具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明,应当理解,此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明,并不用于限定本发明。
实验材料及主要试剂的来源与配制乙醇,北京化工厂;24孔超低贴附培养皿(Ultra Low ClusterPlate)Corning;48孔超低贴附培养皿,Corning;培养瓶(74Cm2,24Cm2),Corning;梯度冻存盒,Nalgene;细胞计数仪,Nucleocounter;酶标仪,Thermo;SD大鼠骨髓来源间充质干细胞(BMSC);自提基础培养基(BM),Gibco;成骨分化诱导培养基(OM),CYAGEN,美国;FBS,胎牛血清,Gibco。胰蛋白酶(0.25%),Gibco磷酸盐缓冲液(PBS)Gibco;DMSO, Sigma-Aldrich;CCK-8Dojindo,日本;BCA蛋白浓度定量试剂盒Beyotime;Dapi溶液Solarbio;Tritc Phalloidin罗丹明标记鬼笔环肽Solarbio;Goldner三色染色液Solarbio;活、死细胞活力毒性检测试剂盒,key Gen;ALP活性测定试剂盒Beyotime;TritonX-100Biotopped;多聚甲醛谷歌生物;二甲苯北京化工厂;TECHNOVIT7200树脂 EXAKT,德国;钙黄绿素Sigma;四环素Sigma;甲苯胺蓝染液谷歌生物;品红国药集团;
实验仪器
EBM S12电子束熔融设备;Arcam,德国便携式微弧氧化电源(JHMAO-220/6A)金弧绿宝,中国;扫描电子显微镜(SEM)Hitachi,日本;Micro-CT扫描仪Siemens USA;X-射线光电子谱分析仪(XPS)Kratos,UK;能量色散X射线谱仪(EDS)Philips,Netherlands X线衍射仪(XRD)Focus,Bruker;通用力学测试仪,MTS Inc,USA;电感耦合等离子体原子发射光谱分析,ICP-AES;硬组织切磨片机EXAKT,德国;脱水浸透仪EXAKT,德国;光固化包埋仪,EXAKT,德国;平行载片粘合压片装置,EXAKT,德国;干燥渗透再聚合装置,EXAKT,德国;塑料载玻片EXAKT,德国;甲基丙烯酸甲酯光聚合树脂 EXAKT,德国;TECHNOVIT 7210精密粘合剂EXAKT,德国;TECHNOVIT 4000黏合剂EXAKT,德国;砂纸EXAKT,德国;防冷却型外径千分尺EXAKT,德国;荧光显微镜Leica,德国;
主要试剂的配制:
基础培养基(BM,500ml);
Cyagen Mesenchymal stem cell basal medium(PT-3238)440ml;
Cyagen Mesenchymal cell growth supplement(P T-4106E)50ml;
Cyagen GA-100(PT-4504E)0.5ml;
Cyagen L-glutamine(PT-4107E)10ml;
成骨诱导培养基(OM,200ml);
Cyagen Osteogenic basal medium 175ml;
Cyagen Mesenchymal cell growth supplement 20ml;
Cyagen Penicillin/Streptomycin 2ml
Cyagen L-glutamine4 ml;
CyagenAscorbate 400μl;
Cyagen Dexamethasone 20μl;
Cyagenβ-glycerophosphate 2ml;
0.25%胰蛋白酶5ml;
细胞冻存液(10ml);
基础培养基7ml;
FBS胎牛血清2ml;
DMSO 1ml;
蛋白标准液(1mg/ml,10ml);
白蛋白10mg;
磷酸盐缓冲剂10mg;
十二烷基硫酸钠溶液(SDS,1%,10ml);
十二烷基硫酸钠1g;
磷酸盐缓冲液10ml;
多孔Ti6A4V假体的制备
本发明实施例采用的多孔钛合金支架为EBM(electron beam melting)快速成型技术制备而成,包括3种规格分别用于不同的试验检测,分别为:(1)直径10mm、高度5mm 的圆柱体,用于细胞实验;(2)直径5mm、高度6mm的圆柱体,用于材料表征、体外力学测试、细胞培养、植入实验等;(3)采用EBM技术制备直径10mm、厚度1mm的图片片状Ti6A14V材料用于表征。参见下表1。
假体依据CAD图像软件(CATIA以及INCAT USA)设计,内部孔径为640μm,其中支柱直径400μm,为具有钻石状晶格孔隙的圆柱体。设计完成导出CAD设计存为STL格式后使用Arcam EBM S12(ArcamAB,Sweden)设备进行样品的制备,样品的原材料为:Ti6A14VELIArcam标准粉末,粉粒的直径在45-100μm之间,采用电子束在真空环境下对粉末开始进行逐层的熔融打印,层厚0.1mm,成型后,充入氦气后自然冷却至 100℃,然后充入空气,并完成打印过程。
实施例1:光功能化仪器的结构与参数设计
参见附图1,提供了本发明的光功能化照射设备的一个实例,其参数满足:
1)光源由两组波段组成,一组365±20nm(365nm为峰值,下文简称365nm波段),一组270±20nm(270nm为峰值,下文简称270nm波段);光源是LED光源,体积小,方便紧凑排列,光源发射的紫外线波长通常以某一波长为主,相邻波长为辅,所以仅以峰值对光源进行描述;
2)照射时,腔任意位置能量分布:270nm波段照射能量大于2mw/cm2,365nm波段照射能量大于30mw/cm2,且均匀性大于80%;从至少两个角度、多个角度、优选全向角度发射紫外线,实现腔体内紫外线的能量分布较为均匀,最优选的情况下能够实现从所有角度照射;不同波段的紫外线可以单独照射,亦可以同时照射;
3)内腔具有至少1立方厘米的体积,能承受一定重量物体压迫,设置有开口;这个尺寸仅仅是示例性的,可以根据需要处理的结构大小进行适应新调整,在一些实施例中,六面体内腔尺寸≥3x3x4立方厘米。
一个优选实施例中,紫外线光源型号:365nm光源:CUN66B1B(Seoul);270nm光源:CUD7GF1A(Seoul)。光源排列,所有270nm与365nm灯珠的间距为5mm,均匀覆盖于照射面,如图1至图3所示。图1中示出了光功能化仪器的一个实物照片,其内部为六面体内腔,并打开了舱门,显示出内部和舱门上规则设置的led紫外灯珠,所述的光源排列仅仅是示例性的,灯珠的间距没有要求,只要能实现目标能量密度即可。
图3给出了光功能化仪器的使用状态,示出了光功能化仪器的内部结构,黑色箭头指示假体;红色箭头指示365nm波段紫外灯,白色箭头指示270nm波段紫外灯;
该光功能化仪器的结构仅仅是示例性,壳体的其他结构,例如圆柱体、正方体、非规则形状也是可行的。
光功能化仪器包括:壳体,壳体设置有容纳待处理钛合金结构件的腔体;紫外线灯,紫外线灯设置在所述壳体的内壁;控制面板,控制面板用于设置和显示紫外线的波长和处理时间。壳体具有可以打开的部分,内部用于将待照射的结构件放置其中;控制面板包括控制器和显示器,控制器用于控制照射的紫外线波长和时间,显示器用于使用者设置和读取程序的运行情况,一个优选实施例中,显示器是触摸屏,使用者可以进行输入设定。控制面板可以控制紫外灯的开关和时序,例如在六面体内腔的情况下,可以同时开启两种波长的紫外灯,也可以单独开启一个波段的紫外灯,或者控制不同波段的紫外灯交替照射;又例如,可以开启一个面,两个面或更多个面上的紫外灯,而不开启其他面上的紫外灯,还可以按照需求加上时序控制。
实施例2:使用本发明的光功能化仪器对钛合金材料进行光功能化处理及经处理钛合金材料实验检测
2.1实验分组与对应的处理
实验共分为5组,分别是为GC(对照组)、GL、G270、G365、GU。其中GC未接受光照处理,GL接受15分钟的紫外线高压汞灯照射;G270、G365和GU组为本发明仪器处理组,分别为接受270nm、365nm、270nm与365nm双波长照射,照射时间均为15分钟。
GC(对照组)处理流程:在实验室环境下(常温、常压、空气环境下)放置4周后,在无菌操作台上放置15分钟(不接受照射),并进行密封保存,24小时之内进行高压蒸汽灭菌及烘干,期间操作均使用金属器械,避免接触可能污染,并开始后续处理。
GL处理流程:假体制备后,在实验室环境下(常温、常压、空气环境下)放置4周后,在无菌操作台上接受高压汞灯(多波长峰值,包括270nm和365nm)照射15分钟,并进行密封保存,24小时之内进行高压蒸汽灭菌及烘干,期间操作均使用金属器械,避免接触可能污染,并开始后续处理。
G270、G365和GU(仪器照射处理组)标准流程:假体制备后,在实验室环境下(常温、常压、空气环境下)放置4周后,使用紫外线光功能化仪器用270nm或/与365nm两种波长的紫外线同时照射假体15分钟,并进行密封保存,24小时之内进行高压蒸汽灭菌及烘干,期间操作均使用金属器械,避免接触可能污染,并开始后续处理。
后续实验检测如下:
2.2物理化学测试:接触角测试、XPS、XRD等;
2.3体外细胞培养:细胞培养、ALP活性测试、细胞形态测试等;
2.4体内实验:处理后的假体进行兔股骨髁上假体植入术。
2.2物理化学表征测试
2.2.1亲水性测试接触角测试
采用座滴法(Sessile Drop)对3D打印钛合金(每组各10个)表面进行接触角测试并照相,并利用直接测量法测量出角度,后进行统计分析。
2.2.2扫描电子显微镜
经过处理后,使用金刚石锯从正中间切开多孔钛合金支架,用场发射的扫描电镜(FE-SEM:S-4800,hITACHI)分析3D打印多空金属支架内外部的表面形态。
2.2.3X射线光电子能谱
X-射线光电子能谱(XPS;250XI,Thermo escalab,USA)用于分析样品表面的化学组成。单色Al Kα(1486.6eV)为射线源,功率150W,500μm束斑,电荷校正采用污染碳 C1s=284.8eV进行校正。
2.4X射线衍射
采用X射线衍射技术(XRD;D8,ADVANCE,Bruker)对涂层进行物相分析,使用 Cu-Kα射线源,管电压为40kV,管电流为50mA,连续扫描模式,扫描速度为4°/min,衍射角2θ为10-80°。
2.2.5能量色散X-射线谱仪
采用能量色散X射线能谱仪(EDS:DX-4,Phililps,the Netherlands)来分析3D 打印钛合金表面的元素组成(Elemental Composition)。
2.3细胞培养
细胞生长培养基的制备:培养基在使用前需加入10%的胎牛血清和双抗,一般为血清。培养基分装成小瓶(100~200mL)以便使用,翻帽塞塞紧瓶口。按细胞生长需求,制备相应的生长培养基。一般的细胞生长培养基为培养基+10%胎牛血清,最后按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素),使青霉素和链霉素的终浓度分别为100U/mL和100 U/mL。
2.3.1SD大鼠骨髓来源间充质干细胞的培养与鉴定
BMSCs分离培养
取SD大鼠,颈椎脱臼法处死,浸泡于75%乙醇中约5-10分钟(min),无菌手术器械取出双侧股骨及胫骨,去除附着肌肉,将其浸泡于适量培养基中。取10ml针筒,在股骨及胫骨两端打各打2~3个孔,针筒吸取适量培养基插入一端干骺端,将骨髓中细胞冲至培养皿中,反复几次,直至股骨及胫骨发白,收集此细胞悬液,用200目金属滤网过滤去除稍大的杂质,将过滤后细胞悬液收集至离心管中,800r/min,5min离心,弃上清,加人适量α-MEM培养基混匀,接种于10cm塑料培养皿中,于37℃,体积分数5%CO2饱和湿度孵育箱中培48-72小时(h)后更换培养基,注意动作轻柔,此后每隔3天更换培养基1次,约9~12天后形成多个细胞集落,长满瓶底约70%~80%后可进行传代培养。
细胞传代
等待细胞达到80%的汇合度后进行再传代培养,我们首先要将培养瓶中培养液移出,接着加入适量的磷酸盐缓冲液(PBS)缓慢的清洗后弃液,再之后将培养瓶内部加入适量的 0.125%浓度的胰蛋白酶覆盖住细胞,在室温下来进行细胞消化,当我们在倒置显微镜下面观察细胞逐渐变为圆形,接着从培养瓶分离时,我们加入适量的基础培养基来中和胰蛋白酶,然后轻轻的敲打培养瓶从而使细胞脱离后,接着将细胞悬液在为800转/分钟(rpm)的条件下来离心5分钟,移出液体后,我们加入适量基础培养基,轻轻的吹打细胞团块重悬细胞,最后,我们将等量搅拌均匀的细胞悬液来分至培养瓶内部,补充适量的基础培养基后,再置于培养箱内部培养,培养环境需为温度37℃,二氧化碳浓度为5%,细胞培养到第3~5代时使用。
细胞鉴定
通过流式表面标记鉴定:成骨、成软骨、成脂肪三系的分化实验确定CD105、CD166、CD29和CD44的表达为阳性,CD14、CD34以及CD45的表达为阴性。
细胞计数
采用细胞计数板来进行细胞定量:首先将计数板及盖片擦拭干净,并将盖片盖在计数板;细胞消化步骤同前,在细胞重悬后,吸入100μl细胞悬液放置于Ep管内,用培养基稀释一定的倍数,然后移液枪将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片和计数板之间,静置3min(注意盖片下不要有气泡)最后计算板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方,根据公式计算(细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104×稀释倍数/ml)细胞数量,重复3次,取平均值。根据测定的细胞数量,再加入适量的基础培养基调整细胞浓度至5×104/600μl。
2.3.2细胞接种
将预先处理好的3D多孔钛合金内置物置于基础培养基中先浸泡30min,在浸泡完成后放置于48孔超低贴附的培养板内部,然后在每个支架上滴加600μl细胞悬液,用移液枪反复回吸和滴加,以便细胞悬液与支架均匀接触,培养至24小时使细胞的进一步贴附。
接种24h后换液,用于CKK8、细胞骨架、live/DeadViability,每孔分别加入600μl基础培养基,在用于成骨分化的检测实验的样品中,加入1ml的成骨诱导培养基,再每3天进行一次换液。
2.3.3细胞增殖
我们在接种后1天、3天和7天,分别对细胞的增殖活性(Cell proliferation)来进行检测。首先我们将培养板内的培养液吸出,加入1ml磷酸盐缓冲液(PBS)来清洗剩余的培养基1次,然后将支架分别移至24孔板内,每孔加入1ml的新鲜基础培养基以及 100μlCCK-8的试剂,我们将培养板放置于37℃条件下来孵育2h,待反应结束后,每孔吸出100μl加入96孔板,再使用酶标仪在450nm的波长下来测定吸光度。
活、死细胞活力毒性检测
细胞在支架接种3天后,对细胞的增殖活性(Cell proliferation)来进行观察。将培养板内的培养基吸出,加入1mlPBS液清洗支架上剩余的培养基,然后将支架分别移至24孔板内,每孔加入1ml Live/Dead工作液(2μM CalceinAM和8μM PI),室温孵育30min 后,吸出工作液,终止孵育。用PBS对支架清洗2遍(操作过程要轻柔),然后使用激光共聚焦显微镜观察标记细胞。
细胞骨架
细胞在支架接种3天后,对细胞的增殖活性(Cell proliferation)来进行观察。将培养板内的培养基吸出,加入1mlPBS液清洗支架上剩余的培养基,然后将支架分别移至24孔板内,吸掉培养液,在37℃条件下预热的1×PBS(PH7.4)清洗细胞2次;使用溶于PBS的4%甲醛溶液进行细胞固定,室温固定10min;室温条件下,用PBS清洗细胞2 次,每次10min;取1ml配置好的TRITC标记鬼笔环肽工作液,室温避光孵育30min;然后用PBS清洗支架3次,每次5min;使用1ml DAPI溶液(浓度:100nM)对细胞核进行复染10min;最后吸出染色液,用PBS清洗3遍,终止染色,使用激光共聚焦显微镜观察标记细胞。
2.3.4细胞碱性磷酸酶活性
细胞在3D打印支架接种24h后,更换成骨分化培养基继续培养,再每3天进行换液。在成骨分化培养基培养第7天与14天,检测3D多孔钛合金内置物上细胞的碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)的活性,并且测定细胞的总蛋白含量进行校正。碱性磷酸酶(ALP)的活性检测:首先我们使用磷酸盐缓冲液(PBS)来清洗待测样品两次,然后用1ml0.2%Triton X-100来裂解3D多孔钛合金内置物上的细胞;吸取细胞裂解液来检测ALP的活性;我们依照实验的说明来配制检测缓冲液、显色底物溶解(para-nitrophenylphosphate,pNPP)以及标准品的工作液,然后稀释标准品(p-nitrophenol)为0.002μmol;依照实验的说明我们将每孔分别加入待测的样品,底物溶液、检测缓冲液以及标准品,在 37℃的条件下孵育5min,然后在405nm的波长下读取吸光值,并且计算碱性磷酸酶(ALP)的DEA活性单位,碱性磷酸酶(ALP)的DEA活性单位来定义为在pH9.8的 diethanoamine(DEA)缓冲液中,37℃的条件下,每分钟的水解pNPP显色底物生成1μmnol p-nitrophenol所需ALP的量定义为一个酶活力的单位,也被称作为一个DEA的酶活力单位。
细胞总蛋白定量,首先我们使用磷酸盐缓冲液(PBS)来清洗待测样品两次,然后用1ml 0.2%Triton X-100裂解3D多孔钛合金内置物上的细胞,将细胞裂解液稀释至15倍后进行检测:按照实验说明来配制蛋白的定量工作液(Micro BCAWoriking Reagent),并且,我们将标准品稀释至200μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1μg/ml以及0.5μg/ml,来建立300μl的反应体系,我们将每孔分别加入150μl的标准品或者待测样品,然后向每孔分别加入150μl的工作液,搅拌均匀后进行封孔膜密封,在37℃条件下来孵育2小时,然后在562nm的波长下,再读取吸光值,并用BCA测得的总蛋白含量对于ALP活性行标准化处理。
2.3.5细胞形态分析
细胞的接种在3天后,采用扫描电镜(SEM)来观察细胞在3D多孔钛合金内置物上的粘附情况,具体的步骤如下:细胞在支架接种3天后,将培养板内的培养基吸出,加入1mlPBS液清洗支架上剩余的培养基,然后将支架分别移至24孔板内,吸掉培养液,用PBS(PH7.4)清洗细胞2次;首先,用3%戊二醛在4℃的条件下来固定2h;0.18M 的蔗糖冲洗液在4℃条件下固定2h;1%的锇酸在4℃的条件下固定2小时;接着,梯度乙醇(30%,50%,70%,90%,100%)脱水3次,每次15min;然后将乙醇异戊脂置换20min;在临界点干燥;对待测样品进行喷金,采用SEM观察。
2.3.6力学特性测试
为了测试紫外线光功能化处理对3D多孔钛合金支架压缩强度造成的影响,运用通用力学测试机(Landmark,MTS Inc.MN,USA)来对处理前后的3D多孔钛合金支架进行静态压缩的测试。测试的样品为直径5mm,高度为6mm的3D打印圆柱金属支架,压缩过程中的形变率为1.8mm/分,每组测试的样品数量为5个,测试数据自动的生成为应力-应变曲线(Stress-strain curve),从而,分析得到的弹性模量(Elastic modulus)、屈服强度(Yieldstrength)以及压缩强度(Compression strength)。
2.4体内实验
兔股骨髁植入的实验,评价紫外线光功能化的体内生物的相容性,以及骨整合的性能。本次实验所采用的实验动物,均有由北京维通利华公司所提供,所有的实验方案均已通过北京大学医学部的伦理委员会审批(LA2014214通过,动物实验的操作和饲养均符合国家实验动物的饲养和使用指南。
2.4.1兔股骨骼植入实验
实验设计:考虑到实验的成本效益和实验动物“3R”的原则(Reduction,Replacement, Refinement),所以,我们选择新西兰的大白兔作为本次实验动物的初步评估紫外线光功能化对3D打印多孔钛合金内置物骨整合性能造成的影响,尽管这样,我们根据兔股骨骼的解剖特点(兔股骨骼的前后径大约为12-15mm),再将兔股骨的内侧骼所造的骨缺损大小为5mm,以及模拟极限骨缺损的模型(Critical bone defect)。据文献统计,正常的兔骨愈合的骨重塑发生于3周至8周,8周时骨重塑已经大部分都完成,从而,在本研究中,我们观察的时间点选择为植入术后8周,而且为了动态反应的3D打印多孔钛合金植入物植入术后骨整合的过程,将分别在术后第3周及第7周分别皮下注射钙黄绿素和四环素来标记不同的时期骨生成的情况。
手术方法:雄性新西兰大白兔,随机分组,采用胺碘酮50mg/kg肌肉来注射麻醉,双侧的股骨外侧髁备皮,用0.5%的碘伏进行消毒,然后,纵行切开皮肤皮下至骨膜面,接着采用尖刀片来刮涂附着的骨膜,并且,定位股骨骼部,我们采用5mm直径的电钻,在生理盐水冷却下在股骨髁造一个直径为5mm的骨缺损,然后用生理盐水来冲洗局部,再将假体植入骨缺损的地方,接着采用4#的抗菌薇乔线逐涂层间断缝合肌肉层、筋膜层和皮肤。术后3天再采用青霉素40万单位肌肉来注射预防感染。
2.4.2序贯荧光素标记
为了能够动态的观察3D多孔钛合金内置物骨整合的详细过程,我们分别采用钙黄绿素(Calcein)和四环素(Tetracycline)序贯荧光标记(Sequential fluorescentlabeling)3周以及7周的骨生成的情况,我们采用试剂的配制和给药时间(如表2),给药前的试剂采用为0.2μm的过滤器来进行消毒,给药的途径采用为皮下注射的方式,手术后3周和7周的生成骨分别被标记为绿色和黄色。
注射时间 |
3周 |
8周 |
试剂名称 |
钙黄绿素(Calcein) |
四环素(Tetracycline) |
注射剂量 |
10mg/Kg |
30mg/Kg |
试剂配制 |
IgCalcein+2gNaHCO2+100mLH2O |
3gTetracycline+2gNa2HPO2+100mLH2O |
表2.荧光素标记的试剂配制和给药计划
3.5.3Micro-CT扫描
我们在术后8周后,首先以过量的苯巴比妥钠杀死实验的动物,接着剥离股骨骼,然后将植入的标本分为两部分分别进行处理,我们将标本置于-80℃的冷冻保存,
2.5实验结果
2.5.1亲水性测试:接触角测量
在接触角测试中可以直观的看到(图4),实验组(GU)的亲水性较对照组(GC)有明显升高。经测量,GU组的接触角θ(θ=60.3±0.05)明显低于用GC组(θ=90.1± 2.41),且p<0.05,有明显统计学差异。GL、G270、G365与GC组相比,有明显统计学差异(p<0.05);GL、G270、G365与GU组相比,GU组的接触角最小,有明显统计学差异(p<0.05)。
2.5.2 SEM与EDS分析涂层的形貌特征和元素比例
图5显示了经过紫外线光功能化处理前后,4个对照组(GL、G270、G365、GU)的表面形貌的变化,相对于对照组(GC),我们观察到更多的复杂形貌和表面微孔形成;进一步地,相对于GL、G270和G365,在GU组,观察到最多的表面微孔形成。
在金属支架内部确定的EDS选择区域提示了钛合金表面的元素组成由Ti、O以及少量 Al、V、C组成,如图6A~E。而且值得注意的是,如图6F~J,EDS确定的对照组(GC)与4个光功能化处理组(GL、G270、G365、GU)内表面不同化学元素(C、O、AL、Ti、 V)的原子质量百分比,相对于对照组(GC),光功能化处理过的4组(GL、G270、G365、GU)的碳(元素C)含量减少,且p<0.05,有明显统计学差异(图6F);GC与GU组有明显统计学差异(p<0.01);且GL、G270、G365与GU组相比,GU组的碳含量最少,有明显统计学差异(p<0.05);而其他元素如Ti、O、Al|、V均无明显差异(p>0.05)。
总体而言,经过紫外线光功能化处理的实验组,出现了表面形貌变化和C元素的减少;且GU组的碳含量最少、表面形貌变化最大,另外图6G还显示了使用本发明的照射仪所进行的单波段照射G365在假体内部形成了相对于GL的显著优势,多角度照射对于假体内部孔径表面的光功能化有明显益处。
2.5.3 XPS分析钛合金表面的化学组成
图7显示经XPS检测后紫外线光功能化处理前后的化学组成以及状态。根据全谱及分峰拟合的结果,主要表面的元素为O、Ti、C。
对5组中的C元素和O元素进行分析,可以得到两种元素所处的化学环境及不同化学环境的元素所占的相对比例如表所示。对C元素的窄扫谱进行分峰拟合(如图7B、7E、7H、7K、7N)可以得到三个峰:C-C峰对应结合能为284.82eV,C-O峰对应结合能为286.41eV, C=O峰对应结合能为288.41eV。不同样品对应的峰位会略有差异。不同样品中三种化学环境的C元素的相对比例如表3所示。对O元素的窄扫谱进行分峰拟合(如图7C、7F、7I、 7L、7O)可以得到三个峰:O-Ti(TiO2)峰对应的结合能为529.99eV,O-C峰对应的结合能为531.89eV,O=C峰对应的结合能为532.99eV。不同样品对应的峰位会略有差异。5组样品中三种化学环境的O元素的相对比例如表4所示。
表3:5组样本不同化学环境的C元素所占相对比例
|
GC(%) |
GL(%) |
G270(%) |
G365(%) |
GU(%) |
C-C |
87.45 |
86.87 |
81.28 |
83.07 |
81.72 |
C-O |
6.13 |
5.64 |
10.63 |
10.64 |
14.8 |
C=O |
6.42 |
7.49 |
8.09 |
6.29 |
3.48 |
表4:5组样本不同化学环境的O元素所占相对比例
|
GC(%) |
GL(%) |
G270(%) |
G365(%) |
GU(%) |
O-Ti(TiO2) |
44 |
53.17 |
61.28 |
66.14 |
53.9 |
O-C |
51.92 |
44.39 |
35.24 |
30.53 |
41.4 |
O=C |
4.08 |
2.43 |
3.48 |
3.33 |
4.69 |
综上所述,提示3D打印多孔钛合金表面在紫外线处理前后均由二氧化钛以及碳氧化合物组成。
2.5.4 XRD物相构成的测试
如图8,XRD结果显示了3D打印钛合金支架经过紫外线光功能化处理前后的物相组成。5个组均可以看到基体钛产生的多个衍射峰(1峰,即Ti6AL4V)和少量碳元素(C)的存在,但是4个光功能化处理组(GL、G270、G365、GU)均发现了更多氧化物的形成(AL2O3)。Ti6AL4V为主相,代表的衍射峰有2θ=35.921゜,2θ=39.010゜,2θ=41.166゜,2θ=53.921 ゜,2θ=64.677゜,2θ=72.030゜,2θ=77.923゜和2θ=79.549゜分别对应于(200)晶面、(002)晶面、(201)晶面、(202)晶面、(220)晶面、(203)晶面、(222)晶面和(401)晶面。
2.5.5细胞相容性CCK8活性测试与Live-Dead荧光测试
在5组3D打印金属支架上进行骨髓间充质干细胞的培养1天、3天、7天后,通过测定孔隙金属表面的细胞活性(增殖率)来评估细胞的相容性。如图9A,在共培养3天和7 天两个时间点,细胞增殖率比较差别具有一致性:GU组较GC、GL、G365组有明显升高,且差异有统计学意义(P<0.01);GU组较G270有明显升高,且差异有统计学意义(P<0.05); GL和G270也存在明显统计学差异(P<0.05),说明双波段紫外线处理相对于单波段处理具有显著优势。而在Live-Dead荧光测试中(图9E),可以直观看到G270、G365、GU组相对GC和GL组在3D打印金属支架表面的活细胞数目更多,证明本发明仪器和方法提供了更加均匀的多角度照射,比现有的汞灯照射效果好。
2.5.6 ALP活性
ALP活性测试(如图9B)显示,在7天时,5组间无明显统计学差异(P>0.05);在 14天时,GU组相对于GC和GL组具备更高的碱性磷酸酶活性,差异具备统计学意义(P <0.01);GU组相对于G365也具备更高的碱性磷酸酶活性,差异具备统计学意义(P<0.05); GL与G270组相对,有明显统计学差异(P<0.01);而G270与GU组无明显统计学差异(P>0.05)。
2.5.7细胞形态
细胞形态学实验结果(图9D)可以直观看到,在3D打印支架上,相对于GC组,GL、G270、G365和GU组的细胞的增殖和附着更多,铺展面积更大,更多的细胞伪足的伸展;而使用全方位照射的光功能化组(G270、G365、GU)细胞在3D打印支架内部的附着更多。
支架细胞共培养的SEM结果显示光功能化处理组(GL、G270、G365、GU)在假体表面出现更多的胶原纤维附着,如图9C。值得注意的是,在10000倍电子显微镜下,GU组观察到大量的胶原纤维附着(图10)。
2.5.8紫外线光功能化对于多孔钛合金支架力学特性的影响
图11显示了紫外线光功能化处理前后的力学特性的表现,通过压缩测试,在屈服强度(图11A)、弹性模量(图11B)、压缩强度(图11C)进行比较,GC、GL、G270、G365、 GU)5组间均没有明显统计学差异(p>0.05);应力应变曲线(图11D)5组也基本一致。
2.5.9骨缺损修复实验结果
所有实验动物在术中未出现异常,术后恢复情况良好,无明显严重并发症出现,实施麻醉安乐死后,切开手术部位,大体观察见局部无炎症的迹象,手术部位无感染及植入物脱出等。
2.5.10 Micro-CT分析
其中3D打印的钛合金支架为白色,骨组织为绿色。根据图12A~E直观可见,光功能化处理组(GU)相对于对照组(GC)有更多的骨组织长入,几乎长满了假体的内部孔隙。如图12F,GU的骨体积分数(骨长入率BIR),GC组、GL组、G270组、G365组、GU 组分别为(43.33±5.08)%、(61.03±3.44)%、(74.44±1.90)%、(66.16±1.52)%、(75.53±1.40)%,GC与光功能化处理组(GL、G270、G365、GU)、GL与GU、G365 和GU之间有明显统计学差异(P<0.05)。相比于汞灯照射,本发明的仪器的单波段照射实现了更好的效果,双波段紫外线比单波段紫外线照射效果显著更好。
2.5.11组织学分析
我们采用Goldner三色染色对多孔支架的骨长入进行组织学分析,染色后在光镜下多孔支架的支柱是黑色的,而矿化的骨小梁绿色的,类骨质为黄色。
植入兔股骨髁8周后,GC和GL两组仅在周边有骨长入,并且生成的骨组织与多孔支架没有紧密的接触;相反,在G270、G365和GU组的多孔钛合金支架上可以发现更广泛的骨长入,新生骨组织与钛合金支架紧密结合,并且矿化形成骨质,如图13A。
骨长入的定量分析结果,如图13B和13C,分别比较了5组在植入8周后的骨长入(BI)、骨/假体接触率(BICR),类骨质和矿化骨比例。
5组(GC、GL、G270、G365、GU)的BI分别为(14.56±1.15)%、(10.58±0.91)%、(24.7±1.74)%、(19.22±3.26)%、(25.04±1.29)%,GC、GL与GU组有明显统计学差异(P<0.01);G270与GU无明显统计学差异(P>0.05);G365与GU组有明显统计学差异(P<0.05),如图13B。
5组(GC、GL、G270、G365、GU)的BICR分别为(15.14±0.67)%、(10.26±1.00)%、(32.04±1.12)%、(18.56±1.65)%、(41.66±1.64)%,GC、GL与GU组有明显统计学差异(P<0.01);G270与GU有明显统计学差异(P<0.05);G365与GU组有明显统计学差异(P<0.01),如图13B。
5组(GC、GL、G270、G365、GU)的类骨质比例分别为(55.08±4.06)%、(63.3 ±10.85)%、(29.42±4.02)%、(40.94±8.61)%、(20.62±1.59)%,GC、GL与GU 组有明显统计学差异(P<0.01);G270与GU无明显统计学差异(P>0.05);G365与GU 组有明显统计学差异(P<0.05),如图13C。
5组(GC、GL、G270、G365、GU)的矿化骨比例分别为(44.68±4.64)%、(35.02 ±10.41)%、(70.58±4.02)%、(59.06±8.61)%、(79.38±1.59)%,GC、GL与GU 组有明显统计学差异(P<0.01);G270与GU无明显统计学差异(P>0.05);G365与GU 组有明显统计学差异(P<0.05),如图13C。
相比于汞灯照射,本发明的仪器的单波段照射实现了更好的效果,双波段紫外线比单波段紫外线照射效果显著更好。
2.5.12骨荧光标记
体内的序贯荧光标记显示是否经过紫外线光功能化处理的假体植入后呈现随不同时间点表现出的不同的骨整合模式。
图13D中,钛合金假体颜色为白色,绿色荧光为3周的成骨,而红色代表8周的成骨。根据荧光标记可以直观的看到,在钛合金假体内部,G270、G365和GU组中,3周的成骨更多见。而GC和GL组的呈现更多的是8周的成骨。
2.5.13推出实验
图14显示对照组GC与实验组GU在兔股骨髁假体植入术后8周进行推出实验的结果。如图14A,GC、GL、G270、G365、GU 5组的最大推出力分别为:250.3±16.6、271.7 ±19.9、391.2±16.7、301.7±10.2、450.5±18.5;GC、GL、G365相比GU组有明显统计学差异(P<0.01);G270与GU组有明显统计学差异(P<0.05);GL与G270组有明显统计学差异(P<0.01);如图14B,轴向推出力与位移曲线显示,G270和GU组相对于GC、 GL、G365组,为了产生相同的位移,假体需要更大的推出力。
根据以上实施例可知,紫外线C(270nm波段)和紫外线A(365nm波段)紫外线对钛合金假体的光功能化各自具有不同方向的独特效果,通过使用双波段的紫外线处理可以获得相对于单独波段处理的显著效果;本发明的光功能化仪器能够通过多个紫外线光源实现对钛合金表面的均匀处理,效果远超现有的汞灯;光功能化仪器内单波段多角度的紫外线光源和均匀的功率可以对内部有孔的结构实现外部和内部光功能化处理,效果远超现有的汞灯。
实施例3
使用多孔钛合金假体,其他实验方法如前所述,本发明人还进行了不同照射方法和时间的处理实验对比,每组使用三个假体,第一组,使用270nm紫外线波段照射处理30分钟;第二组,使用365nm紫外线波段照射处理30分钟;第三组,使用270nm紫外线波段和365nm紫外线波段依次交替照射1分钟,一共持续照射30分钟;第四组,使用270nm紫外线波段和365nm紫外线波段依次交替照射5分钟一共持续照射30分钟;第五组,使用270nm紫外线波段和365nm紫外线波段同时照射15分钟;第六组,使用270nm紫外线波段照射处理60分钟;第二组,使用365nm紫外线波段照射处理60分钟;
扫描电子显微镜观察对比五组的处理结果,第三组、第四组、第五组之间差别不大,未见明显差别,第三组、第四组、第五组与第一组和第二组之间均有明显差别,第六组和第一组之间几乎没有差别,第七组和第二之间几乎没有差别,实验数据未示出。
通过实施例3可以知晓,使用两个波段的紫外线的照射时间如何设置对于结果没有显著影响,即,UVA和UVC同时照射、交替照射、甚至先后照射对改性的影响很小;另外通过结合单波段15分钟处理结果,对比处理30分钟和60分钟的假体,发现15分钟之后,单一波段的处理已经基本不再继续产生影响,假体的表面形态基本不再变化。
实施例4
使用多孔钛合金假体,其他实验方法如前所述,本发明人还进行了UVA和UVC波段内不同波长的处理实验对比,每组使用3个假体,第1组,使用200±20nm紫外线波段和 365±20nm紫外线波段同时照射15分钟;第2组,使用240±20nm紫外线波段和365±20nm 紫外线同时照射15分钟;第3组,使用270±20nm紫外线波段和365±20nm紫外线波段同时照射15分钟;第4组,使用270±20nm紫外线波段和340±20nm紫外线波段同时照射15 分钟;第5组,使用270±20nm紫外线波段和380±20nm紫外线波段同时照射15分钟;
扫描电子显微镜观察对比3组的处理结果,组之间未见明显差异,说明在波段之内的紫外线有类似的效果,可以根据需求选择该波段之内的合适波长。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。