CN104389032A - 一种适用于含绿色荧光蛋白茧丝的脱胶方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于含绿色荧光蛋白茧丝的脱胶方法，包括如下步骤：将茧丝烘至恒重，在浴比为1：50的预处理液中浸泡，然后在碱性蛋白酶浓度为0.5～3g·L^-1、温度为40～60℃条件下脱胶30～120分钟，水洗、烘干，得脱胶茧丝，其中预处理液为pH＝10的含1g/L纯碱和0.5g/L渗透剂JFC的溶液，该方法适用于含绿色荧光蛋白茧丝的脱胶，脱胶率高，并且能够最大限定保持茧丝的荧光特性，该方法脱胶后对茧丝的力学性能损失较小，手感柔软，丝光好，可满足转基因绿色茧蚕丝脱胶的要求。

Description

一种适用于含绿色荧光蛋白茧丝的脱胶方法

技术领域

本发明属于化学领域，具体涉及一种适用于含绿色荧光蛋白茧丝的脱胶方法。

背景技术

纺织印染行业一直被认为是一个大的污染源，其中染整业的染化药品是重要的“贡献者”。这些染化药品除对操作工人的健康有影响，还会给消费者带来长期危害，甚至某些染料还有致癌性。近年来，蚕丝染色主要采用酸性染料和活性染料。就染色效果来说，酸性染料色彩鲜艳，但染色牢度差；活性染料虽然染色牢度好，但染料的利用率不高，染色的重现性差，改色困难；又由于蚕丝丝素在碱性过高时易损伤，因此蚕丝的染色存在很多局限性。

随着piggyBac介导的转基因技术在家蚕中的建立和广泛应用，各种转基因家蚕丝腺表达系统如Fib-H，Fib-L，P25和Ser1相继被建立起来的用于外源基因在转基因家蚕丝腺中的精确与高量表达，这些表达系统不仅可以用来大规模生产具有高附加值的重组外源蛋白。同时也能利用其在蚕丝中表达具有不同生物学功能的蛋白，进而遗传改良蚕丝的机械，赋予蚕丝新生物学功能和用途，具有非常广阔的应用前景。Zhao等将绿色荧光蛋白GFP至于家蚕的丝素基因启动子的控制之下实现在蚕丝丝素层中的表达，育成含有天然绿色荧光蛋白成分的新型蚕茧。GFP是一种能够自身催化形成生色团并在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光的蛋白，其具有荧光稳定、易于检测、生物安全性好等优点。随着转基因技术的进一步发展，会有更多天然彩色茧诞生，为蚕丝带来一场颜色革命。

但是，新型彩色茧的诞生同时也带来了新的问题：丝胶的存在会影响蚕丝的手感、色泽以及后续的印染加工，因此蚕丝必须进行精练。这些新型彩色茧要想工业化，也必须进行缫丝、精练等一系列的加工。蚕丝的精练主要是脱去丝胶的过程，其原理是将丝胶在酸、碱、酶、高温高压等条件下通过膨化而溶解，强酸强碱、高温高压等条件都极易使蛋白质变性，因此脱胶的过程即伴随着蛋白的变性过程。而绿色茧丝中的荧光蛋白由于本质上仍具有蛋白质的特性，不耐高温，对酸碱的敏感度仍有待确定(一旦产生变性，则荧光消失)。生丝固胶软化的生产方法一文中采用低温固胶的技术将蚕丝中的丝胶固着，此种固胶工艺温和，可保持绿色茧丝的色彩，但这种方式处理的茧丝手感较差，其使用也受到限制。

因此，急需寻找一种不影响荧光蛋白活性，脱胶率高的脱胶方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种适用于含绿色荧光蛋白茧丝的脱胶方法，脱胶率高，并能最大限定保持茧丝的荧光特性，该方法脱胶后对茧丝的力学性能损失较小，手感柔软，丝光好。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种适用于含绿色荧光蛋白茧丝的脱胶方法，包括如下步骤：将茧丝烘干至恒重，在浴比为1：50的预处理液中浸泡，然后在碱性蛋白酶浓度为0.5～3g·L^-1、温度为40～60℃条件下脱胶30～120分钟，水洗、烘干至恒重，得脱胶茧丝，所述预处理液为pH＝10的含1g/L纯碱和0.5g/L渗透剂JFC的溶液。

优选的，所述浸泡的条件是在温度为50℃条件下浸泡0.5小时。

优选的，所述脱胶中，碱性蛋白酶浓度为3g/L。

优选的，所述脱胶的温度为50℃。

优选的，所述脱胶的时间为120分钟。

优选的，所述水洗的条件是依次用温度为80℃、50℃和18～25℃的水洗5分钟。

更优选的，所述烘干的温度为105～110℃。

本发明的有益效果在于：本发明公开通过采用皂碱法、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶分别对绿色茧丝进行脱胶，在保持丝素中的绿色荧光蛋白活性的前提下，最大程度的脱除丝胶。通过比较三种脱胶方法的正交实验结果可知，三种方法在适当的条件下均可完全脱胶，但碱性蛋白酶完全脱胶的条件明显更加温和，并且显微镜下的照片显示，在达到最大脱胶率时，皂碱法和木瓜蛋白酶脱胶后的绿色茧丝荧光消失，而碱性蛋白酶脱胶后的绿色茧丝仍保持较强的荧光特性。对脱胶茧丝的力学性能检测显示，采用此法脱胶获得的茧丝力学性能损失较小，手感柔软、丝光好，可以满足含绿色荧光蛋白茧丝脱胶的要求。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为绿色荧光茧丝荧光观察(A-B：绿色荧光茧丝的白光图和荧光图；C-D：正常茧丝的白光图和荧光图)。

图2为皂碱法脱胶绿色茧丝对绿色荧光特性的影响。

图3为木瓜蛋白酶脱胶绿色茧丝对绿色荧特性的影响。

图4为碱性蛋白酶脱胶绿色荧光茧丝荧光特性的影响(A：白光图；B：绿色荧光图)。

图5为SEM观察结果以及茧丝在断裂时的应力数和行变数拟合分析结果(A：SEM观察结果；B：应力数和行变数拟合分析结果)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例使用的材料、主要试剂及仪器如下：

材料：含绿色荧光蛋白茧丝(简称“绿色茧丝”)由西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室提供，其制备方法参见Zhao A，Zhao T，Zhang Y，et al.New and highly efficientexpression systems for expressing selectively foreign protein in the silk glands of transgenicsilkworm.Transgenic Res.2010；19:29-44。分别取绿色茧丝和正常茧丝，切片后置于荧光显微镜下观察，结果如图1所示。结果显示本发明实施例中使用的绿色茧丝在丝素层散发出强烈的绿色荧光信号。

试剂：工业皂片购自重庆重陵日化厂；木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶购自南宁庞博生物工程有限公司，渗透剂JFC，无水碳酸钠，冰乙酸均为分析纯。

仪器：三孔电热恒温水槽购自上海齐欣科学仪器有限公司，热机械分析仪DMA Q800购自美国TA Instruments公司。

实施例1、绿色茧丝荧光观察及含胶率测定

取6g绿色茧丝，放入恒温烘箱内，以105～110℃烘至恒重，即为试验前干重W₀，再将试样在下列条件下进行处理：

试样经上述条件处理后，用软水充分洗涤，再于105～110℃烘至恒重，即为试验后干重W₁，然后按下述公式计算含胶率，精确至0.01％。

含胶率＝(W₀-W₁)/W₀×100％

重复三个平行试验，取三次平均值作为含胶率的最终结果。计算得到含胶率为26.86％。将此含胶率作为脱胶效果的评判标准，脱胶率越接近含胶率，说明脱胶越充分。

实施例2、皂碱法脱胶绿色茧丝的方法

取绿色茧丝样品在105～110℃烘箱中烘至恒重，并记录绿色茧丝干重，记为m₀，在浴比为1:50的皂碱溶液中浸泡0.5小时，其中皂碱溶液含浓度为3～7g·L^-1的工业皂和浓度为1～5g·L^-1的纯碱，然后在温度为60～95℃条件下脱胶20～60分钟(具体按表1条件脱胶)，接着依次在温度为80℃、50℃和18～25℃的水中水洗5分钟，最后置于105～110℃烘箱中烘至恒重，记录脱胶茧丝干重，记为m₁。根据脱胶率＝(m₀-m₁)/m₀×100％计算脱胶率，结果见表1所示。

表1、皂碱法脱胶绿色茧丝的正交方法及结果

由表1的极差分析可知，皂碱法脱胶最优工艺条件为A3B3C3D2，在工业皂浓度为7g/L，纯碱浓度为5g/L，温度为95℃下脱胶40min时，绿色茧丝的脱胶率最大，其中，温度对脱胶率的影响最大，其次是工业皂用量，时间和纯碱用量的影响较小。然后将皂碱法脱胶的茧丝，于质量分数为4％的多聚甲醛中固定30min，然后用1×PBS漂洗三次，每次10min，再用体积分数为70％的乙醇换洗多次后，置于体积分数为70％乙醇中4℃保存；随后，利用石蜡对丝腺组织进行包埋，并将包埋好的组织材料蜡块用Leica RM2235型号石蜡切片机进行切片，切片厚度为4～7μm。最后，将蜡带进行分段粘于包被有多聚赖氨酸的防脱载玻片上。将薄片收集到载玻片上进行免疫杂交在荧光显微镜下观察纤维的荧光强弱，结果如图1所示。结果发现，脱胶温度在60℃以上(不包括60℃)的茧丝荧光均消失，而脱胶温度在60℃的茧丝脱胶率均小于2％。

实施例3、木瓜蛋白酶脱胶绿色茧丝的方法

取9份2g绿色茧丝样品，在105～110℃烘箱中烘至恒重，分别记录脱胶前干重m₀，在浴比为1：50的预处理液中于50℃下浸泡0.5h，其中预处理液为pH＝10、含浓度为1g/L的纯碱和0.5g/L渗透剂JFC的溶液，然后在木瓜蛋白酶浓度为0.5～1g·L^-1、pH为5～9、温度为40～80℃条件下脱胶30～60分钟(具体按表2条件脱胶)，接着依次在温度为80℃、50℃和18～25℃的水中水洗5分钟，最后置于105～110℃烘箱中烘至恒重，记录脱胶后干重m₁。根据脱胶率＝(m₀-m₁)/m₀×100％计算脱胶率，结果见表2所示。

表2、木瓜蛋白酶脱胶绿色茧丝的正交方法及结果

由表3极差分析可知，木瓜蛋白酶脱胶较充分的工艺条件为A1B2C3D1，也就是在木瓜蛋白酶用量0.5g/L，时间45min，温度80℃，pH＝5时，绿色茧丝的脱胶率最大。将木瓜蛋白酶脱胶的茧丝按实施例2的方法进行荧光显微镜观察，结果如图3所示。结果显示，脱胶温度在40℃时，荧光较明显，脱胶温度在60℃时，有微弱荧光，脱胶温度在80℃时，几乎无荧光。而在60℃条件下，木瓜蛋白酶法脱胶的脱胶率最高也只能达到17.17％，这种丝胶未脱除干净的蚕丝，由于丝胶蛋白已发生变性，所以使得蚕丝手感发硬，颜色泛黄，也容易在后续的染整过程中产生疵病，因此无法达到理想的效果，说明木瓜蛋白酶不适用于绿色荧光茧丝脱胶。

实施例4、碱性蛋白酶脱胶绿色茧丝的方法

取9份2g绿色茧丝样品，在105～110℃烘箱中烘至恒重，分别记录脱胶前干重m₀，在浴比为1：50的预处理液中于50℃下浸泡0.5h，其中预处理液为pH＝10，含1g/L纯碱、0.5g/L渗透剂JFC的溶液，再在碱性蛋白酶为0.5～3g·L^-1，温度为40～60℃件下脱胶30～120分钟，接着依次在温度为80℃、50℃和18～25℃的水中水洗5分钟，最后置于105～110℃烘箱中烘至恒重，记录脱胶后干重m₁。根据脱胶率＝(m₀-m₁)/m₀×100％计算脱胶率，结果见表3所示。

表3、碱性蛋白酶脱胶绿色茧丝的正交方法及结果

由表3极差分析可知，皂碱法脱胶较充分的工艺条件为A3B3C2，在碱性蛋白酶浓度为3g/L，温度为50℃条件下脱胶120min，绿色茧丝的脱胶率最大。然后将碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶脱胶的茧丝按实施例2的方法进行荧光显微镜观察，结果如图4所示。结果显示，在脱胶率达到25.16％时，茧丝仍有明显荧光。说明碱性蛋白酶可用于绿色荧光茧丝脱胶。

SEM观察：将碱性蛋白酶脱胶绿色茧丝和未脱胶的茧丝进行SEM观察，结果如图5中A所示。结果显示，碱性蛋白酶脱胶绿色茧丝表面光滑平整，说明碱性蛋白酶工艺温和，对绿色茧丝丝素的伤害较小。

测试绿色茧丝的力学性能：采用热机械分析仪DMA Q800测试脱胶后的绿色茧丝单纤维的直径、断裂强度、断裂伸长率进行测定。具体为：将测试样品固定在中空的纸质模板中，测试部分固定长度为1.5cm。蚕丝力学性能的测定利用SHIMADZU仪器，测定拉升速度为1mm/min，相对湿度为60％的条件下，蚕丝样品在断裂时的应力数和行变数，结果如表4所示，最后对获得数据进行拟合分析，结果对图5中B所示。

表4、碱性蛋白酶对绿色茧丝力学性能的影响

由表4可知，脱胶前后转基因绿色茧丝的直径(μm)分别为13.51±0.23和11.31±0.31；脱胶前后转基因绿色茧丝的断裂强度分别为1.53±0.06Gpa和1.45±0.09Gpa；脱胶前后转基因绿色茧丝的断裂应变分别为18.91±0.17％和15.41±0.34％。上述结果表明，碱性蛋白酶法脱胶对绿色茧丝的力学性能影响较小。

以上结果最终确认了皂碱法不能应用于转基因含绿色荧光蛋白茧丝的脱胶，这种方法在完全脱胶的情况下会使荧光蛋白发生不可逆转的变性，从而丧失其绿色荧光特性；建立并评估了木瓜蛋白酶对转基因绿色茧丝的脱胶条件与效果，发现木瓜蛋白酶在保持转基因绿色茧蚕丝荧光特性的前提下，最大的脱胶率仅为10％，尚不能满足转基因绿色茧丝脱胶的工艺要求。初步探索并评估了碱性蛋白酶对转基因绿色茧丝的脱胶条件与效果，发现碱性蛋白酶在浴比1:50，酶用量3g/L，反应温度50℃，反应时间120min，pH＝9，可最大限度保持转基因绿色茧丝的荧光特性，同时脱胶率达到25％以上，并且此法脱胶后的茧丝的力学性能损失较小、手感柔软、丝光好，可以满足转基因绿色茧蚕丝脱胶的工艺要求。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种适用于含绿色荧光蛋白茧丝的脱胶方法，其特征在于，包括如下步骤：将茧丝烘干至恒重，在浴比为1:50的预处理液中浸泡，然后在碱性蛋白酶浓度为0.5～3g·L^-1、温度为40～60℃条件下脱胶30～120分钟，水洗、烘干至恒重，得脱胶茧丝，所述预处理液是pH＝10的含1g/L纯碱和0.5g/L渗透剂JFC的溶液。

2.根据权利要求1所述的脱胶方法，其特征在于：所述浸泡的条件是在温度为50℃条件下浸泡0.5小时。

3.根据权利要求1所述的脱胶方法，其特征在于：所述脱胶中，碱性蛋白酶浓度为3g/L。

4.根据权利要求1所述的脱胶方法，其特征在于：所述脱胶的温度为50℃。

5.根据权利要求1所述的脱胶方法，其特征在于：所述脱胶的时间为120分钟。

6.根据权利要求1所述的脱胶方法，其特征在于：所述水洗的条件是依次用温度为80℃、50℃和18～25℃的水洗5分钟。

7.根据权利要求1所述的脱胶方法，其特征在于：所述烘干的温度为105～110℃。