KR20180035878A

KR20180035878A - Glp-1 분비촉진제

Info

Publication number: KR20180035878A
Application number: KR1020187006014A
Authority: KR
Inventors: 토시히코 야다; 유사쿠 이와사키; 히로시 하라; 토오루 히라; 유카 키시모토; 마치코 미나미
Original assignee: 각코우호우진 지치 이카다이가쿠; 마쓰다니가가꾸고오교가부시끼가이샤; 국립대학법인 홋가이도 다이가쿠
Priority date: 2015-07-29
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2018-04-06
Also published as: CN108135918A; EP3329922A1; WO2017018500A1; JP6896247B2; EP3329922A4; US20180214467A1; JPWO2017018500A1

Abstract

본 발명은 자당을 필수 구성으로 하지 않고도 GLP-1의 분비를 촉진할 수 있는, 비교적 저가이며 안정성이 우수한 인크레틴 호르몬 관련약인 GLP-1 분비 촉진제를 제공하는 것을 과제로 하며, D-프시코오스를 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 GLP-1 분비 촉진제에 의해 상기 과제를 해결한다.

Description

GLP-1 분비촉진제{GLP-1 SECRETAGOGUE}

본 발명은 내당능 이상의 치료 또는 당뇨병의 예방 등에 유용한, 인크레틴 호르몬인 GLP-1의 분비 촉진제에 관한 것이다.

글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1)은 식사 섭취에 의해 소화관에서 분비되며, 췌장으로부터의 인슐린 분비를 촉진하는 작용을 갖는 인크레틴 호르몬의 일종이다. GLP-1은 소화관의 관강(管腔) 내로의 영양소 유입에 응답하여, 소화관의 내분비 세포의 하나인 L세포로부터 분비되며, 췌장의 β세포 표면에 있는 GLP-1 수용체에 결합하여, β세포 내로부터 인슐린 분비를 촉진한다. GLP-1은 혈당치를 상승시키는 호르몬인 글루카곤의 분비를 억제하며, 또한 췌장 β세포의 보호 작용/증식 촉진 등의 작용도 동물에서 확인되고 있다. 그 외의 작용으로서, 심보호 작용이나 심박출량을 증가시키거나, 고혈압 개선 작용, 염증성 면역 응답을 약화시키는 작용, 섭취한 음식물의 위로부터의 배출을 늦추는 작용 등도 있어, GLP-1의 분비를 촉진하는 작용을 갖는 물질은 매우 유용하다.

한편, 국제 당뇨 연맹(IDF)은 세계의 당뇨병에 관한 조사를 정리한 「당뇨 아트라스 제 6판 2014 UPDATE」에서, 세계의 당뇨병 인구는 폭발적으로 계속 증가하고 있으며, 2014년 현재 당뇨병 유병자 수는 3억 8천 6백 7십만명(유병율 8.3%)으로 늘어, 유효한 대책을 실시하지 않으면 2035년에는 5억 9천 1백 9십만까지 증가할 것이라고 예측하고 있다. 즉, 당뇨병은 세계적으로 심각한 질병인 것은 명백하다.

일본 당뇨병 학회가 공표한 「과학적 근거에 기초한 당뇨병 진료 가이드라인 2013」의 「당뇨병 진단의 지침」에는, 당뇨병의 진단은 만성 고혈당인지 아닌지에 증상 등을 가미하여 수행한다고 되어 있으며, 고혈당인지 아닌지는 공복시 혈당치와 75g 경구 당 부하 시험(OGTT) 2시간치의 조합에 의한 판정 및 HbAc1(NGSP)치≥6.5%를 기준으로 한 판정에 의해 수행한다고 되어 있다. 그리고, 공복시 혈당치 126㎎/dl 이상을 당뇨병역, 110~126㎎/dl을 경계역으로 구분하고, 또한 OGTT 2시간치 200㎎/dl 이상을 당뇨병역, 140~200㎎/dl을 경계역으로 구분하고 있으며, 미국 당뇨병 학회나 WHO에서는 공복시 혈당치로 정의한 IFG(impaired fasting glucose)와 OGTT 2시간치로 정의한 IGT(impaird glucose tolerance)를 구별하고 있는 바, 일본 당뇨병 학회에서는 양자를 합쳐 「경계형」이라 부르고 있다. 이 「경계형」은 치료 등의 대처를 전혀 하지 않은 경우에는 「당뇨병형」으로 진행하기 때문에 적절한 치료나 대처가 필요하다.

이들 「경계형」 및 「당뇨병형」의 당뇨병 관련 질병의 치료에서는 최근,인크레틴 호르몬인 글루코오스 의존성 인슐린 분비 자극 폴리펩타이드(GIP)나 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1) 관련약이 주목받고 있다. 특히, 일본인은 인슐린 분비능, 특히 식후의 인슐린 분비능이 낮다고 하여, 지금까지는 인슐린의 주사에 의해 혈당치를 확실하게 낮추는 치료법이 일반적으로 채용되어 왔지만, 인슐린은 혈당치를 너무 낮춘다는 리스크도 있으므로, 혈당치를 과도하게 낮추지 않는 상기 인크레틴 호르몬 관련약이 주목받고 있다.

GIP는 주로 장관 상부에 존재하는 K세포에 대한 자극에 의해 분비되며, GLP-1은 상술한 바와 같이 주로 장관 하부에 존재하는 L세포에 대한 자극에 의해 분비되는 인크레틴 호르몬이다. 인크레틴 호르몬은 췌장에 작용하여 고혈당시에 인슐린 분비를 촉진시키고, 고혈당이 아닌 경우에는 인슐린 분비를 촉진시키지 않으므로 저혈당을 일으킬 위험이 적다. 그러나, 한편으로 인크레틴 호르몬은 인크레틴 분해 효소(DPP-4)에 의해 빠르게 분해된다는 결점이 있으므로, 인크레틴의 분해를 억제하는 「DPP-4 저해제」나 DPP-4의 작용을 받지 않는 「인크레틴 호르몬 아날로그」가 개발되어, 부작용이 적은 것으로서 상당히 기대를 받고 있다. 그러나, 어떠한 인크레틴 호르몬 관련약도 자연계에 존재하는 것이 아니므로, 그 제조 비용은 저렴하지 않다.

인크레틴 호르몬 관련약으로는 상기 DPP-4 저해제나 인크레틴 호르몬 아날로그약 외에, 아카보즈, 보글리보스, 미그리톨 등의 이당류 분해 효소 저해약(α-GI제)도 알려져 있다. 그러나, 이들은 합성된 것으로서 저렴하지 않고, 매일 식사와 함께 경구 섭취할 수 있지만, 의사의 처방이 필요하다.

또한, 이들 종래의 α-GI제는 길항형의 이당류 분해 효소 저해제이므로 그 저해 작용에는 편차가 있어 항상 일정한 효과를 얻을 수 있는 것이 아니므로, 그 문제를 해결하기 위해서, 길항형 저해제 대신 비길항형의 자당 분해 효소 저해제인 L-아라비노스, D-자일로스 및/또는 D-타가토스와, 자당을 유효 성분으로 함유하거나, 자당 함유 식품과 함께 섭취하는 것을 특징으로 하는 약제가 제안되어 있다(일본 특허공개 2013-63947호 공보). 그러나, 이 약제는 자당을 필수 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하고 있어, 본래 당뇨병 환자에게 섭취를 제한해야 하는 자당을 필수로 하기 때문에, 그 사용 방법에 세심한 주의를 기울여야 하는 불편이 있었다.

본 발명의 목적은 상기 선행기술을 감안하여, 자당을 필수의 유효 성분으로 하지 않고도, 혹은 자당을 별도로 투여하지 않고도 GLP-1의 분비를 촉진하는, 비교적 저가이며 안전성이 우수한 인크레틴 호르몬 관련약인 GLP-1 촉진제를 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 이러한 과제를 해결하기 위하여 여러 가지로 검토한 결과, 의외로 D-프시코오스가 자당을 필수로 하지 않고도 GLP-1의 분비를 촉진하는 것을 발견하였다.

D-프시코오스는 α-GI제로 알려져 있으므로(Tech. Bull. Fac. Agr. Kagawa Univ., Vol. 58, 27-32, 2006), 당초 발명자들은 자당 분해 효소 저해제로서 알려진 L-아라비노스, D-자일로스 또는 D-타가토스와 마찬가지로 D-프시코오스도 자당을 동시에 섭취하지 않는 한은 GLP-1의 분비를 촉진하지 않을 것이라 추측하였다. 또한, 상세는 후술하겠지만, 마우스 대장에서 유래한 GLP-1 산생 세포에서의 GLP-1 분비 실험에서, GLP-1을 분비하는 것으로 알려져 있는 난소화성 덱스트린(포지티브 컨트롤)과는 달리, D-프시코오스가 GLP-1을 분비하지 않았다는 실험 결과로부터, D-프시코오스가, 자당을 필수의 유효 성분으로 하지 않고도, 혹은 자당 혹은 자당 함유 식품을 동시에 섭취하지 않고도 GLP-1의 분비를 촉진할 것이라고는 전혀 생각하지 못했다. 따라서, 포유 동물에게 D-프시코오스만을 경구 섭취시키는 것만으로 GLP-1의 분비를 촉진시킬 수 있다는 사실은 놀랄 만한 발견이었다. 또한, 앞서 서술한 GIP는 GLP-1과 마찬가지로 인슐린 분비를 촉진시키는 인크레틴 호르몬으로 알려졌지만, GLP-1과는 달리, 지방 합성계를 활성화하여 지방 축적을 유도하는 것으로 알려져 있는 바, 본 발명의 GLP-1 분비 촉진제는 GIP의 분비를 촉진하지 않음을 알 수 있었다.

즉, 본 발명은 상기 사실에 기초하여 완성된 것으로, 이하의 (1)~(6)으로 구성되는 것이다.

(1) D-프시코오스를 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 GLP-1 분비 촉진제.

(2) 자당을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 GLP-1 분비 촉진제.

(3) 공복시에 투여되는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 GLP-1 분비 촉진제.

(4) 유효 성분인 D-프시코오스가 1회에 5g 이상의 양이 되도록 투여되는 것을 특징으로 하는 상기 (1) ~ (3) 중 어느 한 항에 기재된 GLP-1 분비 촉진제.

(5) 자당 혹은 자당 함유 식품의 섭취없이 투여되는 것을 특징으로 하는 상기 (1) ~ (4) 중 어느 한 항에 기재된 GLP-1 분비 촉진제.

(6) 상기 (1) ~ (5) 중 어느 한 항에 기재된 GLP-1 분비 촉진제 및 수용성 식물 섬유를 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 GLP-1 분비 촉진 조성물.

본 발명의 GLP-1 분비 촉진제는 D-프시코오스를 유효 성분으로 하는 것으로, 그 D-프시코오스의 식경험 및 안전성은 확인되어 있으며, 약제와 같은 부작용이 인정되지도 않고 자당을 필수 성분으로 하지도 않으므로 매우 사용하기 쉬워, 간편하게 포유 동물의 GLP-1 분비를 촉진할 수 있다. 또한, D-프시코오스는 칼로리가 0이면서 설탕의 70% 정도의 단맛을 가지며, 자당을 필수 성분으로 하지 않고도 우수한 GLP-1 분비능을 가지므로, 2키로칼로리/g의 열량을 가짐과 동시에, GLP-1 분비에 자당이 필수인 D-타가토스와 비교하여, 섭취 칼로리를 크게 저감시킬 수 있다는 점에서 유용하다.

도 1은 마우스 대장에서 유래된 GLP-1 산생 세포에서의, D-프시코오스 10mM, 20mM, 40mM의 각 용액 또는 난소화성 덱스트린(화이버솔 2) 10mM 용액에 대한 GLP-1 분비 실험의 결과를 나타내는 도면.
도 2는 절식 마우스에게 1g/㎏의 D-프시코오스를 경구 투여한 후의 시간의 경과에 따른 문맥 중의 액티브 GLP-1 농도(a), 토탈 GLP-1 농도(b) 및 토탈 GIP 농도(c)를 나타내는 도면.
도 3은 마우스에게 생리 식염수, D-프시코오스 0.3g/㎏ 혹은 1.0g/㎏, D-타카토스 1.0g/㎏ 또는 D-글루코오스 1.0g/㎏을 각각 경구 투여하고, 투여 30분 후의 문맥혈에서의 액티브 GLP-1 농도(a) 및 토탈 GIP 농도(b)를 나타내는 도면.
도 4는 절식 마우스를 이용한 D-프시코오스 1g/㎏ 경구 투여에 의한 섭식 억제 효과에 대한 GLP-1 수용체 저해제(Exendin-9, Ex-9)의 효과를 나타내는 도면. 즉, 절식 마우스에 Ex-9(200mmol/㎏) 또는 생리 식염수를 복강 내 투여하고, 그 후 바로 생리 식염수 혹은 D-프시코오스 1g/㎏을 경구 투여하여, 투여 후 30분에서 6시간 후의 경시적(經時的)인 섭식량을 에너지값(kcal)에 의해 나타낸 도면.
도 5는 D-프시코오스 혹은 D-타가토스 각 1g/㎏을 마우스에 경구 투여한 후 1시간에서 6시간 후의 경시적인 섭식량을, 생리 식염수를 경구 투여했을 때의 섭식량에 대한 상대값에 의해 나타낸 도면.
도 6은 D-프시코오스, 난소화성 덱스트린(화이버솔 2), 덱스트린(마츠타니 화학공업 주식회사 제품 「파인덱스 #2」) 각 0.2g/㎏을 각각 SD 래트에게 투여 후 0분에서 240분 후의 경시적인 혈중 글루코오스 농도(a) 및 토탈 GLP-1 농도(b)를 나타내는 도면.
도 7은 인간에게 물 200㎖ 또는 D-프시코오스 5g/200㎖, 10g/200㎖ 혹은 15g/200㎖를 섭취시킨 후, 15분 후, 30분 후, 60분 후, 120분 후 및 180분 후의 각 혈중의 토탈 GLP-1을 정량하여, 혈중 농도-시간 곡선 하면적(AUC)을 산출한 결과를 나타내는 도면.

본 발명의 약제는 GLP-1의 분비를 촉진하는 것으로, 내당능 이상의 치료나 당뇨병에 대한 예방/치료 등, GLP-1의 기능을 통한 여러 가지 생리 기능 및 질병/증상의 개선에 매우 유용한 것이다.

본 발명의 GLP-1 분비 촉진제의 유효 성분인 D-프시코오스는 종래 공지된 어떠한 것이라도 사용할 수 있으며, 그 정제도 여하를 불문하고, 즈이나 등의 식물에서 추출한 것, 알칼리 이성화법에 의해 D-글루코오스나 D-프락토오스를 원료에 이성화한 것(예를 들면, 마츠타니 화학공업(주)제 「레어슈가스위트」), 미생물 또는 그 재조합체에서 얻어지는 효소(이소메라아제나 에피메라아제 등)를 이용하는 효소법에 의해 D-글루코오스나 D-프락토오스를 원료로 하여 이성화한 것(예를 들면, 마츠타니 화학공업(주)제 「Astraea Allulose」 등이 있어, 비교적 용이하게 입수할 수 있다.

본 발명의 GLP-1 분비 촉진제가 그 효과를 발휘하기 위해서는 D-프시코오스를 경구 섭취하는 것이 중요하며, 그 때 자당이 장 내에 동시에 존재하는 상태는 필수로 하지 않는다. 즉, 본 발명의 GLP-1 분비 촉진제를 자당 함유 식품에 함유시킬 필요는 없으며, 또한, 본 발명의 GLP-1 분비 촉진제를 자당 혹은 자당 함유 식품과 동시에 섭취하거나 섭취 후에 투여할 필요도 없다.

본 발명의 GLP-1 분비 촉진제의 제형은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 타블렛상, 과립상, 분말상, 캅셀상, 겔상, 졸상 등 모두 가능하고, 또한 제제화는 공지의 방법에 따라 수행할 수 있는데, 유효 성분인 D-프시코오스를 전분이나 카르복시메틸셀룰로오스 등의 약학적으로 허용할 수 있는 담체와 혼합하여, 또는 필요에 따라 안정제, 부형제, 결합제, 붕괴제 등을 첨가함으로써 수행할 수 있다.

본 발명의 GLP-1 분비 촉진제는 유효성분인 D-프시코오스가 1회에 0.07g/체중㎏ 이상의 양이 되도록 투여하는 것이 바람직하며, 1회에 0.07~2.0g/체중㎏이 보다 바람직하고, 1회에 0.1~0.6g/체중㎏의 양인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 GLP-1 분비 촉진제는 공복시에 섭취하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 식전 5분 이전에 섭취하는 것이 바람직하고, 더욱 구체적으로는, 앞선 식후 3시간 경과후, 동시에 다음 식전 10분 이전에 섭취하는 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 GLP-1 분비 촉진제 외에 수용성 식물 섬유를 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 GLP-1 분비 촉진 조성물을 제공한다.

수용성 식물 섬유로는 펙틴, 글루코만난, 알긴산, 구아검, 한천 등의 고점성 식물 섬유, 혹은 난소화성 덱스트린, 폴리덱스트로스, 구아검 분해물 등의 저점성 식물 섬유를 들 수 있다.

이들 중에서, 효과의 관점에서 특히 난소화성 덱스트린, 구아검 가수 분해물, 폴리덱스트로스 등이 바람직하다.

이들 중 저점성 식물 섬유가 취급 및 대장까지의 이동 시간이 짧다는 관점에서 바람직하다. 저점성 수용성 식물 섬유라 함은, 50질량% 이상의 식물섬유를 함유하고, 상온수에 용해하여 저점성의 용액, 대략 5질량% 수용액에서 20mPas 이하의 점도를 나타내는 용액이 되는 식물섬유 소재를 의미한다. 저점성 식물섬유로서 보다 구체적으로는 난소화성 덱스트린, 구아검 가수 분해물, 폴리덱스트로스(예를 들면 라이테스 등), 헤미셀룰로오스에서 유래한 것 등을 들 수 있다.

난소화성 덱스트린은 각종 전분, 예를 들면 감자 전분, 타피오카 전분, 콘스타치, 밀가루 전분 등을 130℃ 이상에서 가열 분해하고, 이것을 아밀라아제로 다시 가수 분해하여, 상법에 따라서, 필요에 따라 탈색, 탈염하여 제조한 것이다. 식물 섬유의 평균 분자량이 500에서 3000 정도, 바람직하게는 1400~2500, 더욱 바람직하게는 2000 전후이다. 글루코오스 잔기가 α-1,4, α-1,6, β-1,2, β-1,3, β-1,6-글루코시드 결합하고, 환원 말단의 일부는 레보글루코산(1,6-안하이드로글루코오스)인, 분기 구조가 발달한 덱스트린이다. 「뉴트리오스」(로켓사제), 「파인화이버」, 「화이버솔 2」(마츠타니 화학 공업 주식회사제)의 상품명으로 시판되고 있다('식품신소재 포럼' NO. 3(1995, 식품신소재 협의회편)).

구아검의 가수 분해물은 구아검을 효소에 의해 가수 분해한 것으로, 그 성상은 통상 저점성으로 냉수 가용, 수용액은 중성으로 무색 투명하다. 구아검 가수 분해물로는 「선화이버」(태양 화학사), 「화이버론」(대일본 제약사)의 상품명으로 시판되고 있다.

헤미셀룰로오스에서 유래된 것은 통상 콘의 외피로부터 알칼리 추출하고, 정제하여 제조된 것으로, 평균 분자량은 약 20만으로 크지만, 5% 수용액의 점도는 10cps 정도로 낮고, 물에 녹아 투명한 액이 된다. 헤미셀룰로오스에서 유래된 것은 「셀룰에이스」(일본 식품 화공사)의 상품명으로 시판되고 있다.

폴리덱스트로스(라이테스)는 포도당과 솔비톨을 구연산의 존재하에서 액압 가열하고 중합시켜 정제한 것으로, 수용성이며 저점성이다. 「라이테스」(화이자사)로서 시판되고 있다.

이들 저점성의 수용성 식물 섬유 중에서도 난소화성 덱스트린이 가장 효과적으로 바람직하다.

본 발명의 GLP-1 분비 촉진제의 유효 성분으로는 D-프시코오스를 단독으로 사용할 수 있지만, GLP-1의 분비를 장시간 유지하고자 하는 경우에는 난소화성 덱스트린을 병용하는 것이 바람직하다. 난소화성 덱스트린은 D-프시코오스보다도 늦게 GLP-1의 분비 촉진 효과를 발휘하므로, 병용함으로써 GLP-1의 분비를 장시간 유지할 수 있기 때문이다.

본 발명의 GLP-1 분비 촉진제와 난소화성 덱스트린은 질량비로 1:0.1~1:100의 비로 포함되는 것이 바람직하고, 1:0.5~1:50인 것이 보다 바람직하다.

실시예

이하에 본 발명의 GLP-1 분비 촉진제의 우수한 효과를 구체적으로 나타낸다. 또한, 실시예의 기재는 발명의 이해를 위한 것으로 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다. 또한, 실시예를 나타내기 전에 참고를 위하여 예비 시험의 결과를 나타낸다.

활성형(액티브) GLP-1은 혈중에서 효소인 DPP-4에 의한 매우 빠른 한정적 분해를 받음으로써 생리 활성을 잃고, 불활성형 GLP-1이 되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 활성형 GLP-1을 측정하고자 하는 경우에는 혈액을 바로 펩타이드 분해 억제제(DPP-4 저해제) 함유 샘플링 실린지에 보존하여 측정하거나, 상당량의 혈액을 채취하는 등의 시도가 필요하다. 그런 점에서, 활성형(액티브) GLP-1과 불활성형 GLP-1을 합친, DPP-4에 의한 영향을 받지 않는 혈중 토탈 GLP-1을 정량함으로써 그 체내 분비량 자체는 알 수 있으므로, 원칙적으로 토탈 GLP-1을 정량함으로써 GLP-1 분비 촉진 효과를 확인하기로 하고, 실험에 의해서는, 참고를 위해 액티브 GLP-1도 함께 측정하기로 하였다.

GIP에 대해서는 활성형과 불활성형을 합친 토탈 GIP를 측정하였다.

(예비 시험)

<배양 세포>

마우스 대장에서 유래한 Glucagon-like peptide-1(GLP-1) 산생 세포주 GLUTag를, 10% FBS를 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's medium으로 37℃, 5% CO₂ 존재 하에서 배양하였다.

<GLP-1 분비 시험>

GLUTag 세포를, 48웰 플레이트에서 서브컨플루언트가 될 때까지 2, 3일간 배양하였다. 각 시료(D-프시코오스 또는 난소화성 덱스트린)를 첨가하기 전에 Hepes 버퍼(140mM NaCl, 4.5mM KCl, 20mM Hepes, 1.2mM CaCl₂, 1.2mM MaCl₂, 10mMD-glucose, 0.1% BSA, pH 7.4)로 웰을 세정하고, 이 버퍼에 용해한 시료 용액을 80μl 첨가하여, 37℃에서 60분간 인큐베이션하였다. 상청을 회수 후, 원심 분리(800×g, 5분간, 4℃)로 세포를 침전시키고, 그 상청 70μl를 동결 보존하였다. 이 상청 중의 토탈 GLP-1을, 시판하는 「Enzyme immuno assay kit」(주식회사 야나이하라 연구소제)로 측정하였다.

<결과>

D-프시코오스의 10mM, 20mM, 40mM의 각 용액 또는 난소화성 덱스트린(마츠타니 화학공업 주식회사 제품「화이버솔 2」(DE10)) 10mM 용액을 첨가하여 상기 GLP-1 분비 시험을 수행한 결과, 난소화성 덱스트린이 GLP-1 분비를 현저하게 촉진하는 한편, D-프시코오스에서는 약간의 분비 촉진 경향이 보여지는 정도였다(도 1). 즉, D-프시코오스가 GLP-1 산생 세포주로의 직접 작용에 의해 GLP-1 분비를 촉진하는 효과는 관찰되지 않았다.

(실시예 1)

실험 동물로서, C57BL/6J 수컷 마우스(9-11주령)를 이용하였다. 실험 전일 18시 00분부터 16시간 절식시킨 마우스에, 오전 10:00에 D-프시코오스를 1g/㎏ 경구 위 내 투여하였다. 경구 투여량은 10㎖/㎏으로 하였다. D-프시코오스 투여 전 및 투여하고 나서 30분 및 60분 후에 이소플루레인 마취 하에서 문맥 채혈하였다. 또한, 샘플링 실린지에는 혈액 응고 억제제(헤파린(최종 농도 50IU/㎖))와 펩타이드 분해 억제제(아프로티닌(최종 농도 500KIU/㎖) 및 빌다글립틴(최종 농도 10μM))을 미리 첨가해 놓았다. 채취한 혈액은 냉각 원심하여, 얻어진 혈장을 분석할 때까지 -80℃에 보존해 두었다. 액티브 GLP-1, 토탈 GLP-1 및 토탈 GIP의 정량 분석은 ELISA 키트(밀리포어사제, 각각 EGLP-35K, EZGLPIT-36K 및 EZRMGIP-55K)를 이용하여 수행하였다. 또한, 통계 해석은 일원배치 분산 분석(대응 있음)을 수행하고, 이어서 D-프시코오스 투여 전(0분)을 대조로 한 Dunnett 검정을 수행하였다. 결과는 도 2에 나타낸다. 또한, 도 2 중, *은 P<0.05, **은 p<0.01이다. 또한, 도 2 중 막대 그래프 내의 수치는 실험수를 나타낸다.

그 결과, D-프시코오스를 경구 투여하면, 투여후 30분부터 60분 후까지, 시간 의존적으로 문맥 중의 액티브 GLP-1 및 토탈 GLP-1 농도가 상승하였다(도 2(a), (b)). 즉, D-프시코오스의 단독 경구 투여에 의해 GLP-1의 분비가 유도되는 것이 마우스를 이용한 실험에서 처음으로 밝혀졌으며, 그 작용 기작으로서, D-프시코오스가 GLP-1 산생 세포(L세포)에 직접 작용하는 것이 추찰되었다. 한편, D-프시코오스의 경구 투여는 투여후 60분까지는 GIP 분비에는 영향을 미치지 않았다(도 2(c)). 이상으로부터, D-프시코오스의 단독 경구 투여는 지방 합성을 촉진시키는 GIP의 분비에는 영향을 주지 않고, 인슐린 분비 촉진/식욕 억제/위 배출 억제 등의 작용을 갖는 GLP-1의 분비를 강하게 유도하는 것이 밝혀졌다.

(실시예 2)

실험 전날 18시 00분부터 16시간 절식시킨 C57BL/6J 수컷 마우스(9-11주령)에 오전 10:00에 D-프시코오스를 0.3g/㎏ 혹은 1g/㎏, D-타가토오스 혹은 D-글루코오스를 각 1g/㎏, 또는 생리 식염수를 경구 위 내 투여하였다. 경구 투여량은 10㎖/㎏으로 하였다. 투여하고 나서 30분 후에 이소플루레인 마취 하에서 문맥 채혈하였다. 또한, 샘플링 실린지에는 혈액 응고 억제제(헤파린(최종 농도 50IU/㎖))와 펩타이드 분해 억제제(아프로티닌(최종 농도 500KIU/㎖) 및 빌다글립틴(최종 농도 10μM))를 미리 첨가해 두었다. 채취한 혈액은 냉각 원심하여, 혈장은 분석할 때까지 -80℃에 보존하였다. 액티브 GLP-1 및 토탈 GIP의 정량 분석은 상술한 키트를 이용하여 수행하였다. 또한, 통계 해석은 일원 배치 분산 분석(대응 없음)을 수행하고, 이어서 생리 식염수를 대조로 한 Dunnett 검정을 수행하였다. 결과는 도 3에 나타낸다. 도 3 중, *은 P<0.05, **은 p<0.01이다. 또한, 도 2 중의 막대 그래프 내의 수치는 실험수를 나타낸다.

그 결과, D-글루코오스 1g/㎏의 경구 투여는 투여 후 30분의 문맥 중 액티브 GLP-1 농도를 전혀 변동시키지 않는 한편, D-프시코오스 0.3g/㎏의 경구 투여는 투여후 30분의 문맥 중 액티브 GLP-1 농도를 상승시키는 경향이 있으며, D-프시코오스 1g/㎏의 경구 투여는 문맥 중의 액티브 GLP-1 농도를 유의하게 상승시켰다(도 3(a)). 또한, D-타가토오스(1g/㎏)를 단독으로 경구 투여하면, 투여후 30분 후의 문맥 중 액티브 GLP-1 농도는 상승하는 경향은 있었지만, 그 값은 대조군과 비교하여 유의한 상승은 아니었으며, D-프시코오스 1g/㎏과의 값과 비교하면 낮은 값이었다(도 3(a)). 따라서, D-프시코오스는 D-타가토오스보다 유리한 GLP-1 분비 촉진제임을 알 수 있었다. 마지막으로, D-프시코오스 0.3g/㎏ 혹은 1g/㎏, D-글루코오스 1g/㎏ 또는 D-타가토오스 1g/㎏의 경구 투여 후의 문맥 중 토탈 GIP를 측정한 결과, D-글루코오스 투여군만 GIP 농도가 유의하게 상승하였다(도 3(b)). 따라서, 단당의 경구 투여에 의한 GLP-1 및 GIP 분비 메카니즘에는 각각 독립한 분비 촉진 기작이 존재함이 명확해졌다.

(실시예 3)

C57BL/6J 수컷 마우스(9-11주령)를 개별 케이지 내에서 1주일 이상 예비 사육하고, 실험자에 의한 핸들링을 하여 사육/실험 환경에 순화시켰다. 실험 전날 18시 00분부터 16시간 절식시킨 후, 9시 45분부터 생리 식염수 또는 GLP-1 수용체 저해제(Exendin-9, Ex=9, 200nmol/㎏)를 복강내 투여하고, 그 직후에 생리 식염수 또는 D-프시코오스 1g/㎏을 경구 위 내 투여하였다. 복강내 투여 및 경구 투여의 각 투여 용량은 각각 5㎖/㎏ 및 10㎖/㎏으로 하였다. 10시 00분부터 CE-2 사료(영양 밸런스를 갖춘 일반적인 마우스용 사료, 일본 크레아제)를 마우스에게 자유롭게 섭취시키고, 0.5시간, 1시간, 2시간, 3시간 및 6시간 후의 섭취량을 경시적으로 측정하였다. 섭취량은 경구 위 내 투여한 D-프시코오스 1g당 0kcal, CE-2 사료 1g당 3.45kcal로 한 에너지 섭취량(kcal)으로 산출하였다. 통계 해석은 각 시점에서의 결과에 대하여 일원 배치 분산 분석(대응 없음)을 수행하여, Tukey's 검정에 의한 전군 비교를 수행하였다. 결과는 도 4에 나타낸다. 또한, 도 4 중 *은 P<0.05, **은 p<0.01이다.

그 결과, 「대조군」(생리 식염수 복강내 투여-생리 식염수 경구 투여, 백(白))과 「D-프시코오스군」(생리 식염수 복강내 투여 - D-프시코오스 경구 투여, 망점)을 비교하면, D-프시코오스 1g/㎏ 경구 투여는 투여후 30분부터 6시간까지 유의하게 섭식량을 저하시켰다. 「GLP-1 수용체 저해제 단독 투여군」(Ex9 복강내 투여 - 생리 식염수 경구 투여, 망목 사선)은 「대조군」과 비교하여, 모든 시간대에서 같은 레벨의 섭식량이고(도 4), CE-2 사료의 섭취에 의해 분비되는 내인성 GLP-1은 섭식량에 영향을 주지 않는 것으로 시사되었다.

한편, 「GLP-1 수용체 저해제 + D-프시코오스군」(Ex9 복강내 투여 - D-프시코오스 경구 투여, 사선)에 대하여 비교하면, 투여후 30분의 「GLP-1 수용체 저해제 + D-프시코오스군」의 섭식량은 「대조군」 혹은 「GLP-1 수용체 저해제 단독 투여군」과 비교하여 유의하게 감소하여, 「D-프시코오스군」과 같은 레벨의 섭식량이었다. 따라서, 투여후 30분 후의 D-프시코오스에 의한 섭식 억제 작용은 GLP-1 이외의 섭식 억제 작용임이 시사되었다(도 4). 투여후 1시간 이후의 섭식량은 「대조군」이나 「GLP-1 수용체 저해제 단독 투여군」의 섭식량과 유의한 차이는 없었으며, 역으로, 「D-프시코오스군」보다 유의하게 섭식량이 증가하였다(도 4). 즉, D-프시코오스 경구 투여 후 1시간부터 6시간의 섭식 억제 작용이 GLP-1 수용체 저해제의 복강내 투여에 의해 소실되는 것으로 나타났다. 이상으로부터 D-프시코오스 1g/㎏의 경구 투여는 GLP-1 분비 촉진을 통하여 섭식량을 억제함이 명백해졌다.

(실시예 4)

C57BL/6J 수컷 마우스(7-11주령)를 개별 케이지 내에서 1주일 이상 예비 사육하고, 실험자에 의한 핸들링을 하여 사육/실험 환경에 순화시켰다. 실험 전날 18시 00분부터 16시간 절식시킨 후, 9시 50분부터 생리 식염수, D-프시코오스 1g/㎏ 또는 D-타가토오스 1g/㎏을 각각 경구 위 내 투여하였다. 투여 용량은 10㎖/㎏으로 하였다. 10시 00분부터 CE-2 사료를 마우스에 자유 섭식시키고, 1시간, 2시간 및 6시간 후의 섭식량을 경시적으로 측정하였다. 섭식량은 경구 위 내 투여한 D-타가토오스 1g당 2kcal, CE-2 사료 1g당 3.45kcal로 한 에너지 섭취량(kcal)으로 하여 산출하였다. 통계 해석은 각 시점에서의 결과에 대하여 일원 배치 분산 분석(대응 없음)을 수행하여, Tukey's 검정에 의한 전군 비교를 수행하였다. 결과는 도 5에 나타낸다. 또한, 도 5 중 *은 P<0.05, **은 p<0.01이다.

그 결과, 「D-프시코오스군」(망점)은 D-프시코오스 경구 투여후 1시간부터 6시간까지 「대조군」(생리 식염수 투여, 백)보다 유의하게 섭식량이 낮은 값이었다(도 5). 「D-타가토오스 투여군」(사선)은 투여후 1시간의 섭식량은 「대조군」보다 유의하게 낮은 값이었지만, 「D-프시코오스군」보다 유의하게 높은 값이었다. 또한, 「D-타가토오스 투여군」(사선)은 D-타가토오스 투여후 2시간 및 6시간의 섭식량은 「대조군」과 같은 정도였고, 「프시코오스군」보다 유의하게 높은 값으로, 섭식 억제 작용은 인정되지 않았다.

따라서, D-타가토오스 1g/㎏ 경구 투여는 섭식 억제 작용이 인정되지만, 그 작용은 투여후 1시간까지의 단기적인 것으로, D-프시코오스 1g/㎏ 경구 투여와 비교하여 그 작용 정도는 약한 것임이 명확해졌다. D-타가토오스 1g/㎏ 경구 투여에 의한 섭식 억제 작용이 약한 이유로는, D-프시코오스보다 GLP-1 분비 촉진 효과가 약하기(도 3) 때문으로 추측되었다.

(실시예 5)

하룻밤 절식시킨 Sprague Dawley 래트(8~9주령의 수컷)의 꼬리 정맥으로부터 시료 투여전(0분)의 채혈을 수행하였다. 피딩 튜브를 이용하여 탈이온수(대조군), D-프시코오스, 난소화성 덱스트린(DE10), 덱스트린(마츠타니 화학공업 주식회사 제품「파인덱스 #2」(DE 10))의 각 용액을 2g/㎏ 체중(10mL/㎏ 체중)으로 경구 투여하였다. 그 후, 15분, 30분, 60분, 90분, 120분, 150분, 180분, 210분, 240분 후에 꼬리 정맥으로부터 채혈을 수행하였다.

혈액은, 미리 DPP-IV 저해제(밀리포어사제), 아프로티닌(와코준야쿠 공업사제), 헤파린(나카라이테스크사제)을 첨가한 튜브에 회수하였다. 원심 분리에 의해 혈장을 회수하여 -80℃에서 동결 보존하였다. 얻어진 혈장 중의 토탈 GLP-1 농도를 시판 ELISA 키트(밀리포어사제 Multi Species GLP-1 Total ELISA)로 측정하였다. 혈장 중의 글루코오스 농도는 글루코오스 CII-테스트와코(와코준야쿠 공업사제)로 측정하였다.

<실험 결과>

도 6에 혈당치의 변화 및 혈중 토탈 GLP-1 농도의 변화를 나타낸다. 혈당치는 덱스트린 투여로 상승하였고, 난소화성 덱스트린에서는 약간 상승하였으며, D-프시코오스 투여에서는 대조군(물 투여)과 같은 약간의 변동을 나타내었다(도 6(a)). 그 결과로부터, D-프시코오스에는 혈당치를 상승시키는 작용이 없음이 확인되었다.

한편, GLP-1 농도는 D-프시코오스 투여에 의해 투여후 60분~120분을 피크로 하여 크게 상승한 것에 대하여, 난소화성 덱스트린 투여에서는 투여후 90분 이후에 상승하였지만, D-프시코오스보다는 약한 작용이었고, GLP-1의 분비 자극으로 가장 잘 알려진 글루코오스로 구성된 소화성 덱스트린(파인덱스 #2)의 투여에 의해서는 GLP-1 분비를 촉진하지 않았다(도 6(b)). 그 결과로부터, D-프시코오스에 강한 GLP-1 분비 촉진 작용이 있으며, 투여후 60~120분을 피크로 한 지속성 있는 작용임을 알 수 있었다.

(실시예 6)

<시험 방법>

1주일 이상의 휴지기를 미리 설정한 후, 건강한 피험자 6명(남 3명 및 여 3명. 체중 53.3±7.4㎏.)에 대하여, 1회에 물 200㎖(대조 음료) 또는 D-프시코오스 5g/200㎖(체중 환산하면 D-프시코오스 0.07~0.11g/㎏), 10g/200㎖(체중 환산하면 D-프시코오스 0.14~0.22g/㎏) 혹은 15g/200㎖(시험 음료)(체중 환산하면 D-프시코오스 0.21~0.33g/㎏)을 랜덤 섭취시켰다. 대조 음료 또는 시험 음료를 섭취하는 날(시험일)의 전날 밤은 지정된 석식을 섭취시키고, 전날밤 21시 이후부터 시험 당일 오전 9시까지 물 및 차 음료를 제외한 음식물의 섭취를 금하였다. 상기 지정식은 식물 섬유, 유산균, 발효성 당질과 같은 장내 세균이 이용하여 발효할 가능성이 있는 물질을 거의 함유하지 않는 메뉴(카레, 오야코동, 규동, 중화동) 중 어느 하나의 선택으로 하였다. 시험날 당일 오전 9시 공복시에 채혈후, 대조 음료 또는 시험 음료를 섭취시키고, 그 섭취 후 15분, 30분, 60분, 120분 및 180분 후에 채혈을 하였다. 또한, 그 채혈 동안은 지정된 분량의 물만 섭취 가능하게 하였다. 채혈은 각 피험자 자신이 당뇨병 환자용으로 시판되는 사혈기로 손가락 끝을 찔러 얻어진 출혈액을 헤마토크릿관으로 채취함으로써 수행하였다. 채취한 혈액은 마이크로 튜브로 옮겨 원심 분리기에 제공하고, 원심 분리된 혈장의 토탈 GLP-1량을 메르크(주) 제품「Multi Species GLP-1 Total ELISA」를 이용하여 측정하였다. 또한, 피험자에게는 시험 기간인 약 1개월간은 규칙적인 생활을 엄수하도록, 과격한 운동이나 폭음폭식을 피하고, 시험 중에는 실내에서 평온하게 지내도록 하였다.

<시험 결과>

각 혈중의 토탈 GLP-1을 종축으로, 상기 D-프시코오스 섭취 후 15분~180분 후의 각 시간을 횡축으로 하여 꺾은선 그래프를 그렸을 때의, 혈중 토탈 GLP-1 농도-시간 곡선 하면적(AUC)를 산출하여, 얻어진 수치를 도 7에 나타내였다. D-프시코오스 섭취량에 의존하여 AUC 수치가 커지고 있으며, D-프시코오스를 1회에 0.07g/체중㎏ 이상 섭취함으로써, 혈중의 토탈 GLP-1 분비량을 촉진하는 효과를 얻을 수 있음을 알 수 있었다.

Claims

D-프시코오스를 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 GLP-1 분비 촉진제.
제 1항에 있어서,
자당을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 GLP-1 분비 촉진제.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
공복시에 투여되는 것을 특징으로 하는 GLP-1 분비 촉진제.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
유효 성분인 D-프시코오스가 1회에 0.07g/체중㎏ 이상의 양이 되도록 투여되는 것을 특징으로 하는 GLP-1 분비 촉진제.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
자당 혹은 자당 함유 식품의 섭취없이 투여되는 것을 특징으로 하는 GLP-1 분비 촉진제.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 기재된 GLP-1 분비 촉진제 및 수용성 식물 섬유를 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 GLP-1 분비 촉진 조성물.