、溴、碘、-OR7、-N(R8)(R9)、-CN、SR10、S(O)R10、S(O)2R10；
R6为H、C1-C6烷基；
R7为H或C1-C6烷基；
各个R8和R9独立地为H或C1-C6烷基；
R10为H或C1-C6烷基；
m为1、2、3、4、5或6；
n为0、1、2、3、4、5或6。
140.如权利要求139所述的化合物，其中所述化合物为其无机盐。
141.如权利要求140所述的化合物，其中所述化合物为其氢卤酸盐。
142.如权利要求141所述的化合物，其中所述化合物为其盐酸盐。
143.如权利要求139所述的化合物，其中所述化合物为其有机盐。
144.如权利要求139所述的化合物，其中R1和R2分别独立地为C1-C3烷基。
145.如权利要求139所述的化合物，其中R1为甲基。
146.如权利要求139所述的化合物，其中R2为甲基。
147.如权利要求139所述的化合物，其中R1和R2均为甲基。
148.如权利要求139所述的化合物，其中R1为H、甲基、乙基、异丙基或2-羟乙基。
149.如权利要求148所述的化合物，其中R2为H。
150.如权利要求148所述的化合物，其中R2为甲基。
151.如权利要求148所述的化合物，其中R2为乙基。
152.如权利要求148所述的化合物，其中R2为丙基。
153.如权利要求148所述的化合物，其中R2为异丙基。
154.如权利要求139所述的化合物，其中R2为H、甲基、乙基、丙基或异丙基。
155.如权利要求139所述的化合物，其中R1为H、甲基、乙基、异丙基或2-羟乙基，R2为H、甲基、乙基、丙基或异丙基。
156.如权利要求139所述的化合物，其中m为1。
157.如权利要求139所述的化合物，其中n为1。
158.如权利要求139所述的化合物，其中m和n均为1。
159.如权利要求139所述的化合物，其中L1为-NR6C(O)-或-C(O)NR6-。
160.如权利要求139所述的化合物，其中L1为-OC(O)-或-C(O)O-。
161.如权利要求139所述的化合物，其中L1为S-S-。
162.如权利要求139所述的化合物，其中L1为-N(R6)C(O)N(R6)-。
163.如权利要求139所述的化合物，其中L1为-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-。
164.如权利要求139所述的化合物，其中L1为-O-N＝C-。
165.如权利要求139所述的化合物，L1为-OC(O)NH-N＝C-或-NHC(O)NH-N＝C-。
166.如权利要求139所述的化合物，其中L2为-NR6C(O)-或-C(O)NR6-。
167.如权利要求139所述的化合物，其中L2为-OC(O)-或-C(O)O-。
168.如权利要求139所述的化合物，其中L2为S-S-。
169.如权利要求139所述的化合物，其中L2为-N(R6)C(O)N(R6)-。
170.如权利要求139所述的化合物，其中L2为-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-。
171.如权利要求139所述的化合物，其中L2为-O-N＝C-。
172.如权利要求139所述的化合物，L2为-OC(O)NH-N＝C-或-NHC(O)NH-N＝C-。
173.如权利要求139所述的化合物，其中L1和L2均为-NR6C(O)-或-C(O)NR6-。
174.如权利要求139所述的化合物，其中L1和L2均为-OC(O)-或-C(O)O-。
175.如权利要求139所述的化合物，其中L1和L2均为S-S-。
176.如权利要求139所述的化合物，其中L1和L2均为-N(R6)C(O)N(R6)-。
177.如权利要求139所述的化合物，其中L1和L2均为-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-。
178.如权利要求139所述的化合物，其中L1为NR6C(O)-，L2为-S-S-。
179.如权利要求139所述的化合物，其中L1为-OC(O)-，L2为-S-S-。
180.如权利要求139所述的化合物，其中L1为-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-，L2为-S-S-。
181.如权利要求139所述的化合物，其中L1为-N(R6)C(O)N(R6)-，L2为-S-S-。
182.如权利要求139所述的化合物，其中L1-R3和L2-R4共同构成缩醛、缩酮或原酸酯。
183.如权利要求139所述的化合物，其中R3和R4分别独立地为烷基。
184.如权利要求139所述的化合物，其中R3和R4均为C6-C28烷基。
185.如权利要求184所述的化合物，其中L1和L2分别独立地为-S-S-、-OC(O)N(R6)-或-N(R6)C(O)O-。
186.如权利要求139所述的化合物，其中R3为烷基。
187.如权利要求139所述的化合物，其中R4为烷基。
188.如权利要求139所述的化合物，其中R3为烯基。
189.如权利要求139所述的化合物，其中R4为烯基。
190.如权利要求139所述的化合物，其中R3和R4分别独立地为烯基。
191.如权利要求190所述的化合物，其中R3和R4分别独立地为C6-C30烯基。
192.如权利要求190所述的化合物，其中R3和R4均为相同的烯基。
193.如权利要求139所述的化合物，其中每个R3和R4包含2个双键基团。
194.如权利要求193所述的化合物，其中所述双键中的至少一个具有Z构型。
195.如权利要求193所述的化合物，其中所述两个双键均具有Z构型。
196.如权利要求190所述的化合物，其中R3和R4中的至少一个为下式(II)结构：
Figure A2007800447380017C1
式(II)
其中
x为1～8的整数；且
y为1～10的整数。
197.如权利要求196所述的化合物，其中R3和R4均为式(II)。
198.如权利要求190所述的化合物，其中至少一个所述双键具有E构型。
199.如权利要求198所述的化合物，其中所述两个双键均具有E构型。
200.如权利要求198所述的化合物，其中R1和R2中的至少一个为下式(III)结构：
Figure A2007800447380018C1
式(III)
其中
x为1～8的整数；且
y为1～10的整数。
201.如权利要求200所述的化合物，其中R1和R2均为式(III)。
202.如权利要求190所述的化合物，其中R1和R2各包含三个双键。
203.如权利要求202所述的化合物，其中至少一个所述双键具有Z构型。
204.如权利要求203所述的化合物，其中至少两个所述双键具有Z构型。
205.如权利要求204所述的化合物，其中所述三个双键均具有Z构型。
206.如权利要求190所述的化合物，其中R1和R2中的至少一个为下式(IV)结构：
Figure A2007800447380018C2
式(IV)
其中
x为1～8的整数；且
y为1～10的整数。
207.如权利要求206所述的化合物，其中R1和R2均为式(IV)。
208.如权利要求190所述的化合物，其中至少一个所述双键具有E构型。
209.如权利要求208所述的化合物，其中至少两个所述双键具有E构型。
210.如权利要求209所述的化合物，其中所述三个双键均具有E构型。
211.如权利要求210所述的化合物，其中R1和R2中的至少一个为下式(IV)结构：
Figure A2007800447380018C3
式(V)
其中
x为1～8的整数；且
y为1～10的整数。
212.如权利要求212所述的化合物，其中R1和R2均为式(V)。
213.一种包含式(X)化合物的制品。
214.式(X)化合物的制备方法，
Figure A2007800447380019C1
式(X)
其中
R1和R2分别独立地为C1-C6烷基，其任选被1-4个R5取代；
R3为烷基、烯基、炔基；
L1为-OC(O)-；
R5为-OR7、-N(R8)(R9)、-CN、SR10、S(O)R10、S(O)2R10；
R6为H、C1-C6烷基；
R7为H或C1-C6烷基；
R8和R9分别独立地为H或C1-C6烷基；
R10为H或C1-C6烷基；
m和n分别独立地为1、2、3、4、5或6；
所述方法包括在存在偶联剂的条件下使式(VI)化合物
式(VI)
与式(VII)化合物反应，
式(VII)
从而提供式(X)化合物。
215.如权利要求214所述的方法，其中所述偶联剂为碳二亚胺。
216.如权利要求215所述的方法，其中所述偶联剂为EDCI。
217.形成缔合复合物的方法，其包括在存在缓冲剂的条件下，使权利要求1或权利要求213的脂质制品与治疗剂相接触，其中所述缓冲剂：
具有足够的强度以使式I分子中所有的氨基充分质子化；
以100～300mM存在；
其存在浓度提供的质子化作用显著强于20mM的相同缓冲剂。
218.通过权利要求217的方法制备的缔合复合物。
219.形成缔合复合物的方法，其包括在包含至少约90％乙醇的混合物中，使权利要求1或权利要求213的脂质制品与治疗剂相接触，并快速混合所述脂质制品与所述治疗剂，从而提供直径小于约200uM的颗粒。
220.如权利要求219所述的方法，其中所述颗粒的直径小于约50uM。
221.形成缔合复合物的方法，其包括在存在缓冲剂的条件下，使权利要求1或权利要求213的脂质制品与治疗剂相接触，其中所述缓冲剂的浓度为约100mM～约300mM。
222.缔合复合物，其包含权利要求1或权利要求213的制品和核酸。
223.如权利要求222所述的缔合复合物，其还包含聚乙二醇化的脂质。
224.如权利要求222所述的缔合复合物，其还包含结构性部分。
225.如权利要求224所述的缔合复合物，其中所述结构性部分为胆固醇。
226.如权利要求222所述的缔合复合物，其中所述核酸为siRNA。
227.如权利要求226所述的缔合复合物，其中所述核酸为经修饰而具有降解抗性的siRNA。
228.如权利要求226所述的缔合复合物，其中所述核酸为通过多糖骨架修饰而被修饰的siRNA。
229.如权利要求226所述的缔合复合物，其中所述siRNA靶向一个或多个目的基因。
230.如权利要求229所述的缔合复合物，其中所述一个或多个目的基因为在肝脏中内源表达的基因。
231.如权利要求230所述的缔合复合物，其中所述目的基因为apoB。
232.如权利要求230所述的缔合复合物，其中所述目的基因为FVII。
233.如权利要求230所述的缔合复合物，其中所述目的基因为PCSK9。
234.如权利要求230所述的缔合复合物，其中所述目的基因为VEGF。
235.如权利要求230所述的缔合复合物，其中所述目的基因为KSP(eg5)。
236.如权利要求230所述的缔合复合物，其中所述目的基因为铁调素。
237.如权利要求230所述的缔合复合物，其中所述目的基因为HCV。
238.如权利要求222所述的缔合复合物，其中所述核酸为单链核酸或其衍生物。
239.如权利要求238所述的缔合复合物，其中所述核酸为反义核酸。
240.如权利要求238所述的缔合复合物，其中所述核酸为小RNA。
241.如权利要求238所述的缔合复合物，其中所述核酸为小RNA的反义寡核苷酸(antagomir)。
242.权利要求241所述的缔合复合物，其中所述核酸针对于小RNA-122。
243.权利要求241所述的缔合复合物，其中所述核酸针对于小RNA-181。
244.权利要求241所述的缔合复合物，其中所述核酸针对于小RNA-155。
245.权利要求241所述的缔合复合物，其中所述核酸针对于小RNA-16。
246.如权利要求222所述的缔合复合物，其还包含结构性部分和聚乙二醇化的脂质，其中权利要求1或权利要求213所述的制品、结构性部分、聚乙二醇化的脂质和核酸的重量比为(8-22)∶(0.4-10)∶(0.4-12)∶(0.4-2.2)。
247.如权利要求246所述的缔合复合物，其中所述结构性部分为胆固醇。
247.如权利要求247所述的缔合复合物，其中所述比例为(10-20)∶(0.5-8.0)∶(5-10)∶(0.5-2.0)。
248.如权利要求248所述的缔合复合物，其中所述比例为15∶0.8∶7∶1。
249.如权利要求246所述的缔合复合物，其中所述脂质体的平均直径在10nm～750nm之间。
250.如权利要求249所述的缔合复合物，其中所述缔合复合物的平均直径在30nm～200nm之间。
251.如权利要求250所述的缔合复合物，其中所述缔合复合物的平均直径在50nm～100nm之间。
252.如权利要求222所述的缔合复合物，其中所述制品少于未反应脂质的15重量％。
253.药学上可接受的组合物，其包含权利要求1或权利要求213所述的制品。
254.药学上可接受的组合物，其包含权利要求222所述的缔合复合物。
255.哺乳动物的治疗方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗量的权利要求222所述的缔合复合物。
256.如权利要求1所述的制品，其中所述制品包含下式之一或下式的混合物，其中除非在下式中有明确说明，否则R不是H，
Figure A2007800447380022C1
257.如权利要求1所述的制品，其中所述制品基本由下式之一或下式的混合物组成，
Figure A2007800447380022C2
258.如权利要求257所述的制品，其中R均为
Figure A2007800447380022C3
259.如权利要求258所述的制品，其中R均为
Figure A2007800447380022C4
260.如权利要求256或257所述的制品，其中R1为C10-C18烷基(如C12烷基)或C10-C30烯基。
261.如权利要求256所述的制品，其中R为
Figure A2007800447380022C5
262.如权利要求261所述的制品，其中R1为C10-C18烷基。
263.如权利要求261所述的制品，其中R1为C12烷基，R2为H。
264.如权利要求253所述的制品，其中式(I)如下所示，其中除非有明确说明，否则R不是H，
Figure A2007800447380022C6
R为
Figure A2007800447380022C7
265.如权利要求264所述的制品，其中R1为C12烷基，R2为H。
266.如权利要求256所述的制品，其中式(I)如下所示，其中除非有明确说明，否则R不是H，
Figure A2007800447380023C1
R为
Figure A2007800447380023C2
267.如权利要求266所述的制品，其中R1为C12烷基，R2为H。
268.如权利要求1所述的制品，其中式(I)如下所示，其中除非有明确说明，否则R不是H，
Figure A2007800447380023C3
269.如权利要求268所述的制品，其中R为
Figure A2007800447380023C4
270.如权利要求269所述的制品，其中R1为C10-C18烷基或C10-C30烯基。
271.如权利要求268所述的制品，其中R为
Figure A2007800447380023C5
272.如权利要求271所述的制品，其中R1为C10-C18烷基或C10-C30烯基，R2为H。
271.包含多种脂质部分和治疗剂的缔合复合物的形成方法，所述方法包括：
在乙醇和NaOAc缓冲水溶液中混合多种脂质部分，从而获得颗粒；和
向所述颗粒添加治疗剂，从而形成所述缔合复合物。
272.如权利要求271所述的方法，其中所述脂质部分以存在于100％乙醇溶液中而提供。
273.如权利要求271所述的方法，其中所述多种脂质部分包含阳离子脂质。
274.如权利要求273所述的方法，其中所述阳离子脂质为权利要求1或权利要求213所述的脂质。
275.如权利要求274所述的方法，其中所述阳离子脂质为以下脂质之一或其混合物：
Figure A2007800447380024C1
276.如权利要求271所述的方法，其中所述多种脂质部分包括PEG-脂质。
277.如权利要求276所述的方法，其中所述PEG-脂质具有以下结构：
Figure A2007800447380024C2
其中，
L1和L2分别独立地为键或C(O)；
R1和R2分别独立地为烷基、烯基或炔基；其每一个任选被一个或多个取代基取代；
X为-C(O)NH-、C(S)NH、-C(O)C1-3烷基C(O)NH-；或-C(O)C1-3烷基C(O)O-；
m为0-11的整数，且
n为1-500的整数。
278.如权利要求277所述的方法，其中所述PEG-脂质为
Figure A2007800447380024C3
279.如权利要求271所述的方法，其中所述多种脂质部分包括结构性脂质。
280.如权利要求279所述的方法，其中所述结构性脂质为胆固醇。
281.如权利要求271所述的方法，其还包括挤出包含脂质的颗粒。
282.如权利要求271所述的方法，其中在添加治疗剂之前挤出包含脂质的颗粒。
283.如权利要求271所述的方法，其中所述治疗剂为核酸。
284.如权利要求283所述的方法，其中所述核酸为siRNA。
284.如权利要求283所述的方法，其中所述核酸为经修饰而具有降解抗性的siRNA。
285.如权利要求283所述的方法，其中所述核酸为通过多糖骨架修饰而被修饰的siRNA。
286.如权利要求283所述的方法，其中siRNA与亲脂部分结合。
287.如权利要求284所述的方法，其中所述siRNA靶向一个或多个目的基因。
288.如权利要求287所述的方法，其中所述一个或多个目的基因为在肝脏中内源表达的基因。
289.如权利要求288所述的方法，其中所述目的基因为apoB。
290.如权利要求288所述的方法，其中所述目的基因为FVII。
291.如权利要求288所述的方法，其中所述目的基因为PCSK9。
292.如权利要求288所述的方法，其中所述目的基因为VEGF。
293.如权利要求288所述的方法，其中所述目的基因为KSP(eg5)。
294.如权利要求288所述的方法，其中所述目的基因为铁调素。
295.如权利要求288所述的方法，其中所述目的基因为HCV。
296.如权利要求283所述的方法，其中所述核酸为单链核酸或其衍生物。
297.如权利要求296所述的方法，其中所述核酸为反义核酸。
298.如权利要求296所述的方法，其中所述核酸为小RNA。
299.如权利要求296所述的方法，其中所述核酸为反义小RNA(antagomir)。
300.如权利要求271所述的方法，其中所述缔合复合物包含阳离子脂质、结构性脂质、PEG-脂质和核酸。
301.如权利要求300所述的方法，其中所述阳离子脂质、结构性脂质、PEG-脂质和核酸的摩尔比为(36-48)∶(42-54)∶(6-14)。
302.如权利要求301所述的方法，其中所述阳离子脂质、结构性脂质、PEG-脂质和核酸的摩尔比为(38-46)∶(44-52)∶(8-12)。
303.如权利要求302所述的方法，其中所述阳离子脂质、结构性脂质、PEG-脂质和核酸的摩尔比为约42∶48∶10。
304.如权利要求271所述的方法，其中总赋形剂与核酸的重量比小于约15∶1。
305.如权利要求304所述的方法，其中总赋形剂与核酸的重量比为约10∶1。
306.如权利要求305所述的方法，其中总赋形剂与核酸的重量比为约7.5∶1。
307.如权利要求305所述的方法，其中总赋形剂与核酸的重量比为约5∶1。
308.如权利要求300所述的方法，其中所述阳离子脂质具有以下结构：
Figure A2007800447380026C1
所述PEG-脂质具有以下结构：
Figure A2007800447380026C2
所述结构性脂质为胆固醇。
309.如权利要求308所述的方法，其中所述阳离子脂质、结构性脂质和PEG-脂质的摩尔比为(38-46)∶(44-52)∶(8-12)。
310.如权利要求309所述的方法，其中所述阳离子脂质、结构性脂质、PEG-脂质和核酸的摩尔比为约42∶48∶10。
310.如权利要求308所述的方法，其中总赋形剂与核酸的重量比小于约15∶1。
311.如权利要求310所述的方法，其中总赋形剂与核酸的重量比为约10∶1。
312.如权利要求310所述的方法，其中总赋形剂与核酸的重量比为约7.5∶1。
313.如权利要求310所述的方法，其中总赋形剂与核酸的重量比为约5∶1。
314.通过权利要求271-313中任一项的方法制备的缔合复合物。
315.缔合复合物，其包含阳离子脂质、结构性脂质、PEG-脂质和核酸，其中所述阳离子脂质为以下脂质之一或其混合物：
Figure A2007800447380027C1
所述PEG-脂质具有以下结构：
Figure A2007800447380027C2
所述结构性脂质为胆固醇。
316.如权利要求315所述的缔合复合物，其中所述核酸为siRNA。
317.如权利要求315所述的缔合复合物，其中所述阳离子脂质具有下式结构：
318.如权利要求315所述的方法，其中所述阳离子脂质、结构性脂质、PEG-脂质和核酸的摩尔比为(36-48)∶(42-54)∶(6-14)。
319.如权利要求318所述的方法，其中所述阳离子脂质、结构性脂质、PEG-脂质和核酸的摩尔比为(38-46)∶(44-52)∶(8-12)。
320.如权利要求319所述的方法，其中所述阳离子脂质、结构性脂质、PEG-脂质和核酸的摩尔比为约42∶48∶10。
321.如权利要求315所述的方法，其中总赋形剂与核酸的重量比小于约15∶1。
322.如权利要求321所述的方法，其中总赋形剂与核酸的重量比为约10∶1。
323.如权利要求321所述的方法，其中总赋形剂与核酸的重量比为约7.5∶1。
324.如权利要求321所述的方法，其中总赋形剂与核酸的重量比为约5∶1。
325.式(XV)的化合物，
Figure A2007800447380028C1
式(XV)
其中，
L1和L2分别独立地为连接键或C(O)；
R1和R2分别独立地为烷基、烯基或炔基；其每一个任选被一个或多个取代基取代；
X为-C(O)NH-、-C(S)NH、-C(O)C1-3烷基C(O)NH-；或-C(O)C1-3烷基C(O)O-；
m为0～11的整数，且
n为1～500的整数。
326.如权利要求325所述的化合物，其中L1和L2均为连接键。
327.如权利要求325所述的化合物，其中L1和L2均为C(O)。
328.如权利要求325所述的化合物，其中R1和R2分别独立地为烷基。
329.如权利要求328所述的化合物，其中R1和R2分别独立地为C6-C28烷基，例如C10-C18烷基，如C14烷基。
330.如权利要求325所述的化合物，其中R1和R2均为烷基，例如长度相同的直链烷基，如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C14烷基或C16烷基。
331.如权利要求330所述的化合物，其中R1和R2分别独立地为C14烷基。
332.如权利要求325所述的化合物，其中式XV表示外消旋混合物。
333.如权利要求325所述的化合物，其中式XV表示光学纯的‘R’异构体(例如，具有R对映异构体过量的化合物，如至少约95％ee，或大于97％ee，如98％ee或99％ee)。
334.如权利要求325所述的化合物，其中式XV表示光学纯的‘S’异构体(例如，具有R对映异构体过量的化合物，如至少约95％ee，或大于97％ee，如98％ee或99％ee)。
335.如权利要求325所述的化合物，其中R1和R2分别独立地为烯基，例如R1和R2分别独立地为C6-C30烯基，或R1和R2为相同的烯基。
336.如权利要求335所述的化合物，其中每个R1和R2包含单个双键，例如为E或Z构型的单个双键。
337.如权利要求335所述的化合物，其中每个R1和R2包含两个双键。
338.如权利要求325所述的化合物，其中X为-C(O)NH-，从而提供下式(XV′)的化合物：
Figure A2007800447380029C1
式(XV′)。
339.如权利要求325所述的化合物，其中X为-C(O)C1-3烷基C(O)O-。
340.如权利要求325所述的化合物，其中m为1-10的整数，例如2-4的整数或整数2。
341.如权利要求325所述的化合物，其中n为1-500的整数，例如40-400、100-350、40-50或42-47的整数。
342.如权利要求325所述的化合物，其中所述化合物为式(XV′)的化合物，
Figure A2007800447380029C2
式(XV′)
其中，L1和L2均为连接键。
343.如权利要求342所述的化合物，其中R1和R2分别独立地为烷基，例如为C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C14烷基。
344.如权利要求343所述的化合物，其中R1和R2均为烷基，例如长度相同的直链烷基，如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，如C14烷基或C16烷基。
345.如权利要求342所述的化合物，其中m为1-10的整数，例如2-4的整数或整数2。
346.如权利要求342所述的化合物，其中n为1-500的整数，例如40-400或40-50的整数。
347.如权利要求342所述的化合物，其中所述化合物为式(XV′)的化合物，其中L1和L2均为连接键，R1和R2均为烷基(例如C6-C28烷基，如C10-C18烷基，优选C14烷基)，n为约40～～400的整数。
348.如权利要求325所述的化合物，其中所述化合物具有下式(XVI)的结构：
Figure A2007800447380030C1
式(XVI)
其中，重复PEG部分的平均分子量为2000，n值在42～47之间。
349.如权利要求348所述的化合物，其中所述式XVI的化合物为具有优选的绝对构型‘R’的立体异构体(例如，R对映异构体过量90％、95％、97％、98％、99％)。
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