CN113136202A - 一种荧光蚕丝材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种荧光蚕丝材料的制备方法，从转基因家蚕品种的蚕茧中提取DsRed1蛋白、超滤浓缩后得到DsRed1浓缩液；对所述DsRed1浓缩液进行碱性蛋白酶灭活得到荧光蛋白溶液；对所述荧光蛋白溶液与丝素蛋白溶液混合后冷冻干燥得到DsRed1/Fibroin冻干复合物；简化了荧光蚕丝材料的制备过程，提高外源蛋白，尤其是红色荧光蛋白的表达效率与生物活性，降低生产成本。

Description

一种荧光蚕丝材料的制备方法
技术领域
本发明应用于生物技术领域，具体涉及一种荧光蚕丝材料的制备方法。
背景技术
随着21世纪生物工程以及基因工程的迅速发展，人们对医用、药用、食用、美容、保健等各种用途的功能性蛋白需求量日益增大，依靠天然来源的蛋白质提取和生产已无法满足快速增长的市场需求。建立和完善各种高效的原核和真核表达系统，并利用菌株、细胞和昆虫等作为宿主生物反应器，是实现低成本、规模化生产具有生物学活性的重组外源蛋白的有效和可持续方法，并成为当今世界研究的热点。利用中国仓鼠卵巢细胞作为生物反应器生产外源蛋白是目前最为标准的表达模式，但其运营成本和对环境的要求极为苛刻，严重限制了其大规模推广应用。为了建立低成本、规模化、安全可持续的高效生产外源蛋白的生物工厂，自2000年以来，科研人员开始尝试利用转基因生物，如哺乳动物、鸟类、昆虫以及植物的器官作为生物反应器来生产重组外源蛋白。
家蚕以泌丝著称，是最早被人类所完全驯化利用的经济动物(昆虫)之一。绢丝腺是合成、分泌蚕丝蛋白的唯一器官，为整个蚕丝业的生物学基础。经过数千年的人工驯化，家蚕的绢丝腺具备了超强的蛋白质合成与分泌能力，一头体重5g左右家蚕能合成分泌约0.5g蚕丝蛋白，为目前已知昆虫之最。蚕丝蛋白主要由丝素蛋白(fibroin)和覆被在其外层的丝胶蛋白(sericin)构成：丝素蛋白是蚕丝的主体，约占75％，由蚕的后部丝腺合成，包括fib-H链、fib-L链和P25三种主要组分，均不溶于水；其余为丝胶蛋白，约占25％，由蚕的中部丝腺合成，包括丝胶1(Sericin1)、丝胶2(Sericin2)和丝胶3(Sericin3)三种主要组分，其中又以丝胶1蛋白含量最高，均可溶于水。随着现代分子生物学和转基因技术的发展，家蚕绢丝腺的高效合成与分泌丝蛋白这一特征，以及所具备的糖基化、甲基化等对外源蛋白保持活性极其重要的蛋白质翻译后修饰加工能力，饲养成本低，可工厂化生产，对人畜安全等特点，使其成为理想的生物反应器模型，备受各国研究人员关注并竞相开发利用。
从1962年下村修等在名为Aequorea victoria的水母体内发现并分离得到最早的荧光蛋白绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)开始，人们对于荧光蛋白的进一步研究和应用都没有停止过。近年来，国内外利用piggyBac转座子介导的转基因技术以及家蚕组织特异启动子元件在丝腺中尝试表达了多个外源蛋白，包括：在后部丝腺表达了丝素重链融合的EGFP(Zhao et al.2010)、猫干扰素(Kurihara et al.2007)、增强型绿色荧光蛋白(Kojima et al.2007)、蜘蛛丝牵引蛋白(Zhu et al.2010)，丝素轻链融合的人Ⅲ型胶原蛋白的部分肽段(Tomita et al.2003)、增强型绿色荧光蛋白(Tomita etal.2003)、羟基脯氨酸胶原部分肽段(Adachi et al.2006)、成纤维细胞生长因子(Hino etal.2006)、部分胶原蛋白肽段(Yanagisawa et al.2007)，以及P25融合的红色荧光蛋白(Royer et al.2005)等。但上述研究成果的产业化推进颇为困难，主要原因在于：这类丝素重链表达系统由于调控元件较为单一，并且外源蛋白需要与内源丝蛋白进行融合才能实现分泌表达，对外源蛋白的表达量和生物活性产生不利影响，研究人员尝试过蛋白复性策略，但是流程繁琐且收效甚微，因而极大的限制的丝素重链表达系统的应用。
荧光蚕丝作为一种新型的生物功能材料，在组织工程、生物成像、智能服装、生物电子等领域展现出巨大的应用前景，但目前荧光蚕丝多采用后处理改性的方式对蚕丝进行染色，不但不环保，而且蚕丝的光稳定性和生物相容性差；现有的基因改性方法也多采用外源蛋白与内源丝蛋白融合的方式，制备过程繁琐，成本高，难以大规模推广应用。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述问题，提供一种荧光蚕丝材料的制备方法，简化荧光蚕丝材料的制备过程，提高外源蛋白，尤其是红色荧光蛋白的表达效率与生物活性，降低生产成本。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：
一种荧光蚕丝材料的制备方法：从转基因家蚕品种的蚕茧中提取DsRed1蛋白、超滤浓缩后得到DsRed1浓缩液；对所述DsRed1浓缩液进行碱性蛋白酶灭活得到荧光蛋白溶液；对所述荧光蛋白溶液与丝素蛋白溶液混合后冷冻干燥得到DsRed1/Fibroin冻干复合物。
进一步的，所述DsRed1蛋白的提取过程为：将转基因家蚕品种的蚕茧加入研磨机粉碎，将粉碎后的蚕茧溶解于含有碱性蛋白酶的Tris-HCl溶液中，在50℃-55℃下提取；提取后进行过滤后收集滤液，然后分别用滤纸、微孔滤膜进行再次过滤得到DsRed1提取液。
进一步的，所述碱性蛋白酶的加入量为所述Tris-HCl溶液质量的0.3％。
进一步的，所述DsRed1蛋白提取时蚕茧与溶液的浴比为10-25mg/mL。
进一步的，所述碱性蛋白酶灭活的过程为：将DsRed1浓缩液分别在25℃-75℃的条件下进行水浴。
进一步的，将经碱性蛋白酶灭活处理后得到的所述荧光蛋白溶液在-20℃环境中冷冻过夜，冷冻干燥得到DsRed1冻干粉。
进一步的，所述DsRed1浓缩液在-20℃环境中冷冻6小时-12小时。
进一步的，所述丝素蛋白溶液的制备方法为：将两广二号蚕茧置于0.2％Na2CO3溶液中经沸水浴脱胶后，用去离子水洗涤干净并干燥；然后将脱胶后的蚕丝用LiBr溶液置于65℃烘箱进行溶解，溶解后的丝素溶液用截留分子量为10kDa的透析袋置于去离子水中透析，将透析后的丝素溶液经离心后取上清获得丝素蛋白溶液。
进一步的，脱胶后的蚕丝与LiBr溶液的比例为1g：20ml。
进一步的，透析时每隔3-6小时更换一次去离子水，更换4-6次完成透析。
进一步的，所述冷冻干燥过程为将所述荧光蛋白溶液与丝素蛋白溶液混合均匀后放置于-20℃环境中冷冻12h，然后在-80℃下冷冻24h。
进一步的，将所述DsRed1/Fibroin冻干复合物以质量2.5％的比例溶解于去离子水中，然后将混合溶液加入成膜容器，干燥得到DsRed1/Fibroin膜材料。
进一步的，将所述DsRed1/Fibroin冻干复合物以质量2.5％的比例溶解于去离子水中，将混合溶液在所需材料上进行喷涂，干燥后得到DsRed1/Fibroin荧光图案。
采用注射器、喷枪、喷射器等将混合溶液在所需材料上进行喷涂形成所需的荧光图案。
进一步的，将所述DsRed1冻干粉以质量0.1％的比例溶解于蛋白浓度为2％的丝素蛋白溶液中，然后将溶液放置于4℃冰箱，并静置3-5天，形成DsRed1/Fibroin凝胶材料。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1)本发明建立了一种荧光蚕丝材料的制备方法，DsRed1蛋白的生产不需要内源丝蛋白进行融合即可实现大规模生产，制备方法简单，提高了荧光蛋白的产率，1g LG-HFRS-F2的蚕茧最终可以获得8mg的DsRed1蛋白，可实现DsRed1蛋白的大规模工业化生产。
2)本发明荧光蚕丝材料制备工艺简单易操作，适合规模化生产，不需要后期进行蚕丝染色，环保无毒性，光稳定性和生物相容性好。
附图说明
图1为本发明一种荧光蚕丝材料的制备方法中荧光蛋白转基因家蚕品种的培育过程。
图2为本发明一种荧光蚕丝材料的制备方法DsRed1蛋白提取过程中的颜色变化图。
图3为本发明一种荧光蚕丝材料的制备方法中DsRed1提取液蛋白电泳检测图。
图4为本发明一种荧光蚕丝材料的制备方法中DsRed1浓缩液荧光强度检测图及不同状态光照示意图。
其中，A为不同温度水浴处理后DsRed1浓缩液荧光强度检测图，B为不同温度水浴处理后DsRed1浓缩液相对荧光强度，C为不同温度水浴处理后DsRed1浓缩液在白光下的颜色变化照片，D为不同温度水浴处理后DsRed1浓缩液在蓝色LED灯下的颜色变化照片。
图5为本发明一种荧光蚕丝材料的制备方法中荧光蛋白溶液蛋白电泳检测图。
图6为本发明一种荧光蚕丝材料的制备方法过程中的颜色变化图。
图7为本发明一种荧光蚕丝材料的制备方法中丝素膜在荧光显微镜下的照片图及丝素图案在Blue-LED灯及白光下的照片图。
其中，图A为丝素膜在荧光显微镜下的照片图，图B为丝素图案在Blue-LED灯及白光下的照片图。
图8为本发明一种荧光蚕丝材料的制备方法中DsRed1/Fibroin凝胶及其对照样在Blue-LED灯及白光下的照片图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
实施例1：荧光蛋白转基因家蚕品种的培育
参见附图1，将构建的生产荧光蛋白的家蚕品系HFRS与家蚕品系“两广二号”LG进行杂交得到F1代，将F1代家蚕饲养至结茧后，将F1代家蚕进行自交得到F2代，在F2代结茧后选取茧色为粉红色的个体作为转基因家蚕品种，命名为LG-HFRS-F2。本发明中选用的生产荧光蛋白的家蚕品系HFRS为按照专利号为2021103128740的发明专利中方法培育得到的家蚕品系；选用的家蚕品系“两广二号”LG为市场上常规“两广二号”家蚕。家蚕饲养温度为26℃，食物为桑叶。
F2代家蚕结茧后蚕茧有四种颜色，分别为粉红色、橙色、黄色和白色，其中粉红色蚕茧的家蚕高产荧光蛋白，因此后续选用粉红色蚕茧的个体作为转基因家蚕品种。
实施例2：DsRed1蛋白的提取
参见附图2，将实施例1中转基因家蚕品种LG-HFRS-F2的蚕茧加入研磨机粉碎，将粉碎后的蚕茧以10-25mg/mL的浴比溶解于含有0.3％碱性蛋白酶(1：200000)的20mM Tris-HCl(pH 9.0)溶液中，放置在50℃-55℃水浴锅中进行提取大于等于2h；提取后在18000rpm下离心10min过滤，过滤后收集滤液，然后分别用滤纸、0.45μm的微孔滤膜进行再次过滤得到DsRed1提取液。
参见附图3，将得到的DsRed1提取液利用蛋白电泳检测，分别可以看到DsRed1蛋白单体和四聚体大小的条带，表明DsRed1蛋白在LG-HFRS-F2蚕丝中以四聚体的形式存在。通过Image J软件对提取液中的纯度进行了灰度分析，DsRed1在DsRed1提取液中的纯度为82.18％。
实施例3：碱性蛋白酶的灭活
将实施例2得到的DsRed1提取液用50000MWCO超滤管(截留分子量小于等于50000MWCO的超滤管均可)进行浓缩，得到DsRed1浓缩液。
将含有DsRed1蛋白的碱性蛋白酶浓缩液，在25℃-75℃的条件下进行水浴，水浴时间分别为3小时-24小时，进行碱性蛋白酶灭活得到荧光蛋白溶液。将丝素粉以2.5％的比例分别与水浴后的提取液进行混合溶解，用4-20％梯度丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，看丝素蛋白是否完整或降解。
参见附图4，对得到的DsRed1浓缩液分别选用25℃、65℃、70℃、80℃进行水浴处理24h后，对荧光强度进行检测，可以看出，与25℃处理组相比DsRed1蛋白的荧光强度，70℃和80℃组显著降低，65℃组与25℃组没有显著差异(如图4A所示)。以25℃组处理24h后的DsRed1蛋白活性为100％，通过荧光强度对比分析，80℃处理24小时组的DsRed1蛋白的活性显著失活，仅为17.41％；70℃组能保留90.42％的活性；65℃组的活性为98.85％(如图4B所示)。
对碱性蛋白酶灭活后的荧光蛋白溶液进行光照观察，可见不同温度处理24h后的样品进行白光下观察发现，25℃组、65℃组和70℃组溶液为粉红色，80℃组颜色明显变浅(如图4C所示)，不同温度处理24h后的样品在蓝色LED灯下观察，25℃组、65℃组和70℃组溶液透过橙色滤光片后呈亮黄色，80℃组荧光强度明显变弱(如图4D所示)。为了探究温度和时间对于碱性蛋白酶活性的影响，将丝素粉以2.5％的比例分别与水浴后的提取液进行混合溶解，用4-20％梯度丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，看丝素蛋白是否完整或降解。参见附图5，对碱性蛋白酶灭活后的荧光蛋白溶液在25℃、65℃、70℃和80℃分别处理3h和24h处理后的样品中按2.5％的比例添加丝素粉充分溶解，以2.5％的丝素水溶液为对照，蛋白电泳检测结果分析表明65℃、70℃和80℃处理24h后电泳结果跟丝素水溶液的丝素蛋白条带结果基本一致，表明水浴温度大于或等于65℃处理24h以后碱性蛋白酶会失活。25℃处理3h组对丝素蛋白的降解最为明显，25℃处理24h大部分丝素蛋白也被降解，不能保证丝素蛋白的完整性，65℃和70℃处理3h后均有少量降解，但是70℃处理3h丝素蛋白条带的完整性要好于65℃组(如图5所示)。
实施例4：DsRed1冻干粉的制备
参见附图6，将实施例3碱性蛋白酶灭活得到荧光蛋白溶液放置于-20℃环境中冷冻12h，然后在-80℃下冷冻24h，冷冻干燥得到DsRed1冻干粉，1g LG-HFRS-F2的蚕茧最终可以获得近8mg的DsRed1蛋白，DsRed1冻干粉的颜色为红色。
实施例5：DsRed1/Fibroin冻干复合物的制备
参见附图6，将实施例3碱性蛋白酶灭活得到荧光蛋白溶液与丝素蛋白溶液混合后放置于-20℃环境中冷冻12h，然后在-80℃下冷冻24h，冷冻干燥得到DsRed1/Fibroin冻干复合物，DsRed1/Fibroin冻干复合物的颜色为粉红色。
丝素蛋白溶液的制备方法为：
将两广二号蚕茧置于0.2％Na2CO3溶液中经沸水浴脱胶后，用去离子水洗涤干净并干燥。然后将5g脱胶后的蚕丝用100ml 9.3M LiBr溶液置于65℃烘箱进行溶解，溶解后的丝素溶液用截留分子量为10kDa的透析袋置于去离子水中透析，每隔3-6小时更换一次去离子水，需更换4-6次。将透析后的丝素溶液经离心后取上清获得丝素溶液。
实施例6：DsRed1/Fibroin膜材料和荧光图案的制备
DsRed1/Fibroin膜材料的制备方法为：将实施例5得到的DsRed1/Fibroin冻干复合物以质量2.5％的比例溶解于去离子水中得到混合溶液，然后将混合溶液加入成膜容器，干燥得到DsRed1/Fibroin膜材料。
DsRed1/Fibroin荧光图案的制备方法为：将实施例5得到的DsRed1/Fibroin冻干复合物以质量2.5％的比例溶解于去离子水中得到混合溶液，用注射器将混合溶液在所需材料上进行喷涂，干燥后得到DsRed1/Fibroin荧光图案。
为了检测DsRed1/Fibroin冻干复合物得到的DsRed1/Fibroin膜材料或DsRed1/Fibroin荧光图案的荧光效果，将DsRed1/Fibroin冻干复合物以2.5％的比例溶解于去离子水中，离心10min后，取溶液于培养皿或者将溶液写在载玻片上，室温自然风干后，制备出含有DsRed1的丝素膜和丝素荧光图案。
同时，将丝素蛋白溶液不与实施例3碱性蛋白酶灭活得到荧光蛋白溶液混合，即直接将丝素蛋白溶液放置于-20℃环境中冷冻12h，然后在-80℃下冷冻24h，冷冻干燥得到的样品作为对照样。将对照样做同样的处理，将对照样以2.5％的比例溶解于去离子水中，离心10min后，取溶液于培养皿或者将溶液写在载玻片上，室温自然风干后，制备出膜材料和荧光图案。将本实施例的丝素膜、对照样置于荧光显微镜下观察并拍照(参见附图7A)，将载玻片上的图案置于蓝色LED灯下和白光下进行观察和拍照(参见附图7B)。
参见附图7，荧光显微镜下观察膜材料，发现本实施例4的DsRed1/Fibroin冻干复合物膜材料在荧光显微镜下呈红色荧光，而不含DsRed1的对照样的膜材料在荧光显微镜下观察不到红色荧光。在载玻片上形成的含有DsRed1的DsRed1/Fibroin冻干复合物丝素图案“Silk”在Blue-LED灯下呈黄色荧光，在白光下呈粉红色，而不含DsRed1的对照样的丝素图案“SWU”在Blue-LED灯下不发荧光，在白光下无颜色。
实施例7：DsRed1/Fibroin凝胶材料的制备
参见附图8，将实施例4DsRed1的冻干粉以质量0.1％的比例溶解于蛋白浓度为2％的丝素溶液中，然后将溶液放置于4℃冰箱，静置3-5天形成DsRed1/Fibroin凝胶材料。同时，将2％的丝素蛋白溶液不与实施例3碱性蛋白酶灭活得到荧光蛋白溶液混合，即直接将丝素蛋白溶液放置于4℃冰箱，静置3-5天之后混合溶液得到的凝胶材料作为对照组，DsRed1/Fibroin凝胶材料在Blue-LED灯下呈橘黄色荧光，在白光下呈粉红色，对照组在Blue-LED灯下不发荧光，在白光下呈乳白色透明。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术构思前提下所作任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种荧光蚕丝材料的制备方法，其特征在于：从转基因家蚕品种的蚕茧中提取DsRed1蛋白、超滤浓缩后得到DsRed1浓缩液；对所述DsRed1浓缩液进行碱性蛋白酶灭活得到荧光蛋白溶液；对所述荧光蛋白溶液与丝素蛋白溶液混合后冷冻干燥得到DsRed1/Fibroin冻干复合物。
2.如权利要求1所述一种荧光蚕丝材料的制备方法，其特征在于，所述DsRed1蛋白的提取过程为：将转基因家蚕品种的蚕茧加入研磨机粉碎，将粉碎后的蚕茧溶解于含有碱性蛋白酶的Tris-HCl溶液中，在50℃-55℃下提取；提取后进行过滤后收集滤液，然后分别用滤纸、微孔滤膜进行再次过滤得到DsRed1提取液。
3.如权利要求2所述一种荧光蚕丝材料的制备方法，其特征在于：所述碱性蛋白酶的加入量为所述Tris-HCl溶液质量的0.3％。
4.如权利要求2所述一种荧光蚕丝材料的制备方法，其特征在于：所述DsRed1蛋白提取时蚕茧与溶液的浴比为10-25mg/mL。
5.如权利要求1所述一种荧光蚕丝材料的制备方法，其特征在于：将经碱性蛋白酶灭活处理后得到的所述荧光蛋白溶液在-20℃环境中冷冻过夜，冷冻干燥得到DsRed1冻干粉。
6.如权利要求1所述一种荧光蚕丝材料的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白溶液的制备方法为：将两广二号蚕茧置于0.2％Na2CO3溶液中经沸水浴脱胶后，用去离子水洗涤干净并干燥；然后将脱胶后的蚕丝用LiBr溶液置于65℃烘箱进行溶解，溶解后的丝素溶液用截留分子量为10kDa的透析袋置于去离子水中透析，将透析后的丝素溶液经离心后取上清获得丝素蛋白溶液。
7.如权利要求1所述一种荧光蚕丝材料的制备方法，其特征在于：所述DsRed1/Fibroin冻干复合物制备的冷冻干燥过程为将所述荧光蛋白溶液与丝素蛋白溶液混合均匀后放置于-20℃环境中冷冻12h，然后在-80℃下冷冻24h。
8.如权利要求1所述一种荧光蚕丝材料的制备方法，其特征在于：将所述DsRed1/Fibroin冻干复合物以质量2.5％的比例溶解于去离子水中，然后将混合溶液加入成膜容器，干燥得到DsRed1/Fibroin膜材料。
9.如权利要求1所述一种荧光蚕丝材料的制备方法，其特征在于：将所述DsRed1/Fibroin冻干复合物以质量2.5％的比例溶解于去离子水中，将混合溶液在所需材料上进行喷涂，干燥后得到DsRed1/Fibroin荧光图案。
10.如权利要求5所述一种荧光蚕丝材料的制备方法，其特征在于：将所述DsRed1冻干粉以质量0.1％的比例溶解于蛋白浓度为2％的丝素蛋白溶液中，然后将溶液放置于4℃冰箱，并静置3-5天，形成DsRed1/Fibroin凝胶材料。
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