CN104540846B - 重新折叠来自包涵体的g‑csf的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了重新折叠来自包涵体的重组粒细胞集落刺激因子(G‑CSF)的新方法。该方法包括两个重新折叠步骤。具体而言，该方法包括用增溶剂溶解G‑CSF、在增溶剂和氧化剂的存在下氧化性重新折叠G‑CSF(第一重新折叠步骤)、有效去除增溶剂以及在没有增溶剂的条件下进行第二重新折叠步骤以完成G‑CSF的重新折叠。本发明描述了各种从部分重新折叠的G‑CSF有效去除增溶剂的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于重新折叠来自包涵体的G-CSF(集落刺激因子)的新方法。特别地，其涉及一种包括两个重新折叠步骤的方法。本发明涉及一种用于重新折叠G-CSF的方法，通过(a)溶解G-CSF，(b)氧化性重新折叠(第一重新折叠步骤，在增溶剂的存在下)，(c)除去增溶剂和(d)第二重新折叠步骤(不存在增溶剂)。本发明也涉及一种除去增溶剂的新方法。
背景技术
内源性造血生长因子，粒细胞-集落刺激因子(G-CSF，同义词“集落刺激因子3”＝CSF3)调节骨髓中祖细胞的增殖和分化以及向外周血中释放成熟中性粒细胞(“嗜中性粒细胞“)。影响迅速分裂细胞的癌症化疗往往会导致称为“中性粒细胞减少症”的副作用。中性粒细胞减少症是外周血中的嗜中性粒细胞计数下降并影响多于三分之一接受为了癌症的骨髓抑制性化疗的患者。中性粒细胞减少症患者可能出现发热(“发热性中性粒细胞减少”)，并且感染的风险增加。像败血症一样，会发生威胁生命的胃肠道和肺部感染。化疗的后续周期可能被迫延迟，直到病人已经从中性粒细胞减少症中恢复。重组人G-CSF是一种有效的药用物质，其成功地应用于治疗化疗引起的中性粒细胞减少。其可恢复血液中嗜中性粒细胞的数量并使其保持高于临界水平(Dale 2002)。
天然人G-CSF是一种O糖基化蛋白，由174个氨基酸组成，并且是相对疏水的。糖基化形式的糖链位于苏氨酸133。除了这种主要形式外，体内可存在另一种具有三个额外氨基酸的拼接形式(Zsebo 1986)。当重组人G-CSF是在大肠杆菌(E.coli)中表达，可以观察到如下现象：首先，产生包涵体中的重组蛋白；第二，产生的G-CSF分子缺乏天然糖链，和第三，重组G-CSF具有额外的N端甲硫氨酸。该G-CSF分子被命名为N-甲硫氨酰-G-CSF或rmet(hu)G-CSF，其国际非专有名称(INN)为“非格司亭(filgrastim)”，具有18.7-18.9kD的分子量(Welte 1996)。非格司亭的的理论相对质量(Mr)是18.799。G-CSF多肽链包含5个半胱氨酸，对非格司亭的结构研究揭示了在Cys 37-43和Cys 65-75之间有两个二硫键，而未配对的Cys 18仍是还原性的(Wingfield 1988)。市场上第一款产品是Amgen's其含有非格司亭，是一种大肠杆菌表达的重组人met-G-CSF(Welte 1996)。另一种欧盟批准的G-CSF产品Chugai’s 含有来格司亭(lenograstim)，其来源于重组哺乳动物(CHO)细胞，并且是糖基化(Holloway 1996)。此外，Amgen在2002年推出G-CSF的改良产品其由非格司亭和聚乙二醇的缀合物组成(INN＝聚乙二醇非格司亭)(Molineux2004)。最后，欧洲几个不同的仿制药制药公司在最近几年推出了几种的生物类似物。
异源重组多肽在转化的微生物中的过表达经常导致形成含有重组蛋白质的所谓包涵体(IB)。这些包涵体是高折射的、无定形的聚集体，其中的多肽一般是未折叠的、还原的、非活性的，并且在一般的水性缓冲液中至少部分不溶。本领域描述了从包涵体获得重组蛋白质的工艺，通常包括细胞的溶解和破裂，随后离心。通常用去污剂洗涤含有高比例包涵体的沉淀，以去除脂膜、脂多糖(LPS)和其它细胞碎片或污染物。
科学文献中提供了许多方法将包涵体从细菌中分离并纯化，以及此后重组蛋白溶解并重新折叠成其天然状态。(本文所使用的术语“重新折叠”和“复性”同义)。
已用到不同的策略溶解重组蛋白质。除了离子型或非离子型去污剂，如十二烷基硫酸钠(SDS)或N-月桂酰肌氨酸(肌氨酰)，离液试剂，如盐酸胍(GuHCl)或尿素，已被用于溶解感兴趣的蛋白质。溶解常在碱性(pH为8-12.5)，存在还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤醇(DTE)或2-巯基乙醇(ME)(Marston 1986，Rudolph 1990，Rudolph 1996，Dietrich 2003)的条件下进行。通常情况下，溶解的蛋白质首先被还原并失活，然后经过重新折叠后进行层析纯化。
例如，EP0219874公开了一种对来自大肠杆菌包涵体的重组蛋白进行重新折叠的通用方法。为进行溶解，在高pH值使用离液剂盐酸胍和精氨酸。EP0219874描述了在由GSH/GSSG提供的氧化还原反应条件下二硫键的形成。
Rudolph 1990中描述了下列顺序的步骤：a)在pH 8-9的还原条件(DTT、DTE或2-ME)下使用盐酸胍或尿素进行溶解，b)通过透析或凝胶色谱法(Sephadex G-25)去除试剂，和c)通过氧化重排系统(oxido shuffling systems)或通过蛋白质硫醇的反相化学修饰形成二硫键(＝重折叠)，两者都基于加入的GSH/GSSG的效果。
另一篇综述(Rudolph 1996)关注了重新折叠过程中使用的添加剂，其可影响未折叠蛋白、折叠中间体和天然折叠的蛋白质的溶解性和稳定性。作者提出一个通用的基本方案用于溶解和重新折叠：用pH值为8的6M盐酸胍和100mM DTT溶解。通过透析除去还原剂，pH调节至4.5。用含有EDTA和GSH/GSSG、pH为7.5至8.5的缓冲液进行高度稀释(1∶200)来进行重新折叠。
Dietrich 2003中用6M盐酸胍在还原条件(DTE)下溶解来自大肠杆菌包涵体的蛋白质。重新折叠温育被限定在pH 9的存在GSH/GSSG的1M精氨酸之中。用疏水作用色谱(HIC)并接着用使用SP琼脂糖的阳离子交换层析(CEX)进行最后的纯化。
一个可从GE医疗集团2007获得的应用笔记(应用笔记18-1112-33，1-4)也综述了通用方案。其中建议用8M尿素或6M盐酸胍。提到了缓慢透析或近中性pH值下稀释来进行重新折叠。或者，可以使用层析步骤进行重新折叠。所建议的取代透析或稀释的层析方法包括排阻色谱法(SEC)、离子交换色谱(IEX)和疏水作用色谱(HIC)。
WO00/02901描述了一种通过在重新折叠罐中施加高压而进行重新折叠的一般方法。任选地，离液剂和/或氧化还原剂(DTT/GSSG)存在于重新折叠缓冲液中。
从二十世纪80年代开始，开发生产生物学活性的重组G-CSF的方法经历了很长的历史。大多数出版物描述的是利用大肠杆菌生产。在该宿主中，G-CSF可以良好地表达并在包涵体中正常积累。使用的其它表达系统例如CHO细胞(Holloway 1994)、人细胞(WO01/04154)或酵母(US5055555)。
Zsebo 1986中描述了用2％肌氨酰溶解G-CSF并通过AEX和CEX色谱法纯化可溶性G-CSF。
WO87/01132中描述了来源于大肠杆菌的人G-CSF(非格司亭)。其中描述了两种可供选择的重新折叠/纯化方法：工艺1)：用1％月桂酸(一种饱和C15脂肪酸)溶解G-CSF并用40μM CuSO4进行氧化，随后在C4材料上进行HPLC-纯化。工艺2)：用2％肌氨酰溶解并用20μMCuSO4进行氧化，丙酮沉淀G-CSF，再用6M盐酸胍溶解，在此条件下未折叠。通过凝胶色谱法去除盐酸胍(Sephadex G-25，重新折叠步骤)，随后的色谱是CEX(CM-纤维素)，接着是最终的排阻色谱法(SEC，Sephadex G-75)。
Devlin 1988使用了另一种可选择的增溶剂，其用10％的SDS溶解IB-沉淀，并通过SEC(Sephacryl S-200，0.1％SDS中)纯化SDS溶解的(SDS-loaded)G-CSF，接着是反相高压液相色谱(RP-HPLC法，Vydac C4)。
这些早期出版物集中在构建适当的表达系统并得到纯化的物质以进行G-CSF的进一步表征，而不是提供适合商业化大规模生产重组G-CSF的重新折叠和纯化工艺。WO 89/10932公开了一种更先进的工艺，其描述了来自大肠杆菌IB的人和牛G-CSF的纯化方法。用清洁剂(脱氧胆酸盐)处理IB以提取污染物。用肌氨酰溶解G-CSF。用CuSO4进行氧化。进一步的处理描述于Lu 1992and Heidari 2001中。
已公开了上述用于溶解和氧化重新折叠的方法的几种可替换方案，包括WO89/10932中使用2％肌氨酰/40uM CuSO4的方法。这些策略大多数遵循经典的通用溶解方法(Marston 1986、Rudolph 1990、Rudolph 1996，参见上文)，用诸如盐酸胍和尿素的强变性剂在还原条件以及碱性pH值下完全断裂氢键。特别是最近的出版物优选对盐酸胍-或尿素溶解的G-CSF进行重新折叠。
例如，Wingfield 1988中描述了纯化野生型G-CSF和来自大肠杆菌IB的突变蛋白。用6M盐酸胍进行溶解。于SEC(Sephacryi 3200)上在4M盐酸胍的存在下对未折叠蛋白进行第一次纯化。随后氧化G-CSF并通过3M尿素中透析而重新折叠，并用CEX(CM-Sepharose)和SEC(Ultrogel AcA54)进行进一步纯化。
Kang 1998的论文描述了在大肠杆菌中以IB表达的N-甲基-hu-G-CSF。在碱性条件下用2M尿素溶解G-CSF。通过稀释以及室温下温育16h启动重新折叠。随后pH降低到pH5.5，并除去出现的沉淀物。接着先后进行两次色谱层析，首先是CEX步骤(SP Sepharose)，接着是使用多聚缓冲液(polybuffers)的色谱聚焦步骤(PBE94)。
WO98/53072中公开了一种N-末端具有小前导肽的G-CSF，其在大肠杆菌中表达而未切割信号肽，从而以IB积累。在还原条件(10mM DTT)于8M尿素中进行溶解。对溶解的G-CSF进行AEX(DEAE-Sepharose)处理，然后进行SEC(Sephacryl 200)。其描述的氧化性重新折叠包括一个相当短的温育期，存在2mM谷胱甘肽。
在另一出版物(Wang 2005)中，以8M的尿素并伴随100mM 2-ME和5mM EDTA在pH8下进行溶解。随后的AEX色谱法(Q-Sepharose)中，进行与基质结合的重新折叠。G-CSF结合于柱上，在保持结合状态的同时降低流动相中的尿素浓度。该缓冲液含有GSH/GSSG，而洗脱的G-CSF是具有生物学活性的。进一步的方法在WO01/87925和WO2004/015124中描述。
WO2004/001056公开了一种方法，包括在pH 8下先温育6小时，随后在pH 4-5下再温育6-8小时。
WO2006/097944描述了用尿素或盐酸胍(2-6M)在碱性pH(8-11)下溶解IB，酸性pH下室温稀释后，重新折叠6-16小时。
WO2006/135176涉及为随后的聚乙二醇化而纯化的G-CSF突变蛋白。该G-CSF变体在大肠杆菌中表达，并通过使用8M尿素在pH 11下从IB溶解。通过在2M尿素和50mM甘氨酸中稀释并在pH 9下温育过夜而进行重新折叠。
EP1630173公开了一种分离并重新折叠来自大肠杆菌的IBG-CSF(非格司亭)的方法。该方法是基于用变性剂，优选盐酸胍进行提取。在GSH/GSSG的存在以及高pH和低温下进行重新折叠。
EP1837346描述了分离、重新折叠和纯化在大肠杆菌的IBS中表达的G-CSF(非格司亭)的方法。盐酸胍用于溶解，在GSH的存在下进行重新折叠。随后用凝胶色谱法(SephadexG-25)去除变性剂和缓冲液。
Rao 2008中描述了一种生产来自大肠杆菌IB的G-CSF的工艺。IBs被溶解于异常高pH值(pH值12-12.8)下的含有25mM的半胱氨酸的2M尿素中。
Vanz 2008中也描述了类似的溶解、重新折叠和纯化G-CSF(非格司亭)的方法。
Khalilzadeh 2008建议对上述使用肌氨酰/CuSO4的方法进行调整。用8M尿素对洗涤后的IB进行溶解。通过逐级透析的方法进行重新折叠，尿素从8M降低到0M。CuSO4的浓度范围从5-60μM，最适浓度显示为40μM。色谱序列由三个步骤组成，AEX(DEAE)，接着HIC(丁基)，最后是SEC(Sepfaadex G-25)。
WO2008/096370还描述了来自大肠杆菌IB的huG-CSF的重新折叠和纯化。用尿素在DTT存在且pH升高到12-12.5的条件下进行溶解。
最后，WO2010/146599公开了用6M盐酸胍溶解，并用DTT还原G-CSF。为进行重新折叠而配制了一种复合缓冲液，其组成为2M尿素、0.1M精氨酸、10％的蔗糖、2mM EDTA，并包含诸如10mM Na-抗坏血酸/二氢抗坏血酸/DTT或GSH/GSSG或半胱氨酸/胱氨酸(氧化还原剂(redox))。
对从包涵体获得G-CSF的新方法仍有持续的需求。
发明概述
本发明涉及一种用于将从包涵体提取的重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF)重新折叠成生物学活性分子的新方法。该方法包括用增溶剂溶解G-CSF，在该增溶剂的存在下对G-CSF进行氧化和部分重新折叠，有效地除去该增溶剂，以及在没有增溶剂的条件下完成重新折叠。本发明公开了从部分重新折叠的G-CSF中分离增溶剂的各种方法。
本发明人惊奇地发现，两个重新折叠步骤的组合显著提高了正确折叠的G-CSF的产量。
本发明也公开了重新折叠来自包涵体重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的新方法。该方法包括两个重新折叠步骤。特别是，该方法包括用增溶剂溶解G-CSF，在增溶剂与一种氧化剂的存在下对G-CSF进行氧化性重新折叠(第一重新折叠步骤)，有效地除去增溶剂，在不存在增溶剂的条件下完成G-CSF重新折叠的第二重新折叠步骤。本发明描述了从部分重新折叠的G-CSF中有效分离增溶剂的各种方法。本发明进一步提供了使用离子交换层析随后纯化重新折叠的G-CSF的工艺。
所有引用的参考文献以其全文引入本发明。
在一方面，本发明提供了一种重新折叠来自包涵体的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的方法，包括：
a)在存在增溶剂的条件下溶解G-CSF；
b)进行氧化和第一重新折叠步骤，其包括在存在氧化剂和增溶剂的条件下温育溶解的G-CSF；
c)通过离子交换树脂的吸附和/或离子交换色谱法除去增溶剂，和任选地进行酸沉淀；和
d)进行第二重新折叠步骤，其包括在没有增溶剂的条件下稀释并温育步骤c)的G-CSF。
包涵体可从微生物中获得，优选为大肠杆菌。G-CSF可以是重组牛或人G-CSF，可以是牛或人甲硫氨酰-G-CSF。增溶剂可以是N-月桂酰肌氨酸(N-Lauroylsarcosin)。氧化剂可以是CuSO4。G-CSF的溶解可在高于pH 7的pH值下进行。
在一些实施方案中，增溶剂是浓度为约0.5％到约1.5％的N-月桂酰肌氨酸。
在一些实施方案中，氧化和第一重新折叠步骤进行至少两小时。在一些实施方案中，氧化和第一重新折叠步骤是在通气的条件下进行且不冷却。在一些实施方案中，氧化和第一重新折叠步骤是在约7-9的pH值，并在约20-28℃的温度下进行约15-25小时。
在一些实施方案中，上述步骤(c)中的除去增溶剂包括：AEX(阴离子交换)和CEX(阳离子交换)，任选按照该顺序。在一些实施方案中，上述步骤(c)中的除去增溶剂包括：
a)通过将G-CSF溶液与悬浮树脂材料混合而结合阴离子交换树脂材料，并通过过滤去除树脂材料，和/或
b)在所述增溶剂与树脂结合而G-CSF保留在流过物(flow through)中的条件下进行离子交换层析，和/或
c)在G-CSF与树脂结合而所述增溶剂保留在流过物中的条件下进行离子交换层析。
在一些实施方案中，增溶剂和其它杂质通过依次使用下列步骤而去除：AEX、酸沉淀、AEX和CEX。
在一些实施方案中，增溶剂和其它杂质通过依次使用下列步骤而去除：
a)通过将G-CSF溶液与悬浮树脂材料混合而使增溶剂与阴离子交换树脂材料结合，并通过过滤去除树脂材料，
b)通过将pH降低到低于pH 5而将杂质沉淀，并通过过滤去除沉淀；
c)在剩余增溶剂与树脂结合而G-CSF保留在流过物中的条件下进行阴离子交换层析；
d)在G-CSF与树脂结合而剩余增溶剂保留在流过物中的条件下进行阳离子交换层析；和
e)通过使用pH或盐浓度增加的洗脱缓冲液的逐步或梯度洗脱，从阳离子交换树脂洗脱结合的G-CS。
在本文中所描述方法的一些实施方案中，第二重新折叠步骤是在低电导率缓冲液和/或冷却条件下进行多于12小时。在一些实施方案中，第二重新折叠步骤的进行是在低于2.0mS/cm的电导率，和/或在约2-8℃进行，和/或进行至少24小时。在一些实施方案中，所述第二重新折叠步骤是在高于pH 7的pH值下进行。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括精制(polishing)步骤，其包括一个或多个离子交换色谱。所述精制步骤中的一个或多个离子交换色谱可包括阴离子交换色谱接着是阳离子交换色谱。
在另一个方面，本发明提供了一种纯化G-CSF和/或除去增溶剂的工艺，所述增溶剂用于溶解来自包涵体的G-CSF，所述工艺包含以下步骤：
a)在G-CSF与树脂结合的条件下进行的阴离子交换层析；；
b)通过使用pH降低或盐浓度增加的洗脱缓冲液的逐步或梯度洗脱将结合的G-CSF洗脱；
c)在G-CSF与树脂结合的条件下进行阳离子交换层析；
d)通过使用pH或盐浓度增加的洗脱缓冲液的逐步或梯度洗脱将结合的G-CSF洗脱；
其特征在于，所述阴离子和阳离子交换树脂的骨架聚合物均包含甲基丙烯酸酯的衍生物。
发明详述
本发明提供一种用于重新折叠粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的新方法。特别是，提供用于以高产量从包涵体获得活性G-CSF的新方法，这使得可以工业化生产纯化的G-CSF。
本发明的目的之一是提供一种工业规模的高效生产工艺来以高纯度(高达药品等级)生产重组G-CSF药品，同时考虑品质、经济性和管理要求。本发明提供一种用于重新折叠和纯化包涵体中表达的重组G-CSF的新方法。
现有技术描述了几种对包涵体中的G-CSF进行溶解和重新折叠的方法。如上文所述(见背景技术)现有技术中IB蛋白(特别是针对G-CSF)的溶解和重新折叠可分为两种不同的主要策略。较为经典的方法是使用一种强离液剂(变性剂)，如尿素或盐酸胍，通常在还原条件和碱性pH值下。第二种策略也是在该领域中常用的，其使用强表面活性剂，如肌氨酰或月桂酸进行溶解。曾报道偶尔也使用十二烷基硫酸钠(SDS)，一种强离子型去污剂，对G-CSF进行溶解(Devlin1988)。
每种现有技术的方法都具有某些缺点。如由本发明人进行的实验所阐释的，SDS作为增溶剂是不适合的，因为其(如果不是不可能)难以有效去除。例如，当通过陶瓷羟磷灰石(CHT)上的层析除去SDS时，痕量的SDS仍然结合于所述蛋白质。SDS不能被完全除去。使用盐酸胍溶解(Wingfield 1988，Dietrich 2003，W02006/097944，EP16301273，EP1837346，WO2010/146599)有其他原因引起的问题。虽然盐酸胍可以通过透析或凝胶色谱法除去，但盐酸胍溶解的方法随后需要使用较大体积，这是由于需要强烈稀释来防止重新折叠温育过程中折叠中间产物的凝聚(Rudolph1990，Rudolph 1996)。曾报道了高达1∶200的稀释(Rudolph 1996)。在由本发明人测试的盐酸胍方法中，确证了需要强烈稀释，并且为达到使用盐酸胍法最佳的产量，至少需要1∶50的稀释比。这种溶解，需要用大的不锈钢罐进行大规模工艺，并不经济。
代替盐酸胍的另一变性剂，尿素，也已经被报道用于溶解G-CSF。现有技术中使用了接近饱和浓度的尿素，如8M的尿素(WO98/53072，WO01/87925，WO2006/135176，2008KhaliIzadeh，WO2008096370)。尿素面临与所讨论的使用盐酸胍一样的问题。此外，本领域技术人员公知，尿素的存在，特别是在碱性pH下，容易产生不需要的蛋白质修饰，如脱酰胺基作用。并且，可由氰酸铵(总是与尿素在溶液中平衡)生成的异氰酸的存在导致伯氨基的氨甲酰化(Rudolph 1996)。最后，本领域中还报道了当聚合抑制剂精氨酸作为共同变性剂在重新折叠过程中以高浓度存在时，可能对产量有益(EP0219874，Rudolph 1996，Dietrich 2003)。然而，精氨酸是一种昂贵的试剂，在经济上可取的做法是放弃使用精氨酸。
如上面所提到的，表面活性剂肌氨酰，也可以用于溶解来自IB的G-CSF。优选使用2％肌氨酰(Zsebo 1986、WO8701132、WO8910932、Lu 1992、Heidari 2001)。肌氨酰是一种具有良好溶解性的阴离子表面活性剂。使用肌氨酰的优点之一是，在随后的重新折叠温育中需要的稀释倍数较低(2倍，而使用盐酸胍/尿素时是50-200倍)。另一个优点是对环境产生废弃化学物质相对较少。但是，在使用原来所描述的方法时，本发明人在他们的实验中观察到重新折叠后的产量相当低，并且批次间的高度变化。诸如肌氨酰的表面活性剂通常通过增加一般蛋白质的溶解度而促进溶解。由于肌氨酰不像离液剂那样变性和重新折叠蛋白质，最初不正确折叠的IB蛋白质随后无法重新折叠；因此与盐酸胍/尿素法相比产量要低。
本发明克服了现有技术的缺点。
本发明提供了一种获得重新折叠的G-CSF的新方法，它解决了与现有技术方法相关联的问题。令人惊讶地发现，通过在增溶剂的存在下运用第一氧化性重新折叠步骤，随后有效地除去增溶剂(例如通过离子交换树脂的吸附和/或酸沉淀和/或离子交换色谱)，接着进行第二重新折叠步骤，该步骤包括稀释G-CSF并在没有增溶剂的条件下温育，可以获得更高产量的单体可溶性G-CSF，即通过本发明所述的方法获得了重新折叠G-CSF。
因此，本发明涉及一种新的方法，用于从包涵体中的无活性前体生产生物学活性G-CSF。在微生物中过表达异源重组多肽常常导致包涵体的形成，其中的多肽是未折叠的、还原的、无活性的，并至少部分不溶于普通的水性缓冲液。本发明公开了重新折叠来自包涵体的重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的新方法。特别的，本发明涉及一种包括两个重新折叠步骤的新的重新折叠方法。该方法包括用增溶剂溶解G-CSF，在增溶剂和氧化剂存在下对G-CSF进行氧化性重新折叠(氧化和第一重新折叠步骤)，有效地除去增溶剂，在没有增溶剂情况下进行第二重新折叠步骤以完成G-CSF的折叠。
本发明还涉及重新折叠和纯化步骤的新组合。经过第一重新折叠步骤后，在进行第二重新折叠步骤以完成G-CSF的折叠之前，引入一种新颖的中间纯化步骤以保证有效除去增溶剂和氧化剂。本发明通常还涉及一种将增溶剂和重新折叠过程中使用的其他试剂一起除去的新方法。
本发明新描述的方法的主要原理示意性地描述于图1中(也包括了任选的下游精制步骤)。简言之，该方法包括：
a)用增溶剂溶解来自包涵体的G-CSF(任选地，之前提取和/或分离和/或洗涤包涵体)；和
b)通过在氧化剂和增溶剂的存在下温育而对溶解的G-CSF进行氧化和部分重新折叠；和
c)去除增溶剂(和其他杂质)；和
d)通过对部分重新折叠的G-CSF进行稀释和温育而完成重新折叠。
因此，第二重新折叠步骤是在不存在增溶剂的情况下进行的。
因此，在第一方面，本发明提供了重新折叠来自包涵体的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的方法，其包括：
(a)在增溶剂的存在下溶解G-CSF；和
(b)氧化和第一重新折叠步骤，包括在氧化剂和增溶剂的存在下温育溶解的G-CSF；和
(c)通过离子交换树脂的吸附和/或酸沉淀和/或离子交换色谱法除去增溶剂；和
(d)第二重新折叠步骤，包括在没有增溶剂的条件下稀释并温育步骤(c)的G-CSF。
包涵体可从微生物获得。该微生物可以，例如，重组产生G-CSF。因此，该方法可任选地进一步包括从微生物细胞中分离包涵体的步骤。
包涵体
本发明提供重新折叠来自包涵体的G-CSF的方法。以往，已经测试了几种不同表达系统高水平生产G-CSF的能力。所有被测试的细菌菌株均以包涵体(IB)的形式表达G-CSF蛋白。包涵体(IB)含有高量的G-CSF，但其是未折叠的无活性形式。将分离的包涵体流分(fraction)，优选洗涤过的包涵体流分用作本文描述的方法的起始原料。这样的包涵体制备物可以由适当的表达系统、发酵条件、收获和裂解过程以及适宜分离和洗涤IB的方法来提供。现有技术中公开了此类方法(例如，参见Rudolph 1990、Rudolph 1996、Heidari2001、Khalilzadeh 2008.、Rao 2008、Vanz 2008、US5849883、EP0219874、EP1630173或WO2O04001056)。从宿主细胞中提取包涵体的工艺通常包括溶解和破裂细胞然后离心。包涵体可通过在分离器中收获细胞来获得(例如通过离心，如在11000g)，用高压匀浆机(例如在约1000bar下)机械破裂细胞并随后分离从分离器中的细胞碎片分离的包涵体(例如通过离心，如在11000g)。包含较高比例典型包涵体的沉淀通常用洗涤剂洗涤。可将包涵体冷冻，在G-CSF溶解前存储起来。发现从分离器中的细胞碎片分离并在-80℃的还原缓冲液中储存的IB可稳定保存长达8个月。
包涵体可以从微生物细胞获得。因此本文描述的方法可以包括从微生物宿主细胞中提取包涵体的步骤。用于表达G-CSF的微生物宿主细胞可以是酵母细胞、丝状真菌细胞或细菌细胞。在优选的实施方案中，所述微生物是细菌，在更优选的实施方案中是革兰阴性菌，最优选的是大肠杆菌。包涵体因此可从大肠杆菌细胞获得。
G-CSF
如在本发明的上下文中使用的“G-CSF”包括G-CSF的物种直系同源物，例如人G-CSF、牛G-CSF等。人G-CSF的氨基酸序列是(SEQ ID NO：1)：
TPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP。
其可以在例如Holloway，1994中，或在Drugbank登录号DB00099中找到。
牛G-CSF的序列是(SEQ ID NO：2)：
TPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCAAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAPLSSCSSQSLQLRGCLNQLHGGLFLYQGLLQALAGISPELAPTLDTLQLDVTDFATNIWLQMEDLGAAPAVQPTQGAMPTFTSAFQRRAGGVLVASQLHRFLELAYRGLRYLAEP。
其可以在例如美国专利US5849883的图7，或PDB登录号1BGC-A中找到。
在优选的实施方案中，G-CSF是哺乳动物的G-CSF，在特别优选的实施方案中是人G-CSF。在一些优选的实施方案中，重组多肽是甲硫氨酰-G-CSF(Met-G-CSF)，如人Met-G-CSF(r-met-hu-G-CSF＝非格司亭)。
非格司亭的序列是(SEQ ID NO：3)：
MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP。
牛G-CSF可同样命名为甲硫氨酰基-牛G-CSF。
如在本发明的上下文中使用的“G-CSF”包括G-CSF的功能性变体。这里所提到的“变体”是指“功能性变体”，除非上下文另有说明。G-CSF蛋白的变体是指序列不同于G-CSF蛋白质但仍具有相同的生物学活性的蛋白质(功能性变体)。一种G-CSF蛋白的“变体”是指有一个或多个氨基酸不同于参比G-CSF蛋白的序列(如人G-CSF序列)的蛋白质。一种“变体”可替换地或额外的具有其它的修饰，例如甲基化、聚乙二醇化、琥珀酰化、加入标签或标记等等。所述变体可以是一种酶或化学修饰的G-CSF。它可以是融合到另一个肽或多肽的融合蛋白。
在优选的实施方案中，G-CSF是聚乙二醇化的。
“变体”可以是天然变体，包括等位基因变体或剪接变体(例如，参见Zsebo 1986)，包括等位基因变体，或合成产生的变体。现有技术中显示了以包涵体表达修饰形式的G-CSF。例如，EP0719860在其实施例2和3中记载了修饰的牛G-CSF的构建和生产，其以包涵体表达。因此可以使用本文描述的方法获得变体。
在一些实施方案中，G-CSF变体是与SEQ ID NO：3(r-met-hu-G-CSF＝非格司亭)具有至少70％，至少80％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，在至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少99.5％的序列相同性的蛋白质。序列相同性可以使用标准序列分析工具，例如的Clustal、BLAST等，或比对算法，如例如Needleman-Wunsch算法、Smith-Waterman算法等等来确定。所述变体可以具有一个或多个保守氨基酸取代。如果一个氨基酸被与之具有类似性质的氨基酸所取代，例如一种极性氨基酸与另一种极性氨基酸，一种酸性氨基酸与另一种酸性氨基酸等，则该氨基酸取代是保守的。保守取代不太可能影响蛋白质的化学性质，因此不太影响蛋白的功能。G-CSF“变体”因而包括与SEQ ID NO：3相比具有一个或多个突变、缺失、取代、插入和/或一个或多个氨基酸修饰，只要G-CSF的变体仍显示出与G-CSF相同的生物学功能(功能等价物)。变体是否具有相同的生物学功能，可以在确定G-CSF生物学活性的实验中测试(如下文所讨论)。市售的G-CSF可被用作参考对照。如果变体具有与参比的市售G-CSF相比至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少99.5％的活性，其可被认为具有“相同的生物学活性”，即是“具有生物学活性的”或“有活性的”。
因此当本发明提及“G-CSF”时，包括人G-CSF的物种直系同源物和变体，即人G-CSF的功能性变体。
溶解
在增溶剂的存在下对IB流分中的G-CSF进行溶解。可使用任何合适的增溶剂(即任何使本发明描述的溶解G-CSF的试剂)。此类增溶剂可以选自，例如(但不限于)变性剂或离液剂组，诸如(但不限于)盐酸胍或尿素，或洗涤剂、表面活化剂(tenside)或表面活性剂(surfactant)，例如(但不限于)N-月桂酰肌氨酸(肌氨酰)、月桂酸、十二烷基硫酸钠(SDS)或N-十六烷基三甲基氯化铵。
对于肌氨酰，本发明人发现，与频繁报道的2％的肌氨酰浓度相反，1％(w/v)的肌氨酰即可实现最大溶解作用。更有利地，与其它诸如SDS的离子型去污剂相反，本发明人发现肌氨酰可通过各种纯化方法从产品中完全除去。最后，本申请发明人发现有效除去肌氨酰后的第二重新折叠步骤使得正确折叠的单体G-CSF产量增加。
因此，在本发明的优选实施方案中，增溶剂是去污剂或表面活性剂。在更优选的实施方案中，增溶剂是一种阴离子表面活性剂，最优选的是肌氨酰。溶解作用中肌氨酰的优选浓度为0.2-2.0％(w/v)，在更优选的实施方案中为约0.5％-1％(w/v)，最优选为约1％(w/v)或1％(w/v)。
进一步发现，如温度、pH、缓冲液等其他参数的优化可以进一步提高产量。最适温度、pH、缓冲液等可以根据本申请说明书而使用本文描述的方法建立。在优选的实施方案中，溶解在碱性pH下进行，例如在pH 7-10，或7-9，或7.5-8.5，或7.8-8.2的范围内进行。在优选的实施方案中，pH为约8或8。在一些实施方案中，溶解在室温下进行，例如20-25℃之间。在特定的pH范围内用于溶解的适当缓冲液为本领域公知的。例如可使用Tris-HCl。优选地，在搅拌下进行溶解。
在优选的实施方案中，溶解用肌氨酰在碱性pH值下进行，优选pH为8。优选的溶解缓冲液是Tris-HCl/pH 8，优选40mM的Tris-HCl/pH.8。
溶解后，可进行稀释步骤，例如稀释度为5倍或4倍或3倍或优选2倍。用于稀释的优选溶剂是低电导率的缓冲液或更优选就是水。低电导率是指至少低于2mS/cm的电导率，更优选低于1mS/cm。一种合适的缓冲系统是例如10mM Tris或更低浓度且pH值大于7的Tris/HCl。也可以使用其它具有相同低电导率和pH值的缓冲液。
第一重新折叠步骤(氧化性重新折叠)
还原性半胱氨酸的氧化和二硫键的形成对于G-CSF的正确折叠是必要的。经典的方法是在一对氧化/还原剂的存在下进行氧化(Rudolph 1990，Rudolph 1996，参见背景技术)。已出版了许多体外重新折叠技术。基于这些重新折叠方案，本发明人已经得出一些一般原则，其对在包涵体中表达的含二硫键的蛋白质来说是普遍的。因为蛋白质是在还原和未折叠的状态下，该重新折叠程序的机理主要是通过在成对半胱氨酸的巯基基团之间形成天然二硫键而将多肽链氧化折叠成天然构象。在典型的重新折叠过程中，增溶剂(离液剂或去污剂)的浓度起初降低到低于变性浓度，这通常是通过步进式稀释或透析或通过凝胶色谱法，例如用葡聚糖凝胶G-25来实现。诸如CuSO4等的氧化剂或诸如谷胱甘肽氧化还原剂(GSH/GSSG)的氧化还原体系的存在促进重新折叠温育期间二硫键的形成。通常的温育在室温下进行几个小时到几天。也描述了各种附加的添加剂，其可以任选地用于增加蛋白的溶解性和/或防止聚集。聚集，特别是部分折叠中间体的聚集，是重新折叠过程中的主要问题，最好通过低于临界蛋白浓度的稀释来阻止(Rudolph 1990，Rudolph 1996)。对于G-CSF，现有技术还教导了通过CuSO4与肌氨酰的组合进行氧化。重新折叠在氧化剂和增溶剂的存在下进行(Zsebo 1986、WO8701132、WO8910932、Lu 1992、Heidari 2001)。
本发明人发现，在增溶剂，如肌氨酰的存在下，G-CSF的折叠并不能完全达到。因此这种氧化和折叠步骤仅产生部分重新折叠的G-CSF。本发明人发现，完全除去增溶剂，接着在没有增溶剂的条件下进行第二重新折叠步骤能提高产量。本发明人还设计了用于除去增溶剂的优化方法(见下文)。其它也可导致不完全折叠的污染物也被除去。
任何合适的氧化剂都可以使用，如氧气或空气流(鼓泡)、GSSG(谷胱甘肽-OX)、金属离子(Cu2+、Fe2+、Zn2+……)、过氧化氢(H2O2)。在优选的实施方案中，氧化剂是CuSO4。除CuSO4外，其他的铜盐都可以使用(如CuCl2)。
以有效量使用增溶剂。本领域技术人员可以容易地确定和优化有效量，即实现有效溶解G-CSF的量。测定溶解的G-CSF量的方法在下文进一步描述(例如，参见实施例13.3)。
在第一重新折叠步骤中增溶剂的优选浓度为0.2-2.0％(w/v)，更优选为0.2％-1％(w/v)，最优选是约0.5％(w/v)或0.5％(w/v)。在优选的实施方案中，如果使用肌氨酰，肌氨酰的浓度低于1％(w/v)，优选0.5％(w/v)。
本发明人进一步观察到，长时间氧化可能导致RP-HPLC色谱图上出现2-3个额外的峰。这些额外的峰可能是由于G-CSF的甲硫氨酸残基氧化。这种氧化形式是不需要的产品相关物质，通过合适的色谱法去除他们是困难的。
在一些实施方案中，氧化性重新折叠(即氧化和第一重新折叠步骤)进行1-30小时，或2-25小时，或6-25小时，或10-25小时，或12-25小时，或14-25小时，或16-25小时，或18-22小时，或19-21，或20-24小时。在一些实施方案中，G-CSF的氧化和部分重新折叠进行2多于小时，优选地为多于12小时，优选为多于20小时，最优选20-24小时。
在优选的实施方案中，氧化性重新折叠步骤(即氧化和第一重新折叠步骤)在碱性pH进行，例如pH在7至10，或7至9，或7.5到8.5，或者7.8到8.2的范围内。在优选的实施方案中，pH为约8或8。在一些实施方案中，第一重新折叠步骤的pH值大于7，优选pH 8。
氧化性重新折叠步骤也可以用已经(部分)纯化的G-CSF进行。在一些实施方案中，用于氧化性重新折叠的G-CSF的纯度大于50％，优选纯度为约60％-70％，甚至更高。
氧化性重新折叠优选在不冷却的条件下进行，优选在室温下，优选在18-30℃，优选在20-28℃，优选在20-26℃，优选在20-24℃，优选在21-23℃，最优选在约22℃或22℃下进行。
氧化性重新折叠可在持续的气流下进行。
基于各种优化实验，用于氧化性重新折叠(氧化和第一重新折叠步骤)的最优选条件显示于表1的“第一重新折叠”栏下。
氧化性重新折叠步骤可以通过加入终止剂，例如EDTA来停止。在一些实施方案中，氧化反应是通过加入EDTA终止，优选最终浓度为约1mM，但也可使用其他浓度。EDTA去除Cu2+(假定CuSO4用作氧化剂)，从而停止氧化。除EDTA外其它Cu2+络合剂和/或其他浓度都可以使用。依据氧化剂，可使用其它螯合剂，例如terdentat-配体，例如N-甲基吡啶(picolinoyl)-乙二胺，甘氨酸-2-比啶基甲基胺，Nα-(2-吡啶基甲基)-甘氨酰胺和Nα-(2-吡啶基甲基)-甘氨酸-乙基胺。
如上文所讨论，本发明的发明人已经发现肌氨酰的存在阻止绝大部分G-CSF变为完全重新折叠。本发明人认为，这可能部分是由于在增溶剂的存在下重新折叠更慢。然而，如上文所讨论，温育时间不能随意的延长，因为更长的温育时间可使得产品质量达到不可接受的水平。
本发明人惊奇地发现，重新折叠可以通过完全去除增溶剂和氧化剂后的第二次温育而优化和完成，出人意料地导致可溶的、纯的、具有生物学活性的G-CSF的产量提高。
除去增溶剂和氧化剂并去除其它污染物。
在一个中间纯化步骤中，氧化和部分重新折叠的G-CSF进行了进一步纯化。重要的是，在执行第二重新折叠步骤之前，增溶剂必须被完全除去。氧化剂和污染物/杂质也进一步被部分除去。
现有技术中描述了几个通过透析/超滤或色谱方法去除增溶剂和氧化剂的程序。然而，发明人已经发现，通过单批次吸附步骤，不能实现完全去除如肌氨酰的增溶剂。在由本发明人进行的实验中，肌氨酰的浓度在该步骤后保持在0.01-0.04mg/ml(表III)，发现这对正确折叠的G-CSF的产量有负面影响。
为提高可溶性活性G-CSF的产量，必须完全去除增溶剂，即低于本文所描述的检测方法的可检测水平。例如，残余增溶剂的浓度可通过HPLC测量并通过UV检测。本发明人进行的试验中的检测极限为0.01mg/ml。Burgess，R.R.1996中更详细地描述了该方法(Purification of over produced E.coli RNA polymeraseσfactors by solubilizinginclusion bodies and refolding from sarkosyl.Methods Enzymol.273：145-149)。
可以使用任何适当的去除方法。例如，可以通过离子交换树脂吸附，和/或酸沉淀，和/或离子交换色谱法来实现充分的去除。应用任何一种根据本发明的技术或这些技术的组合，导致增溶剂，如肌氨酰的浓度不会干扰或抑制第二重新折叠步骤中的重新折叠，优选的浓度低于0.01mg/ml，优选低于检测极限。这些纯化步骤可以以任何顺序和/或以任何组合的方式应用，只要其使得增溶剂的完全去除。也可使用其他合适的纯化方法。本发明描述的方法因此包括完全除去增溶剂的步骤，即增溶剂的去除程度足以使得任何残余量不会干扰或抑制第二重新折叠步骤。因此第二重新折叠步骤在不存在增溶剂的条件下进行，即增溶剂存在的量不足以干扰第二重新折叠步骤，即增溶剂低于检测极限。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种方法，其中增溶剂由下列一个或多个步骤除去：
i)通过混合G-CSF溶液与悬浮树脂材料而结合阴离子交换树脂材料，并通过过滤除去树脂材料，和/或
ii)在增溶剂结合到树脂上而G-CSF保留在流过物中，或者相反，G-CSF结合到树脂而增溶剂保留在流过物中的条件下进行离子交换层析。
在在本发明的一个实施方案中，提供了一种方法，其中所述增溶剂(和其他杂质)通过下列一个或多个步骤所去除：
i)通过混合G-CSF溶液与悬浮树脂材料而结合到阴离子交换树脂材料，并通过过滤除去树脂材料，和/或
ii)酸沉淀。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种方法，其中所述增溶剂(和其他杂质)通过下列一个或多个步骤所去除：
i)通过混合G-CSF溶液与悬浮树脂材料而结合到阴离子交换树脂材料，并过滤除去树脂材料，和/或
ii)酸沉淀，和/或
iii)在增溶剂结合到树脂上而G-CSF保留在流过物中，或者相反，G-CSF结合到树脂而增溶剂保留在流过物中的条件下进行离子交换层析。
在一个优选的实施方案中，增溶剂(和其他杂质)通过顺序应用下列步骤而除去：
a)通过混合G-CSF溶液与悬浮树脂材料而使增溶剂结合到阴离子交换树脂材料，并通过过滤除去树脂材料，
b)通过降低pH值到低于pH 5而将杂质沉淀，并过滤除去沉淀物，
c)在残余增溶剂结合到树脂中而G-CSF保留在流过物中的条件下进行阴离子交换层析，
d)在G-CSF结合到树脂中而残余增溶剂保留在流过物中的条件下进行阳离子交换层析，
e)通过使用pH或盐浓度增加的洗脱缓冲液进行逐步或梯度洗脱而从阳离子交换树脂上洗脱结合的G-CSF。
离子交换树脂吸附
离子交换树脂的吸附可用于除去增溶剂。
作为除去增溶剂第一步骤，可进行离子交换树脂吸附。适当的方法是本领域所熟知的。如上所述，对于去除增溶剂，如肌氨酰，一种方法是分批吸附到DOWEX阴离子交换树脂(Dow Chemicals，美国)，优选用Dowex 1X4(WO8910932、Lu 1992、Heidari 2001)。捕捉了结合的表面活性剂的树脂通过过滤除去。与Dowex树脂非常类似的产品是BioRad公司的AG树脂(如AG-1X8)，其可以以相同的方式使用。
上述方法适用于所有在溶液中带电的增溶剂。许多表面活性剂是两亲性的，其它的是阴离子或阳离子性的。根据增溶剂的种类和溶液pH值，所述电荷可以是正的或负的。AEX材料如Dowex或AG-1的选择取决于带负电荷的增溶剂，例如肌氨酰或SDS。与此相反，根据树脂种类选择的离子交换色谱法，可对带负电或正电的增溶剂均可结合。带负电的增溶剂将结合AEX树脂而不结合CEX树脂。带正电的试剂则与之相反。例如药剂，如阳离子脂质体，十六烷基三甲基铵，或精氨酸可以通过阳离子交换层析除去。除了增溶剂外，通过该方法也将至少部分去除其他污染物。这些其它污染物/杂质可包括过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白(HCP)、DNA/RNA、内毒素(例如LPS)、氧化剂(例如Cu2+)、过程相关的化学物质(例如EDTA)，以及与产品相关的杂质，例如聚集体。
在一些实施方案中，增溶剂是一种在分批模式下吸附到AEX树脂上的阴离子去污剂或表面活性剂。优选的去污剂或表面活性剂是肌氨酰。在一些实施方案中，肌氨酰吸附于分析纯(AG)AEX树脂(BioRad公司，美国)中，优选AG 1-X系列的树脂，最优选的树脂是AG 1-X8。在一些实施方案中，树脂作为一次性的材料使用。
在优选的实施方案中，用AG 1-X树脂对增溶剂的批次吸附在碱性pH值的缓冲液中进行，优选约pH 8。合适的缓冲系统可基于磷酸盐、碳酸盐、硼酸盐、Tris、HEPES、MOPS、HEPPS、EPFS、CAPS CAPSO、CHES、TES、BES、TAPS、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、甲基甘氨酸、二羟乙基甘氨酸、乙酰氨基甘氨酸、甘氨酰胺或其它pKa值高于7的生物相容性缓冲物质。优选的吸附缓冲液是Tris-HCl/pH8，优选20mM的Tris-HCl/pH 8。最优选的为Tris-HCl/pH 8+1mM EDTA。
AG 1-X8的优选量为每克肌氨酰10-60g干树脂，最好为20g/g肌氨酰。在一些实施方案中，初始肌氨酰浓度为0.5％。
在优选的实施方案中，离子交换树脂吸附步骤除去了大于90％，大于95％，更优选大于96％，更优选大于97％，更优选大于98％，更优选大于99％，更优选大于99.2％，更优选大于99.3％，更优选大于99.4％，更优选大于99.5％，更优选大于99.6％，更优选大于99.7％，更优选大于99.8％，更优选大于99.9％的增溶剂。在优选的实施方案中，增溶剂是肌氨酰。在一些实施方案中，该离子交换树脂吸附步骤通过AG1-X8批次吸附除去大于95％的肌氨酰，更优选至少99％肌氨酰。在一些实施方案中，带有捕获的肌氨酰的AG 1-X8树脂从溶液中过滤分离。优选的过滤步骤是利用100pm不锈钢网眼。更优选地，过滤步骤利用100um的尼龙袋过滤网格。
如果离子交换树脂吸附步骤不能使增溶剂充分完全的除去，可以进行进一步的纯化步骤，例如酸沉淀和/或离子交换层析。
酸沉淀
任选地，可以进行酸沉淀步骤来去除其他潜在的污染物。令人惊奇的是，本发明人发现，通过简单的酸沉淀，绝大部分的污染物都可以轻易地除去。已知G-CSF，尤其非格司亭，在酸性pH下具有最佳溶解性和稳定性，甚至将pH值降低到低于等电点(非格司亭的PI＝5.65)仍保持可溶。污染物的酸沉淀可通过将pH值降低到6.5至6.0之间，6.0和5.5之间，5.5和5.0之间，5.0和4.5之间，在4.5和4.0之间，4.4和3.5之间，3.5和3.0之间等而进行。
尽管存在残留的增溶剂，本发明人发现，加入的尿素可对沉淀过程产生额外的有益效果。通过降低pH值，有时会发生G-CSF非特异性且不期望的共沉淀，从而导致最终产量不期望的损失。本发明人已经发现，这一缺点可以通过将亚变性浓度的尿素在pH调节前加入到溶液中而克服。尿素可有效防止G-CSF的共沉淀。通过用醋酸或醋酸钠缓慢平稳的降低pH值而优化这一步骤可显示出最好的结果。pH值低于5.0就已经产生效果。相当低的尿素浓度，即约1M就已足够。
在一些实施方案中，酸沉淀前残留肌氨酰的浓度是0.01到0.04mg/ml之间。
在一些实施方案中，pH值通过加入浓缩的醋酸钠或醋酸而降低。在一些实施方案中，pH值降低到低于pH 5.0，优选低于4.8，最优选至pH4.3-4.5。在一些实施方案中，在尿素的存在下进行酸化，优选尿素浓度低于3M，最优选为1M尿素。在一些实施方案中，通过深层过滤(depth filtration)除去沉淀物。
离子交换色谱法
离子交换也可用于去除增溶剂。除去增溶剂的步骤可包括一个或多个离子交换步骤。
如果使用离子交换树脂吸附(使用或不使用酸沉淀)没有完全除去增溶剂，可以使用一个或多个离子交换色谱步骤以完全除去增溶剂。离子交换步骤可包括AEX和/或CEX，以任意顺序。也可使用任何其他合适的离子交换技术。
现有技术中描述了用离子交换色谱法纯化G-CSF。许多工艺都利用AEX和CEX，或以任意顺序应用两种方法，或一种IEX步骤与其他色谱方法，如HIC，XMAC，SEC或RP-HPLC相结合(见背景技术)。
对于肌氨酰，发明人发现，如果AEX批次吸附和酸沉淀后仍然有低浓度的肌氨酰残留，就可以通过随后的离子交换步骤完全除去。
本发明人发现，酸沉淀步骤之后，G-CSF保留在上清液中，pH值低于其PI。在这些pH值条件下的G-CSF是阳离子性的，其将结合到CEX上而不结合到AEX树脂上。这已由实验证实。
在一些实施方案中，所述离子交换步骤包括AEX而后是CEX。发现AEX可以在非结合模式(G-CSF在流过物中)中使用，而杂质如残余的增溶剂或DNA结合到树脂上，其促使发明人开发了两个柱子以AEX、CEX的先后顺序串联连接的串联步骤作为本发明的一个实施方案。AEX树脂的主要作用是结合残余的肌氨酰，而CEX树脂的主要功能仅仅是缓冲液交换(为第二次重新折叠做准备)。通过第一个柱的G-CSF随后结合于第二树脂，而蛋白质可通过适当方法从CEX柱上洗脱。这种方法是本领域技术人员所熟知的。对结合的G-CSF进行解吸附的洗脱方法可以包括通过逐步洗脱或梯度洗脱而增加盐的浓度，或者可替换的，G-CSF的洗脱可以例如通过将pH值提高到高于PI值来实现。其也可以通过逐步洗脱或pH梯度来实现。如果应用pH值逐步洗脱，则其额外提供了快速缓冲和pH值交换的可能性。
用于多肽的色谱中AEX树脂的合适的官能团是已知的。这些官能团包括二乙氨乙基(DEAE)、三甲基氨乙基(TMAE)、四氨甲基(quaterny aminomethyl，Q)和四氨乙基(quaterny aminoethyl，QAE)，这些都是生物色谱工艺常用的官能阴离子交换基团。合适的市售产品包括，例如，Macro-Prep High Q、Macro-Prep DEAE、Nuvia Q(BioRad，美国)、TOYOPEARL DEAE-650、TOYOPEARL SuperQ-650、TOYOPEARL QAE-550(Tosoh Bioscience，日本)、Fractogel EMD DEAE、Fractogel EMD TMAE(Merck，德国)、Biosepra Q CeramicHyperD、Biosepra DEAE Ceramic HyperD(Pall Corporation，美国)、DEAE-Sepharose FF、DEAE-Sepharose CL-4B、Q-Sepharose FF、Q-Sepharose CL-4B-、Q-Sepharose HP、Q-Sepharose XL、Q-Sepharose Big Beads、QAE-Sephadex、DEAE-Sephadex、Capto DEAE、Capto Q、Capto Q ImpRes、Source 15Q、Source 30Q和DEAE Sephacel(GE Healthcare，美国)。
在优选的实施方案中，AEX树脂是DEAE。DEAE是经典的弱阴离子交换基团，其在本发明人的实验中显示出极高的分辨率和快速平衡分布。
用于CEX树脂的合适官能团包括羧甲基(CM)、磺酸盐(S)、磺丙基(SP)和磺乙基(SE)。这些是生物色谱工艺中常用的阳离子交换官能团。合适的市售产品包括，例如，Macro-Prep High S、Macro-Prep CM、Nuvia S(BioRad，美国)、TOYOPEARL CM-650、TOYOPEARL SP-650、TOYOPEARL SP-550(Tosoh Bioscience，日本)、Fractogel EMD COO-、Fractogel EMD S03-(Merck，德国)、Biosepra CM Ceramic HyperD、Biosepra S CeramicHyperD(Pall Corperation，美国)、CM-Sepharose FF、SPSepharose FF、S-Sepharose FF、SP-Sepharose HP、SP-Sepharose XL、SP-Sepharose Big Beads、CM-Sephadex、Capto S、Capto SP ImpRes、Source15S、Source 3OS(GE Healthcare，美国)。
在优选的实施方案中，CEX树脂是以SP为官能团的树脂。SP是一种经典的强阳离子交换基团，其在本发明人的实验中显示出极高的分辨率、快速平衡分布以及极高的再现性。
因此，在本发明的一些实施方案中，用于除去增溶剂(和氧化剂以及去除其它污染物)的AEX色谱法以非结合模式进行，并且产生的流过物直接排出，而不需要经过随后的柱子。
在优选的实施方案中，两个柱子(AEX+CEX)直接连接且G-CSF结合到CEX树脂上。
在本发明的一些实施方案中，AEX树脂为弱阴离子交换树脂，并优选带有DEAE官能团。最优选的树脂是DEAE Macro-Prep(BioRad，美国)。
在一些实施方案中，样品装载在pH值低于5，优选pH 4.3-4.5，最优选在pH4.5的醋酸钠缓冲液中。
在本发明的一些实施方案中，CEX的树脂是一种强阳离子交换树脂，优选带有SP的官能团。最优选的树脂是的Toyopearl SP-650(Tosoh，Tokio)。
在优选的实施方案中，将G-CSF从CEX树脂上洗脱是通过提高洗脱缓冲液的pH值进行的。更优选的洗脱用不连续梯度的pH进行。
在一些实施方案中，CEX洗脱缓冲液具有碱性pH值，优选pH为8，最优选的洗脱缓冲液是20mM的Tris-HCl/pH 8。
在最优选的实施方案中，将DEAE Macro-Prep柱直接连接到Toyoperl SP-650柱，在乙酸钠缓冲液pH 4.5中进行样品装载，G-CSF的洗脱通过使用pH 8的Tris-HCl缓冲液的pH梯度进行。
在本文中所描述方法的一些实施方案中，增溶剂和其它杂质通过依次实施下列步骤而去除：
a)AEX，
b)酸沉淀，
c)AEX，和
d)CEX。
在步骤a)中，增溶剂结合至阴离子交换树脂。树脂材料可通过过滤除去。
在步骤b)中，pH值可以低于5，如4至5。沉淀物可通过过滤除去。
在步骤c)中，残余增溶剂结合到树脂上。G-CSF保留在流过物中。
在步骤d)中，G-CSF结合到树脂上。残余增溶剂保留在流过物中。
这之后可以通过逐步或梯度洗脱从CEX树脂上洗脱结合的G-CSF或其功能性变体。洗脱缓冲液可以具有增加的pH或盐的浓度，增加的pH值是指高于在步骤b)的pH值，即pH值大于5，或者大于6或大于7。
第二重新折叠(完成折叠)
已经提到，令人吃惊地发现，当进行第二轮重新折叠时，单体、可溶的并活性的G-CSF的产量可以显著提高。该实验表明，使用的“经典”肌氨酰/CuSO4方法获得的G-CSF并没有完全重新折叠。
第二重新折叠步骤包括稀释，然后温育部分重新折叠的G-CSF。
用于稀释的优选溶剂是低电导率的缓冲液，或更优选为水。稀释可以是5倍，或4倍，或3倍，或优选2倍稀释。低电导率是指电导率至少低于2mS/cm，更优选低于1mS/cm。一种合适的缓冲系统是例如含10mM或更低Tris且pH值大于7的Tris/HCl，也可以使用其它具有相同低电导率和pH值的缓冲液。
虽然不束缚于(bound to)任何理论，本发明人有以下发现。现有技术已知(Lu1992)，G-CSF的第二个二硫键的形成具有相对慢的动力学。具有还原性自由半胱氨酸基团的不完全折叠的中间体有聚集和/或沉淀的风险(Rudolph 1990，Rudolph 1996)。以G-CSF为例，有三个未成对半胱氨酸的中间体可存在相当长的时间，这取决于Cu2+的浓度和温度(Lu 1992)。聚集和沉淀导致在过滤和层析步骤中G-CSF的损失。本发明人推测，改进折叠效率能使下游过程产量的提高。本发明人发现第二重新折叠步骤提高了产量。
本发明人惊奇地发现，第二重新折叠步骤中在弱碱性pH值下温育是有益的。这是特别令人惊奇的，因为，G-CSF尤其非格司亭是一种相对疏水性的蛋白质，其在pH值大于其等电点(5.65)时不太可溶且稳定性较差。最佳溶解性和稳定性是在酸性环境下，pH为4或更低。因此，经典的纯化方法，如层析法在较低pH值下进行，优选在pH为4-5.5的乙酸盐缓冲液中进行。与此相反，本发明人发现，在碱性pH下温育有利于进一步增加产量。本发明人认为，不存在氧化剂时，碱性pH值对于巯基的完全氧化以及形成G-CSF的两个天然二硫键是重要的。
因此，第二重新折叠步骤可在碱性pH值下进行，即在pH为7或更高。pH值可以大于7。所述第二折叠步骤可以在pH 7至10之间，或在7和9之间，或在7和8.5之间，或在7和8之间，或在7.5和10之间，或在7.5和9之间，或在7.5及8.5之间，或者在pH值约为8或在pH为8进行。
第二重新折叠步骤的温育在没有增溶剂的条件下进行。
在优选的实施方案中：
所述第二重新折叠步骤可以在例如下列一种缓冲液中进行：磷酸盐、碳酸盐、硼酸盐、Tris、HEPES、MOPS、HEPPS、EPFS、CAPS CAPSO、CHES、TES、BES、TAPS、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、甲基甘氨酸、二羟乙基甘氨酸、乙酰氨基甘氨酸、甘氨酰胺或其它pKa值高于7的生物相容性缓冲物质。优选的第二重新折叠步骤缓冲液是Tris-HCl/pH8，优先10mM的Tris-HCl/pH 8。
所述第二重新折叠步骤可以在，例如低浓度的残余去污剂下进行，如0.01mg/ml或更低。第二重新折叠步骤可以在，例如离子强度为0.02mol/L或更低的溶液中进行。
所述第二重新折叠步骤可以在，例如0°-20℃，或2°-8℃，或2°-5℃的温度范围进行。
所述第二重新折叠步骤可以进行，例如至少24小时，或者大于24小时，或30-48小时，或32-42小时的温育时间。
所述第二重新折叠步骤可以在溶液中较低的电导率下进行，如0.1-2mS/cm，或0.2-1.5mS/cm，或0.5-1.0mS/cm。第二重新折叠步骤可在冷却下进行。
所述第二重新折叠步骤可以在连续搅拌下进行。
本文描述的方法中可以运用上述一个或多个参数。
在一些实施方案中，将部分纯化的G-CSF用于完成重新折叠，纯度优选为约80-90％。
优选地，通过在低电导率缓冲液中于冷却条件下将部分重新折叠的G-CSF温育多于12小时而完成重新折叠。
优选地，在低于2mS/cm的电导率下完成重新折叠；最优选电导率低于1mS/cm。
在一些实施方案中，在高于7的pH值下完成重新折叠，优选pH(约)为8。
用于第二重新折叠温育的缓冲液可以是10mM的Tris-HCl，优选pH(约)为8。
在一些实施方案中，第二重新折叠步骤在冷却的条件下进行，优选2-8℃。
在优选的实施方案中，第二折叠的温育时间为大于12小时，更优选大于24小时，最优选32-42小时。
基于各种优化实验，完成折叠(第二次重新折叠)特别优选的条件显示于表1的“第二重新折叠”栏下。
最终纯化(精制步骤)
上述第一和第二重新折叠步骤的结合使得活性单体G-CSF的产量提高。
任选地，并根据所得G-CSF的用途，可进行随后的下游工艺，例如一个或多个精制步骤。本文描述的方法还可以包括一个或多个精制步骤。该精制步骤使得第二重新折叠步骤之后的重新折叠G-CSF进一步纯化。
随后的下游工艺(精制)可以包括使用AEX和CEX层析，或本领域用于G-CSF的精制/纯化的其他方法，例如，HIC、IMAC、SEC或RP-HPLC(参见背景技术部分中的参考文献)。精制步骤也可以包括两种或更多种这些方法的组合。
第二重新折叠步骤后，G-CSF的纯度通常是80-90％(表III)。这不符合药物品质。如果该产品将要用作活性药物成分，需要进行至少一个进一步精制的步骤以达到期望的纯度。该精制步骤去除从宿主或工艺中产生的残余污染物。此外，也除去任何产品相关的物质和相关的杂质。
AEX
下游的精制可以包括一个或多个AEX步骤，该精制步骤可包括AEX。
本领域技术人员可以选择适当的AEX。树脂的选择可以基于所需的分离性能、工艺时间、清洁稳健性、再现性、结合力、批次间的一致性以及整体经济性等在优选的实施方案中，使用官能团DEAE。本领域技术人员将理解，除了官能团外，还要对AEX树脂的骨架性质以及珠尺寸加以考虑。在特别优选的实施方案中，使用了基于甲基丙烯酸酯的衍生物的矩阵(如和)。该矩阵显示非常良好的分辨率和再现性。甲基丙烯酸酯材料更坚硬并且有比例如常用的交联琼脂糖基质(如)更好的使用周期。由于AEX目前可以在结合模式(与去除增溶剂的在先步骤相反)中使用，可以选择性使用通过用逐步或梯度增加盐浓度或通过逐步或梯度降低洗脱缓冲液的pH而获得的洗脱条件。
AEX树脂材料已在上文讨论过。
本领域技术人员可以选择适当的下游精制的方法，这取决于先前使用的条件，如缓冲液等。例如，在优选的实施方案中，第二重新折叠步骤是在低电导率的约pH 8的缓冲液中进行。这对于结合模式中的AEX精制步骤来说是理想的初始状态，可使得污染物进一步去除，如果需要的话，缓冲液将容易的转换为低pH缓冲液，其中G-CSF是更可溶的，且更稳定。
CEX
下游的精制可以包括一个或多个CEX精制步骤。该精制步骤可包括CEX。
作为AEX步骤的替代(或附加)，CEX色谱法也可以用作一种有效的精制步骤。对于这种方法，需要在样品装载前将pH调整到低于5.5，以进行结合模式下的色谱，这对于蛋白质的充分分离时重要的。阳离子交换官能团和矩阵可根据与上述AEX相同的标准来选择。在优选的实施方案中，可使用甲基丙烯酸酯骨架上的SP和CM官能团 在特别优选的实施方案中，使用Toyopeari CM-650，更优选使用ToyopeariSP-650。
CEX树脂材料已在上文提及。
一旦结合到CEX树脂上，G-CSF可在选择性的条件下洗脱，通过用逐步或梯度增加盐浓度或通过逐步或梯度升高洗脱缓冲液的pH。
本领域技术人员知道如何优化色谱的分辨率。
在一些实施方案中，一个色谱步骤，AEX或CEX，足以实现G-CSF产品所需的品质。
在其他实施方案中，下游工艺包括两个或更多的精制步骤。例如，精制可以包括两个或更多色谱步骤。因此，如果希望或必要，可以进行两个或多个离子交换精制步骤。当使用两个精制步骤时，优选使用AEX而后是CEX。在这种情况下，这两个步骤均在结合模式下进行。该顺序中的优点之一是，G-CSF最终是在酸性pH下获得，这样就可以长期储存浓缩的G-CSF。已证实使用两个IEX精制步骤可获得极高的纯度(表IV)。
下游精制步骤可获得的G-CSF纯度为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％或99.5％。
为计算根据本发明(见实施例13)的纯度，使用了HPLC色谱，其被整合为主峰(面积)。任何剩余的“杂质”是所述的“产品相关的杂质”，这是指它们是修饰过的G-CSF分子，如氧化(不同种)、脱酰胺化、二聚、聚合或者到目前为止结构尚未阐明的异构化作用(表Iv)。当然这些产品相关物质仅以痕量存在。值得注意的是，在最后纯化的G-CSF制备物中，“过程相关的杂质”，如HCP、DNA或细菌内毒素只检测到非常低的ppm水平或根本检测不到(表IV)。这样的纯度其他地方会被报道为明显的同质。用于确定纯度的分析方法在实施例13中公开。图3显示了纯化的G-CSF批次的SEC-HPLC色谱图(3B)与用作参考可商购的欧盟批准的药用产品(3A)比较的例子。在主峰的左面可见痕量的聚集体。主峰右边的峰是由溶剂产生的而非杂质所致。这些色谱图显示了根据所描述的方法纯化的G-CSF具有足够的品质，甚至达到药物级别。
在本发明的一些实施方案中，完全重新折叠的G-CSF进一步被纯化，包含一个或多个离子交换色谱法。
优选地，所述离子交换色谱包括阴离子交换色谱以及随后的阳离子交换色谱。
在一些实施方案中，通过使用两个精制步骤：AEX和CEX，具有约80-90％纯度的部分纯化的G-CSF被进一步纯化到纯度高于95％。
在一些实施方案中，AEX步骤之后是CEX步骤。优选地，这两个步骤均在结合模式下进行。
使用本文所述的方法，所获得的G-CSF可以达到药用级质量。该G-CSF制备物适于治疗性应用或可作为中间体用于随后的偶联，例如与聚乙二醇偶联。
在一个方面中，本发明提供一种纯化G-CSF的工艺。该工艺也可用于去除本发明讨论的第一和第二重新折叠步骤之间的增溶剂。本发明提供的是一种纯化G-CSF和/或去除用于溶解包涵体中的G-CSF的增溶剂的工艺，该工艺包括下列步骤：
e)在G-CSF结合于树脂的条件下进行阴离子交换层析；和
f)通过使用pH降低或盐浓度升高的洗脱缓冲液的逐步或梯度洗脱来洗脱结合的G-CSF；和
g)在G-CSF结合于树脂的条件下进行阳离子交换层析；和
h)使通过用pH或盐浓度升高的洗脱缓冲液的逐步或梯度洗脱来洗脱结合的G-CSF。
“降低/升高pH值”或“升高盐浓度”是指用于洗脱的缓冲液与柱平衡、样品装载和洗涤的缓冲液相比。
关于AEX和CEX，合适的材料和条件已在上文讨论。在优选的实施方案中，该方法的特征在于，所述阴离子和阳离子交换树脂的骨架聚合物均包括甲基丙烯酸酯的衍生物。
在一些实施方案中，AEX树脂的官能团是二乙氨乙基(DEAE)基团。
在一些实施方案中，CEX的树脂的官能团是羧甲基(CM)基团。
在一些实施方案中，阴离子和阳离子交换树脂的骨架聚合物不包含交联的琼脂糖，诸如
在优选的实施方案中，AEX和/或CEX阴离子和/或阳离子交换树脂的骨架聚合物包括甲基丙烯酸酯的衍生物。
在更优选的实施方案中，AEX树脂是DEAE Macro-Prep(BioRad)，CEX树脂是Toyopearl CM-650(Tosoh)。
在一些实施方案中，AEX柱以pH值高于7的低电导率缓冲液平衡，优选用10mM的Tris-HCl/pH8。
在一些实施方案中，G-CSF是从CEX柱上通过提高盐的浓度洗脱下来，盐浓度优选具有梯度，最优选具有线性梯度。优选通过具有线性NaCl梯度的Tris-HCl/pH 8缓冲液进行洗脱。
在一些实施方案中，在CEX步骤之前，调节从AEX柱上洗脱的G-CSF的pH值，优选将pH调节至低于5.5，最优选至(约)pH 4.5。优选的，从AEX柱上洗脱的G-CSF用水进行2倍稀释，用50％的乙酸通过滴定将pH调节到(约)4.5。
在一些实施方案中，CEX柱用pH低于5.5的低电导率缓冲液平衡，优选用20mM的乙酸钠/pH 5.3。
在一些实施方案中，G-CSF是从CEX柱上通过提高盐的浓度洗脱下来，盐浓度优选具有梯度，最优选具有线性梯度。
优选用pH 5.3的醋酸钠线性梯度将G-CSF从CEX柱上洗脱。
在优选的实施方案中，G-CSF是根据图2的纯化方案公开的步骤顺序从IBs上溶解下来、重新折叠并纯化。
在本发明的一些实施方案中，精制后最终纯化的G-CSF是由凝胶色谱法制备，优选使用Sephadex G-25。
在一些实施例中，配制的缓冲液中含有山梨醇及聚山梨醇酯；更优选的，该配制缓冲液包含10mM乙酸钠/pH 4/5％(w/v)的山梨醇/0.006％(w/v)的聚山梨醇酯80。
附图说明
图1描述了两步重新折叠的策略，包括任选的为生产生物学活性G-CSF而进行的下游精制步骤。进一步的细节在实施例中公开。
图2公开了一种优选实施方案，即从含有G-CSF的包涵体开始直到G-CSF的完全重新折叠和纯化的起始的顺序步骤。进一步的细节在实施例中公开。
图3对作为对照的可商购的非格司亭药用产品的纯度分析的SEC-HPLC色谱图(3A)与根据图2中总结的顺序纯化的产品的色谱图(3B)进行了比较。进一步细节在实施例中详细地描述。
表格说明
表1列出了两步重新折叠的优选条件。第一重新折叠温育中的浓度是用水对溶解的G-CSF进行二倍稀释而产生的。第二重新折叠温育缺少第一重新折叠中的试剂肌氨酰和CuSO4。进一步的细节在实施例中提及。
表2显示了由650克洗净且冷冻的包涵体开始的三批生产的纯度和产率。产率的计算参考包涵体的湿重。最终的纯度由RP-HPLC中排除产品相关物质(G-CSF的异构体)与产品相关杂质的影响的主峰面积行计算。进一步的细节在实施例中提及。
表3显示了G-CSF纯化过程中的总纯度以及两个选定的过程相关杂质(肌氨酰，内毒素)的值。所示范围指示了采用不同的分析方法获得的三个G-CSF的生产批次的分析结果。进一步的细节在实施例中提及。
表4显示了用不同的方法对三个后续G-CSF的生产批次的特定杂质和生物学活性分析结果。这些数据取自常规批次释放检验。进一步的细节在实施例中提及。
实施例
实施例1：发酵和表达
G-CSF(非格司亭)通过重组大肠杆菌C2523T7pol pRG/GCSFa克隆(一种转化了含G-CSF表达载体的大肠杆菌)制备。在无菌条件下，将来自液氮存储的工作细胞库小瓶中的0.10-0.15cm3细胞悬浮液接种到种子培养基中。将接种的种子培养瓶放在回转摇床培养箱中于37℃下以185rpm的转速培养24-28小时。当六个摇瓶培养在600nm光密度(OD)平均值达到0.9-1.1时，将摇瓶中的培养物收集到装有一只硅胶管的无菌5dm3玻璃烧瓶中。用WM323U/R泵将收集的3dmJ量的种子培养物转移到100dm3发酵罐，该罐用无菌补充生产培养基填充至75dm3(GBA，以甘油为碳源的合成培养基)。在严格好氧条件下于37℃下进行深层培养，当培养基中的碳源耗尽时，以适当的速率向培养物中加入甘油补料液。将整个培养期间的溶解氧量保持在不低于30％的水平。当培养物的OD值达到30时，温度降低到32℃，加入0.33mM IPTG来诱导G-CSF的表达。进一步培养细菌5小时直至OD值为80-95，以生产G-CSF。
实施例2：细菌的收获
停止搅拌、通气和添加碳源，将培养物冷却至低于15℃，通过11000g下离心收获细菌。细胞沉淀在转子中，水洗所述细胞(释放电荷)。收集细菌细胞的浓缩物，用水将其稀释回原来的一半体积，加入0.5M NaH2PO4至终浓度为10mM。湿菌体的总质量(生物量)为约10-11.5kg。
实施例3：细菌裂解和包涵体的制备
将分离并洗涤的细菌经三次通过匀浆器而使其在压力(100MPa)下破碎。在分离器中以11000g转速通过沉淀使包涵体从细胞碎片中分离。沉淀的包涵体通过洗涤缓冲液释放电荷，所述缓冲液含有5mM的DTT，10mM NaH2PO4，5mM的EDTA，和2％吐温20，pH 7.2。用同样的缓冲液对该浓缩IB悬浮液进行2倍稀释，并再次沉淀。使用10mM NaH2PO4缓冲液重复两次洗涤步骤，在第二次洗涤结束时无需稀释。IB的最终沉淀物冷冻贮存在-80℃下。
实施例4：包涵体的溶解
将冷冻包涵体(湿重650克)解冻，并溶解在含有40mM Tris-HCl，pH8和1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸(肌氨酰)的溶解缓冲液中，总体积为32.5dm3。将悬浮液室温下连续搅拌培养。
实施例5：氧化性重新折叠(第一次重新折叠)
用水对溶解的IB悬浮液进行2倍稀释，在65dm3的总体积下形成0.5％的肌氨酰和20mM Tris-HCl的最终浓度。添加CuSO4加到终浓度40uM。将G-CSF氧化并部分重新折叠，其间连续搅拌并对顶部空间通气，在室温下进行至少20小时。通过加入终浓度为1mM的EDTA而终止氧化。
实施例6：通过AEX分批吸收而去除肌氨酰
在分批模式中，将肌氨酰吸附到阴离子交换(AEX)树脂上。以每克肌氨酰使用20gAG 1-X8树脂(BioRad公司，美国)的量将其加入溶液。将悬浮液搅拌两小时以结合大部分肌氨酰。树脂经100um孔径的尼龙过滤袋网过滤除去。用随后的纯化步骤(实施例7和8)将滤液中剩余的肌氨酰从产物中完全除去。
实施例7：在酸性pH下沉淀污染物
通过pH4.3-4.5下的酸沉淀将一些杂质轻易除去，而G-CSF仍然保持溶解。通过加入终浓度1M尿素防止G-CSF发生任何潜在的非特异性和不希望的共沉淀。尿素由6M原液提供，并以1dm3/min的速率缓慢加入到实施例6的滤液中。随后，加入1/20体积的pH4.8的1M醋酸钠降低pH值。用50％乙酸滴定将pH进一步降低至4.3-4.5。沉淀至少一小时。然后将沉淀物经深层过滤器(Pall公司K700/KS50双层)过滤除去。
例8：通过串联AEX+CEX色谱去除剩余肌氨酰并置换缓冲液
将50mM/pH 4.5的乙酸钠缓冲液用于平衡1)装有DEAE Macro-Prep(Bio-Rad，USA)AEX树脂的4dm3柱，和2)装有Toyopearl SP-650C(Tosoh，日本)CEX树脂的8dm3柱。两个柱直接串联连接到AKTA过程色谱系统(GE Healthcare，瑞典)上。通过0.2um无菌过滤器清洁后，将实施例7的滤液装入的第一根柱。残留的肌氨酰结合到DEAE树脂上，而G-CSF保持未结合(非结合模式)并出现在第一根柱的流过物中。将该流过物直接载入结合G-CSF(结合模式)的第二根柱(SP树脂)。用20mM Tris-HCl/pH 8进行简单的梯度洗脱而将G-CSF从树脂上解吸。除了去除残留肌氨酰，通过该方法也实现了将缓冲液由乙酸钠/pH 4.5置换为Tris-HCl/pH 8。
实施例9：二次重新折叠(完成折叠)
在这个阶段中，完成了大约一半的蛋白质流分的折叠，而其余的蛋白质不完全折叠或错误折叠。用20mM的Tris-HCl，pH 8将G-CSF溶液从Toyopearl SP-650C上洗脱，并通过0.2um无菌过滤器进入一个不锈钢容器中。将过滤后的溶液用水稀释2倍。蛋白质折叠的第二温育(第二重新折叠)在低电导率的环境中(＜1mS/cm)，在pH 8、2-8℃的冷却下进行32-42小时。
实施例10：通过AEX色谱纯化(精制步骤1)
A柱中装入DEAE Macro-Prep(Bio-Rad，美国)，并用10mM的Tris-HCl/pH8平衡。将来自第二次重新折叠(实施例9)的溶液装入DEAE柱。用10mM Tris-HCl/pH 8中的0mM-200mM的递增线性NaCl梯度洗脱正确折叠的G-CSF。合并洗脱的G-CSF，并用水稀释2倍。用50％乙酸滴定将pH值至4.5。
实施例11：通过CEX色谱纯化(精制步骤2)
对于最终精制步骤，将从AEX色谱(实施例10)收集到的由正确折叠蛋白组成的G-CSF合并物直接载入填充了Toyopearl CM-650S树脂的CEX柱。该柱用pH 5.3的20mM醋酸钠进行平衡。用在24倍柱体积以内的pH 5.3的20mM到40mM乙酸钠的递增线性盐梯度洗脱结合的G-CSF。收集含有纯G-CSF的流分并合并用于配制(formulation)。
实施例12：用凝胶色谱法配制纯化的G-CSF
将从CEX柱洗脱的纯化G-CSF(实施例11)通过0.2um无菌过滤器过滤，并通过装有Sephadex G-25细树脂并经配制缓冲液(10mM乙酸钠，pH4，5％山梨糖醇，和0.006％聚山梨醇酯80)平衡的14dm3柱。相同的缓冲液也用作洗脱(running)缓冲液。用配制缓冲液洗脱空隙中的G-CSF。对于整个批次(35-48g G-CSF)，在Sephadex G-25进行三个随后的制备，每个使用三分之一的CEX过滤洗脱物。通过用配制缓冲液的稀释将所配制的G-CSF浓度调节至0.9-1.0mg/ml，并最终用0.2μm的无菌过滤器胶囊过滤。配制的G-CSF作为无菌溶液是非常稳定的，可以在2-8℃下储存即使没有数年也有很多个月。
实施例13：分析方法
按照欧洲药典(Ph.Eur.)实施公知的标准分析方法，该药典包含一篇描述非格司亭特定分析方法的专论(欧洲药品与卫生保健质量管理局(European Directorate forthe Quality of Medicines&Health Care，EDQM)(2010)：非格司亭浓缩溶液，欧洲药典7.0，2015-2018)。对于基本技术，该专论与药典的其他章节相互参照。这些可参考的特定章节，提供了该技术更为详细的描述，并被引用在以下实施例的方括号中。这些应用的参考标准是可商购且欧盟批准作为药用的授权药品(非格司亭)，或是使用这些商用参考进行了校正的内部标准。对于按照国际单位(IU)的相对效能的分析，另外使用了世界卫生组织(WHO)的国际G-CSF标准。用于分析纯度、特定杂质、G-CSF-相关蛋白和生物学活性(效能)的测试方法按照欧洲药典的专论进行，只做很少修改。因此，在下文中，对这些本领域已知的标准分析方法只作简要描述。
实施例13.1-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：[Ph.Eur.7，2.2.31]。SDS-PAGE电泳用于测定分子大小、G-CSF的同一性以及纯度。凝胶有12％的聚丙烯酰胺(PA)并包括十二烷基硫酸钠(SDS)。该方法在还原性和非还原性条件下使用。凝胶用Sypro ruby染色。为了计算出相对分子质量(Mr)，使用具有确定质量的标记蛋白的标记板。
实施例13.2-高效体积排阻色谱法(SEC-HPLC)：[Ph.Eur.7，2.2.30]。用SEC检测分子量高于非格司亭的杂质或G-CSF相关物质(二聚体、聚集体)。蛋白的检测是基于紫外吸收。纯度(主峰)和杂质(二聚体、聚集体)表示为活性物质中每个组分的面积％。由重复测定的平均值计算检测结果。图3显示了一个纯化的G-CSF批次(3B)与参考标准(3A)比较的SEC色谱图的示例。聚集体的痕迹可见于主峰的左边。主峰右边的峰是由溶剂而非杂质所引起的。
实施例13.3-反相高压液相色谱(RP-HPLC)：[Ph.Eur.7，2.2.29]。RP-HPLC用于确定G-CSF的同一性，以计算G-CSF的含量和纯度。该方法也被用于对产品相关物质进行鉴别和定量。蛋白的检测基于紫外吸收。相关的蛋白杂质表示为在活性物质中的百分比(面积％)。由重复测定的平均值计算检测结果。
实施例13.4-等电聚焦凝胶电泳(IEF)：[Ph.Eur.7，2.2.54]。该方法用于检测与G-CSF具有不同电荷的杂质或产品相关物质(例如脱酰胺的G-CSF)。分离是在含有基于两性电解质的固定化pH梯度的聚丙烯酰胺凝胶中进行。此外，用一组具有确定等电点(PI)的标记蛋白对各蛋白带的PI进行计算。
实施例13.5-酶联免疫吸附测定(ELISA)：该方法用于定量测定大肠杆菌宿主细胞蛋白(HCP)的水平。该试验是通过使用可商购(通用的)免疫性酶分析试剂盒(CygnusTechnologies，no.F410)来进行。微量滴定条的固相包被有亲和纯化的抗大肠杆菌多克隆抗体，其捕获来自测试样品的HCP。辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗大肠杆菌抗体示踪剂同时结合到HCP上，产生的三明治结构可以承受洗涤步骤。结合的HCP以及HRP分别通过底物四甲基联苯胺(TMB)在过氧化氢存在下的氧化反应进行检测。光密度用ELISA读数器测定。用在不同浓度下测量HCP校准物(由试剂盒提供)得到的校正曲线进行定量。所述方法完全按照供应商的说明书进行。HCP浓度表示为ng/ml或ng/mg(ppm)。
实施例13.6-定量聚合酶链反应(qPCR)：该试验用于测定大肠杆菌宿主细胞中的DNA。使用一种称为“resDNASEQTM大肠杆菌残余DNA定量系统”的市售试剂盒，它是基于实时qPCR技术(Applied Biosystems)。该方法非常灵敏并专门用于检测DNA污染。该测定是基于使用序列特异性引物(SSP)和荧光标记的杂交探针的聚合酶链反应(PCR)对序列明确的DNA片段进行序列特异性扩增和实时荧光检测。整个方法包括仪器使用、试剂、采样和软件计算，根据供应商的说明书进行。
例如13.7-细菌内毒素：[Ph.Eur.7，2.6.14，方法C]。革兰阴性细菌内毒素的检测是全球统一的基于来自马蹄蟹(鲎(Limulus polyphemus))的变形细胞裂解物的标准方法。这种鲎测试(“LAL试验”)根据欧洲药典使用浊度动力学技术(方法C)进行。其结果表示为与国际内毒素标准BRP相关的国际单位(IU)。
实施例13.8-测定生物学活性(相对效能)：在基于细胞的体外增殖试验中进行测定G-CSF样品的生物学活性，其按照非格司亭的专论中所描述并做如下改动。该生物测定方法是基于对NFS 60细胞的增殖变化的比较，该细胞来源于小鼠成骨髓细胞系。用系列稀释的测试样品和参比溶液平行处理NFS-60细胞。NFS-60细胞的增殖可被G-CSF显著并特异性刺激。细胞繁殖在微量板上进行72小时。通过使用可被活细胞转化成荧光染料试卤灵的底物刃天青检测增殖效果。高灵敏度检测荧光信号。剂量响应曲线用平行线测定法计算，在该曲线的直线部分具有至少三个点，该计算被用作统计评估。可接受的范围是参比溶液的80％至125％。相对效价由国际单位(IU)表示，其是由内部标准经国际卫生组织对非格司亭的标准校准而定义。具有完全活性的纯的人G-CSF具有1.0×108IU/mg的特定生物学活性。
实施例13.9-肽作图：[Ph.Eur.7，2.2.55]。质谱(MS)分析之前的肽作图用于分析二硫键。肽键酶法分析程序是在欧洲药典关于非格司亭专论的基础上发展起来的。用于切割的蛋白酶是谷氨酰内肽酶(EndoGlu-C)。温育在37℃下进行24小时，停止温育，加入8M盐酸胍及煮沸。肽作图步骤在还原性和非还原性条件下进行。对还原和非还原条件下肽谱的MS质谱差异证实二硫键的位置。完全折叠完好的G-CSF(非格司亭)有两个二硫键，位于Cys37-Cys43和Cys65-Cys75，而18位的一个半胱氨酸残基是未成对的。
可选的，蛋白水解消化后从G-CSF样品获得的肽在RP-HPLC系统中分离并进行紫外检测。此方法提供将供试品溶液中得到的指纹样色谱与参比物质中获得的色谱图进行比较得到的比较数据。
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41.WO 87/01132
Claims (21)
1.一种重新折叠来自包涵体的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的方法，其包括：
a)在增溶剂的存在下溶解G-CSF；
b)进行氧化和第一重新折叠步骤，包括在存在氧化剂和增溶剂的条件下温育溶解的G-CSF；
c)通过离子交换树脂吸附和/或离子交换色谱法除去增溶剂；和
d)进行第二重新折叠步骤，包括用低电导率缓冲液，或水，稀释并温育步骤(c)的G-CSF；
其中所述第二重新折叠步骤在电导率至少低于2mS/cm的低电导率缓冲液中进行多于12小时。
2.根据权利要求1的方法，其中所述包涵体来自微生物。
3.根据权利要求2的方法，其中所述微生物是大肠杆菌。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述G-CSF是重组牛或人甲硫氨酰-G-CSF。
5.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述增溶剂是N-月桂酰肌氨酸。
6.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述氧化剂为CuSO4。
7.根据权利要求1-3任一项的方法，其中G-CSF的溶解在大于pH 7的pH值进行。
8.根据权利要求5的方法，其中所述增溶剂是浓度为0.5％至1.5％的N-月桂酰肌氨酸。
9.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述氧化和第一重新折叠步骤进行至少两小时。
10.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述氧化和第一重新折叠步骤在通气且不冷却下进行。
11.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述氧化和第一重新折叠步骤是在7-9的pH值和/或在20-28℃的温度进行，和/或进行15-25小时。
12.根据权利要求1-3任一项的方法，其中步骤(c)中的除去增溶剂包括阴离子交换层析和阳离子交换层析。
13.根据权利要求12的方法，其中步骤(c)中的除去增溶剂包括：
a)通过将G-CSF溶液与悬浮树脂材料混合而结合阴离子交换树脂材料，并通过过滤除去树脂材料，和/或
b)在所述增溶剂与树脂结合而G-CSF保留在流过物中的条件下进行离子交换层析，和/或
c)在G-CSF与树脂结合而所述增溶剂保留在流过物中的条件下进行离子交换层析。
14.根据权利要求13的方法，其中通过顺序应用下列步骤除去所述增溶剂和其它杂质：
(i)阴离子交换层析，
(ii)酸沉淀，
(iii)阴离子交换层析，和
(iv)阳离子交换层析。
15.根据权利要求14的方法，其中通过顺序应用下列步骤除去所述增溶剂和其它杂质：
a)通过将G-CSF溶液与悬浮树脂材料混合使增溶剂与阴离子交换树脂材料结合，并通过过滤除去树脂材料，
b)通过将pH降低到低于pH 5使杂质沉淀，并通过过滤除去沉淀；
c)在剩余增溶剂与树脂结合而G-CSF保留在流过物中的条件下进行阴离子交换层析；
d)在G-CSF与树脂结合而剩余增溶剂保留在流过物中的条件下进行阳离子交换层析；和
e)通过使用pH或盐浓度增加的洗脱缓冲液进行逐步或梯度洗脱，从阳离子交换树脂洗脱结合的G-CSF。
16.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述第二重新折叠步骤在冷却条件下进行。
17.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述第二重新折叠步骤在2-8℃的温度进行，和/或进行至少24小时。
18.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述第二重新折叠步骤在高于pH 7的pH值进行。
19.根据权利要求1-3任一项的方法，其中该方法还包括精制步骤，其包括一个或多个离子交换层析。
20.根据权利要求19的方法，其中所述精制步骤中的一个或多个离子交换层析包括阴离子交换层析以及随后的阳离子交换层析。
21.根据权利要求19的方法，其中所述一个或多个离子交换层析包括以下步骤：
a)在G-CSF与树脂结合的条件下进行阴离子交换层析；
b)通过使用pH降低或盐浓度增加的洗脱缓冲液的逐步或梯度洗脱，将结合的G-CSF洗脱；
c)在G-CSF与树脂结合的条件下进行阳离子交换层析；
d)通过使用pH或盐浓度增加的洗脱缓冲液的逐步或梯度洗脱将结合的G-CSF洗脱；
其特征在于，所述阴离子和阳离子交换树脂的骨架聚合物均包含甲基丙烯酸酯衍生物。
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