CN102191207A - 表达可溶性fgf-21的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种表达可溶性FGF-21的基因工程菌，该菌包括携带质粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21的大肠杆菌DH5α，以及同时携带质粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21和质粒pTf16-ParaB-tig的大肠杆菌BL21(DE3)。本发明还提供含有FGF-21序列的基因工程菌，表达可溶性FGF-21的基因工程菌的构建方法。本发明还提供用该菌生产FGF-21的方法，用表达分子伴侣tig和自诱导培养方法得到可溶性FGF-21。本发明还提供该菌生产的FGF-21在制备治疗糖尿病的药物中的应用。本发明纯化工艺简单，易于操作，生产成本低，且表达产物有降血糖和调节脂代谢的生物学活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域中的基因工程菌及其构建方法和应用，特别是涉及表达可溶性人成纤维生长因子21，即FGF-21的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
糖尿病是严重威胁人类健康的三大疾病之一，发病率呈逐年上升趋势。预计到2025年，全球糖尿病的发病率将接近成年人的7％。糖尿病不仅仅是心血管疾病的危险因素，还导致全球每30秒就有1人需要截肢，它也是引起肾衰竭和失明的首要原因。据统计，每年约有350万人死于糖尿病。美国每年治疗2型糖尿病总共需花费1320亿美元，因此开发高效低价的糖尿病新药具有广阔的市场前景。
根据美国糖尿病协会估算，美国糖尿病患者中，90％以上是2型糖尿病患者。2型糖尿病是一种包括胰岛素分泌减少、外周组织胰岛素抵抗、进行性β细胞功能不全、血糖控制进行性恶化以及大血管和微血管并发症危险性增加等在内的多因子疾病，它的发病是以餐后高血糖和空腹高血糖为特征的。对大部分人而言，高血糖的产生是由于胰腺β细胞分泌的胰岛素不足以补偿外周组织中的胰岛素抵抗。
目前，胰岛素是被广泛使用的降糖药，但用胰岛素治疗2型糖尿病可能会产生低血糖、体重增加、过敏、浮肿等副作用，因此在临床上存在一定的用药风险。
FGF-21是最近发现的FGF基因家族中的一位新成员。相关研究表明FGF-21是一非常有意义的保护糖代谢稳态的细胞因子，具有胰岛素类似的作用，能抑制胰高血糖素的分泌，促进脂肪组织对葡萄糖的吸收，增加胰岛素的敏感性，因此FGF-21可以作为今后一种新的降糖药物。
FGF-21的生物学功能主要有几方面：
(1)降低血糖和类胰岛素作用，能调节糖代谢。主要可能是通过上调GLUT-1的表达促进脂肪组织对葡萄糖的摄取、抑制胰高血糖素的分泌、增加胰岛素敏感性、保护胰腺β细胞、促进胰岛素合成、调节血液循环中脂肪细胞因子等功能来降低血糖。但与胰岛素不同的是，其降血糖作用起效慢、作用强、持续时间长，它不会引起胰岛素受体酪氨酸磷酸化。任何剂量的FGF-21均未引起低血糖的发生以及体重的增加。这些说明FGF-21是非胰岛素依赖性的，它与胰岛素共同作用具有叠加效应。
(2)调节脂代谢，降低甘油三酯的水平，改善脂代谢的紊乱。血浆甘油三酯(TG)降低幅度呈剂量依赖性，而且能持续较长时间。
(3)抵抗饮食诱导肥胖的发生，能通过减轻体重来改善胰岛素抵抗，是代谢综合征的独立相关因素。
(4)FGF-21是FGF基因家族中的一员，但相关研究并没有发现肝脏肿瘤的发生以及其他任何组织的增生，说明FGF-21不会促进有丝分裂，从而为今后FGF-21用于糖尿病治疗的安全性提供了依据。
综上所述，FGF-21有明显的优势，可开发为新型治疗2型糖尿病新型的降糖药物。
但是，根据国内外的研究情况，由于大肠杆菌自身在表达外源目的蛋白的限制，FGF-21在大肠杆菌中主要是以包涵体形式表达，难以获得高效稳定的可溶性表达。国外对FGF-21的研究还不多，Kharitonenkov等人最早以pET30a为载体，在大肠杆菌中表达FGF-21，但是FGF-21仅以包涵体形式存在。(A.Kharitonenkov，T.L.Shiyanova，A.Koester，et al.FGF-21 as anovel metabolic regulator. The Journal of clinical investigation，2005，115：1627-1635.)。在其他FGF-21相关研究中，研究人员也多采用Kharitonenkov等人的方法来表达纯化FGF-21。
虽然分子伴侣作为一种能够介导蛋白质进行正确折叠的蛋白质，它能使蛋白质获得正确的构型，增强其可溶性。但是，本发明所采用的方法，即在同一菌体内，使用含有分子伴侣基因的质粒，通过诱导表达分子伴侣蛋白，进而促进FGF-21的可溶性表达，在目前国内外FGF-21研究中尚未见有报道。
另外，在基因工程表达外源目的蛋白时，人们常选用pET系统的质粒，这是因为该表达系统有如下优点：含有强启动子T7lac，T7RNA聚合酶特异性识别T7启动子，从而开启下游基因的大量转录；T7mRNA比较稳定；T7mRNA带有较强的翻译信号。但是T7表达系统也有其不足之处，蛋白的表达需要用IPTG诱导，步骤比较繁琐。而且，一定浓度的IPTG会对细菌产生毒性，直接影响蛋白的表达效率。另外，由于lac mRNA本底水平的组成型合成，可导致目的蛋白的少量表达。研究表明，非目的性表达出的目的蛋白可能会导致目的蛋白的不稳定、甚至丧失表达的能力。(F.W.Studier.Protein production by auto-induction inhigh-density shaking cultures.Protein Expression and Purification，2005，41：207-234.)(J.Meerman，G.Georgiou.Construction and characterization of a set of E. coli strains deficent in allknown loci affecting the proteolytic stability of secreted recombinant
本发明采用的利用自诱导表达外源目的蛋白的方法解决了以上现有技术存在的问题，既抑制非目的性目的蛋白表达，又表达效率高、操作简洁。自诱导使用的培养基中同时加入葡萄糖和乳糖，大肠杆菌会优先利用葡萄糖，在葡萄糖耗尽前，不会诱发lac操纵子。当葡萄糖耗尽，乳糖开始发挥作用，开启T7表达系统，而乳糖的代谢产物也同时作为细菌生长的碳源。另外，自诱导的方法省去了监测培养基的菌密度和添加IPTG诱导蛋白表达的步骤，一方面使得实验操作更加简洁，另一方面避免了IPTG对细菌的毒害作用。通过自诱导方法，得到的生物量和FGF-21蛋白的产量均高于IPTG方法。
发明内容
本发明的目的在于构建一种可溶性表达重组人成纤维生长因子21，即FGF-21的基因工程菌，用于生产可溶性、产量高、且成本低的FGF-21。
本发明的一个目的是提出一种可溶性表达FGF-21的基因工程菌。该基因工程菌包括携带重组质粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21的大肠杆菌DH5α，以及同时携带重组质粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21和质粒pTf16-ParaB-tig的大肠杆菌BL21(DE3)，其中，所述的重组质粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21中的PT7lac是质粒pET32a(+)的启动子，TrxA是硫氧还蛋白，6×His是组氨酸纯化标签，所述质粒pTf16-ParaB-tig中的ParaB是质粒pTf16的启动子。
本发明的另一目的是提供一种可溶性表达FGF-21的基因工程菌的构建方法。根据FGF-21的基因序列设计引物，通过PCR扩增获得FGF-21双链DNA，经酶切，插入质粒pET32a(+)，构建成重组质粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21，转化大肠杆菌DH5α，制得含FGF-21DNA序列的基因工程菌，再将质粒pTf16-ParaB-tig和重组质粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21分别转入大肠杆菌BL21(DE3)，获得表达可溶性FGF-21的基因工程菌。
本发明采用以下技术方案：
第一步FGF-21DNA序列的扩增
以含有FGF-21DNA相关序列的质粒pDONR223-FGF-21作为模板，发明人通过委托专业的生物技术公司提供所述质粒pDONR223-FGF-21。根据序列设计引物，通过PCR扩增获得FGF-21DNA序列，同时在该序列两端引入酶切位点Bgl II和EcoR I。PCR产物用DNA GelExtraction Kit回收，获得FGF-21DNA片段，即SEQ ID NO.1序列。
FGF-21DNA序列：
5’CACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGGGGGCCAAGTCCGGCAGCGGTACCTCTACACAGATGATGCCCAGCAGACAGAAGCCCACCTGGAGATCAGGGAGGATGGGACGGTGGGGGGCGCTGCTGACCAGAGCCCCGAAAGTCTCCTGCAGCTGAAAGCCTTGAAGCCGGGAGTTATTCAAATCTTGGGAGTCAAGACATCCAGGTTCCTGTGCCAGCGGCCAGATGGGGCCCTGTATGGATCGCTCCACTTTGACCCTGAGGCCTGCAGCTTCCGGGAGCTGCTTCTTGAGGACGGATACAATGTTTACCAGTCCGAAGCCCACGGCCTCCCGCTGCACCTGCCAGGGAACAAGTCCCCACACCGGGACCCTGCACCCCGAGGACCAGCTCGCTTCCTGCCACTACCAGGCCTGCCCCCCGCACCCCCGGAGCCACCCGGAATCCTGGCCCCCCAGCCCCCCGATGTGGGCTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCAGCTACGCTTCCTGA3’(546bp)，即SEQ ID NO.1序列。
所用引物为：
F1：5’GAAGATCTGGACGACGACGACAAGCACCCCATCCCTGAC3’，即SEQ ID NO.2序列。
BglII
F2：5’ATGAATTCTCAGGAAGCGTAGCTGGGGCTTCGGCCCTGG3’，即SEQ ID NO.3序列。
EcoR I
第二步构建含FGF-21基因序列的基因工程菌
用限制性内切酶Bgl II和EcoR I分别双酶切所述第一步获得的FGF-21DNA片段和质粒pET32a(+)，分别纯化回收大片段，并将其连接，得到含FGF-21DNA片段的重组质粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21，将重组质粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21转化到大肠杆菌DH5α，获得含FGF-21DNA序列的基因工程菌。委托专业的生物技术公司对该基因工程菌测序，证实该基因工程菌含正确如SEQ ID NO.1所示的FGF-21基因片段。
第三步构建可溶性表达FGF-21的基因工程菌
将质粒pTf16-ParaB-tig和重组质粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21分别转入大肠杆菌BL21(DE3)，获得表达可溶性FGF-21的基因工程菌。
上述构建涉及到的质粒pET32a(+)，大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)，限制性内切酶BglII和EcoR I，Ex Taq DNA聚合酶，以及能够表达分子伴侣蛋白的质粒pTf16-ParaB-tig均可从市场购得。委托合成所述引物序列的生物技术公司是上海英骏生物技术有限公司，委托测序的生物技术公司是上海博尚生物技术有限公司。
本发明另一目的在于提供采用本发明构建的基因工程菌生产可溶性FGF-21的生产方法，操作步骤如下：
第一步液体培养
将上述构建好的表达可溶性FGF-21的基因工程菌在LB液体培养基中培养12小时，培养条件是37℃，210rpm。再将培养12小时的菌液按1％的比例转接入乳糖自诱导培养基中。27℃，210rpm培养19小时。取少量菌液进行菌密度检测和FGF-21产量分析，剩下菌液离心收集菌体。
乳糖自诱导培养基的配方组成包括：胰蛋白胨0.25-4％，酵母提取物0.125-2％，NaCl0.125-2％，Na2HPO4 12.5-200mM，KH2PO4 12.5-200mM，(NH4)2SO4 6.25-100mM，MgSO4 0.5-8mM，甘油0.125-2％，葡萄糖0.0125-0.2％，乳糖0.05-0.8％。
优选的乳糖自诱导培养基配方如下：
胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 0.5％，Na2HPO4 50mM，KH2PO4 50mM，(NH4)2SO425mM，MgSO4 2mM，甘油0.5％，葡萄糖0.05％，乳糖0.2％。
第二步纯化制备FGF-21融合蛋白
将第一步中收集的菌体用IDA-0缓冲液重悬，超声破碎后，离心收集上清，进行镍离子亲和层析，收集FGF-21融合蛋白组分，用截留分子量为30KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管将蛋白脱盐和浓缩。
IDA-0缓冲液配方如下：
Tris-HCl(pH 7.4)20mM，0.5M NaCl。
第三步制备FGF-21
用肠激酶酶解FGF-21融合蛋白，30℃裂解10-16小时，终止反应，再次进行镍离子亲和层析，收集含FGF-21的组分，用截留分子量为10KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管将蛋白脱盐和浓缩，得到FGF-21。
本发明另一目的在于提供采用本发明构建的基因工程菌生产的FGF-21在降血糖和脂代谢方面的应用。采用本发明构建的基因工程菌表达的FGF-21具有降血糖和降甘油三酯活性，在制备治疗糖尿病的药物中作该药物的活性成分的应用。
本发明的优点在于：
本发明通过基因工程技术方法构建含有FGF-21的基因工程菌，用该基因工程菌生产的FGF-21是以可溶形式表达，从而大大提高了FGF-21的产量。
本发明通过乳糖自诱导培养基诱导表达FGF-21，省去了监测培养基的菌密度和添加IPTG诱导蛋白表达的步骤，使得实验操作更加简洁；其次，因避免了IPTG对细菌的毒害作用，自诱导方法得到的生物量高，FGF-21产量也高。
因而，用本发明提供的基因工程菌生产FGF-21，产量高，为可溶性形式，有生物学活性，纯化工艺简便，生产成本较低。
以下通过具体附图说明和实施例对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
图1：FGF-21在C57BL/6小鼠中的口服糖耐量(OGTT)检测图
与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
图2：FGF-21在C57BL/6小鼠中的甘油三酯检测图
与对照组相比，**P＜0.01。
具体实施方式
下面通过实施例，进一步详细说明本发明。说明书及实施例中未注明具体条件的实验方法，可按常规条件进行。
实施例1构建可溶性表达FGF-21的基因工程菌。
第一步FGF-21DNA序列的扩增
委托专业的生物技术公司提供含有FGF-21DNA相关序列的质粒pDONR223-FGF-21，根据FGF-21DNA序列设计引物，通过PCR获得FGF-21DNA序列，同时在该序列两端引入酶切位点Bgl II和EcoR I。PCR产物用DNA Gel Extraction Kit回收，获得FGF-21DNA片段。
PCR反应体系中包含：2μl质粒模板，10μl Ex Taq DNA聚合酶，引物F1和F2各0.5μl，6μl无菌水。PCR条件为：94℃，45s；58℃，1min，72℃，90s，经过30个循环后，72℃延伸10min。
FGF-21DNA序列：
5’CACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGGGGGCCAAGTCCGGCAGCGGTACCTCTACACAGATGATGCCCAGCAGACAGAAGCCCACCTGGAGATCAGGGAGGATGGGACGGTGGGGGGCGCTGCTGACCAGAGCCCCGAAAGTCTCCTGCAGCTGAAAGCCTTGAAGCCGGGAGTTATTCAAATCTTGGGAGTCAAGACATCCAGGTTCCTGTGCCAGCGGCCAGATGGGGCCCTGTATGGATCGCTCCACTTTGACCCTGAGGCCTGCAGCTTCCGGGAGCTGCTTCTTGAGGACGGATACAATGTTTACCAGTCCGAAGCCCACGGCCTCCCGCTGCACCTGCCAGGGAACAAGTCCCCACACCGGGACCCTGCACCCCGAGGACCAGCTCGCTTCCTGCCACTACCAGGCCTGCCCCCCGCACCCCCGGAGCCACCCGGAATCCTGGCCCCCCAGCCCCCCGATGTGGGCTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCAGCTACGCTTCCTGA3’(546bp)
所用引物为：
F1：5’GAAGATCTGGACGACGACGACAAGCACCCCATCCCTGAC3’
Bgl II
F2：5’ATGAATTCTCAGGAAGCGTAGCTGGGGCTTCGGCCCTGG3’
EcoR I
第二步构建含FGF-21基因序列的基因工程菌
用限制性内切酶Bgl II和EcoR I分别双酶切所述第一步获得的FGF-21DNA片段和质粒pET32a(+)，分别纯化回收大片段，并将其连接，得到含FGF-21DNA片段的重组质粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21。将重组质粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21转化到大肠杆菌DH5α，获得含FGF-21DNA序列的基因工程菌，将该基因工程菌委托专业的生物技术公司测序，验证该基因工程菌含正确的FGF-21基因片段。
第三步构建可溶性表达FGF-21的基因工程菌
将质粒pTf16-ParaB-tig和重组质粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21分别转入大肠杆菌BL21(DE3)，获得表达可溶性FGF-21的基因工程菌。
实施例2制备FGF-21
第一步液体培养
将实施例1所构建的表达可溶性FGF-21的基因工程菌在LB液体培养基中培养12小时，培养条件是37℃，210rpm。再将培养12小时的菌液按1％的比例转接入乳糖自诱导培养基中。在27℃，210rpm的条件下培养19小时。取少量菌液进行菌密度检测和FGF-21产量分析，剩下的菌液离心收集菌体。经分析，在分子伴侣tig的协助下，自诱导方法获得的FGF-21融合蛋白占总蛋白的百分比约为25.6％，诱导后的菌密度为OD600nm＝10.7，而不加入分子伴侣tig，采用IPTG诱导则得到的FGF-21融合蛋白占总蛋白百分比约为15.9％，诱导后的菌密度OD600nm＝3.9，说明采用自诱导培养的方法生产FGF-21的产量大大提高。
乳糖自诱导培养基配方如下：
胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 0.5％，Na2HPO4 50mM，KH2PO4 50mM，(NH4)2SO425mM，MgSO4 2mM，甘油0.5％，葡萄糖0.05％，乳糖0.2％。
第二步纯化制备FGF-21融合蛋白
将第一步中收集的菌体用IDA-0缓冲液重悬，超声破碎后，离心收集上清。取镍离子亲和层析柱，用IDA-0缓冲液进行柱平衡。将样品加入镍离子亲和层析柱中，分别用5倍体积的IDA-0，IDA-20，IDA-40，IDA-60，IDA-80，IDA-100，IDA-200，IDA-1000溶液洗脱，分别收集穿透部分和各个组分的洗脱液，用于SDS-PAGE分析蛋白质洗脱情况。经SDS-PAGE分析含有FGF-21融合蛋白的洗脱液用截留分子量为30KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管将蛋白脱盐和浓缩。
IDA-0缓冲液配方如下：
Tris-HCl(pH 7.4)20mM，0.5M NaCl。
IDA-20缓冲液配方如下
Tris-HCl(pH 7.4)20mM，0.5M NaCl，20mM咪唑。
IDA-40缓冲液配方如下：
Tris-HCl(pH 7.4)20mM，0.5M NaCl，40mM咪唑。
IDA-60缓冲液配方如下：
Tris-HCl(pH 7.4)20mM，0.5M NaCl，60mM咪唑。
IDA-80缓冲液配方如下：
Tris-HCl(pH 7.4)20mM，0.5M NaCl，80mM咪唑。
IDA-100缓冲液配方如下：
Tris-HCl(pH 7.4)20mM，0.5M NaCl，100mM咪唑。
IDA-200缓冲液配方如下：
Tris-HCl(pH 7.4)20mM，0.5M NaCl，200mM咪唑。
IDA-1000缓冲液配方如下：
Tris-HCl(pH 7.4)20mM，0.5M NaCl，1M咪唑。
第三步制备FGF-21
用肠激酶酶解FGF-21融合蛋白，30℃裂解10-16小时，终止反应，再次进行镍离子亲和层析，收集含FGF-21的组分，用截留分子量为10KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管将蛋白脱盐和浓缩，得到FGF-21。
实施例3FGF-21的降血糖作用
在中科院上海生命科学研究院上海斯莱克实验动物有限公司购买清洁级雄性健康C57BL/6小鼠，配置50％葡萄糖溶液，0.9％NaCl溶液，FGF-21溶于0.9％NaCl溶液。测试的血糖测试仪在上海新立医疗器械有限公司购买。
雄性健康C57BL/6小鼠分为2组(n＝6)。1.对照组；2.FGF-21给药组。
每天以皮下注射的方式按0.5mg/kg/d给药，连续给药7天，对照组则连续7天注射0.9％NaCl溶液。在第7天进行小鼠口服糖耐量(OGTT)实验。糖耐量实验是在第6天晚上对小鼠禁食16小时后，于第7天早上测基础血糖，然后按0.5mg/kg皮下注射FGF-21，对照组注射0.9％NaCl溶液。1小时后，按4g/kg对小鼠进行口服50％葡萄糖，记此时为0时刻，再分别于第15、30、45、60、75、90、105分钟进行小鼠尾静脉取血，用血糖测试仪测定血糖浓度，以检测FGF-21的降血糖作用。
实验结果如附图1所示，FGF-21给药组在45、60、75分钟，均能明显降低小鼠血糖，与对照组相比有显著差异(P＜0.05)或极显著差异(P＜0.01)，糖耐量得到改善。说明按本发明方法制备的FGF-21具有降低血糖的生物学活性，可在制备治疗糖尿病的药物中作该药物的活性成分的应用。
实施例4FGF-21对脂代谢的影响
在中科院上海生命科学研究院上海斯莱克实验动物有限公司购买清洁级雄性健康C57BL/6小鼠，配置0.9％NaCl溶液，FGF-21溶于0.9％NaCl溶液。
雄性健康C57BL/6小鼠分为2组(n＝6)。1.对照组；2.FGF-21给药组。
每天以皮下注射的方式按0.5mg/kg/d给药，连续给药28天，对照组则连续28天注射0.9％NaCl溶液。于第29天对小鼠眼球采血，血样4℃放置30-60min后，4000r/min离心10min，取血清，委托德赛诊断系统(上海)有限公司测定血清中甘油三酯水平。
实验结果如附图2所示，FGF-21给药组能明显降低小鼠甘油三酯水平，与对照组相比有极显著差异(P＜0.01)。说明按本发明方法制备的FGF-21能够影响小鼠的脂代谢，可在制备治疗糖尿病的药物中作该药物的活性成分的应用。
序列表
<110>华东师范大学
<120>表达可溶性FGF-21的基因工程菌及其构建方法和应用
<130>
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>546
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(546)
<400>1
cac ccc atc cct gac tcc agt cct ctc ctg caa ttc ggg ggc caa gtc 48
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
cgg cag cgg tac ctc tac aca gat gat gcc cag cag aca gaa gcc cac 96
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
ctg gag atc agg gag gat ggg acg gtg ggg ggc gct gct gac cag agc 144
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
ccc gaa agt ctc ctg cag ctg aaa gcc ttg aag ccg gga gtt att caa 192
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
atc ttg gga gtc aag aca tcc agg ttc ctg tgc cag cgg cca gat ggg 240
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
gcc ctg tat gga tcg ctc cac ttt gac cct gag gcc tgc agc ttc cgg 288
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
gag ctg ctt ctt gag gac gga tac aat gtt tac cag tcc gaa gcc cac 336
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
ggc ctc ccg ctg cac ctg cca ggg aac aag tcc cca cac cgg gac cct 384
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
gca ccc cga gga cca gct cgc ttc ctg cca cta cca ggc ctg ccc ccc 432
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
gca ccc ccg gag cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc ccc gat gtg 480
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
ggc tcc tcg gac cct ctg agc atg gtg gga cct tcc cag ggc cga agc 528
G1y Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser G1n G1y Arg Ser
165 170 175
ccc agc tac gct tcc tga 546
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210>2
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer
<222>(1)..(39)
<400>2
gaagatctgg acgacgacga caagcacccc atccctgac 39
<210>3
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer
<222>(1)..(39)
<400>3
atgaattctc aggaagcgta gctggggctt cggccctgg 39
Claims (5)
1.一种表达可溶性FGF-21的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌包括携带重组质粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21的大肠杆菌DH5α，以及同时携带重组质粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21和质粒pTf16-ParaB-tig的大肠杆菌BL21(DE3)；其中，所述重组质粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21中的PT7lac是质粒pET32a(+)的启动子，TrxA是硫氧还蛋白，6×His是组氨酸纯化标签；所述质粒pTf16-ParaB-tig中的ParaB是质粒pTf16的启动子。
2.如权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
第一步FGF-21 DNA序列的扩增
以含有FGF-21 DNA序列，即SEQ ID NO.1序列的重组质粒作为模板；
设计引物，引物为：
F1：5’GAAGATCTGGACGACGACGACAAGCACCCCATCCCTGAC3’，即SEQ ID NO.2序列；
F2：5’ATGAATTCTCAGGAAGCGTAGCTGGGGCTTCGGCCCTGG3’，即SEQ ID NO.3序列；
通过PCR扩增获得FGF-21 DNA序列，同时在该序列两端引入酶切位点Bgl II和EcoR I；
第二步构建含FGF-21 DNA序列的基因工程菌
用限制性内切酶Bgl II和EcoR I分别双酶切所述第一步获得的FGF-21 DNA片段和质粒pET32a(+)，分别纯化回收大片段，并将其连接，得到含FGF-21 DNA片段的重组质粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21；
将所述重组质粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21转化到大肠杆菌DH5α，构建含FGF-21 DNA序列的基因工程菌；
第三步构建可溶性表达FGF-21的基因工程菌
将质粒pTf16-ParaB-tig和重组质粒pET32a(+)-PT7lac-TrxA-6×His-FGF-21分别转入大肠杆菌BL21(DE3)，获得表达可溶性FGF-21的基因工程菌。
3.一种用权利要求1所述的基因工程菌生产FGF-21的方法，其特征在于，步骤如下：
第一步液体培养
将所述表达可溶性FGF-21的基因工程菌在LB液体培养基中培养；然后，将培养所得菌液按比例转接入乳糖自诱导培养基中培养；最后离心收集菌体；
第二步纯化制备FGF-21融合蛋白
将第一步中收集的菌体用IDA-0缓冲液重悬，超声破碎后，离心收集上清，进行镍离子亲和层析，收集FGF-21融合蛋白；其中，所述IDA-0缓冲液的组成包括：Tris-HCl(pH7.4)20mM，0.5M NaCl；
第三步制备FGF-21
用肠激酶酶解以上所得的FGF-21融合蛋白，经裂解后，再次进行镍离子亲和层析，收集含FGF-21的组分，并用超滤管将其脱盐和浓缩，得到产物FGF-21。
4.如权利要求3所述的生产FGF-21的方法，其特征在于，所述乳糖自诱导培养基的配方包括：胰蛋白胨0.25-4％，酵母提取物0.125-2％，NaCl 0.125-2％，Na2HPO4 12.5-200mM，KH2PO4 12.5-200mM，(NH4)2SO4 6.25-100mM，MgSO4 0.5-8mM，甘油0.125-2％，葡萄糖0.0125-0.2％，乳糖0.05-0.8％。
5.根据权利要求1所述基因工程菌表达的FGF-21，在制备治疗糖尿病的药物中作该药物活性成分的应用。
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