CN1810304A - 煅烧骨粉的制备方法在骨缺损修复中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种引导骨组织再生的支架材料——煅烧骨粉的制备方法及其在骨缺损修复中的用途。煅烧骨粉具有明显的促进骨愈合的作用及较好的生物相容性，且具有一定的硬度和强度、易于塑形且来源丰富，解决了人工合成材料在孔隙率、孔隙交通、孔隙大小等方面的制作难题。

Description

煅烧骨粉的制备方法在骨缺损修复中的用途

技术领域

本发明涉及一种引导骨再生的支架材料的制备方法，尤其涉及一种煅烧骨粉的制备方法及其在骨缺损修复中的用途，属于医用卫生材料制备领域。

背景技术

由于自体骨移植和同种异体骨移植在应用上的限制，使骨缺损的修复成为多年来临床治疗的难题。用人工材料取代二者应用于临床是当前在骨移植领域研究的主要方向，也是颌面外科、修复外科、骨外科的主要研究内容。

目前骨组织工程中采用的支架材料种类繁多，虽各有优点，但均有无法克服的不足，因而限制了材料的发展。煅烧骨是唯一拥有天然骨小梁结构和骨无机物晶体结构的生物材料，其作为引导骨组织再生术的支架材料，越来越引起人们的重视。其结构式同羟基磷灰石，有一定的硬度和强度、易于塑形且来源丰富，解决了人工合成材料在孔隙率、孔隙交通、孔隙大小等方面的制作难题。而且煅烧骨粉在制备的过程中经过了一定的物理化学方法处理，并经过高温煅烧，消除了抗原性，解决了生物相容性的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种煅烧骨粉的制备方法，解决了其它骨组织支架材料的抗原性和生物相容性的问题。

本发明还提供了该煅烧骨粉在骨缺损中的用途。

本发明的煅烧骨粉是通过以下方法制备的：

A、取哺乳动物骨的松质骨部分切成小块；

B、将切成小块的骨进行水煮、干燥；

C、将水煮、干燥后的骨进行酸、碱处理，并用二次蒸馏水清洗数次，至PH值为7后干燥；

D、将上述制备好的骨，放入高温炉中在600-1000℃煅烧。

本发明的最佳技术方案是高温炉煅烧过程中充入氧气，温度控制为700-900℃，煅烧2-3次，每次3-5小时。

本发明所制备的牛骨粉经能谱分析、X线衍射及扫描电镜观察显示其为无有机质，具有完整三维交通的松质骨结构。在结构上符合理想骨缺损修复材料要求。

通过兔骨髓基质干细胞与异种煅烧骨粉体外复合试验，证明本发明制备的骨粉生物相容性好，对细胞无不良刺激，材料没有细胞毒性。因此本发明研制的异种煅烧骨粉可作为优良的骨替代材料，构建组织化人工骨。动物实验结果显示本发明的骨粉组织相容性好，在植入体内早期亦未见有明显的淋巴细胞浸润，且成骨速度较快，骨缺损是以膜内化骨的方式愈合，未见软骨化骨。

本方法所制备的骨粉具有良好的抗压能力，且骨粉是经过高温煅烧的纯无机物质，不存在任何抗原物质。扫描电镜照片结果显示，骨粉保留了天然骨的多孔结构及骨小梁，与人体骨结构相似、内表面积大、孔隙间相互交通，有利于成骨细胞的粘附与生长，有利于纤维及血管长入。另外骨粉塑形能力强，可根据原来骨的形态塑形，可操作性好。将从兔的骨髓间充质干细胞定向分化来的成骨细胞与煅烧骨粉共同培养后，扫描电镜下观察可见骨粉表面有大量的成骨细胞吸附，生长状态良好，形态正常，数量较多，且与骨结合的紧密。这说明本实验研制的骨粉不仅生物相容好，可做为骨缺损修复支架，也可以作为骨组织工程的载体使用。以后可通过对成骨细胞相关基因表达检测该骨粉的体内成骨效果

本发明的优点是提供了一种较为理想的骨缺损修复材料的制备方法，煅烧骨粉主要用于骨缺损的修补，尤其适用于牙槽嵴的扩展和重建治疗、填充牙周部位的骨缺损，截根术、囊肿切除术后的缺损充填，填充拔牙窝，以保持牙槽嵴形态等。煅烧块状骨不易塑形，很难修复特殊部位的骨缺损。如下颌骨、上颌窦底等部位的骨缺损。

说明书附图

图1A、1：本发明骨粉的X-ray衍射谱图

图2A、2B：本发明骨粉的红外谱图

图3：本发明煅烧骨的电镜图

图4：DMEM培养7天的骨髓间质干细胞(40×)

图5：诱导培养21天后的骨髓间质干细胞(VonKossa染色，40×)

图6：煅烧骨粉与兔成骨细胞共同培养5天(40×)

图7：成骨细胞与煅烧牛骨材料复合

图8：煅烧骨粉治疗家兔颅骨损伤12周时骨组织的X线图片

图9A：煅烧骨粉未见生物膜治疗家兔颅骨损伤12周时骨组织的组织学变化

图9B：煅烧骨粉治疗家兔颅骨损伤12周时骨组织的组织学变化

具体实施方式：

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

                        煅烧骨的前处理

遵循所选取骨的强度和空隙率基本与人骨相类似的原则，选取一岁龄牛脊骨作为处理的对象。

将刚处死的牛脊骨切成10mm³小块，用清水冲洗数次，后投入锅中水煮，这一过程的主要目的是去除附着在牛骨上面的有机质，如：明胶、骨髓、蛋白质等，此过程需用4～5小时。

将上述处理干净的牛骨在干燥箱中干燥后，用粉碎机将牛骨粉碎成约为5mm³小块后放入锅中再次水煮，将其中的大部分有机质去除，此过程大约需3h期间换水3次，干燥备用。

将上述牛骨置入1MNaOH或碳酸氢钠溶液中浸泡30分钟，以去除剩余有机质。

将上述的牛骨块置入30％H₂O₂中浸泡30分钟，氧化和分解残留在骨内的微量有机质，并用二次蒸馏水清洗数次，至PH值为7，干燥备用。

通过上述的步骤，可以将其中绝大部分的有机质和有害物质去除。

实施例2

                    煅烧骨粉的制备方法

制备好的牛骨块放入高温炉中(型号：Tube Furnace 21100，Germen)不同温度下在下煅烧。下面仅将不同温度下的实验情况列表比较(见表1)：

表1.牛骨物性与煅烧温度的关系

温度℃	表观状态	物性	处理时间(小时)
				150	颜色无变化(白色)	强度无变化	3

250	颜色开始变黑	同上	3
				350	颜色为黑色	同上	3
450	同上	同上	3
				550	淡灰色	同上	3
650	颜色变白	强度变弱	3
				800	白色	同上	3

本实验通过对不同煅烧温度的骨粉进行比较，煅烧温度为150℃时，孔隙内有软组织残留。动物实验证明，该条件下烧制的骨粉骨引导作用较好。在植入早期(3周)有淋巴细胞及多核巨细胞反应，骨生长情况良好，在骨发生中心，成骨细胞较多，分泌旺盛；6周时淋巴细胞开始减少直至消失。说明煅烧温度为150℃的骨粉，虽然内部存在着软组织，但经过前期处理后，其排异反应已明显消除，且不影响其骨传导作用(根据灰度测定150℃、800℃骨粉在不同时间的吸收情况将在下面进一步讨论)。

煅烧至550℃时孔隙内不存在有机质，但表面色泽呈灰色，证明有碳化物存在，尚未被充分氧化。在煅烧过程中加氧后骨表面颜色变浅，接近正常。

煅烧至800℃时骨粉呈乳白色，电镜观察，孔隙内部无软组织存在，孔隙清晰，孔径为300-550μm，孔隙交通好，保持骨的天然结构。体外与兔成骨细胞共同培养，成骨细胞生长状态良好，细胞与骨结合紧密，数量较多，说明该骨粉能作为骨组织工程的支架使用。动物体内实验证明高温煅烧的骨粉基本上无排异反应。

结论：于600℃以下温度所得的骨块，由于煅烧不充分，样品均为黑、灰色；600℃以上煅烧充分，致有机成分完全氧化，样品为白色的，其强度有少许下降，但足以满足需要。

实验例1

            煅烧骨粉的X-射线(粉末)衍射分析

仪器型号：理学D/max 2500V PC X-ray衍射仪。

工作条件：Cu耙、40kv、200mA，标准样品台连续式扫描。

扫描速度：4.000deg/min。

送样宽度：0.020deg。

扫描轴：2Theta/thetan。

扫描范围：5.000≥60.000deg。

将本发明的煅烧骨粉进行X线衍射分析，结果其成份如图1所示。

实验例2

              煅烧骨粉的透射式红外表征

仪器型号：BIO-RAD FT135型傅立叶变换红外光谱仪。

实验方法：用红外光谱法可以鉴定有机分子中存在的官能团及其化学环境，红外光谱法是非破坏性的。而且它需要的样品量少，获得图谱快。样品的制备主要为KBr(溴化钾)压片法，首先将固体样品研细，使其颗粒直径小于通过样品的光的波长，取约为15到20mg样品在玛瑙研钵中研磨3到10min，直到它扩散到整个研钵内壁并有粘结性和玻璃状的外观为止。然后进行测试，结果见图2。

实验例3

               煅烧骨粉的电感耦合等离子体原子光谱分析

仪器型号：POEMS美国Thermo Jarrell Ash

仪器参数：功率1150V样品提升：1.48ml/min

Ar载气：0.56L/min观察高度：13mm

实验方法：首先将称取样品，然后用硝酸溶解样品，定容，将样品送入仪器。

电感耦合等离子体原子光谱法测定本发明煅烧骨粉的元素含量，结果如表2所示。

元素(mg/g)	皮质骨骨粉	800℃骨粉
			Ca	289	333
P	272	193
			AL	＜0.01	-
Ba	0.23	0.297
			Cu	＜0.0002	-
Fe	0.013	0.046
			Mg	＜0.0005	0.0008
Sr	0.28	0.196
			Si	0.84	0.069
Ti	＜0.001	-
			Zn	0.065	0.038

实验例4

煅烧骨粉的光电子能谱检测

VG ESCALAB MKII型光电子能谱为美国UG公司制造

光电子能谱仪由谱仪室、激光源、能量分析器、信号检测器、真空系统、电子学装置和计算机组成。

实验方法：将样品放在载物台上，将其碾碎，放入仪器内，抽真空，然后开启仪器对样品进行检测，样品在激光的照射下产生信号，经过信号检测器转化成信号由电脑输出，即可得到我们所需的结果。

实验例5

        煅烧骨粉的扫描电镜检测

电镜型号：AEOL-JSM-5500LV，(日本制造)。

电子显微镜的基本结构：电子光学系统、真空系统、电器系统。

成像原理：处于负高压的电子枪发射一束电子经两级磁透镜组成的照明系统把这些电子聚成直径仅为几微米的强电子束照射在要观察的物体上，电子与物质相互作用，产生弹性和非弹性散射，从而使这些电子所观察物体的形貌和结构特征等信息，这些电子经物镜聚焦并在物镜的像平面形成所观察物体的放大像，再经两次或更多级的磁透镜组成的成像系统进一步放大，最后这些成像电子打在荧光屏上发出荧光。在荧光屏上我们就可以看见放大几十倍到几十万倍的被观察物体的放大图像，这些图像可以用照片的形式记录下来。

扫描电镜下观察结果显示本发明的煅烧骨粉为无有机质的具有完整三维交通的松质骨结构。在结构上符合理想骨缺损修复材料要求。150℃烧制的骨粉在电镜下观察无机结构内尚有有机物存在。而煅烧至800℃的骨粉内完全无软组织(见图3)。

实施例6

                煅烧牛骨粉的生物相容性体外试验

1.兔间质细胞(MSCs)的体外分离及培养：选取三周龄的大耳白兔，雌雄不限，体重2.5-3.5公斤。速眠新(1ml/kg)肌肉注射麻醉后无菌抽取骨髓1.5-2.0ml(注射器内含稀释的肝素钠3000u约定0.2ml)，放入DMEM培养基中吹打制成单细胞悬液，置于2个25ml培养瓶中，37℃、5％CO₂条件下培养，于第五天首次细胞换液，弃去培养液，用Tyrode’s平衡盐溶液冲洗4次，冲去悬浮生长的造血干细胞，之后每2-3天换液，待骨髓间充质干细胞贴满培养瓶低壁80％后，倒掉培养液，用D-Hanks液缓慢冲洗2次，然后用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA联合消化，倒置显微镜下观察，当细胞质伪足回缩约50％时，呈圆形(大约5分钟)，用含有15％血清的完全培养液终止消化，加入培养液5ml用吸管反复吹打将细胞悬浮，将壁上细胞吹打下来，以1000转/分离心，弃上清，收取底壁细胞，以1∶2传代(见图4)。

2.骨髓间充质干细胞体外诱导

髓间充质干细胞体外传3代后，以5×10⁴/孔接种于预置载玻片的12孔板的6孔，更换入含有地塞米松(DEX)，抗坏血酸和β-磷酸甘油的DMEM培养基诱导液，诱导21天后，见细胞呈集落生长。将细胞10％福尔马林固定20分钟，2％硝酸银孵育10分钟，去离子水冲去多余的硝酸银，紫外光照射半小时，光镜下观察。结果发现培养的兔MSCs中加入诱导液后，周边部细胞由单层逐渐转变为复层生长，部分细胞转变为平坦多边角形，在细胞高度密集区又转变为圆形或椭圆形，并分泌细胞外基质，甲苯胺蓝染色呈阳性反应。3天后原来细胞密集的区域细胞质出现收缩，1周左右大部分细胞收缩成细胞团，最后在整个培养环境中形成2-3个细胞结节。VonKossa染色阳性区，呈斑块状，多见于细胞密集生长区。证明该细胞具成骨细胞样特性(见图5)。

3.成骨细胞与煅烧牛骨材料复合

将煅烧骨粉用Co⁶⁰ _γ消毒后用培养液预湿备用。取传第3代骨髓间充质干细胞5×10⁶与小块状煅烧牛骨材料共同培养，24小时后见材料周围有细胞贴壁生长，2-3天换液，5天后见细胞明显增殖，且细胞形态未见异常变化(见图6)。证明本材料没有细胞毒性。

12天后将植有细胞的材料取出，用2.5％的戊二醛固定，1％的锇酸固定，乙醇系列脱水后喷金给予扫描电镜观察。扫描电镜二次成像法显示实验煅烧的牛骨粉在体外培养第五天时已有成骨细胞附着，数量较多，同时在孔洞中也有细胞生长；且生长状态良好，贴附紧密，形态正常.证明本实验研制的骨粉生物相容性好，对细胞无不良刺激，材料无细胞毒性，可做骨组织工程的种子细胞载体使用。(见图7)。

实施例7

            煅烧骨粉对家兔颅骨损伤的修复作用

试验方法

将新西兰白兔随机分为六组(动物由吉林大学医学部动物室提供)，每组四只，雌雄不限，体重2.5-3.5公斤。速眠新(1ml/kg)肌肉注射麻醉，无菌条件下备皮，在两侧颅骨上分别制成1.0×1.5cm的骨穿通缺损，然后在缺损处放入骨粉上复盖生物可降解膜，左侧为实验骨粉组，右侧为对照材料组，按下表分组。

实验骨粉组(左)

1.实验煅烧骨粉(具有松质骨和密质骨混合型)+可降解生物膜

2.实验煅烧骨粉(纯松质骨粉煅烧温度为150℃)+可降解生物膜

3.实验煅烧骨粉(纯松质骨粉煅烧温度为550℃)+可降解生物膜

4.实验煅烧骨粉(纯松质骨粉煅烧温度为800℃)+可降解生物膜

对照组(右)

5.骨缺损处不加骨粉只用可降解生物膜

6.生物可降解骨替代材料

7.骨粉未加膜

8.实验煅烧骨粉(纯松质骨粉煅烧温度为800℃)+生物膜+BMP

分别在3、6、8、12周处死家兔，取颅骨拍X线片，然后，固定在10％的中性福尔马林中，一周后，置20％EDTA中脱钙，脱钙完全后，常规石蜡包埋，切片(6μm)HE染色，镜下观察。

实验结果

(1)大体观察：兔颅骨愈合良好，上覆纤维组织被膜，均无炎症反应。实验组一周处死的兔颅骨表面下陷，呈暗红色，边界清楚，上附可降解生物膜。三、六、八、十二周处死的兔颅骨表面纤维组织被膜色泽与正常部位相同，呈乳白色，与正常部位呈移行关系。对光观察透光度强，说明骨组织密度低。随时间增长，生物可降解膜逐渐变脆，触之易碎。多孔PLA/PGA共聚骨替代材料组表面被覆的纤维组织较厚，随时间延长虽透光度有所减弱，但明显强于实验组。

(2)X线观察：实验组在三周处死的兔颅骨缺损处有明显的骨粉颗粒存在，六周处死的兔颅骨缺损处仍有骨粉颗粒，但影像不清晰。X线片见骨密度仍低于正常骨组织。八周、十二周处死的兔颅骨内未见骨粉颗粒影像，有骨小梁影像，并透光度下降(见图8)。多孔PLA/PGA共聚骨替代材料组，未见明显的骨生成影像。至12周时仍可见明显的骨缺损影像。

(3)组织学观察：经150℃、500℃、800℃煅烧制成的牛骨粉用于新西兰白兔颅骨两侧缺损处观察3、6、8、12周，处死动物，目的是观察在同一条件下放置不同材料对比其促进骨生长的作用。镜下见骨粉被逐渐吸收，进而分化成骨细胞通过膜内化骨成骨，而骨粉间充满富含细胞之结缔纤维组织，最后沉积钙质。这一过程是由外向内进行的即自骨缺损边缘向骨缺损中心进行。

术后一周(仅一只)：处死的白兔颅骨骨缺损处，大体观察见骨缺损边界清楚，暗红色。X线片见骨粉颗粒较清楚。组织学观察：经HE染色见骨缺损部位有大量骨粉颗粒，其间有大量淋巴细胞浸润，可见多核巨细胞，红细胞充满整个视野，未见成骨细胞分化。

术后三周：大体观察见骨缺损表面已覆盖有较厚的纤维结缔组织，创口愈合良好。组织学观察：实验组骨粉颗粒未被吸收，其周围包绕富含细胞纤维组织，骨粉周围该细胞含量更为丰富，靠近骨创边缘的骨粉部分被骨组织替代，骨陷窝内存在骨细胞，且骨粉间纤维结缔组织内有骨基质沉积。煅烧150℃骨粉组有较多的淋巴细胞浸润及多核巨细胞反应，而煅烧800℃骨粉组，不仅无此类炎症反应且骨生成较旺盛，成骨细胞数量较多，且活跃。可降解生物骨替代材料组，未见明显的骨形成，有大量的淋巴细胞浸润，且见有多核巨细胞。

术后六周：骨缺损处表面已恢复正常，触之较正常骨组织软。自然光下见骨缺损区透光性好，骨缺损区逐渐缩小，镜下见靠近骨创边缘成骨区增宽，有骨小梁生成，但骨髓成分较少。靠近中央部位多数骨粉颗粒被骨组织替代，形成骨组织，周围包绕富含细胞的纤维组织。未完全吸收的骨粉颗粒的周边部可见多核破骨细胞。骨粉逐渐被正常骨组织替代，骨粉颗粒内有纤维组织或血管长入，骨粉周边先形成骨组织，符合爬行替代学说。可降解生物骨替代材料组，骨缺损处长入大量的纤维组织，并有大量的淋巴细胞存在，未见有明显的骨生成。煅烧至150℃的骨粉组见骨粉部分吸收，残存的骨粉可见有网状结构，可能是残留的有机物质。

术后八周：骨缺损区有钙化不均匀的编织骨形成及骨小梁形成，其中骨髓细胞成分少，成骨细胞位于骨小梁周边部，数量较多，细胞为长梭形或多角形，核兰染。靠近缺损中央部位，仍可见有少量未被骨组织替代的骨粉颗粒，其周边包绕着纤维结缔组织，与术后三、六周时比较，骨粉颗粒颜色变浅，这可能是在体内逐渐被降解所致。另外骨粉内可见有血管或纤维结缔组织存在，即便是骨缺损中央部位也有骨组织形成。

术后十二周：煅烧至800℃实验组，骨缺损区大部分被骨组织替代，中央区仅见少许分散的骨粉颗粒，板层骨和编织骨的周围见血管和纤维结缔组织(见图9B)。而煅烧至150℃、500℃仍有骨粉颗粒存在，但均不完整，且不同程度的被骨组织替代，颗粒内有纤维组织和血管组织(内有红细胞)，骨粉边缘有破骨细胞，周边有骨组织生成。而可降解生物骨替代材料刺激骨生长情况很差，第十二周时仍未见有明显的新骨形成；未加骨粉组虽缺损边缘有新骨生成，但速度较加骨粉组慢，至12周骨缺损中央部位未见有新骨长入。加骨粉未加可降解生物膜组在第3周可见有少量新骨生成，其骨缺损中央部位被纤维组织充满，大体可见骨粉颗粒有移动现象，存留在缺损部位的骨粉被纤维组织包绕，体积均缩小、变形，至12周仍未见有明显的新骨生成，而骨粉均已消失(见图9A)。

(4)灰度测定：利用日产LuzEX-F型号的图像分析仪，进行骨量测定和灰度检测，每张样片分别取10个点，进行成骨面积的测量，取4个视野测量骨粉的面积及灰度测量，以观测新骨形成量和骨粉在不同时间吸收情况。结果表明，总体结果在新骨形成的量方面皮质骨组、煅烧至150℃、800℃的骨粉组骨形成量无明显差异，灰度测定同样没有差异。骨粉吸收方面经双因素方差分析皮质骨组、煅烧至800℃组与煅烧至150℃组相比有明显差异。骨粉吸收方面：皮质骨组与800℃组有明显差异，灰度测定也有明显差异，P＜0.05。

Claims (10)

1.一种引导骨组织再生的支架材料-煅烧骨粉。

2.权利要求1中所述的煅烧骨粉由下述方法制得：

A、取哺乳动物脊骨的松质骨部分切成小块；

B、将切成小块的骨进行水煮、干燥；

C、将水煮、干燥后的骨进行酸、碱处理，并用二次蒸馏水清洗数次，至PH值为7.0后干燥；

D、将上述制备好的牛脊骨，放入高温炉中在600-1000℃煅烧，的本发明。

3.权利要求2所述的煅烧骨粉的制备方法，其特征在于：将哺乳动物脊骨进行切块、水煮、干燥的方法是将脊骨切成10mm³小块，用清水冲洗数次，后投入锅中水煮4-5小时置于干燥箱中干燥，干燥后用粉碎机将骨粉碎成约为5mm³小块后放入锅中再次水煮2-5小时，期间换水3次，再次干燥。

4.权利要求2所述的煅烧骨粉的制备方法，其特征在于：所述的酸、碱处理方法是采用将水煮、干燥后的脊骨置入1M NaOH溶液中浸泡20-50分钟，置入30％H₂O₂中浸泡20-50分钟。

5.权利要求2所述的煅烧骨粉的制备方法，其特征在于高温炉煅烧过程中温度控制为600-1000℃，煅烧2-3次，每次3-5小时。

6.权利要求2所述的煅烧骨粉的制备方法，其特征在于高温炉煅烧过程中充入氧气。

7.权利要求1中的煅烧骨粉在骨缺损修补中的用途。

8.权利要求7中所述骨缺损为口腔颌面部骨缺损。

9.权利要求7中所述骨缺损为肘关节缺损。

10.权利要求7中所述骨缺损为脊椎骨缺损。

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