CN104311656B - cFGF‑21蛋白及其在治疗类风湿关节炎中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了cFGF‑21蛋白及其在治疗类风湿关节炎中的应用。本发明提供了一种蛋白质，命名为cFGF‑21蛋白，如序列表的序列3所示。本发明还保护所述cFGF‑21蛋白在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。本发明还保护一种治疗类风湿性关节炎的药物，其活性成分为所述cFGF‑21蛋白。本发明对于类风湿关节炎的治疗具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及cFGF-21蛋白及其在治疗类风湿关节炎中的应用。
背景技术
类风湿关节炎是一种病因尚未明了的慢性全身性疾病，主要表现为周围对称性的多关节慢性炎症性(非化脓性炎症)的疾病，可伴有关节外的系统性损害(引起皮下结节、心包炎、心肌炎、肺纤维化、胸膜炎、脾肿大、肾淀粉样变、周围神经炎、动脉炎等病变)。类风湿关节炎的致残率极高，在治疗上至今没有取得突破性进展的疾病，国外把类风湿关节炎的结局归纳为5种后果(即5D):死亡(death)、残疾(disability)、痛苦(discomfort)、经济负担(dollar costs)、药物毒副反应(drug toxicity)。加深对该类风湿关节炎发病机制的认识和寻找可靠的治疗方法具有重大的意义。
近年研究表明,自由基参与RA的发生和发展，在关节滑膜的炎性病变和骨质的破坏过程中，自由基直接或间接参与了滑膜与骨质的损伤。在这个过程中活性氧跟活性氮一样，直接和间接参与破坏关节的基本结构,从而导致关节炎临床症状的产生。由活化的吞噬细胞产生的活性氧(reactive oxygen species,ROS),能够改变IgG的免疫荧光分析行为，产生能够进一步活化吞噬细胞的荧光蛋白聚体。活性氧可成为一些转录因子，如核转录因子(nuclear factor,NF)和衔接蛋白(adaptor protein-1,AP-1)的活化信号，并使得相关基因的表达水平上调。核转录因子NF-κB是一种多极性基因调控蛋白，能调节多种参与免疫反应的细胞因子、炎症介质、粘附分子及蛋白酶类的基因转录过程，从而控制它们的生物合成。NF-κB能够参与免疫细胞的分化、增殖，和活化。NF-κB在参与某些细胞的生长调控以及抗细胞凋亡方面亦起着重要的作用。近年来，研究表明NF-κB在RA发病的多个环节中起重要作用，所以，抑制NF-κB活性为临床治疗各种RA提供了一条新的治疗性干预途径，同时也为筛选新型治疗RA的药物指明了前进方向。
成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)属于FGF家族中FGF19亚家族成员之一，主要表达于肝脏和胸腺中。
发明内容
本发明的目的是提供cFGF-21蛋白及其在治疗类风湿关节炎中的应用。
本发明提供了一种蛋白质，命名为cFGF-21蛋白，如序列表的序列3所示。
编码所述cFGF-21蛋白的基因也属于本发明的保护范围。
所述基因具体可为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：
(1)编码区如序列表的序列4所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有治疗类风湿性关节炎功能的蛋白质的DNA分子；
(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同一性且编码具有治疗类风湿性关节炎功能的蛋白质的DNA分子。
含有所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
本发明还保护所述cFGF-21蛋白在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
所述类风湿性关节炎的药物的疗效体现为与治疗前相比具有如下(a)和/或(b)和/或(c)和/或(d)和/或(e)和/或(f)的改善：
(a)关节肿胀程度降低；
(b)血液中的丙二醛含量降低和/或GSH含量增高和/或SOD活性升高和/或CAT活性升高和/或GSH-Px活性降低；
(c)血液中TNF-α含量降低和/或IL-6含量降低和/或IL-1β含量降低；
(d)细胞浆总蛋白中NF-κB P65的水平增加；
(e)细胞核总蛋白中NF-κB P65的水平降低；
(f)细胞浆总蛋白中Iκ-Bα的水平增加。
本发明还保护一种治疗类风湿性关节炎的药物，其活性成分为所述cFGF-21蛋白。
所述类风湿性关节炎的药物的疗效体现为与治疗前相比具有如下(a)和/或(b)和/或(c)和/或(d)和/或(e)和/或(f)的改善：
(a)关节肿胀程度降低；
(b)血液中的丙二醛含量降低和/或GSH含量增高和/或SOD活性升高和/或CAT活性升高和/或GSH-Px活性降低；
(c)血液中TNF-α含量降低和/或IL-6含量降低和/或IL-1β含量降低；
(d)细胞浆总蛋白中NF-κB P65的水平增加；
(e)细胞核总蛋白中NF-κB P65的水平降低；
(f)细胞浆总蛋白中Iκ-Bα的水平增加。
所述药物还可包括其它药学上可接受的载体或辅料。所述药物中，除了所述活性成分外，可以添加药学上允许的赋形剂、填充剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、增效剂和添加剂等。所述药物的给药形态可为针剂(如粉剂、水剂、油剂)。所述药物的给药途径可为皮下注射、静脉注射或肌肉注射。
本发明的发明人在现有纤维细胞生长因子-21成熟肽的基础上，通过构建突变文库获得了大量突变蛋白，经功能试验和效果比较，发现其中一个突变蛋白对类风湿关节炎具有显著的疗效，具体如下：改善小鼠踝关节的临床病理指数、降低类风湿关节炎小鼠模型踝关节炎症细胞的浸润、关节磨损程度；改善血浆中相关炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达量以及相关氧化应激酶类的活性；改善类风湿性关节炎模型小鼠脾脏相关炎症因子的表达以及核蛋白NF-κB的活性。
本发明对于类风湿关节炎的治疗具有重大价值。
附图说明
图1为cFGF-21蛋白液的聚丙烯凝胶电泳图。
图2为小鼠踝关节依次进行石蜡切片和HE染色后的照片。
图3为小鼠右后足的足跖的厚度。
图4为对小鼠足跖肿胀程度的临床评分。
图5为对小鼠病理切片的评分。
图6为MDA浓度、GSH浓度、SOD活性、CAT活性和GSH-Px活性的检测结果。
图7为TNF-α浓度、IL-6浓度和IL-1β浓度的检测结果。
图8为细胞浆总蛋白中NF-κB P65的水平。
图9为细胞核总蛋白中NF-κB P65的水平。
图10为细胞浆总蛋白中Iκ-Bα的水平。
图6至图10中，1代表生理盐水组，2代表模型对照组，3代表cFGF-21蛋白高剂量组，4代表cFGF-21蛋白低剂量组，5代表FGF-21蛋白高剂量组。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
FGF-21蛋白的成熟肽，简称FGF-21成熟肽，如序列表的序列1自N末端第2至182位氨基酸残基所示。FGF-21成熟肽的编码基因如序列表的序列2自5’末端第4至546位核苷酸所示。
原核表达载体pET-27b(+)：Novagen，产品目录号为69863-3。大肠杆菌Rosetta(DE3)：北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CD801。雄性昆明小鼠：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所试验动物中心。弗氏完全佐剂：Sigma，产品目录号为F5506。二型胶原蛋白：Sigma，产品目录号为C9301。
实施例1、cFGF-21蛋白的制备
一、重组质粒的构建
1、提取离体的人肝脏的总RNA。
2、采用M-MLV反转录酶将步骤1得到的总RNA反转录为cDNA。
3、以步骤2得到的cDNA为模板，采用P1和P2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
P2：5’-CGCGGATCCTTA GGAAGCGTAGCTGGGGCTTCGG-3。
PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃30s、56℃30s、72℃45s，25个循环；72℃延伸10min。
4、用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切步骤3的PCR扩增产物，回收酶切产物。
5、用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切原核表达载体pET-27b(+)，回收约5700bp的载体骨架。
6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒pET-27b-cFGF-21。根据测序结果，对重组质粒pET-27b-cFGF-21进行结构描述如下：在原核表达载体pET-27b(+)的NdeI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列4自5’末端第4-552位核苷酸所示的双链DNA分子。重组质粒pET-27b-cFGF-21中，形成了序列表的序列4所示的融合基因(命名为cFGF-21基因)，表达序列表的序列3所示的蛋白质(命名为cFGF-21蛋白)。
二、对照质粒的构建
在原核表达载体pET-27b(+)的NdeI和BamHI酶切位点之间插入序列表的序列2自5’末端第4-549位核苷酸所示的双链DNA分子，得到重组质粒pET-27b-FGF-21。重组质粒pET-27b-FGF-21中，形成了序列表的序列2所示的融合基因(命名为FGF-21基因)，表达序列表的序列1所示的蛋白质(命名为FGF-21蛋白)。
三、cFGF-21蛋白的制备和纯化
1、将重组质粒pET-27b-cFGF-21导入大肠杆菌Rossetta(DE3)，得到重组菌。
2、将步骤1得到的重组菌的单菌落接种至5mL液体LB培养基中，37℃、120rpm振荡培养10h，然后取菌液，以1:100的体积比接种于500mL含50mg/mL青霉素的液体LB培养基中，37℃、120rpm振荡培养至OD600nm＝0.35。
3、向步骤2得到的菌液中加入IPTG并使其浓度为0.25mmol/L，37℃、120rpm振荡培养4.5h，然后4℃、4000rpm离心30min，收集菌体。
4、取步骤3得到的菌体，用lysis buffer(溶剂为水，溶质及其浓度如下：50mMNa3PO4、300mM NaCl和10mM咪唑)悬浮后用超声破碎仪(厂家为SONICS，型号为VCX800)进行超声破碎(超声破碎仪的脉冲值为35％，总时间为10min，工作1s停1s)，然后4℃、12000rpm离心1min，收集菌体沉淀。
5、取步骤4收集的菌体沉淀，加入洗涤液(pH8.0，溶剂为水，溶质及其浓度如下：20mM Tris、2M尿素和体积含量为0.1％的Triton X-100)对其进行洗涤(共洗涤5次，每次通过4℃、12000rpm离心10min收集菌体)。
6、取步骤5得到的菌体沉淀，用变性液(pH8.0，溶剂为水，溶质及其浓度如下：20mMTris和8M尿素)悬浮，4℃静置12小时，然后4℃、12000rpm离心7min，收集上清液。
7、取步骤6得到的上清液，缓慢滴加到10倍体积的复性液(pH8.0，溶剂为水，溶质及其浓度如下：20mM Tris、2M尿素、50mM NaCl、0.25mM氧化性谷胱甘肽、0.25mM还原性谷胱甘肽和500mM精氨酸)中，4℃静置12小时，然后装入透析袋，在透析液(pH8.0的20mM Tris水溶液)透析24h(12h换液一次)，然后用0.45μm的醋酸纤维素膜进行过滤，收集滤液。
8、取步骤7得到的滤液，采用AKTA purifier100通过Capto-Q阴离子交换层析纯化目的蛋白。
具体参数如下：
柱子型号为XK16(GE公司)，内径为16mm，高度为20cm；
填充物为CaptoTMQ；
洗脱液由溶液甲和溶液乙组成，溶液甲为pH8.0的20mM Tris水溶液，溶液乙为1MNaCl水溶液；洗脱过程如下：第0-69min,溶液乙占洗脱液的体积分数由0％上升线性至18.9％；第69-74min，溶液乙占洗脱液的体积分数由18.9％线性上升至43.8％；第74-81min,溶液乙占洗脱液的体积分数由43.8％线性上升至75.3％；第81-93min，溶液乙占洗脱液的体积分数由75.3％线性上升至100％；第93-94min，溶液乙占洗脱液的体积分数为100％；整个过程中，洗脱液的流速为3.5ml/min。
整个洗脱过程显示四个洗脱峰，收集第二个洗脱峰，即收集保留时间为74-81min的过柱后溶液。
9、取步骤8收集的过柱后溶液，装入透析袋中，在透析液(pH7.6，含50mM Na3PO4和150mM NaCl的水溶液)透析24h(12h换液一次)，得到cFGF-21蛋白液。
cFGF-21蛋白液的聚丙烯凝胶电泳图见图1。回收目的带并进行N端测序，结果表明，N端前15个氨基酸残基如序列表的序列3自N末端第1至15位氨基酸残基所示。
四、FGF-21蛋白的制备和纯化
用重组质粒pET-27b-FGF-21代替重组质粒pET-27b-cFGF-21，其它同步骤三，得到FGF-21蛋白液。
实施例2、cFGF-21蛋白对类风湿性关节炎的治疗作用。
实验动物为六周龄清洁剂雄性昆明小鼠。
用弗氏完全佐剂乳化二型胶原蛋白，使二型胶原蛋白的浓度为1mg/mL，得到二型胶原蛋白溶液。
取实施例1得到的cFGF-21蛋白液，用生理盐水稀释，得到cFGF-21溶液。
取实施例1得到的FGF-21蛋白液，用生理盐水稀释，得到FGF-21溶液。
将6周龄的实验动物随机分为五组，每组8只，分别进行如下平行处理：
第一组(模型对照组)：实验第1天每只小鼠对右后足注射100μl二型胶原蛋白溶液，实验第16天每只小鼠背部皮下注射100μl二型胶原蛋白溶液，实验第21天进行成模判断；实验第22-47天期间，每天的7：00-8:00时段每只成模小鼠内颈部皮下注射0.15mL生理盐水；
第二组(cFGF-21蛋白高剂量组)：实验第1天每只小鼠对右后足注射100μl二型胶原蛋白溶液，实验第16天每只小鼠背部皮下注射100μl二型胶原蛋白溶液，实验第21天进行成模判断；实验第22-47天期间，每天的7：00-8:00时段每只成模小鼠内颈部皮下注射0.15mL cFGF-21溶液(以总蛋白计，每只模型小鼠的单次注射剂量为5mg·kg-1)；
第三组(cFGF-21蛋白低剂量组)：实验第1天每只小鼠对右后足注射100μl二型胶原蛋白溶液，实验第16天每只小鼠背部皮下注射100μl二型胶原蛋白溶液，实验第21天进行成模判断；实验第22-47天期间，每天的7：00-8:00时段每只成模小鼠内颈部皮下注射0.15mL cFGF-21溶液(以总蛋白计，每只模型小鼠的单次注射剂量为1mg·kg-1)；
第四组(FGF-21蛋白高剂量组)：实验第1天每只小鼠对右后足注射100μl二型胶原蛋白溶液，实验第16天每只小鼠背部皮下注射100μl二型胶原蛋白溶液，实验第21天进行成模判断；实验第22-47天期间，每天的7：00-8:00时段每只成模小鼠内颈部皮下注射0.15mLFGF-21溶液(以总蛋白计，每只模型小鼠的单次注射剂量为5mg·kg-1)；
第五组(生理盐水组)：取正常小鼠，实验第22-47天期间，每天的7：00-8:00时段每只小鼠内颈部皮下注射0.15mL的生理盐水。
成模小鼠的判断标准：小鼠足部红肿严重，可影响其正常活动。
实验第14-47天，用游标卡尺测量小鼠右后足的足跖的厚度，结果见图3。部分结果见表1。
表1右后足的足跖的厚度(mm)
| 实验第14天 | 实验第26天 | 实验第35天 | 实验第41天 | 实验第47天 | |
| 生理盐水组 | 2.23 | 2.71 | 2.57 | 2.58 | 2.59 |
| 模型对照组 | 4.38 | 4.88 | 4.58 | 4.65 | 4.68 |
| cFGF-21蛋白高剂量组 | 4.65 | 3.79 | 3.75 | 3.71 | 3.73 |
| cFGF-21蛋白低剂量组 | 4.35 | 3.92 | 3.85 | 3.73 | 3.71 |
| FGF-21蛋白高剂量组 | 4.32 | 3.89 | 3.91 | 3.88 | 3.94 |
实验第14-47天，对小鼠足跖肿胀程度进行临床评分(评分标准参见文献：ZhangY,Ren G,Guo M,Ye X,Zhao J,Xu L,et al.(2013)Synergistic effects ofinterleukin-1βand interleukin-17A antibodies on collagen-induced arthritismouse model.Int Immunopharmacol.15(2):199-205；Qi J,Kan F,Ye X,Guo M,Zhang Y,Ren G,et al.(2012)A bispecific antibody against IL-1βand IL-17A is beneficialfor experimental rheumatoid arthritis.Int Immunopharmacol.14(4):770-8.；Williams RO.(2004)Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoidarthritis.Methods Mol Med.98:207–216.)，结果见图4。
实验第48天，取小鼠的踝关节，依次进行石蜡切片和HE染色，照片见图2。根据图2进行关节病理切片的评分(评分标准参见文献：Vaillant JD,Fraga A,Díaz MT,Mallok A,R,Fahmy Z,et al.(2013)Ozone oxidative postconditioningameliorates joint damage and decreases pro-inflammatory cytokine levels andoxidative stress in PG/PS-induced arthritis in rats.Eur J Pharmacol.714(1-3):318-24)，结果见图5。
实验第48天，对小鼠取血，1200rpm离心10min，取上清，检测氧化应激酶类的含量和活性。MDA的中文全称为丙二醛，用于检测MDA浓度的试剂盒的全称为脂质氧化(MDA)检测试剂盒(厂家为碧云天，货号为S0131)。GSH的中文全称为谷胱甘肽，用于检测GSH浓度的试剂盒的全称为还原型谷胱甘肽(GSH)测试盒(厂家为南京建成，货号为A006-2)。SOD的中文全称为超氧化物歧化酶，用于检测SOD活性的试剂盒的全称为超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(厂家为南京建成，货号为A001-3)。CAT的中文全称为过氧化氢酶，用于检测CAT活性的试剂盒的全称为过氧化氢酶(CAT)测试盒(厂家为南京建成，货号为A007-2)。GSH-Px的中文全称为谷胱甘肽过氧化物酶)，用于检测GSH-Px活性的试剂盒的全称为谷胱甘肽－过氧化物酶(GSH－PX)测试盒(厂家为南京建成，货号为A005)。结果见图6。
实验第48天，对小鼠取血，1200rpm离心10min，取上清，检测相关炎症因子的含量。用于检测TNF-α浓度的试剂盒的全称为肿瘤坏死因子(TNF-α)检测试剂盒(厂家为R&D，货号为MTA00B)。用于检测IL-6浓度的试剂盒的全称为白细胞介素6(IL-6)检测试剂盒(厂家为R&D，货号为M6000B)。用于检测IL-1β浓度的试剂盒的全称为白细胞介素1(IL-1β)检测试剂盒(厂家为R&D，货号为MLB00C)。结果见图7。
实验第51天，分离小鼠的脾细胞，分别提取细胞核总蛋白和细胞浆总蛋白。采用Western blot检测细胞浆总蛋白中NF-κB P65的水平(以β-actin为内参)，Western blot图见图8，根据Western blot图计算细胞浆总蛋白中NF-κB P65的水平，结果见图8。采用Western blot检测细胞核总蛋白中NF-κB P65的水平(以Lamin-b1为内参)，Western blot图见图9，根据Western blot图计算细胞核总蛋白中NF-κB P65的水平，结果见图9。采用Western blot检测细胞浆总蛋白中Iκ-Bα的水平(以β-actin为内参)，Western blot图见图10，根据Western blot图计算细胞浆总蛋白中Iκ-Bα的水平，结果见图10。用于检测NF-κBP65的一抗购自Affinity Biosciences，货号为#AF5006。用于检测Iκ-Bα的一抗购自CellSignaling Technology,Danvers,MA，货号为#4812。用于检测β-actin的一抗购自Signalway USA，货号为21338-2。用于检测Lamin-b1的一抗购自Affinity Biosciences，货号为BF1002。
Claims (6)
1.一种蛋白质，如序列表的序列3所示。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：
(1)编码区如序列表的序列4所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有治疗类风湿性关节炎功能的蛋白质的DNA分子；
(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同一性且编码具有治疗类风湿性关节炎功能的蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求1所述蛋白质在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
6.一种治疗类风湿性关节炎的药物，其活性成分为权利要求1所述蛋白质。
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