CN102603886B

CN102603886B - 突变的成纤维细胞生长因子及在治疗ii型糖尿病中的用途

Info

Publication number: CN102603886B
Application number: CN 201210031800
Authority: CN
Inventors: 王文飞; 吴云舟; 刘铭瑶; 李德山; 何昆; 任桂萍
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2012-02-14
Filing date: 2012-02-14
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2032-02-14
Also published as: CN102603886A

Abstract

本发明公开了突变的成纤维细胞生长因子（FGF-21）及其在治疗内分泌疾病中的用途。本发明突变的成纤维细胞生长因子-21的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示，其编码基因序列为SEQIDNO:1所示。本发明以野生型FGF-21为模板，通过下游引物引入两个精氨酸（Arg），PCR后获得突变体，主要利用Arg的强碱性以及它在生理条件下带正电荷，不仅上调FGF-21的等电点，还帮助FGF-21结合到细胞膜表面。动物学试验结果表明，本发明突变的FGF-21能够更加有效降低动物体内的血糖水平，此外，本发明突变体在降低血糖水平方面还具有起效快、药效持续时间长等优点。本发明突变的FGF-21可作为药物治疗糖尿病，代谢综合症或脂代谢紊乱等内分泌疾病。

Description

突变的成纤维细胞生长因子及在治疗II型糖尿病中的用途

技术领域

本发明涉及成纤维细胞生长因子，尤其涉及突变的成纤维细胞生长因子及其制备方法，本发明还涉及该突变的成纤维细胞生长因子在制备治疗内分泌疾病药物中的用途，属于成纤维细胞生长因子领域。

背景技术

糖尿病是继心脑血管疾病和肿瘤之后的人类第三大杀手。随着生活模式、饮食结构的改变，全世界糖尿病患病率呈急剧上升的趋势。预计到2030年世界糖尿病患病人数将增至3．66亿人，糖尿病将成为世界各个国家一个沉重的负担。

对于 2型糖尿病，绝大多数的患者不可避免的要用药物来治疗。其中，口服药物有三大类：第一类为黄脲类。如优降糖，糖适平，达美康，美吡达等。黄脲类药能够刺激胰岛分泌胰岛素，但胰岛素分泌多了以后，可以引起低血糖，这对低血糖患者而言是一个不可忽视的危险因素，而且部分药物具有较大副作用，如可引起肝功能损伤。第二类药是双胍类药。如降糖灵和二甲双胍；双胍类药并不刺激胰岛素分泌，它刺激机体在细胞水平上提高胰岛素的利用，但对于胰岛素分泌不足的糖尿病患者而言，其发挥的作用就很有限，而且还有乳酸性酸中毒等不良反应。第三类药是a糖苷酶抑制剂，如拜糖平等；这类药的作用是减少人体对饮食中糖的吸收，因为吸收减少，血糖升高也比较缓慢。但该药的主要副作用就是胃肠反应，服用后如发生低血糖反应，还要口服或静脉注射葡萄糖。

目前注射药物主要是胰岛素，注射用的胰岛素在糖尿病的治疗中发挥着重要的作用。但也有其不足，主要为用药后心慌、表情异常、流汗等，重者产生胰岛素休克或低血糖性惊厥；注射胰岛素的患者，经一度停药再用药时，对胰岛素的需用量愈来愈大，使患者必须每天必须多次注射胰岛素，给患者带来很大痛苦，而且大剂量用药也加大了集体产生副作用的机制，其原因可能是机体产生了胰岛素抗体，抗体与胰岛素结合而减弱其作用。

近年来，随着人基因组序列的破译，一批具有独立调节血糖，有望成为新型治疗糖尿病药物的蛋白被相继发现，成纤维细胞生长因子-21（FGF-21）就是其中之一。已有大量实验证明FGF-21是除胰岛素外，生物体内又一个能够独立调节代谢水平的蛋白因子。在已完成的研究中发现，FGF-21能够独立促进小鼠3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄取(不论胰岛素存在与否)，并以剂量依赖性的方式降低ob／ob和db／db小鼠以及ZDF大鼠餐后及空腹时血中的葡萄糖、甘油三酯及糖原水平。更重要的是，在发挥作用的同时，FGF-21没有引起低血糖等其它糖尿病治疗药物常见的副作用。FGF-21的发现为糖尿病患者尤其是糖尿病晚期胰岛素抵抗严重的患者带来了新的希望。但是FGF-21在人体内代谢时间较短，同胰岛素一样需要多次注射才能稳定患者血糖。

因此，将FGF-21进行适当改造，在不改变其原有活性的基础上增加其稳定性及活性，这对于将FGF-21应用于临床具有非常重要的意义。在以往生物药物研究中，多采用随机突变的方法进行蛋白改造，由于突变的随机性及蛋白功能的复杂性，随机突变结果往往适得其反，浪费了大量人力和物力。

发明内容

本发明的目的之一是提供突变的成纤维细胞生长因子-21（FGF-21）及其编码基因；

本发明的目的之二是提供一种设计该突变的成纤维细胞生长因子-21（FGF-21）的理论基础；

本发明目的之三是提供含有突变的成纤维细胞生长因子-21（FGF-21）基因的表达载体或质粒以及含有该表达载体和宿主细胞；

本发明目的之四是将该突变的成纤维细胞生长因子-21（FGF-21）应用于制备成治疗糖尿病的药物或药物组合物。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种突变的FGF-21，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示；编码该突变的FGF-21的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。

主要利用Arg的强碱性以及它在生理条件下带正电荷，不仅上调FGF-21的等电点，改善了FGF-21的稳定性，还帮助FGF-21结合到细胞膜表面，赋予了FGF-21在降低血糖水平方面起效快、药效好等优点。并且，本发明目的明确，保留了很高的同源性，节省了大量后续工作。有利于加快该蛋白的药用开发。

本发明所述突变的FGF-21的方法，包括如下步骤：以从正常人肝脏中提取的RNA为模版，并以此为模板逆转录获得编码FGF-21 的基因，以此为模板，通过下游引物引入突变，PCR后获得突变体，将所获得的突变基因连接到构建好的表达载体中；将所述表达载体转化适当的宿主细胞，并进行诱导表达，活性检测。

含有该突变的FGF-21核苷酸序列的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞也当然的包括在本发明的保护范围之内。优选的，可以将突变的FGF-21核苷酸序列与分子伴侣相连接，再将其克隆到表达载体中。其中，所述的分子伴侣优选为小分子泛素样修饰蛋白（SUMO）；

本发明还提供了一种生产突变FGF-21的方法，包括：将突变的FGF-21核苷酸序列与分子伴侣相连接，再将其克隆到表达载体中，得到重组表达载体；将该重组表达载体转化至宿主细胞中；诱导表达FGF-21，分离纯化FGF-21，利用蛋白酶切除与其融合表达的分子伴侣部分，纯化，即得。

优选的，所述的表达载体可以是pET-30a（+），所述的宿主细胞可以是Transetta (DE3) ；所述的分子伴侣优选为小分子泛素样修饰蛋白（SUMO）；其中，所述的纯化包括：将酶切后的蛋白进行树脂亲和层析，依次经洗涤、洗脱、脱盐。

动物学试验结果表明，本发明突变的FGF-21相比于野生型FGF-21，能够更加有效降低动物体内的血糖水平，此外，本发明突变的FGF-21在降低血糖水平方面还具有起效快、药效持续时间长等优点。本发明突变的FGF-21可作为药物治疗糖尿病，代谢综合症或脂代谢紊乱等内分泌疾病。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

说明：本发明中涉及的基因的设计、合成和克隆，表达载体的构建，核酸提取及序列分析及鉴定，以及表达产物的分离和纯化等操作步骤，可按照本领域已知的技术进行(参见CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

附图说明

图一为蛋白电泳图。

图二为突变蛋白与野生型蛋白在体外糖吸收效果的比较图。

图三为突变蛋白与野生型蛋白在动物实验上降血糖效果的比较图。

图四为两种蛋白在体内半衰期比较图。

实施例1 FGF-21基因的克隆

根据FGF-21基因去除信号肽的核苷酸序列，设计引物，通过互补延伸的方法获得去除信号肽的FGF-21基因。利用在线软件Primer5.0设计FGF-21突变体引物。

以提取的人肝脏总RNA为模板，Oligo(dT)₁₅为引物，参照M-MLV反转录酶M-MLVRT说明书进行cDNA第一条链合成，反应体系和具体操作分别如下：

70℃水浴5min，冰上放置5min，依次加入：

37 ℃水浴2 h，70 ℃水浴15 min，取2 µl用于PCR扩增反应。采用常规PCR方法扩增FGF-21突变体成熟多肽cDNA，PCR反应（50 µl体系）如下：

P1：5’GGTCTCTAGGT CACCCCATCCCTGACTCCAGT 3’

P2：5’CGCGGATCCTTACCGCCGGGACGCATAGCTGGGGCTTCGG 3’混匀后进行PCR扩增。循环参数为：94℃预变性5 min，94℃ 1 min，56℃1 min，72℃ 1 min的顺序，25个循环后，72 ℃再延伸10 min。最终得到全长的FGF-21突变体基因。

实施例2 突变的成纤维细胞生长因子-21的制备及活性检测

1、突变FGF-21基因表达载体的构建

将实施例1回收后的FGF-21突变体目的片段与原核表达载体pET30a（+）连接，连接反应体系（10 µl）如下：

共10 µl体系，混匀，4 ℃连接过夜。经过酶切鉴定后，构建得到重组质粒pET-30a-FGF-21；

2、突变的FGF-21蛋白的获得

（1）、诱导表达

将含有正确序列的连入FGF-21及含有SUMO标签的pET30a质粒转化至表达菌株Transetta (DE3) （北京全式金生物技术有限公司,目录号：CD801）。转化后的单菌落分别接种至5 mL LB培养基中，37℃培养10 h，以1:100接种于500 mL含青霉素（50 mg/mL）的LB培养基中，37℃培养2 h，A600=0.3-0.6时，加入IPTG至终浓度为0.25 mmol/L进行诱导，诱导3 h后分收获菌体进行超声破碎后离心，分别取上清和沉淀进行12%SDS-PAGE电泳分析。菌体经超声破碎后离心，可溶性表达的目的蛋白可占菌体总目的蛋白的90％以上；

（2）、蛋白质纯化

菌体经超声破碎后离心，上清液经HisTrapTM FF crude colum亲和层析，用杂蛋白洗脱液（40mmol/L 咪唑，500 mmol/L NaCl，50mmol/L Na₃PO₄，pH7.4）洗去杂蛋白后，用洗脱液（500 mmol/L咪唑，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L Na₃PO₄，pH7.4）洗脱融合蛋白，收集洗脱的峰。融合蛋白经HiPrepTM 26/10Desalting 脱盐后，收集脱盐峰。收集的融合蛋白加入SUMO蛋白酶I和终浓度2 mmol/L的DTT，4℃过夜切割，再经HisTrapTM FF crude colum收集紫外吸收峰，12% SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示。

（3）、重组蛋白活性检测

3T3-L1脂肪细胞（ATCC，货号：CL-173™）饥饿12 h，用细胞培养基稀释纯化好的FGF-21蛋白，使其终浓度为0.002、0.02、0.2、2、20mg/L，以每孔1 ml的量将不同浓度的稀释液加入到已分化成熟的脂肪细胞中。每个浓度至少设3个重复孔。

葡萄糖浓度的检测：上述蛋白孵育细胞24 h后，取上清培养基2 μl放入200 μl的葡萄糖检测液中测定葡萄糖的含量。每个浓度至少重复3次，37 ℃反应5～10分钟后，在500 nm波长下测OD值。计算培养液中残留的葡萄糖浓度，公式为：

计算细胞对葡萄糖的消耗率，公式为：

最后运用统计学分析实验结果。

用相同剂量的野生型FGF-21和突变的FGF-21蛋白处理HepG2细胞24h后，经微量化的GOD-POD法葡萄糖检测试剂盒检测培养基中葡萄糖含量，统计学分析结果显示，两种蛋白处理的细胞对葡萄糖的摄取利用显著增加，与未经任何处理的对照组相比，残存在培养基中的葡萄糖含量明显减少。本实验未经处理的HepG2细胞葡萄糖消耗率只有31.1%，而野生型FGF-21和突变的FGF-21作用的HepG2细胞葡萄糖消耗率分别为46.9%和55.0%，说明突变蛋白同野生型蛋白一样具有调节细胞葡萄糖代谢的作用，作用效果相对于野生型FGF21差异极显著。在30h，36h时，突变蛋白刺激的HepG2细胞葡萄糖吸收速率都维持在较高水平，而野生型蛋白刺激的HepG2细胞葡萄糖吸收速率有所下降，说明突变蛋白具有更好地调节细胞葡萄糖代谢的作用并能持续更长的时间，如图2所示。

实施例3 本发明突变FGF-21蛋白的体内活性试验

自发性2型糖尿病db/db模型小鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物质量合格证号SCXK（沪））随机分为3组，每组5只。通过皮下给药方式，阴性对照组注射生理盐水；野生组与突变组以0.75 mg/kg剂量注射蛋白。实验开始于上午8点（此时模型动物血糖为一天内较高值），实验过程中自由饮食。检测模型动物经不同处理后的血糖变化情况，所得实验数据进行统计学分析，结果如图3所示。

实施例4 本发明突变FGF-21蛋白的体内半衰期检测试验

将6只家兔分成2组，将野生型FGF-21和突变FGF-21以0.2mg/kg的剂量分别皮下注射家兔，耳静脉取注射蛋白1.5h、2h、3h、4h和5h后的血液，12000rpm，离心10min，吸取血清并用Elisa（直接法）进行检测。根据Elisa结果绘制清除曲线（如下图），根据t_1/2 = 0.693/k_e（k_e是清除曲线的斜率）计算之后，野生型FGF-21的半衰期是35min，突变FGF-21的半衰期是103min，结果如图4所示。

序列表

SEQ ID NO:1 核酸序列

cac ccc atccctgactccagtcctctcctgcaattcgggggccaagtc

cgg cag cggtacctctacaca gat gatgcc cag cagacagaagcccac

ctg gag atcagg gag gat gggacggtggggggcgctgctgac cag agc

cccgaaagtctcctg cag ctgaaagccttgaagccgggagttattcaa

atcttgggagtcaagacatccaggttcctgtgc cag cggcca gat ggg

gccctg tat ggatcgctccactttgaccct gag gcctgcagcttccgg

gagctgcttctt gag gacggatacaatgtttac cag tccgaagcccac

ggcctcccgctgcacctgccagggaacaagtccccacaccgggaccct

gca ccc cgaggaccagctcgcttcctgccactaccaggcctg ccc ccc

gcactcccg gag cca ccc ggaatcctggcc ccc cag ccc ccc gat gtg

ggctcctcggaccctctgagcatggtgggaccttcc cag ggccgaagc

ccc agctacgcttcccggcggtga

SEQ ID NO:2 蛋白序列

His Pro Ile Pro Asp SerSer Pro LeuLeuGlnPheGlyGlyGln Val

1 5 10 15

ArgGlnArg Tyr Leu Tyr Thr Asp AspAlaGlnGlnThrGluAla His

20 25 30

LeuGlu Ile ArgGlu Asp GlyThr Val GlyGlyAlaAla Asp GlnSer

35 40 45

Pro GluSerLeuLeuGlnLeuLysAlaLeuLys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile LeuGly Val Lys ThrSerArgPheLeuCysGlnArg Pro Asp Gly

65 70 75 80

AlaLeu Tyr GlySerLeu His Phe Asp Pro GluAlaCysSerPheArg

85 90 95

GluLeuLeuLeuGlu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr GlnSerGluAla His

100 105 110

GlyLeu Pro Leu His Leu Pro GlyAsnLysSer Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro ArgGly Pro AlaArgPheLeu Pro Leu Pro GlyLeu Pro Pro

130 135 140

AlaLeu Pro Glu Pro ProGly Ile LeuAla Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

GlySerSer Asp Pro LeuSer Met Val Gly Pro SerGlnGlyArgSer

165 170 175

Pro Ser Tyr AlaSerArgArg

180

Claims

1.一种突变的成纤维细胞生长因子-21，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。

2.编码权利要求1所述的突变的成纤维细胞生长因子-21基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。

3.含有权利要求2所述突变的成纤维细胞生长因子-21基因的表达载体。

4.含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。

5.一种制备权利要求1所述的成纤维细胞生长因子-21的方法，包括：将编码该突变的成纤维细胞生长因子-21的核苷酸序列与分子伴侣相融合，得到融合基因；将融合基因可操作的与表达载体相连接，得到重组表达载体；将该重组表达载体转化至宿主细胞中；诱导表达成纤维细胞生长因子-21，分离纯化成纤维细胞生长因子-21，利用蛋白酶切除与其融合表达的分子伴侣部分，纯化，即得。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的分子伴侣为小分子泛素样修饰蛋白。

7.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的纯化包括：将酶切后的蛋白进行树脂亲和层析，依次经过洗涤、洗脱、脱盐。

8.一种治疗II型糖尿病的药物组合物，包括：治疗上有效量的权利要求1所述的突变的成纤维细胞生长因子-21和药学上可接受的载体或辅料。

9.权利要求1所述的突变的成纤维细胞生长因子-21在制备治疗II型糖尿病药物中的用途。