CN101289664A - 促进细胞生长的中华蜜蜂mrjp1真核表达产物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的促进细胞生长的中华蜜蜂MRJP1真核表达产物的制备方法，利用Bac－to－Bac/BmNPV杆状病毒表达系统构建得到重组Bacmid－MRJP1并转染家蚕细胞，获得重组病毒后注射家蚕幼虫，感染96h后收集血淋巴，经亲和柱纯化后获得了高纯度重组MRJP1。SDS－PAGE和Western－blotting分析表明，表达产物的分子量约为60kDa，且主要以溶解状态存在，表达量明显高于原核表达。本发明为MRJP1的工业化生产奠定了一定的基础，并有望运用到生物医药等领域，为人类健康服务。

Description

促进细胞生长的中华蜜蜂MRJP1真核表达产物的制备方法

技术领域

本发明涉及促进细胞生长的中华蜜蜂MRJP1真核表达产物的制备方法。

背景技术

蜂王浆(RJ，Royal Jelly)是哺育蜂咽下腺与上颚腺分泌的供蜂王和3日龄以内蜜蜂幼虫食用的浆状物质。蜂王浆中含水量一般为64.5％～68.5％，蛋白质12％～14％，碳水化合物8.5％～16％，脂类6％，灰分0.4％～2％，其它物质2.84％～3％。其中王浆蛋白由水溶性蛋白和非水溶性蛋白组成，水溶性蛋白占总蛋白含量的46％～89％，为王浆蛋白的主要部分，称为主要王浆蛋白(MRJPs，Major RoyalJelly Proteins)(陈盛禄等，2001；Townsend et al.，1940)。王浆的生物学活性与其主蛋白密切相关。

近年来，王浆主蛋白尤其是MRJP1的研究逐步深入。MRJP1是王浆主蛋白家族的成员，是一个分子量约为56-57kDa的糖蛋白(Ohashi et al.，1997；Albert etal.，2004)，等电点约为5.1(Kamakura et al.，2001c)，且其序列高度保守。早在1996年，Watanabe等就发现MRJP1能刺激无血清培养基中人淋巴细胞的生长(Watanabe et al.，1996)；随后，Kamakura等研究了王浆57-kDa(即MRJP1)蛋白的生理学作用，他们通过对大鼠原代肝细胞的培养，发现57-kDa蛋白能显著地促进肝细胞的DNA合成，而常用的牛血清却无此作用。此外，57-kDa蛋白还能增加清蛋白(亦称白蛋白)的合成，促进细胞增殖，提示57-kDa蛋白可能起到细胞分裂素的作用(Kamakura et al.，2001b)。紧接着57-kDa蛋白的作用机理也被阐明(Kamakura，2002)；Kamakura等报道王浆有抗疲劳作用，这可能与王浆中57-kDa蛋白有关(Kamakura et al.，2001a)；Bincoletto等在2005年发现王浆能阻碍因肿瘤细胞生长而导致的骨髓抑制，但成分未知(Bincoletto et al.，2005)；Majtan等运用基因工程的方法，在体外表达了重组的Apa1(即MRJP1)并进行了功能实验，发现其能刺激巨噬细胞释放肿瘤细胞坏死因子(TNFα)(Majtan et al.，2006)；此外，Kucharski等报道MRJP1在蜜蜂大脑的蘑菇体表达，提示MRJP1可能在蜜蜂的学习与记忆行为调控中起作用(Kucharski et al.，1998)。

中华蜜蜂是我国特有的蜜蜂资源，长期适应于我国特有的地理特征和气候条件，在我国年均饲养量约200-300万群，约占总饲养蜂群的三分之一，具有其他蜜蜂种类不可替代的应用价值和资源优势。然而目前，中国对于蜜蜂的研究几乎都集中在养蜂生产和蜂产品开发上，很少有涉及蜜蜂分子生物学的研究。同时，蜜蜂分子生物学研究的落后也在一定程度上影响了养蜂生产和深加工蜂产品的开发。西方蜜蜂(Apis mellifera)王浆蛋白功能分子生物学水平上的研究已广泛开展，包括部分王浆主蛋白基因的克隆表达以及深入开展的功能研究(Kamakura et al.，2001b；Bachanováet al.，2002；Kimura et al.，2003；Okamoto et al.，2003；Fontana et al.，2004；Imjongjirak et al.，2005；Majtan et al.，2006)。Pothichot等发现西方蜜蜂的蜂王不能被东方蜜蜂(Apis cerana)的王浆养活，反之亦然(Pothichot et al.，1993)，这暗示着两蜂种间的王浆成分存在差异，而中蜂是东方蜜蜂的一个亚种，不难想象其王浆成分也必然与西方蜜蜂存在差异。因此，开发我国特有的蜜蜂资源——中蜂的基因资源，已经成为国人不可推卸的责任。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是Luckow等人发展的高效、快速昆虫杆状病毒表达系统，目前已被广泛应用(Luckow et al.，1993)。最先采用的是Autographacalifomica核型多角体病毒(AcNPV)，但其不能感染家蚕细胞。目前，以“家蚕生物反应器”为载体的杆状病毒表达系统已经建立起来(Motohashi et al.，2005；Miao et al.，2006)。家蚕(Bombyx mori)是我国重要的农业资源昆虫，饲养历史悠久，技术成熟；以卵滞育，加上人工饲料的开发，一年四季随时可以饲养；饲养周期短，成本低；遗传背景清楚，生物危害性小；家蚕个体大，是其核型多角体病毒BmNPV的天然宿主，表达蛋白后加工完善、产出量高且易于纯化。

目前，主要有以下两种方法获得王浆主蛋白MRJP1：

1)直接分离法主要是对全王浆采用柱层析法配合SDS-PAGE(Schmitzovaet al.，1998；Kamakura et al.，2001c)。步骤包括初分离、柱层析、SDS-PAGE检测、二次柱层析，最后经二次SDS-PAGE分离等，此法成本高，对王浆的新鲜度要求也较高，且较易混杂有其它的蛋白质。

2)基因表达法主要是原核表达法(Imjongjirak et al.，2005；Majtan et al.，2006)。一般采用大肠杆菌表达，但由于缺少适当的糖基化、磷酸化和蛋白切割加工修饰过程，表达产物的生物学特性与天然产物存在差异。此外，原核表达系统所产生的MRJP1在量与溶解度上都不是很理想，且以包含体形式大量存在。Judova等将编码MRJP1的cDNA转入烟草，结果也只得到几种不同构象的糖基化MRJP1的微弱表达(Judova et al.，2004)。

鉴于MRJP1生物学功能的多样化与实用性，以及目前MRJP1生产与纯化上存在的困难，有必要引入一种新的、快速高效的生产方法，开发我国特有的蜜蜂资源——中华蜜蜂的基因资源。

发明内容

本发明的目的是提供一种促进细胞生长的中华蜜蜂MRJP1真核表达产物的制备方法。

本发明的促进细胞生长的中华蜜蜂MRJP1真核表达产物的制备方法，步骤如下：

1)MRJP1基因的克隆

a)以中华蜜蜂8日龄工蜂头部MRJP1 cDNA为模板，采用Primer Primier 5.0软件，设计上游引物F-Prime序列为5’-CCATGGACATGACAAGGTGGTTGTT-3’，下游引物R-Prime序列为3’-TAAAGTTATGTAGACATTCGCC GGCG-5’，分别在上游引物F-Prime序列与下游引物R-Prime序列中引入酶切位点Nco I和Not I；

b)PCR反应体系共50μl，组成如下：5μl 10×PCR Buffer、6μl 25mM MgCl₂、1μl 10mM dNTP Mix、2μl 10μM F-Prime、2μl 10μM R-Prime、5μl中华蜜蜂MRJP1cDNA模板、0.75μl 5U/μl Taq DNA Polymerase，加ddH₂O至终体积为50μl；

PCR反应条件如下：PCR反应体系先在94℃预热3min，然后94℃变性1min、54.6℃退火1min、72℃延伸1min、35个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物电泳分析后经UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收，克隆至TaKaRa公司的pMD18-T载体，经PCR和双酶切鉴定，并测定其序列；

2)重组Bacmid病毒的构建

a)将鉴定正确的pMD18-T-MRJP1质粒经Nco I和Not I酶切后与经相同限制性内切酶酶切的pFastBacHTb表达载体在16℃的条件下连接过夜，将连接产物转化入TG1感受态细胞，得到转移载体pFastBacHTb-MRJP1，经PCR和双酶切鉴定正确后转化入DH10Bac感受态细胞；

b)将上述DH10Bac感受态细胞涂布于含100μg/ml X-gal、40μg/ml IPTG、50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素及7μg/ml庆大霉素的LB平板，挑取白色菌落，以M13通用引物进行PCR检测，获得含有中华蜜蜂MRJP1重组Bacmid病毒；

c)PCR检测反应条件如下：先94℃预热3min，然后94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸4min、35个循环，最后72℃延伸7min；

3)家蚕细胞的培养与转染

a)家蚕细胞BmN用含10％胎牛血清的HyQ SFX-INSECT昆虫细胞培养基在27℃条件下恒温培养；然后接种于50ml培养瓶中，培养至2×10⁶/瓶，离心去除血清，备用；

b)将194μl无血清培养基与6μl FUGENE 6转染剂混匀，室温静置5min，再加入4μg重组Bacmid DNA，混匀，室温静置45min；将该混合液逐滴加入细胞培养瓶中，边加边摇，27℃温育7h后，弃共转染液，加入6ml含血清的完全培养基继续培养3-5天，取上清液，10000rpm，离心2min，上清液于4℃避光保存备用；将所获病毒上清液继续感染细胞，扩繁病毒，收集第三轮感染的病毒上清液，用于注射家蚕幼虫；

4)中华蜜蜂MRJP1在家蚕幼虫中的表达及纯化

将重组病毒及对照物ddH₂O通过皮下注射导入家蚕五龄第一天幼虫，5μl/头，感染96h后收集其血淋巴，经超声波破碎，8000rpm，5min，4℃离心后，取上清液，用Ni-NTA亲和柱纯化，获得中华蜜蜂MRJP1真核表达产物。

本发明与现有技术相比，具有的有益的效果是：

1)利用杆状病毒这一真核表达系统结合“家蚕生物反应器”来生产MRJP1，与原核表达系统比较，具有系统安全性好，快速高效，成本低等优点，在外源基因表达方面具有糖基化、磷酸化和蛋白切割加工修饰过程，表达产物的生物学特性与天然产物相似。此外，该系统蛋白表达量高，还具有正确折叠蛋白并将成熟蛋白分泌到胞外的功能。

2)表达产物主要以溶解状态存在，表达量明显高于原核表达系统，且易于纯化。

3)纯化后的表达产物能显著促进试验室人工培养的家蚕BmN细胞，提示中华蜜蜂MRJP1表达产物具有促进细胞生长的功能。

附图说明

图1是中华蜜蜂MRJP1基因PCR扩增结果，M：DNA分子量标准；箭头所指为目的片段；

图2是重组Bacmid和未重组Bacmid的PCR检测结果。M为DNA分子量标准，1表示重组Bacmid的PCR产物；2表示未重组Bacmid的PCR产物；

图3表示受重组病毒Bacmid-MRJP1转染后家蚕细胞BmN的表型变化，其中图A为转染Bacmid-MRJP1120h后家蚕细胞，直径增大，裂解并聚集成团；图B为对照的正常家蚕细胞；

图4是中华蜜蜂MRJP1表达产物的SDS-PAGE分析结果和利用His单抗进行的Western blotting印迹分析，图中M为蛋白质分子量标准：66.4kDa代表牛血清蛋白，44.3kDa代表卵清蛋白，29.0kDa代表碳酸苷酶，20.1kDa代表胰蛋白酶抑制剂，14.3kDa代表溶菌酶；泳道1为感染家蚕血淋巴上清液；泳道2为对照；泳道3为王浆水溶物；泳道4为纯化的中华蜜蜂MRJP1。泳道5为感染家蚕血淋巴上清液纯化产物的Western blotting分析；

图5是中华蜜蜂MRJP1(rAccMRJP1)促进家蚕细胞BmN生长的功能，于96孔板中种入培养至1.2×10⁵cells/ml的BmN细胞，1×10⁴cells/孔。细胞分别用ddH₂O(Control)、rAccMRJP1(rAccMRJP1，0.5mg/ml)和蜂王浆(RJ)水溶物(RJ，0.5mg/ml)处理。^**表示与对照相比差异极显著(p＜0.01)；

图6是中华蜜蜂MRJP1(rAccMRJP1)促进家蚕细胞BmN生长作用的剂量相关性，A表示促生长作用与中华蜜蜂MRJP1浓度的相关性；B表示促生长作用与不同密度家蚕细胞BmN的相关性，图中荧光值均为三次独立实验的平均值。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明。

实施例1

促进细胞生长的中华蜜蜂MRJP1真核表达产物的制备方法，其特征是步骤如下：

1)MRJP1基因的克隆

a)以中华蜜蜂8日龄工蜂头部MRJP1 cDNA为模板，采用Primer Primier 5.0软件，设计上游引物F-Prime序列为5’CCATGGACATGACAAGGTGGTTGTT-3’，下游引物R-Prime序列为3’-TAAAGTTATGTAGACATTCGCC GGCG-5’，分别在上游引物F-Prime序列与下游引物R-Prime序列中引入酶切位点Nco I和Not I，(见下划线部分)；

b)PCR反应体系共50μl，组成如下：5μl 10×PCR Buffer、6μl 25mM MgCl₂、1μl 10mM dNTP Mix、2μl 10μM F-Prime、2μl 10μM R-Prime、5μl中华蜜蜂MRJP1cDNA模板、0.75μl 5U/μl Taq DNA Polymerase，加ddH₂O至终体积为50μl；

PCR反应条件如下：PCR反应体系先在94℃预热3min，然后94℃变性1min、54.6℃退火1min、72℃延伸1min、35个循环，最后72℃延伸10min，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，获得大小为1300bp左右的特异性扩增片段，见图1，与预期的目的片段大小相符。将目的片段割胶，经UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收，割胶回收方法详见上海生工说明书。然后将回收获得的目的基因克隆至TaKaRa公司的pMD18-T载体，经PCR和双酶切鉴定，并送上海生工测序。

2)重组Bacmid病毒的构建

a)将鉴定正确的pMD18-T-MRJP1质粒经Nco I和Not I酶切后与经相同限制性内切酶酶切的pFastBacHTb表达载体在16℃的条件下连接过夜，将连接产物转化入TG1感受态细胞，得到转移载体pFastBacHTb-MRJP1，经PCR和双酶切鉴定正确后转化入DH10Bac感受态细胞；

b)将上述DH10Bac感受态细胞涂布于含100μg/ml X-gal、40μg/ml IPTG、50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素及7μg/ml庆大霉素的LB平板培养48h后，挑取白色菌落，以M13通用引物进行PCR检测，PCR检测反应条件如下：先94℃预热3min，然后94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸4min、35个循环，最后72℃延伸7min；获得含有中华蜜蜂MRJP1重组Bacmid病毒。经PCR检测，未发生重组的Bacmid经PCR扩增得到273bp大小的特异性片段；重组后的Bacmid，PCR扩增得到转座子内侧片段2430bp加上克隆片段大小之和，即2430bp+1302bp＝3732bp，见图2。PCR结果与预期的片段大小一致，说明中华蜜蜂MRJP1基因已经成功地转座到Bacmid中，重组病毒命名为Bacmid-MRJP1。

3)家蚕细胞的培养与转染

a)家蚕细胞BmN用含10％胎牛血清的HyQ SFX-INSECT昆虫细胞培养基在27℃条件下恒温培养；然后接种于50ml培养瓶中，培养至2×10⁶/瓶，离心去除血清，备用；

b)将194μl无血清培养基与6μl FUGENE 6转染剂混匀，室温静置5min，再加入4μg重组Bacmid DNA，混匀，室温静置45min；在转染剂FuGENE6的介导下，将Bacmid-MRJP1转染家蚕细胞BmN，扩增得到大量重组病毒。将该混合液逐滴加入细胞培养瓶中，边加边摇，27℃温育7h后，弃共转染液，加入6ml含血清的完全培养基继续培养3-5天，细胞直径增大，生长停止，裂解并聚集成团(见图3)，取上清液，10000rpm，离心2min，上清液于4℃避光保存备用；将所获病毒上清液继续感染细胞，扩繁病毒，收集第三轮感染的病毒上清液，用于注射家蚕幼虫。

4)中华蜜蜂MRJP1在家蚕幼虫中的表达及纯化

将重组病毒及对照物ddH₂O通过皮下注射导入家蚕五龄第一天幼虫，5μl/头，感染120h后，家蚕体色变黑，食欲下降，生长延滞，在感染96h时，收集其血淋巴，经超声波破碎，8000rpm，5min，4℃离心后，取上清液和沉淀物，用Ni-NTA亲和柱纯化，获得中华蜜蜂MRJP1真核表达产物。将感染家蚕血淋巴上清液和沉淀的纯化产物进行SDS-PAGE分析，结果表明表达产物主要在上清液中，即主要以溶解状态存在。图4为感染家蚕血淋巴上清液、对照家蚕血淋巴上清液(皮下注射ddH₂O)、RJ水溶物、纯化的rAccMRJP1的SDS-PAGE分析和Western-blotting检测结果。图中可见一条约60kDa的明显条带，证明表达、纯化成功。

实施例2

中华蜜蜂MRJP1真核表达产物具有促进细胞生长的功能，试验如下：

家蚕细胞BmN用含10％FBS的HyQ SFX-INSECT昆虫细胞培养基在27℃条件下恒温培养至密度为1.2×10⁵cells/ml，分装至96孔板上进行实验。共设计6个实验组，1个空白对照组，每组三个重复。每组实验的细胞数目、试验因子及其用量分别为1×10⁴cells/孔、中华蜜蜂MRJP1(简称rAccMRJP1)、0.1mg/ml；0.8×10⁴cells/孔、rAccMRJP1、0.5mg/ml；1×10⁴cells/孔、rAccMRJP1、0.5mg/ml；1.2×10⁴cells/孔、rAccMRJP1、0.5mg/ml；1×10⁴cells/孔、rAccMRJP1、1mg/ml；1×10⁴cells/孔、蜂王浆水溶物(RJ)、0.5mg/ml；1×10⁴cells/孔、ddH₂O、在原有体积基础上补至100μl，最后每组均用ddH₂O补至100μl，27℃孵育3天，于每孔中加入100μl细胞分析用MultiTox-Fluor Multiplex Cytotoxicity AssaySubstrate，混合均匀后37℃孵育1h，用荧光光度计于405nm_Ex/492nm_Em处测定荧光值(参考Promega说明书)。

将纯化后的rAccMRJP1添加到家蚕BmN细胞培养基中，用于测定其对细胞生长的促进作用，并以RJ水溶物和ddH₂O作为对照，每组三个重复。经Excel单因素方差分析，可以得出以下三个基本结论。

rAccMRJP1对家蚕BmN细胞的生长有显著的促进作用。于96孔板中种入培养至1.2×10⁵cells/ml的BmN细胞，1×10⁴cells/孔。细胞分别用ddH₂O(对照)、rAccMRJP1(0.5mg/ml)和RJ水溶物(0.5mg/ml)处理，最后每孔用ddH₂O补至终体积为100μl。27℃孵育3天，测定荧光值。结果显示rAccMRJP1(0.5mg/ml)及RJ水溶物(0.5mg/ml)均能极显著(p＜0.01)促进BmN细胞生长(图5)。

rAccMRJP1对家蚕BmN细胞的促生长作用存在剂量相关性。于96孔板中种入BmN细胞，1×10⁴cells/孔，细胞分别用一系列不同浓度的rAccMRJP1(0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml)处理，最后每孔用ddH₂O补至终体积为100μl。27℃孵育3天，测定荧光值。结果显示各实验组间存在极显著差异(p＜0.01)，rAccMRJP1对BmN细胞的促生长作用存在剂量相关性，且当rAccMRJP1浓度为0.5mg/ml时，其促生长作用最强(图6A)。

rAccMRJP1对家蚕BmN细胞的促生长作用存在细胞密度相关性。于96孔板中种入一系列不同浓度的BmN细胞(0.8×10⁴cells/孔、1×10⁴cells/孔、1.2×10⁴cells/孔)，细胞用0.5mg/ml的rAccMRJP1处理，最后每孔用ddH₂O补至终体积为100μl。27℃孵育3天，测定荧光值。结果显示各实验组间存在极显著差异(p＜0.01)，rAccMRJP1对BmN细胞的促生长作用存在细胞密度相关性，且当细胞密度为1×10⁴cells/孔时，其促生长作用最强(图6B)。

Claims (1)

1.促进细胞生长的中华蜜蜂MRJP1真核表达产物的制备方法，其特征是步骤如下：

1)MRJP1基因的克隆

a)以中华蜜蜂8日龄工蜂头部MRJP1 cDNA为模板，采用Primer Primier 5.0软件，设计上游引物F-Prime序列为5’-CCATGGACATGACAAGGTGGTTGTT-3’，下游引物R-Prime序列为3’-TAAAGTTATGTAGACATTCGCCGGCG-5’，分别在上游引物F-Prime序列与下游引物R-Prime序列中引入酶切位点Nco I和Not I；

b)PCR反应体系共50μl，组成如下：5μl 10×PCR Buffer、6μl 25mM MgCl₂、1μl 10mM dNTP Mix、2μl 10μM F-Prime、2μl 10μM R-Prime、5μl中华蜜蜂MRJP1cDNA模板、0.75μl 5U/μl Taq DNA Polymerase，加ddH₂O至终体积为50μl；

PCR反应条件如下：PCR反应体系先在94℃预热3min，然后94℃变性1min、54.6℃退火1min、72℃延伸1min、35个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物电泳分析后经UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收，克隆至TaKaRa公司的pMD18-T载体，经PCR和双酶切鉴定，并测定其序列；

2)重组Bacmid病毒的构建

a)将鉴定正确的pMD18-T-MRJP1质粒经Nco I和Not I酶切后与经相同限制性内切酶酶切的pFastBacHTb表达载体在16℃的条件下连接过夜，将连接产物转化入TG1感受态细胞，得到转移载体pFastBacHTb-MRJP1，经PCR和双酶切鉴定正确后转化入DH10Bac感受态细胞；

b)将上述DH10Bac感受态细胞涂布于含100μg/ml X-gal、40μg/ml IPTG、50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素及7μg/ml庆大霉素的LB平板，挑取白色菌落，以M13通用引物进行PCR检测，获得含有中华蜜蜂MRJP1重组Bacmid病毒；

c)PCR检测反应条件如下：先94℃预热3min，然后94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸4min、35个循环，最后72℃延伸7min；

3)家蚕细胞的培养与转染

a)家蚕细胞BmN用含10％胎牛血清的HyQ SFX-INSECT昆虫细胞培养基在27℃条件下恒温培养；然后接种于50ml培养瓶中，培养至2×10⁶/瓶，离心去除血清，备用；

b)将194μl无血清培养基与6μl FUGENE 6转染剂混匀，室温静置5min，再加入4μg重组Bacmid DNA，混匀，室温静置45min；将该混合液逐滴加入细胞培养瓶中，边加边摇，27℃温育7h后，弃共转染液，加入6ml含血清的完全培养基继续培养3-5天，取上清液，10000rpm，离心2min，上清液于4℃避光保存备用；将所获病毒上清液继续感染细胞，扩繁病毒，收集第三轮感染的病毒上清液，用于注射家蚕幼虫；

4)中华蜜蜂MRJP1在家蚕幼虫中的表达及纯化

将重组病毒及对照物ddH₂O通过皮下注射导入家蚕五龄第一天幼虫，5μl/头，感染96h后收集其血淋巴，经超声波破碎，8000rpm，5min，4℃离心后，取上清液，用Ni-NTA亲和柱纯化，获得中华蜜蜂MRJP1真核表达产物。

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