KR20140142724A

KR20140142724A - 봉입체로부터의 g-csf의 재폴딩 방법

Info

Publication number: KR20140142724A
Application number: KR20147029032A
Authority: KR
Inventors: 페렌크 펠포엘디; 안트라스 발라기; 야노스 베크지
Original assignee: 리히터 게데온 닐트.
Priority date: 2012-03-19
Filing date: 2013-03-18
Publication date: 2014-12-12
Also published as: CA2867796A1; KR101933753B1; EP2828287A2; PL2828287T3; US9458207B2; DK2828287T3; JP2015512377A; HUE036635T2; LT2828287T; HRP20180234T1; WO2013068603A2; ES2664231T3; NO2828287T3; WO2013068603A3; US20150057439A1; CN104540846B; SI2828287T1; EP2828287B1; HUP1200172A2; CN104540846A

Abstract

봉입체로부터의 재조합 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)의 새로운 재폴딩 방법이 개시된다. 본 방법은 2개의 재폴딩 단계를 포함한다. 특히, 본 방법은 가용화제를 이용한 G-CSF의 가용화 단계, 가용화제 및 산화제의 존재 하에서의 G-CSF의 산화적 재폴딩 단계(제1 재폴딩 단계), 가용화제의 효율적인 제거 단계, 및 가용화제의 부재 하에서 G-CSF의 폴딩을 완료하기 위한 제2 재폴딩 단계를 포함한다. 부분적으로 재폴딩된 G-CSF로부터 가용화제를 효율적으로 제거하는 다양한 방법이 개시된다.

Description

봉입체로부터의 G-CSF의 재폴딩 방법{METHODS FOR REFOLDING G-CSF FROM INCLUSION BODIES}

본 발명은 봉입체로부터의 G-CSF(콜로니 자극 인자)의 새로운 재폴딩(refolding) 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 2개의 재폴딩 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 (a) G-CSF의 가용화, (b) 산화적 재폴딩(가용화제의 존재 하에서의 제1 재폴딩 단계), (c) 가용화제의 제거 및 (d) 제2 재폴딩 단계(가용화제의 부재 하에서)에 의한 G-CSF의 재폴딩 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 가용화제의 새로운 제거 방법에 관한 것이다.

내인성 조혈 성장 인자, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF, 동의어: "콜로니 자극 인자 3" = CSF3)는 골수 내에서의 선구 세포의 증식 및 분화와, 성숙 호중성 과립구("호중구")의 말초 혈액 내로의 방출을 조절한다. 빈번하게는 급속 분열 세포에 영향을 주는 암 화학요법은 "호중구 감소증"으로 칭해지는 부작용에 이르게 된다. 호중구 감소증은 말초 혈액 중 호중구의 카운트의 감소이며, 암에 대한 골수 억제성 화학요법을 받고 있는 3명의 환자 중 1명 초과의 환자에 영향을 준다. 호중구 감소증으로 몰아 넣어진 환자는 발열("발열성 호중구 감소증")이 발병되고 감염 위험이 증가될 수 있다. 생명을 위협하는 위장 및 폐 감염이 일어나며, 이는 패혈증이 그러한 바와 같다. 후속적인 사이클의 화학요법은 환자가 호중구 감소증으로부터 회복될 때까지 지연되어야 할 수 있다. 재조합 인간 G-CSF는 효과적인 의약 물질이며, 화학요법 유발된 호중구 감소증의 치료를 위하여 성공적으로 적용된다. 이것은 혈중 호중구의 수를 회복시키며, 상기 수를 임계 수준 초과의 수준으로 유지한다(문헌[Dale 2002]).

천연 인간 G-CSF는 174개 아미노산으로 이루어진 O-글리코실화 단백질이며, 상대적으로 소수성이다. 글리코실화된 형태의 탄수화물 사슬은 트레오닌 133에 위치한다. 게다가 이러한 주요 형태 외에, 또 다른 스플라이스(splice) 형태가 생체내에서 나타날 수 있으며, 이는 추가의 3개 아미노산을 지닌다(문헌[Zsebo 1986]). 재조합 인간 G-CSF가 이. 콜라이(E. coli)에서 발현될 때, 하기가 관찰될 수 있다: 첫째, 상기 재조합 단백질은 봉입체로 생성되며; 둘째, 생성된 G-CSF 분자는 천연 탄수화물 사슬이 없으며; 셋째, 재조합 G-CSF는 추가의 N-말단 메티오닌을 지닌다. N-메티오닐-G-CSF 또는 rmet(hu)G-CSF로 표기되는 이러한 G-CSF 분자는 국제 일반명(INN) "필그라스팀(filgrastim)"을 받았으며, 18.7-18.9 kD의 분자량을 갖는다(문헌[Welte 1996]). 필그라스팀의 이론적인 상대 질량(Mr)은 18.799이다. G-CSF 폴리펩티드 사슬은 5개의 시스테인을 함유하며, 필그라스팀에서의 구조 연구에 의하면 Cys 37-43과 Cys 65-75 사이에 2개의 디술피드 결합이 나타난 반면 쌍을 형성하지 않은 Cys 18은 여전히 환원된 채 있다(문헌[Wingfield 1988]). 시장에 나와 있는 첫 번째 제품은 이. 콜라이 발현된 재조합 인간 met-G-CSF인 필그라스팀을 함유하는 암젠(Amgen)의 뉴포겐(Neupogen)^®이었다(문헌[Welte 1996]). 유럽 연합에서 인가된 또 다른 G-CSF 제품인, 레노그라스팀을 함유하는 추가이(Chugai)의 그라노사이트(Granocyte)^®는 재조합 포유류(CHO) 세포로부터 유래되며 글리코실화되어 있다(문헌[Holloway 1996]). 게다가, 암젠은 개선된 버전의 G-CSF, 뉴라스타(Neulasta)^®를 2002년에 출시하였는데, 이는 필그라스팀과 폴리에틸렌 글리콜의 콘쥬게이트(INN = 페그필그라스팀)로 이루어진다(문헌[Molineux 2004]). 마지막으로, 몇몇의 바이오시밀러(biosimilar) 버전의 뉴포겐^®이 지난 수년 동안 상이한 일반 제약 회사에 의해 유럽에서 출시되었다.

형질전환된 미생물에서의 이종성 재조합 폴리펩티드의 과다발현은 종종 소위 봉입체(IB)를 형성하는데, 상기 봉입체는 재조합 단백질을 함유한다. 이들 봉입체는 고도 굴절성, 무정형 응집체이며, 그 안의 폴리펩티드는 일반적으로 비폴딩되고, 환원되고, 불활성이고, 일반 수성 완충제 중에 적어도 부분적으로 불용성이다. 봉입체로부터의 재조합 단백질의 수득 공정은 당업계에 개시되어 있으며, 일반적으로 세포의 용해 및 파괴, 이어서 원심분리를 포함한다. 봉입체의 대부분을 포함하는 펠렛은 일반적으로 지질 막, 리포폴리사카라이드(LPS) 및 다른 세포 잔사 또는 오염물질의 제거를 위하여 세제로 세척된다.

과학 문헌은 이러한 봉입체를 박테리아로부터 단리하고 정제할 수 있는 그리고 그 후 재조합 단백질을 가용화하고 그의 천연 상태로 재폴딩할 수 있는 많은 방법을 제공한다('재폴딩' 및 '재생"이라는 용어는 본원에서 동의어로 사용된다).

상이한 전략이 재조합 단백질의 가용화에 사용되어 왔다. 이온성 또는 비이온성 세제, 예컨대 소듐 도데실 술페이트(SDS) 또는 N-라우릴사르코신(사르코실) 외에, 카오트로픽(chaotropic) 시약, 예컨대 구아니딘 염산염(GuHCl) 또는 우레아가 관심있는 단백질의 가용화에 사용되어 왔다. 종종 가용화는 환원제, 예컨대 디티오트레이톨(DTT), 디티오에리트롤(DTE) 또는 2-메르캅토에탄올(ME)의 존재 하에 알칼리 조건(pH 8-12.5) 하에 수행된다(문헌[Marston 1986], 문헌[Rudolph 1990], 문헌[Rudolph 1996], 문헌[Dietrich 2003]). 전형적으로, 가용화된 단백질은 처음에는 완전히 환원되고 불활성이며; 그 후 크로마토그래피 정제 이전에 재폴딩을 겪는다.

예를 들어, 유럽 특허 제0219874호에는 이. 콜라이 봉입체로부터의 재조합 단백질의 일반적인 재폴딩 방법이 개시되어 있다. 가용화를 위하여 카오트로픽제(chaotropic agent)인 GuHCl 및 아르기닌이 고 pH에서 사용되었다. 유럽 특허 제0219874호에는 GSH/GSSG에 의해 제공되는 산화환원 조건 하에서의 디술피드 가교체의 형성이 기술되어 있다.

문헌[Rudolph 1990]에는 하기 순서의 단계가 기술되어 있다: a) 환원 조건(DTT, DTE 또는 2-ME) 하에서 pH 8-9에서 가용화를 위하여 GuHCl 또는 우레아를 사용하는 단계, b) 투석 또는 겔 크로마토그래피(세파덱스(Sephadex) G-25)에 의해 시약을 제거하는 단계 및 c) 옥시도 셔플링(oxido shuffling) 시스템 또는 단백질 티올의 반전적 화학적 개질에 의해 디술피드를 형성하는 단계(=재폴딩)로서 상기 옥시도 셔플링 시스템과 상기 화학적 개질 둘 모두는 첨가된 GSH/GSSG의 효과를 기반으로 하는 단계.

또 다른 개관(문헌[Rudolph 1996])은 비폴딩된 단백질의 용해도 및 안정성에 영향을 줄 수 있는, 재폴딩 동안 사용되는 첨가제, 폴딩 중간체 및 천연 폴딩 단백질을 강조한다. 저자는 가용화 및 재폴딩에 대한 일반적인 기본 프로토콜을 제안한다: pH 8에서의 100 mM DTT 및 6 M GuHCl을 이용한 가용화. 환원제는 투석에 의해 제공되며 pH는 4.5로 조정된다. 폴딩은 pH 7.5 내지 8.5에서 EDTA 및 GSH/GSSG를 포함하는 완충제 중에서의 고도 희석(1:200)에 의해 수행된다.

문헌[Dietrich 2003]에는 환원 조건(DTE) 하에서 6 M GuHCl을 이용한 이. 콜라이 봉입체로부터의 단백질의 가용화가 기술되어 있다. 재폴딩 인큐베이션은 GSH/GSSG의 존재 하에서 1 M 아르기닌에서 pH 9로 규정되었다. 최종 정제는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 이어서 SP 세파로스(Sepharose)를 이용한 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)를 이용하여 수행되었다.

8 M 우레아 또는 6 M GuHCl을 이용한, 문헌[GE Healthcare 2007 (Application Note 18-1112-33, 1-4)]으로부터 입수가능한 적용 주석이 권고된다. 재폴딩은 중성 pH 근처에서의 느린 투석 또는 희석으로 언급되었다. 대안적으로, 크로마토그래피 단계가 재폴딩에 사용될 수 있다. 제안된 크로마토그래피 방법은 크기 제외 크로마토그래피(SEC), 이온 교환 크로마토그래피(IEX) 및 투석 또는 희석 대신 제안된 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 포함한다.

국제 특허 공개 제WO00/02901호에는 재폴딩 탱크 내에서 고압의 인가에 의해 재폴딩하는 일반적인 방법이 기술되어 있다. 임의로, 카오트로픽제 및/또는 산화환원 화합물(DTT/GSSG)이 재폴딩 완충제에 존재한다.

1980년대에 시작하여, 생물학적 활성 재조합 G-CSF를 제조하는 방법을 개발하는 오랜 역사가 있다. 대다수의 간행물에는 이. 콜라이에서의 생성이 기술되어 있다. 이 숙주에서, G-CSF는 잘 발현되며, 보통 봉입체 형태로 축적된다. 사용된 다른 발현 시스템으로는 예를 들어 CHO 세포(문헌[Holloway 1994]), 인간 세포(국제 특허 공개 제WO01/04154호), 또는 효모(미국 특허 제5055555호)가 있었다.

문헌[Zsebo 1986]에는 2% 사르코실을 이용한 G-CSF의 가용화 및 AEX 및 CEX 크로마토그래피에 의한 용해성 G-CSF의 정제가 기술되어 있다.

국제 특허 공개 제WO87/01132호에는 이. 콜라이 유래된 인간 G-CSF(필그라스팀)가 기술되어 있다. 2가지의 대안적인 재폴딩/정제 방법이 기술되었다: 방법 1): G-CSF를 1% 라우르산(포화 C15 지방산)으로 가용화하고, 40 μM CuSO₄로 산화시키고, 이어서 C4 재료 상에서 HPLC로 정제하였다. 방법 2): 가용화를 2% 사르코실을 이용하여 수행하고, 산화를 20 μM CuSO₄를 이용하여 수행하였다. G-CSF를 아세톤으로 침전시키고, 6 M GuHCl을 이용하여 다시 가용화시켰으며, G-CSF는 이 조건에 의해서는 비폴딩되었다. 겔 크로마토그래피(세파덱스 G-25, 재폴딩 단계)에 의한 GuHCl의 제거 후, 후속 크로마토그래피는 CEX(CM-셀룰로오스), 이어서 최종 크기 제외 크로마토그래피(SEC, 세파덱스 G-75)였다.

대안적인 가용화제가 문헌[Devlin 1988]에서 사용되었으며, 이는 10% SDS를 이용하여 IB 펠렛을 가용화시키고 SEC(0.1% SDS 중 세파크릴(Sephacryl) S-200), 이어서 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC, 바이닥(Vydac) C4)에 의해 SDS 로딩 G-CSF를 정제하였다.

이들 초기 간행물은 재조합 G-CSF의 상업적 대규모 제조에 적합한 재폴딩 및 정제 공정을 제공하는 것보다는 적합한 발현 시스템을 구성하는 것, 및 G-CSF의 추가의 특성화를 위하여 정제 물질을 얻는 것에 초점을 맞추었다. 더욱 진보된 방법이 국제 특허 공개 제WO89/10932호에 공개되었는데, 상기 국제 특허 공개에는 이 콜라이 IB로부터의 인간 및 소 G-CSF의 정제 방법이 기술되어 있다. IB를 세제(데옥시콜레이트)로 처리하여 오염물질을 추출하였다. 사르코실을 이용하여 G-CSF를 가용화하였다. CuSO₄를 이용하여 산화를 수행하였다. 추가의 방법이 문헌[Lu 1992] 및 문헌[Heidari 2001]에 기술되었다.

2% 사르코실 / 40 μM CuSO₄를 이용한 국제 특허 공개 제WO89/10932호의 방법을 비롯한 상기에 언급된 가용화 및 산화적 재폴딩 방법에 대한 몇몇 대안이 공개되었다. 이들 방법 중 대부분은 강한 변성제, 예컨대 GuHCl 및 우레아를 사용하여, 알칼리 pH에서 환원 조건 하에서 수소 결합을 완전히 파괴하는 고전적이고 일반적인 가용화 접근법을 따랐다(문헌[Marston 1986], 문헌[Rudolph 1990], 문헌[Rudolph 1996], 상기 참조). 특히, 더욱 최근의 간행물에서는 GuHCl 또는 우레아 가용화된 G-CSF의 재폴딩이 선호되었다.

예를 들어, 문헌[Wingfield 1988]에는 이. 콜라이 IB로부터의 돌연변이 단백질(mutein) 및 야생형 G-CSF의 정제가 기술되어 있다. 가용화는 6 M GuHCl을 이용하여 수행되었다. 제1 정제는 4 M GuHCl의 존재 하에 SEC(세파크릴 S200)에서 비폴딩 단백질을 이용하여 행해졌다. 그 후, G-CSF는 3 M 우레아에 대한 투석에 의해 산화 및 재폴딩되고, CEX(CM-세파로스) 및 SEC(울트로겔(Ultrogel) AcA54)를 이용하여 추가로 정제되었다.

문헌[Kang 1998]으로부터의 논문에는 이. 콜라이 IB 형태로 N-meth-hu-G-CSF를 발현시키는 것이 기술되었다. G-CSF는 알칼리 조건 하에서 2 M 우레아에 의해 가용화되었다. 재폴딩은 희석 및 실온에서의 16 시간 동안의 인큐베이션에 의해 개시되었다. 그 후, pH를 pH 5.5로 저하시키고, 출현 침전물을 제거하였다. 2가지의 후속 크로마토그래피가 수행되었으며, CEX 단계(SP 세파로스) 후에 폴리버퍼를 사용한 크로마토포커싱 단계(PBE94)가 이어졌다.

국제 특허 공개 제WO98/53072호에는 신호 펩티드의 절단 없이 이. 콜라이에서 발현된, 그리고 그에 따라 IB로 축적된, N-말단에 작은 리더 펩티드를 지닌 G-CSF가 개시되어 있다. 가용화는 환원 조건(10 mM DTT) 하에서 8 M 우레아 중에서 수행되었다. 가용화된 G-CSF는 AEX(DEAE-세파로스), 이어서 SEC(세파크릴 200)에 처해졌다. 산화적 재폴딩이 기술되었으며, 이는 2 mM GSH의 존재 하에서 꽤 짧은 인큐베이션을 포함한다.

또 다른 간행물(문헌[Wang 2005])에서, 봉입체는 pH 8의 5 mM EDTA 및 100 mM 2-ME의 존재 하에서 8 M 우레아를 이용하여 가용화되었다. 매트릭스 결합 재폴딩이 후속 AEX 크로마토그래피(Q-세파로스) 동안 수행되었다. G-CSF를 컬럼에 결합시켰으며, 결합된 채 있는 동안 이동상 중 우레아의 농도를 저하시켰다. 완충제는 GSH/GSSG를 함유하였으며, 용출된 G-CSF는 생물학적 활성을 가졌다. 추가의 방법이 국제 특허 공개 제WO01/87925호 및 국제 특허 공개 제WO2004/015124호에 기술되어 있다.

국제 특허 공개 제WO2004/001056호에는 pH 8에서의 6시간 동안의 제1 인큐베이션, 이어서 pH 4-5에서의 6-8시간 동안의 제2 인큐베이션을 포함하는 방법이 개시되어 있다.

국제 특허 공개 제WO2006/097944호에는 IB가 알칼리 pH(8-11)에서 우레아 또는 GuHCl(2-6 M)을 이용하여 가용화되고, 재폴딩이 실온에서 6-16시간 동안 산성 pH에서 희석 후 수행되었음이 기술되어 있다.

국제 특허 공개 제WO2006/135176호는 후속 페길화(PEGylation)용으로 정제된 G-CSF 돌연변이 단백질을 다룬다. 상기 G-CSF 변이체는 이. 콜라이에서 발현되고, pH 11에서 8 M 우레아를 사용하여 IB로부터 가용화되었다. 재폴딩은 2 M 우레아 및 50 mM 글리신으로 되도록 희석시킴으로써 수행되었으며, 이는 pH 9에서 하룻밤 인큐베이션되었다.

유럽 특허 제1630173호에는 이. 콜라이 IB로부터의 G-CSF(필그라스팀)의 단리 및 재폴딩 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 변성제, 우선적으로는 GuHCl을 이용한 추출을 기반으로 한다. 재폴딩은 GSH/GSSG, 높은 pH 및 낮은 온도의 존재 하에서 수행되었다.

유럽 특허 제1837346호에는 이. 콜라이 IB로 발현된 G-CSF(필그라스팀)의 단리, 재폴딩 및 정제 방법이 기술되어 있다. GuHCl이 가용화에 사용되었으며, 재폴딩은 GSH의 존재 하에서 수행되었다. 후속적인 겔 크로마토그래피(세파덱스 G-25)가 변성제 및 완충제의 제거를 위하여 적용되었다.

문헌[Rao 2008]에는 이. 콜라이 IB로부터의 G-CSF의 제조 방법이 기술되어 있다. 상기 IB는 이례적으로 높은 pH 값(pH 12-12.8)에서 25 mM 시스테인의 존재 하에 2 M 우레아에 용해되었다.

G-CSF(필그라스팀)의 유사한 가용화, 재폴딩 및 정제 방법이 문헌[Vanz 2008]에 기술되어 있다.

문헌[Khalilzadeh 2008]에는 상기에 기술된 사르코실/CuSO₄를 사용한 방법에 대하여 수정된 방법이 제안되어 있다. 세척된 IB의 가용화는 8 M 우레아를 이용하여 수행되었다. 재폴딩은 우레아를 8 M로부터 0 M로 감소시키기 위하여 단계적 투석에 의해 수행되었다. CuSO₄ 농도는 5-60 μM의 범위였으며, 최적치는 40 μM로 나타났다. 크로마토그래피 순서는 3개의 단계, AEX(DEAE), 이어서 HIC(부틸) 및 최종 SEC(세파덱스 G-25)로 이루어진다.

국제 특허 공개 제WO2008/096370호에는 이. 콜라이 IB로부터의 huG-CSF의 재폴딩 및 정제가 또한 기술되어 있다. G-CSF를 DTT의 존재 하에 우레아를 이용하여 가용화하였으며, pH를 pH 12-12.5로 상승시켰다.

마지막으로, 국제 특허 공개 제WO2010/146599호에는 6 M GuHCl을 이용한 G-CSF의 가용화 및 DTT를 이용한 환원이 개시되어 있다. 재폴딩에 있어서, 복합 완충제는 2 M 우레아, 0.1 M 아르기닌, 10% 수크로스, 2 mM EDTA로 이루어지고, 옥시도 셔플링제, 예컨대 10 mM Na-아스코르베이트/디히드로아스코르베이트/DTT 또는 GSH/GSSG 또는 시스테인/시스틴(산화환원)을 포함하는 것으로 구성되었다.

봉입체로부터 G-CSF를 수득하는 새로운 방법에 대한 계속된 필요성이 있다.

발명의 개요

본 발명은 봉입체로부터 추출된 재조합 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)를 생물학적 활성 분자로 재폴딩시키는 새로운 방법에 관한 것이다. 본 방법은 가용화제를 이용한 G-CSF의 가용화, 이러한 가용화제의 존재 하에서의 G-CSF의 산화 및 부분적 재폴딩, 가용화제의 효율적인 제거, 및 가용화제의 부재 하에서의 재폴딩의 완료를 포함한다. 부분적으로 재폴딩된 G-CSF로부터 가용화제를 분리하는 다양한 방법이 개시되어 있다.

놀랍게도, 본 발명자는 두 재폴딩 단계의 조합이 올바르게 폴딩된 G-CSF의 수율을 유의하게 증가시킴을 알아냈다.

봉입체로부터의 재조합 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)의 새로운 재폴딩 방법이 개시된다. 본 방법은 2개의 재폴딩 단계를 포함한다. 특히, 본 방법은 가용화제를 이용한 G-CSF의 가용화, 가용화제 및 산화제의 존재 하에서의 G-CSF의 산화적 재폴딩(제1 재폴딩 단계), 가용화제의 효율적인 제거, 및 가용화제의 부재 하에서 G-CSF의 폴딩을 완료하기 위한 제2 재폴딩 단계를 포함한다. 부분적으로 재폴딩된 G-CSF로부터 가용화제를 효율적으로 제거하는 다양한 방법이 기술되어 있다. 본 발명은 추가로, 이온 교환 크로마토그래피를 사용한 재폴딩된 G-CSF의 후속적인 정제 방법을 제공한다.

모든 인용된 참고 문헌은 그 전체가 본원에 포함된다.

일 측면에서, 본 발명은 봉입체로부터의 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)의 재폴딩 방법을 제공하며, 이는

a) 가용화제의 존재 하에서 G-CSF를 가용화하는 단계;

b) 산화제 및 가용화제의 존재 하에서 가용화 G-CSF를 인큐베이션하는 것을 포함하는, 산화 및 제1 재폴딩 단계를 수행하는 단계;

c) 이온 교환 수지 흡착 및/또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 가용화제를 제거하고, 임의로, 산 침전을 수행하는 단계; 및

d) 가용화제의 부재 하에서 단계 (c)의 G-CSF를 희석 및 인큐베이션하는 것을 포함하는, 제2 재폴딩 단계를 수행하는 단계를 포함한다.

봉입체는 미생물, 바람직하게는 이. 콜라이로부터 수득될 수 있다. G-CSF는 재조합 소 또는 인간 G-CSF일 수도 있으며, 이것은 소 또는 인간 메티오닐-G-CSF일 수 있다. 가용화제는 N-라우로일사르코신일 수 있다. 산화제는 CuSO₄일 수 있다. G-CSF의 가용화는 7 초과의 pH 값에서 수행될 수 있다.

일부 실시 양태에서, 가용화제는 약 0.5% 내지 약 1.5%의 농도의 N-라우로일사르코신이다.

일부 실시 양태에서, 산화 및 제1 재폴딩 단계는 2시간 이상 동안 수행된다. 일부 실시 양태에서, 공기 흐름 하에서 그리고 냉각 없이 산화 및 제1 재폴딩 단계가 수행된다. 일부 실시 양태에서, 산화 및 제1 재폴딩 단계는 약 7-9의 pH 값에서 그리고 약 20-28℃의 온도에서 약 15-25시간 동안 수행된다.

일부 실시 양태에서, 상기 단계 (c)에서의 가용화제의 제거는, AEX(음이온 교환) 및 CEX(양이온 교환)를, 임의로 이 순서로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 단계 (c)에서의 가용화제의 제거는 하기를 포함한다:

a) G-CSF 용액을 현탁 수지 물질과 혼합함에 의한 음이온 교환 수지 물질에의 결합 및 여과에 의한 수지 물질의 제거, 및/또는

b) 가용화제가 수지에 결합되고 G-CSF가 통과액(flow through) 중에 잔존하는 조건 하에서의 이온 교환 크로마토그래피, 및/또는

c) G-CSF가 수지에 결합되고 가용화제가 통과액 중에 잔존하는 조건 하에서의 이온 교환 크로마토그래피.

일부 실시 양태에서, 가용화제 및 다른 불순물은 하기 단계의 순차적 적용에 의해 제거된다: AEX, 산 침전, AEX, 및 CEX.

일부 실시 양태에서, 가용화제 및 다른 불순물은 하기 단계의 순차적 적용에 의해 제거된다:

a) G-CSF 용액을 현탁 수지 물질과 혼합함에 의한 음이온 교환 수지 물질에의 가용화제의 결합 및 여과에 의한 수지 물질의 제거;

b) pH를 pH 5 미만으로 저하시킴에 의한 불순물의 침전 및 여과에 의한 침전물의 제거;

c) 잔여 가용화제가 수지에 결합되고 G-CSF가 통과액 중에 잔존하는 조건 하에서 행해진 음이온 교환 크로마토그래피;

d) G-CSF가 수지에 결합되고 잔여 가용화제가 통과액 중에 잔존하는 조건 하에서 행해진 양이온 교환 크로마토그래피; 및

e) 증가된 pH 또는 염 농도를 갖는 용출 완충제를 이용한 단계식 또는 구배식 용출에 의한 양이온 교환 수지로부터의 결합 G-CSF의 용출.

본원에 기술된 방법의 일부 실시 양태에서, 제2 재폴딩 단계는 저 전도도 완충제 중에서 및/또는 냉각 조건 하에서 및/또는 12시간 초과의 시간 동안 수행된다. 일부 실시 양태에서, 제2 재폴딩 단계는 2.0 mS/cm 미만의 전도도에서 및/또는 약 2-8℃의 온도에서 및/또는 24시간 이상 동안 수행된다. 일부 실시 양태에서, 제2 재폴딩 단계는 pH 7 초과의 pH 값에서 수행된다.

일부 실시 양태에서, 본원에 기술된 방법은 폴리싱 단계를 추가로 포함하는데, 상기 폴리싱 단계는 1가지 이상의 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 폴리싱 단계에서의 상기 1가지 이상의 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피, 이어서 양이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계:

a) G-CSF가 수지에 결합되는 조건 하에서 행해진 음이온 교환 크로마토그래피 단계;

b) 감소된 pH 또는 증가된 염 농도를 갖는 용출 완충제를 이용한 단계식 또는 구배식 용출에 의한 결합 G-CSF의 용출 단계;

c) G-CSF가 수지에 결합되는 조건 하에서 행해진 양이온 교환 크로마토그래피 단계;

d) 증가된 pH 또는 염 농도를 갖는 용출 완충제를 이용한 단계식 또는 구배식 용출에 의한 결합 G-CSF의 용출 단계

를 포함하는, 봉입체로부터의 G-CSF의 정제 및/또는 봉입체로부터의 G-CSF의 가용화에 사용되는 가용화제의 제거 방법을 제공하며,

이는 음이온 및 양이온 교환 수지 둘 모두의 골격 중합체가 메타크릴레이트 유도체를 포함하는 것을 특징으로 한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)의 새로운 재폴딩 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 활성 G-CSF를 봉입체로부터 고수율로 수득하는 새로운 방법을 제공하며, 이는 정제된 G-CSF의 공업적 생산을 허용한다.

본 발명의 1가지 목표는 품질, 경제 및 규제 상의 요구를 고려하여, (의약품 등급까지의) 고순도의 재조합 G-CSF 의약 물질에 대한 공업적 규모의 효과적인 제조 방법을 제공하는 것이었다. 본 발명은 봉입체 형태로 발현된 재조합 G-CSF의 신규한 재폴딩 및 정제 방법을 제공한다.

종래 기술에서는 봉입체로부터의 G-CSF의 몇몇 가용화 및 재폴딩 방법이 기술되어 있다. 상기에 약술된 바와 같이(배경기술 참조)IB 단백질(및 특히 G-CSF와 관련된 것)의 가용화 및 재폴딩에 대한 종래 기술은 2가지의 상이한 주요 방법으로 나뉘어질 수 있다. 더욱 고전적인 접근법은, 전형적으로 환원 조건 및 알칼리 pH 하에서 우레아 또는 GuHCl과 같은 강한 카오트로픽제(변성제)를 사용하는 것이다. 당해 분야에서 또한 일반적으로 사용되는 두 번째 방법은 가용화를 위하여 사르코실 또는 라우르산과 같은 강한 계면활성제를 사용하는 것이다. 또한 산발적으로, G-CSF의 가용화에 강한 이온성 계면활성제인 소듐 도데실술페이트(SDS)를 사용하는 것이 보고되었다(문헌[Devlin 1988]).

종래 기술의 방법 각각은 특정한 불리한 점을 갖는다. 발명자에 의해 수행된 실험에서 입증된 바와 같이, 가용화제로서의 SDS는 적합하지 않았으며, 그 이유는 이의 효율적인 제거가, 불가능한 것은 아니라 해도, 어렵기 때문이었다. 예를 들어, 세라믹 히드록시 아파타이트(CHT)에서의 크로마토그래피에 의해 SDS를 제거할 때, 미량의 SDS가 여전히 단백질에 결합된 채 있다. SDS는 완전히 제거될 수 없었다. GuHCl을 이용한 가용화(문헌[Wingfield 1988], 문헌[Dietrich 2003], 국제 특허 공개 제WO2006/097944호, 유럽 특허 제16301273호, 유럽 특허 제1837346호, 국제 특허 공개 제WO2010/146599호)는 다른 이유로 문제가 있다. GuHCl은 투석 또는 겔 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있지만, GuHCl 가용화 방법은 재폴딩 인큐베이션 동안 폴딩 중간체(문헌[Rudolph 1990], 문헌[Rudolph 1996])의 응집을 방지하기 위하여 강한 희석이 필요한 것에 의해 야기되는 많은 부피를 후속적으로 요구한다. 1:200까지의 희석이 보고되었다(문헌[Rudolph 1996]). 발명자에 의해 테스트된 GuHCl 방법에서, 강한 희석에 대한 필요성이 확인되었으며, GuHCl 방법을 이용할 경우 적어도 1:50의 희석비가 최적 수율에 요구되었다. 이러한 종류의 가용화는 대규모 공정용의 대형 스테인리스강 탱크를 필요로 하는데, 이는 비경제적이다.

GuHCl 대신, 또 다른 변성제인 우레아가 G-CSF의 가용화에서의 사용용으로 보고되었다. 거의 포화된 농도의, 예컨대 8 M의 우레아가 종래 기술에서 적용되었다(국제 특허 공개 제WO98/53072호, 국제 특허 공개 제WO01/87925호, 국제 특허 공개 제WO2006/135176호, 문헌[Khalilzadeh 2008], 국제 특허 공개 제WO2008096370호). GuHCl과 관련하여 논의된 것과 동일한 문제가 우레아에 또한 적용된다. 게다가, 특히 알칼리 pH에서 우레아의 존재는 요망되지 않는 단백질 변형, 예컨대 탈아미드화에 유리할 수 있음이 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다. 더욱이, 시안산암모늄(이는 항상 용액 중 우레아와 평형 상태로 존재함)으로부터 생성될 수 있는 이소시안산의 존재는 1차 아미노기를 카르바밀화한다(문헌[Rudolph 1996]). 마지막으로, 재폴딩 동안 응집 저해제인 아르기닌이 공동 변성제로서 고농도로 존재할 때 수율에 대한 이득이 존재할 수 있음이 당업계에 또한 보고되었다(유럽 특허 제0219874호, 문헌[Rudolph 1996], 문헌[Dietrich 2003]). 그러나, 아르기닌은 고가의 시약이며, 아르기닌의 사용을 포기하는 것이 경제적으로 바람직하다.

상기에 언급된 바와 같이, IB로부터의 G-CSF의 가용화에 계면활성제 사르코실이 또한 사용될 수 있다. 우선적으로 2% 사르코실이 사용되었다(문헌[Zsebo 1986], 국제 특허 공개 제WO8701132호, 국제 특허 공개 제WO8910932호, 문헌[Lu 1992], 문헌[Heidari 2001]). 사르코실은 용해성이 우수한 음이온성 텐시드(tenside)이다. 사르코실의 사용에 대한 1가지의 이점은 후속적인 재폴딩 인큐베이션 동안 요구되는 희석률이 더 낮다는 것이다(GuHCl/우레아의 경우 50-200배 대신 2배). 또 다른 이점은 환경을 위한 폐기 화학물질의 상대적으로 낮은 생성이다. 그러나, 원래 기술된 방법을 사용할 때, 본 발명자는 뱃치(batch)마다 변동이 큰 것과 관련된, 재폴딩 후 꽤 낮은 수율을 실험에서 관찰하였다. 계면활성제, 예컨대 사르코실은 일반적으로 단백질의 용해도를 증가시킴으로써 가용화를 용이하게 하는 것이 일반적이다. 사르코실은 카오트로픽제가 그러한 바와 같이 단백질을 변성 및 비폴딩시키는 것은 아니기 때문에, 처음에 부정확하게 폴딩된 IB 단백질은 이후에 재폴딩될 수 없으며; 따라서 수율은 GuHCl/우레아 방법과 비교할 때 더욱 낮아야 한다.

본 발명은 종래 기술의 불리한 점을 극복한다.

본 발명자는 재폴딩된 G-CSF를 수득하는 새로운 방법을 제공하는데, 이는 종래 기술의 방법과 결부된 문제에 대처한다. 놀랍게도, 가용화제의 존재 하에서의 제1 산화적 재폴딩 단계, 이어서 (예를 들어 이온 교환 수지 흡착 및/또는 산 침전 및/또는 이온 교환 크로마토그래피에 의한) 가용화제의 효율적 제거 단계, 이어서 G-CSF를 희석시키고 이것을 가용화제의 부재 하에서 인큐베이션하는 것을 포함하는 제2 재폴딩 단계를 이용함으로써 증가된 수율의 단량체형 용해성 G-CSF가 수득될 수 있으며, 즉, 본원에 기술된 방법에 의해 재폴딩 G-CSF가 수득됨이 밝혀졌다.

따라서 본 발명은 봉입체 형태의 불활성 전구체로부터 생물학적 활성 G-CSF를 제조하는 새로운 방법에 관한 것이다. 미생물에서의 이종성 재조합 폴리펩티드의 과다발현은 종종 봉입체를 형성하며, 여기서, 상기 폴리펩티드는 비폴딩되고, 환원되고, 불활성이고, 일반적인 수송 용출제 중에 적어도 부분적으로 불용성이다. 봉입체로부터의 재조합 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)의 새로운 재폴딩 방법이 본원에 개시된다. 특히, 본 발명은 2개의 재폴딩 단계를 포함하는 새로운 재폴딩 방법에 관한 것이다. 본 방법은 가용화제를 이용한 G-CSF의 가용화, 가용화제 및 산화제의 존재 하에서의 산화적 재폴딩("산화 및 제1 재폴딩 단계"), 가용화제의 효율적인 제거, 및 가용화제의 부재 하에서의 G-CSF의 폴딩의 완료를 위한 제2 재폴딩 단계를 포함한다.

또한 본 발명은 재폴딩 단계와 정제 단계의 새로운 조합에 관한 것이다. 제1 재폴딩 단계 후, 신규한 중간 정제 단계를 도입하여 가용화제 및 산화제의 효율적인 제거를 확증한 후, 제2 재폴딩 단계를 수행하여 G-CSF의 폴딩을 완료한다. 또한 본 발명은 일반적으로 재폴딩 공정에서 사용되는 가용화제 및 다른 에이전트를 제거하는 새로운 방법에 관한 것이다.

상기 새롭게 기술된 방법의 주요 원리가 (임의적 하류 폴리싱 단계와 함께) 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 간략하게는, 본 방법은

a) (임의로, 봉입체의 추출 및/또는 단리 및/또는 세척이 선행하는) 가용화제의 사용에 의한 봉입체로부터의 G-CSF의 가용화와;

b) 산화제 및 가용화제의 존재 하에서의 인큐베이션에 의한 가용화 G-CSF의 산화 및 부분적 재폴딩과;

c) 가용화제 (및 다른 불순물)의 제거와;

d) 부분적으로 재폴딩된 G-CSF의 희석 및 인큐베이션에 의한 재폴딩의 완료를 포함한다.

따라서, 제2 재폴딩 단계는 가용화제의 부재 하에서 수행된다.

따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 봉입체로부터의 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)의 재폴딩 방법을 제공하며, 이는

(a) 가용화제의 존재 하에서 G-CSF를 가용화하는 단계와;

(b) 산화제 및 가용화제의 존재 하에서 가용화 G-CSF를 인큐베이션하는 것을 포함하는, 산화 및 제1 재폴딩 단계와;

(c) 이온 교환 수지 흡착 및/또는 산 침전 및/또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 가용화제를 제거하는 단계와;

(d) 가용화제의 부재 하에서 단계 (c)의 G-CSF를 희석시키고 인큐베이션하는 것을 포함하는 제2 재폴딩 단계를 포함한다.

봉입체는 미생물로부터 수득될 수 있다. 미생물은 예를 들어 재조합적으로 G-CSF를 생성할 수 있다. 따라서 본 방법은 임의로, 미생물 세포로부터 봉입체를 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

봉입체

본 발명은 봉입체로부터의 G-CSF의 재폴딩 방법을 제공한다. 과거에, 몇몇 상이한 발현 시스템들이 G-CSF를 많은 양으로 생성하는 그의 능력에 대하여 테스트되었다. 테스트된 모든 박테리아 균주는 G-CSF 단백질을 봉입체(IB)의 형태로 발현한다. 봉입체(IB)는 G-CSF를 많은 양으로, 그러나 비폴딩된 불활성 형태로 함유한다. 단리된, 바람직하게는 세척된 봉입체의 분획물은 본원에 기술된 방법을 위한 출발 재료로서 사용될 수 있다. 이러한 봉입체 제제는 적합한 발현 시스템, 발효 조건, 수확 및 용해 절차, 및 IB의 적합한 단리 및 세척 방법에 의해 제공될 수 있다. 이러한 방법은 종래 기술에 개시되어 있다(예를 들어, 문헌[Rudolph 1990], 문헌[Rudolph 1996], 문헌[Heidari 2001], 문헌[Khalilzadeh 2008], 문헌[Rao 2008], 문헌[Vanz 2008], 미국 특허 제5849883호, 유럽 특허 제0219874호, 유럽 특허 제1630173호 또는 국제 특허 공개 제WO2004001056호 참조). 일반적으로, 봉입체를 숙주 세포로부터 추출하는 방법은 세포의 용해 및 파괴, 이어서 원심분리를 포함한다. 봉입체는 (예를 들어, 원심분리, 예를 들어 11000 g에서의 원심분리에 의해) 분리기에서 세포를 수확하고, 고압 균질화기(예를 들어 약 1000바)를 이용하여 세포를 기계적으로 파괴하고, 그 후 (예를 들어, 원심분리, 예를 들어 11000 g에서의 원심분리에 의해) 분리기에서 세포 잔사로부터 봉입체를 분리함으로써 수득될 수 있다. 고전적 봉입체의 대부분을 포함하는 펠렛은 일반적으로 세제로 세척된다. 봉입체는 G-CSF의 가용화 이전에 냉동 및 보관될 수 있다. 분리기에서 세포 잔사로부터 분리되고 -80℃에서 환원 완충제 중에 보관된 IB는 8개월까지 안정한 것으로 밝혀졌다.

봉입체는 미생물 세포로부터 수득될 수 있다. 따라서 본원에 기술된 방법은 봉입체를 미생물 숙주 세포로부터 추출하는 단계를 포함할 수 있다. G-CSF의 발현에 사용되는 미생물 숙주 세포는 효모 세포, 사상균 세포 또는 박테리아 세포일 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 미생물은 박테리아이며, 더 바람직한 실시 양태에서, 미생물은 그람(gram) 음성 박테리아이며, 가장 바람직하게는 미생물은 이. 콜라이이다. 따라서 봉입체는 이. 콜라이 세포로부터 수득될 수 있다.

G-CSF

본 발명의 맥락에서, 본원에서 사용될 때, "G-CSF"는 G-CSF의 종 상동체, 예를 들어 인간 G-CSF, 소 G-CSF 등을 포함한다. 인간 G-CSF의 아미노산 서열은 하기 서열(서열 번호 1)이며, 이는 예를 들어 문헌[Holloway, 1994]에서 또는 드럭뱅크(Drugbank) 등록 번호 DB00099로 발견될 수 있다:

소 G-CSF의 서열은 하기 서열(서열 번호 2)이며, 이는 예를 들어 미국 특허 제5849883호의 도 7, 또는 PDB 등록 번호 1BGC-A에서 발견될 수 있다:

바람직한 실시 양태에서, G-CSF는 포유류 G-CSF이며, 특히 바람직한 실시 양태에서, 이것은 인간 G-CSF이다. 일부 바람직한 실시 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 메티오닐-G-CSF(Met-G-CSF), 예컨대 인간 Met-G-CSF(r-met-hu-G-CSF = 필그라스팀)이다.

필그라스팀의 서열은 하기 서열(서열 번호 3)이다:

소 G-CSF가 동등하게 메티오닐-소 G-CSF로서 제공될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 본원에서 사용될 때, "G-CSF"는 G-CSF의 기능성 변이체를 포함한다. 본원에서 "변이체"의 언급은 그 맥락이 달리 지시하지 않으면 "기능성 변이체"를 언급함을 의미한다. G-CSF 단백질의 변이체는 G-CSF 단백질 서열과는 상이하지만 여전히 동일한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 나타낸다(기능성 변이체). G-CSF 단백질의 "변이체"는 1개 이상의 아미노산(들)이 (인간 G-CSF 서열과 같은) 기준 G-CSF 단백질 서열과 상이한 단백질을 나타낸다. 대안적으로 또는 게다가, "변이체"는 예를 들어 메틸화, 페길화, 숙시닐화, 태그 또는 표지체의 부가 등과 같은 다른 변형을 가질 수 있다. 변이체는 효소적으로 또는 화학적으로 변형된 G-CSF일 수 있다. 이것은 또 다른 펩티드 또는 폴리펩티드에 융합된 융합 단백질일 수 있다.

바람직한 실시 양태에서, G-CSF는 페길화된다.

변이체는 합성에 의해 생성된 변이체, 또는 대립유전자 변이체를 포함하는, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함하는 천연 변이체일 수 있다(예를 들어, 문헌[Zsebo 1986] 참조). 종래 기술에서, 변형된 형태의 G-CSF가 봉입체로 발현된다는 것이 밝혀졌다. 예를 들어, 유럽 특허 제0719860호에는 봉입체로 발현된 변형된 소 G-CSF의 구성 및 생성이 실시예 2 및 실시예 3에 기술되어 있다. 따라서 변이체는 본원에 기술된 방법을 이용하여 수득될 수 있다.

일부 실시 양태에서, G-CSF 변이체는 서열 번호 3의 서열(r-met-hu-G-CSF = 필그라스팀)과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 동일성을 공유하는 단백질이다. 서열 동일성은 예를 들어 Clustal, BLAST 등과 같은 표준 서열 분석 도구, 또는 예를 들어 니들맨-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘 등과 같은 정렬 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 변이체는 1개 이상의 보존적 아미노산 치환(들)을 가질 수 있다. 아미노산 치환은, 1개의 아미노산이 유사한 특성을 갖는 아미노산과 교환될 경우, 예를 들어 극성 아미노산이 또 다른 극성 아미노산과 교환되거나 산성 아미노산이 또 다른 산성 아미노산과 교환되는 등의 경우에 보존적이다. 보존적 치환은 화학적 특성, 그리고 그에 따라 단백질의 기능에 영향을 줄 가능성이 더욱 적다. 따라서 G-CSF에 대한 "변이체"는 G-CSF의 변이체가 여전히 G-CSF와 동일한 생물학적 기능을 나타내기만 한다면(기능적으로 등가임), 서열 번호 3의 서열과 비교하여 1개 이상의 아미노산의 하나 이상의 돌연변이(들), 결실(들), 치환(들), 삽입(들) 및/또는 변형(들)을 갖는 단백질을 포함한다. (하기에 논의된 바와 같이) 변이체가 동일한 생물학적 기능을 갖는지에 대한 것은 G-CSF의 생물학적 활성을 결정하는 검정법에서 테스트될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 G-CSF는 기준 대조구로서 사용될 수 있다. 변이체는, 이것이 상업적으로 입수가능한 G-CSF 기준물의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 활성을 가질 경우, "동일한 생물학적 활성"을 갖는 것으로 간주될 수 있으며, 즉, "생물학적으로 활성"이거나 "활성"인 것으로 간주될 수 있다.

따라서 본원에서 "G-CSF"에 대한 언급은 인간 G-CSF의 종 상동체 및 변이체, 즉, 기능성 변이체에 대한 언급을 포함한다.

가용화

IB 분획물의 G-CSF는 가용화제의 존재 하에 가용화된다. 임의의 적합한 가용화제(즉, 본원에 기술된 바와 같이 G-CSF를 가용화하는 임의의 에이전트)가 사용될 수 있다. 예를 들어 이러한 가용화제는 예를 들어 GuHCl 또는 우레아와 같은 (그러나 이로 한정되는 것은 아닌) 변성제 또는 카오트로픽의 군, 또는 예를 들어 N-라우로일사르코신(사르코실), 라우르산, 소듐 도데실 술페이트(SDS) 또는 N-세틸트리메틸암모늄 클로라이드와 같은 (그러나 이로 한정되는 것은 아닌) 세제, 텐시드 또는 계면활성제의 군으로부터 선택될 수 있다 (그러나 이로 한정되는 것은 아니다).

사르코실과 관련하여, 본 발명자는 빈번하게 보고된 2% 사르코실의 농도와는 대조적으로, 최대 가용화가 이미 1%(w/v) 사르코실에서 달성됨을 알아냈다. 더 유리하게는, SDS와 같은 다른 이온성 세제와는 대조적으로, 다양한 정제 방법에 의해 사르코실이 생성물로부터 완전히 제거될 수 있음이 본 발명자에 의해 밝혀졌다. 마지막으로, 효율적인 사르코실 제거 후 제2 재폴딩 단계가 올바르게 폴딩된 단량체형 G-CSF의 수율을 증가시킨다는 것이 본 발명자에 의해 밝혀졌다.

따라서, 본 발명의 바람직한 실시 양태에서, 가용화제는 세제 또는 계면활성제이다. 더 바람직한 실시 양태에서, 가용화제는 음이온성 계면활성제이며, 가장 바람직하게는 가용화제는 사르코실이다. 가용화 동안 사르코실의 바람직한 농도는 0.2-2.0%(w/v)이며, 더 바람직한 실시 양태에서, 약 0.5%-1%(w/v), 가장 바람직하게는 약 1%(w/v) 또는 1%(w/v)이다.

다른 파라미터, 예컨대 온도, pH, 완충제 등의 최적화가 수율을 추가로 향상시킬 수 있음이 추가로 밝혀졌다. 최적 온도, pH, 완충제 등은 본원에 기술된 방법을 이용하여 본 발명의 설명을 고려하여 확립될 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 가용화는 예를 들어 7 내지 10, 또는 7 내지 9, 또는 7.5 내지 8.5, 또는 7.8 내지 8.2의 범위 내의 pH와 같은 알칼리 pH에서 수행된다. 바람직한 실시 양태에서, pH는 약 8이거나 8이다. 일부 실시 양태에서, 가용화는 실온, 즉 20-25℃에서 수행된다. 가용화에 있어서 특정 pH 범위에서 사용될 적합한 완충제는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 트리스(Tris)-HCl이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 가용화는 교반 하에 수행된다.

바람직한 실시 양태에서, 가용화는 알칼리 pH, 우선적으로 pH 8에서 사르코실을 이용하여 수행된다. 가용화에 바람직한 완충제는 트리스-HCl/pH 8, 우선적으로 40 mM 트리스-HCl/pH 8이다.

가용화 후, 예를 들어 5배 또는 4배 또는 3배 또는 바람직하게는 2배의 희석과 같은 희석 단계가 수행될 수 있다. 희석에 바람직한 용매는 저 전도도 완충제이거나 더 바람직하게는 단지 물이다. 저 전도도는 적어도 2 mS/cm 미만, 더 바람직하게는 1 mS/cm 미만의 전도도를 의미한다. 적합한 완충제 시스템은 예를 들어 10 mM 이하의 트리스의 농도의 트리스/HCl이며, 이때 pH 값은 7을 초과한다. 상기 저 전도도 및 pH를 갖는 다른 완충제가 또한 사용될 수 있다.

제1 재폴딩(산화적 폴딩)

환원된 시스테인의 산화 및 디술피드의 형성이 G-CSF의 올바른 폴딩에 필요하다. 고전적인 접근법은 환원제/산화제의 쌍의 존재 하에서의 산화이다(문헌[Rudolph 1990], 문헌[Rudolph 1996], 배경기술 참조). 다수의 시험관내 재폴딩 기술이 공개되었다. 이들 재폴딩 프로토콜을 기반으로 하여, 본 발명자는 봉입체 형태로 발현되는 디술피드 함유 단백질에 대하여 일반적인 일부 일반 원리를 도출하였다. 상기 단백질은 환원된 상태이고 비폴딩되어 있기 때문에, 이러한 재폴딩 절차 뒤의 기작은 주로, 시스테인 쌍의 술프히드릴기들 사이의 천연 디술피드 가교체의 형성에 의해 폴리펩티드 사슬을 천연 배좌로 산화적으로 폴딩시키는 것이다. 전형적인 재폴딩 과정에서, 처음에는, 가용화제(카오트로픽제 또는 세제)의 농도는 종종 단계식 희석에 의해 또는 투석에 의해 또는 예를 들어 세파덱스 G-25를 이용한 겔 크로마토그래피에 의해 변성 농도 미만으로 감소된다. 산화제, 예컨대 CuSO₄ 또는 산화환원 시스템, 예컨대 글루타티온 red/ox(GSH/GSSG)의 존재는 재폴딩 인큐베이션 동안 디술피드 형성을 촉진한다. 일반적으로, 인큐베이션은 실온에서 수시간에서 수일까지 수행되었다. 단백질의 용해도의 증가 및/또는 응집의 방지를 위하여 임의로 사용될 수 있는 다양한 추가의 첨가제가 기술되었다. 응집, 특히 부분적으로 폴딩된 중간체의 응집은 재폴딩 동안 중대한 문제이며, 기껏해야 임계 단백질 농도 수준 미만으로 희석시킴에 의해 방지된다(문헌[Rudolph 1990], 문헌[Rudolph 1996]). G-CSF에 대하여, 종래 기술에서는 CuSO₄를 사르코실과 병용함에 의한 산화가 또한 교시되어 있다. 재폴딩은 산화제 및 가용화제의 존재 하에서 수행되었다(문헌[Zsebo 1986], 국제 특허 공개 제WO8701132호, 국제 특허 공개 제WO8910932호, 문헌[Lu 1992], 문헌[Heidari 2001]).

본 발명자는 가용화제, 예컨대 사르코실의 존재 하에서는 G-CSF의 폴딩이 완전히 달성가능한 것은 아님을 알아냈다. 따라서 이러한 산화 및 폴딩 단계는 단지 G-CSF의 부분적 재폴딩에 이르게 된다. 본 발명자는 가용화제의 완전한 제거, 이어서 가용화제의 부재 하에서의 제2 폴딩 단계가 수율을 향상시킴을 알아냈다. 또한 본 발명자는 가용화제의 최적화된 제거 방법을 또한 고안하였다(하기 참조). 불완전한 폴딩에 또한 기여할 수 있는 다른 오염물질이 또한 제거된다.

임의의 적합한 산화제, 예컨대 산소 또는 공기 흐름(버블링, GSSG(글루타티온-ox), 금속 이온(Cu² ⁺, Fe² ⁺, Zn² ⁺,..), 과산화물(H₂O₂)이 사용될 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 산화제는 CuSO₄이다. CuSO₄ 외에, 다른 구리염이 또한 사용될 수 있다(예를 들어, CuCl₂).

가용화제는 유효량으로 사용된다. 당업자라면, 유효량, 즉, G-CSF의 효율적인 가용화를 달성하는 가용화제의 양을 쉽게 결정하고 최적화할 수 있다. 가용화된 G-CSF의 양을 측정하는 방법이 추가로 하기에 기술되어 있다(예를 들어, 실시예 13.3 참조).

제1 재폴딩 단계 동안의 가용화제의 바람직한 농도는 0.2-2.0%(w/v)이며, 더 바람직하게는 이것은 0.2%-1%(w/v)이며, 가장 바람직하게는 약 0.5%(w/v) 또는 0.5%(w/v)이다. 사르코실이 사용될 경우, 바람직한 실시 양태에서, 사르코실의 농도는 1%(w/v) 미만, 우선적으로 0.5 %(w/v)이다.

본 발명자는 긴 산화 기간에 의해 RP-HPLC 크로마토그램에서 2-3개의 가외의 피크가 출현함을 추가로 관찰하였다. 이들 추가의 피크는 G-CSF의 메티오닌 잔기의 산화로 인한 것일 가능성이 있다. 이러한 산화 형태는 요망되지 않는 생성물 관련 물질이며, 적합한 크로마토그래피에 의한 이의 제거는 어렵다.

일부 실시 양태에서, 산화적 재폴딩(즉, 산화 및 제1 재폴딩 단계)은 1-30시간, 또는 2-25시간, 또는 6-25시간, 또는 10-25시간, 또는 12-25시간, 또는 14-25시간, 또는 16-25시간, 또는 18-22시간, 또는 19-21시간, 또는 20-24 시간의 기간 동안 수행된다. 일부 실시 양태에서, G-CSF의 산화 및 부분적 재폴딩은 2시간 초과의 시간, 우선적으로 12시간 초과의 시간, 바람직하게는 20시간 초과의 시간, 가장 바람직하게는 20-24시간 동안 수행된다.

바람직한 실시 양태에서, 산화적 재폴딩 단계(즉, 산화 및 제1 재폴딩 단계)는 예를 들어 7 내지 10, 또는 7 내지 9, 또는 7.5 내지 8.5, 또는 7.8 내지 8.2의 범위 내의 pH와 같은 알칼리 pH에서 수행된다. 바람직한 실시 양태에서, pH는 약 8이거나 8이다. 일부 실시 양태에서, 제1 재폴딩 단계의 pH 값은 pH 7 초과, 바람직하게는 pH 8이다.

또한 산화적 재폴딩 단계는 이미 (부분적으로) 정제된 G-CSF를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 산화적 재폴딩에 사용되는 G-CSF는 50% 초과의 순도, 우선적으로 약 60-70%의 순도, 또는 이보다 훨씬 더 높은 순도를 갖는다.

산화적 재폴딩은 바람직하게는 냉각 없이, 바람직하게는 실온에서, 바람직하게는 18-30℃, 바람직하게는 20-28℃, 바람직하게는 20-26℃, 바람직하게는 20-24℃, 바람직하게는 21-23℃, 가장 바람직하게는 약 22℃ 또는 22℃에서 수행된다.

산화적 재폴딩은 연속 기류 하에서 수행될 수 있다.

다양한 최적화 실험을 기반으로 하면, 산화적 재폴딩(산화 및 제1 재폴딩 단계)에 가장 바람직한 조건은 표 I에서 "제1 재폴딩" 컬럼 하에 나타낸 것이다.

산화적 재폴딩 단계는 예를 들어 EDTA와 같은 중지제의 첨가에 의해 중지될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 산화는 EDTA를, 바람직하게는 약 1 mM의 최종 농도로 첨가함으로써 중지되지만, 다른 농도가 사용될 수 있다. EDTA는 Cu² ⁺ 이온을 제거하며(CuSO₄가 산화제로 사용되는 경우), 이에 의해 산화를 중지시킨다. EDTA 이외의 다른 Cu² ⁺ 복합체 형성제 및/또는 다른 농도가 사용될 수 있다. 산화제에 따라, 다른 킬레이팅제, 예컨대 터덴탓(terdentat)-리간드, 예컨대 N-피콜리노일-에틸렌디아민, 글리신-2-피리딜메틸아미드, N^α-(2-피리딜메틸)-글리신아미드 및 N^α-(2-피리딜메틸)-글리신-에틸아미드가 사용될 수 있다.

상기에 논의된 바와 같이, 본 발명자는, 상당한 부분의 G-CSF가 완전히 재폴딩되게 되는 것을 사르코실의 존재가 방지함을 알아냈다. 본 발명자는 이것이 부분적으로는 가용화제의 존재 하에서의 더욱 느린 재폴딩에 의해 야기될 수 있다고 간주한다. 그러나, 상기에 논의된 바와 같이, 인큐베이션 시간은 마음대로 연장될 수 없으며, 그 이유는 생성물의 품질이 더욱 긴 인큐베이션 시간에서는 허용불가능한 수준에 도달할 수 있기 때문이다.

놀랍게도, 본 발명자는 가용화제 및 산화제의 완전한 제거 후, 제2 인큐베이션에 의해 재폴딩이 최적화되고 완료될 수 있음을 알아냈는데, 이는 예기치 않게도 용해성의 순수한 생물학적 활성 G-CSF의 수율이 더욱 높아지게 하였다.

가용화제 및 산화제의 제거 및 다른 오염물질의 제거

중간 정제 단계에서, 산화되고 부분적으로 재폴딩된 G-CSF가 추가로 정제된다. 중요하게는, 가용화제는 제2 재폴딩 단계가 수행되기 전에 완전히 제거되어야 한다. 또한, 산화제 및 부분적으로 추가의 오염물질/불순물이 제거된다.

투석/한외여과에 의해 또는 크로마토그래피법에 의해 가용화제 및 산화제를 제거하는 몇몇 절차가 종래 기술에 개시되어 있다. 그러나, 본 발명자는 단일한 뱃치식 흡착 단계에 의해서는 가용화제, 예컨대 사르코실의 완전한 제거가 달성될 수 없음을 알아냈다. 본 발명자에 의해 수행된 실험에서, 사르코실은 이 단계 후 0.01-0.04 mg/ml의 농도로 잔존하였으며(표 III), 이는 올바르게 폴딩된 G-CSF의 수율에 부정적인 영향을 주는 것으로 밝혀졌다.

용해성 활성 G-CSF의 수율을 향상시키기 위하여, 가용화제는 완전히 제거되어야 하며, 즉, 본원에 기술된 검출 방법의 검출 수준 미만으로 제거되어야 한다. 예를 들어, 잔여 가용화제의 농도는 HPLC에 의해 그리고 UV에 의한 검출에 의해 측정될 수 있다. 본 발명자에 의해 수행된 검정법에서의 검출 한계는 0.01 mg/ml였다. 이 방법은 문헌[Burgess, R. R. 1996. Purification of over produced E. coli RNA polymerase σ factors by solubilizing inclusion bodies and refolding from sarkosyl. Methods Enzymol. 273:145-149]에 더욱 상세하게 기술되어 있다.

임의의 적합한 제거 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 충분한 제거는 이온 교환 수지 흡착, 및/또는 산 침전, 및/또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 달성될 수 있다. 본 발명에 따라 이들 기술 중 임의의 1가지의 기술 또는 이들 기술의 조합을 적용하면, 제2 재폴딩 단계에서의 재폴딩을 간섭하지 않거나 저해하지 않는 사르코실과 같은 가용화제의 농도, 바람직하게는 0.01 mg/ml 미만, 바람직하게는 검출 한계 미만의 농도가 생성된다. 이들 정제 단계는, 이것이 가용화제를 완전히 제거하기만 한다면 임의의 순서로 및/또는 임의의 조합으로 적용될 수 있다. 다른 적합한 정제 방법이 또한 사용될 수 있다. 따라서 본원에 기술된 방법은 가용화제를 완전히 제거하는 단계를 포함한다. 즉, 가용화제는 어떠한 잔여량도 제2 폴딩 단계를 간섭하지 않거나 저해하지 않게 하기에 충분한 정도로 제거된다. 따라서 제2 재폴딩 단계는 가용화제의 부재 하에서 수행되며, 즉, 가용화제는 제2 재폴딩 단계를 간섭하지 않는 양으로 존재하며, 즉, 가용화제는 검출 한계 미만으로 존재한다.

본 발명의 일 실시 양태에서, 하기 단계 중 1개 이상의 단계에 의해 가용화제를 제거하는 방법이 제공된다:

i) G-CSF 용액을 현탁 수지 물질과 혼합함으로써 음이온 교환 수지 물질에 결합시키고 상기 수지 물질을 여과에 의해 제거함, 및/또는

ii) 가용화제가 수지에 결합되고 G-CSF가 통과액 중에 잔존하거나, 그 반대인, G-CSF가 수지에 결합되고 가용화제가 통과액 중에 잔존하는 조건 하에서의 이온 교환 크로마토그래피.

본 발명의 일 실시 양태에서, 가용화제(및 다른 불순물)을 하기 단계들 중 1개 이상의 단계에 의해 제거하는 방법이 제공된다:

ii) 산 침전.

ii) 산 침전, 및/또는

iii) 가용화제가 수지에 결합되고 G-CSF가 통과액 중에 잔존하거나, 그 반대인, G-CSF가 수지에 결합되고 가용화제가 통과액 중에 잔존하는 조건 하에서의 이온 교환 크로마토그래피.

바람직한 실시 양태에서, 가용화제(및 다른 불순물)은 하기 단계의 순차적인 적용에 의해 제거된다:

이온 교환 수지 흡착

이온 교환 수지 흡착을 이용하여 가용화제를 제거할 수 있다.

가용화제를 제거하는 제1 단계로서, 이온 교환 수지 흡착이 수행될 수 있다. 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 상기에 기술된 바와 같이, 가용화제, 예컨대 사르코실의 제거에 있어서, 1가지 방법으로는 도웩스(Dowex) 음이온 교환 수지(다우 케미칼즈(Dow Chemicals, 미국)에의 뱃치식 흡착, 바람직하게는 도웩스 1X4를 이용한 것이 있다(국제 특허 공개 제WO8910932호, 문헌[Lu 1992], 문헌[Heidari 2001]). 결합된 계면활성제를 포착하는 수지는 여과에 의해 제거된다. 도웩스 수지와 매우 유사한 제품으로는 바이오라드(Biorad)의 AG 수지(예컨대 AG-1X8)가 있으며, 이는 동일한 방식으로 사용될 수 있다.

상기에 기술된 방법은 용액 중에서 하전되는 모든 가용화제에 적용된다. 많은 계면활성제는 친양쪽성이며, 다른 것은 음이온성 또는 양이온성이다. 가용화제의 종류 및 용액의 pH 값에 따라, 전하는 양전하 또는 음전하일 수 있다. AEX 물질, 예컨대 도웩스 또는 AG-1의 사용은 음으로 하전되는 가용화제, 예를 들어 사르코실 또는 SDS에 의존한다. 이와는 대조적으로, 수지의 유형의 선택에 따른 이온 교환 크로마토그래피는 음으로 하전된 또는 양으로 하전된 가용화제 둘 모두에 결합할 수 있다. 음으로 하전된 가용화제는 AEX 수지에 결합하지만 CEX 수지에는 결합하지 않는다. 양으로 하전된 에이전트는 반대로 거동한다. 예를 들어, 양이온성 지질, 세틸 트리메틸 암모늄 또는 아르기닌과 같은 에이전트는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있다. 가용화제 외에, 다른 오염물질도 상기 방법에 의해 적어도 부분적으로 제거된다. 이들 다른 오염물질/불순물은 공정 관련 불순물, 예컨대 숙주 세포 단백질(HCP), DNA/RNA, 내독소(예를 들어, LPS), 산화제(예를 들어, Cu² ⁺), 공정 관련 화학물질(예를 들어, EDTA), 및 생성물 관련 불순물, 예컨대 응집체를 포함할 수 있다.

일부 실시 양태에서, 가용화제는 뱃치식으로 AEX 수지에 흡착되는 음이온성 세제 또는 텐시드이다. 바람직하게는 세제 또는 텐시드는 사르코실이다. 일부 실시 양태에서, 사르코실은 분석 등급(AG) AEX 수지(바이오라드, 미국), 바람직하게는 AG 1-X 시리즈의 수지에 흡착되며, 가장 바람직하게는 수지는 AG 1-X8이다. 일부 실시 양태에서, 수지는 일회용 재료로서 사용된다.

바람직한 실시 양태에서, AG 1-X를 이용한 가용화제의 뱃치식 흡착은 알칼리 pH, 우선적으로는 약 pH 8을 갖는 완충제에서 수행된다. 적합한 완충제 시스템은 포스페이트, 카르보네이트, 보레이트, 트리스, HEPES, MOPS, HEPPS, EPPS, CAPS, CAPSO, CHES, TES, BES, TAPS, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트리신, 비신, 아세트아미도글리신, 글리신아미드 또는 다른 생체적합성 완충제 물질로서 pKa가 7 초과인 것을 기반으로 할 수 있다. 흡착에 바람직한 완충제는 트리스-HCl/pH 8, 우선적으로 20 mM 트리스-HCl/pH 8이다. 가장 바람직한 것은 트리스-HCl/pH 8 + 1 mM EDTA이다.

바람직하게는 AG 1-X8의 양은 사르코실 1 g당 건조 수지 10-60g이며, 가장 바람직하게는 사르코실 1 g당 건조 수지 20 g이다. 일부 실시 양태에서, 처음의 사르코실 농도는 0.5%이다.

바람직한 실시 양태에서, 이온 교환 수지 흡착 단계에서는 90% 초과, 95% 초과, 더 바람직하게는 96% 초과, 더 바람직하게는 97% 초과, 더 바람직하게는 98% 초과, 더 바람직하게는 99% 초과, 더 바람직하게는 99.2% 초과, 더 바람직하게는 99.3% 초과, 더 바람직하게는 99.4% 초과, 더 바람직하게는 99.5% 초과, 더 바람직하게는 99.6% 초과, 더 바람직하게는 99.7% 초과, 더 바람직하게는 99.8% 초과, 더 바람직하게는 99.9% 초과의 가용화제가 제거된다. 바람직한 실시 양태에서, 가용화제는 사르코실이다. 일부 실시 양태에서, 이온 교환 수지 흡착 단계에서는 AG 1-X8의 뱃치식 흡착에 의해 95% 초과의 사르코실; 더 바람직하게는 99% 이상의 사르코실이 제거된다. 일부 실시 양태에서, 포착된 사르코실을 갖는 AG 1-X8 수지는 여과에 의해 용액으로부터 분리된다. 바람직하게는 여과 단계는 100 μm 스테인리스강 메시를 이용한다. 더 바람직하게는, 여과 단계는 100 μm의 나일론 백 필터 메시를 이용한다.

이온 교환 수지 흡착 단계에 의해 가용화제가 충분히 완전하게 제거되지 않을 경우, 추가의 정제 단계, 예컨대 산 침전 및/또는 이온 교환 크로마토그래피가 뒤따를 수 있다.

산 침전

임의로, 산 침전 단계를 수행하여 다른 잠재적인 오염물질을 제거할 수 있다. 놀랍게도, 본 발명자는 간단한 산 침전에 의해 상당한 부분의 오염물질이 용이하게 제거될 수 있음을 알아냈다. G-CSF, 특히 필그라스팀은 산성 pH에서 최상의 용해성 및 안정성을 갖는 것으로 공지되어 있으며, 심지어, pH를 등전점(필그라스팀의 pI = 5.65) 미만으로 감소시킴에 의해서도 여전히 용해성인 채로 있다. 오염물질의 산 침전은 pH를 6.5 내지 6.0, 6.0 내지 5.5, 5.5 내지 5.0, 5.0 내지 4.5, 4.5 내지 4.0, 4.4 내지 3.5, 3.5 내지 3.0 등의 값으로 저하시킴으로써 수행될 수 있다.

잔여 가용화제의 존재에도 불구하고, 본 발명자는 우레아의 첨가가 상기 침전 공정에 추가의 유익한 영향을 미칠 수 있음을 알아냈다. pH 값을 감소시킴으로써, G-CSF의 비특이적인 그리고 원하지 않는 동시침전이 때때로 일어날 수 있으며, 이는 최종 수율에 있어서 요망되지 않는 손실에 이르게 될 수 있다. 본 발명자는 이러한 결점이 pH 조정 전에 용액에 첨가되는 우레아의 변성 농도 미만의 농도(sub-denaturing concentration)의 사용에 의해 극복될 수 있음을 알아냈다. 우레아는 G-CSF의 동시침전을 효과적으로 방지한다. 이 단계의 최적화는, pH를 아세트산 또는 아세트산나트륨을 이용하여 서서히 그리고 꾸준히 저하시킴으로써 최상의 결과를 나타냈다. 5.0 미만의 pH의 값은 이미 효과적이었다. 약 1 M인 꽤 낮은 농도의 우레아가 충분하다.

일부 실시 양태에서, 산성 침전 이전의 잔여 사르코실의 농도는 0.01 내지 0.04 mg/ml이다.

일부 실시 양태에서, pH 값은 진한 아세트산나트륨 또는 아세트산의 첨가에 의해 저하된다. 바람직한 실시 양태에서, pH 값은 pH 5.0 미만으로, 바람직하게는 4.8 미만으로, 가장 바람직하게는 pH 4.3-4.5로 저하된다. 일부 실시 양태에서, 산성화는 우레아, 바람직하게는 3 M 미만의 농도의 우레아, 가장 바람직하게는 1 M의 우레아의 존재 하에 수행된다. 일부 실시 양태에서, 침전물은 심층 여과에 의해 제거된다.

이온 교환 크로마토그래피

이온 교환은 가용화제의 제거에 또한 사용될 수 있다. 가용화제를 제거하는 단계는 1개 이상의 이온 교환 단계를 포함할 수 있다.

이온 교환 수지 흡착의 사용(산 침전을 이용하거나 이용하지 않음)이 가용화제를 완전히 제거하지 못하였을 경우, 1개 이상의 이온 교환 크로마토그래피 단계(들)가 가용화제의 완전한 제거를 위하여 수행될 수 있다. 이온 교환 단계(들)는 AEX 및/또는 CEX를 임의의 순서로 포함할 수 있다. 임의의 적합한 이온 교환 기술이 사용될 수 있다.

G-CSF의 정제를 위한 이온 교환 크로마토그래피의 사용은 종래 기술에 개시되어 있다. 많은 공정은 AEX 및 CEX, 또는 둘 모두의 방법을 임의의 순서로 이용하거나, IEX 단계를 다른 크로마토그래피법, 예컨대 HIC, IMAC, SEC 또는 RP-HPLC와 조합하여 이용한다(배경기술 참조).

사로크실과 관련하여, 본 발명자는 AEX 뱃치식 흡착 및 산 침전 후에 낮은 농도의 잔여 사르코실이 잔존할 경우 이것은 후속적인 이온 교환 단계에 의해 완전히 제거될 수 있음을 알아냈다.

본 발명자는 산성 침전 단계 후, G-CSF가 상청액 중에 잔존하며 pH가 그의 pI 미만임을 알아냈다. 이러한 pH 조건 하에서 G-CSF는 양이온성이며, CEX에는 결합하지만 AEX 수지에는 결합하지 않는다. 이는 실험에 의해 확인되었다.

일부 실시 양태에서, 이온 교환 단계는 AEX, 이어서 CEX를 포함한다. AEX가 비결합 모드(통과액 중 G-CSF)로 사용될 수 있는 반면 오염물질, 예컨대 잔여 가용화제 또는 DNA는 수지에 결합한다는 발견은, 본 발명의 일 실시 양태로서, AEX, 이어서 CEX의 순서로 시리즈로 커플링된 두 컬럼의 탠덤(tandem) 단계를 본 발명자가 개발하는 것을 촉발하였다. AEX 수지의 일차적인 기능은 잔여 사르코실에 결합하는 것이며, CEX 수지의 일차적인 기능은 단지 완충제 교환이다(제2 재폴딩에 대한 준비). 제1 컬럼을 통과한 G-CSF는 그 후 제2 수지에 결합하며, 상기 단백질은 적합한 방법에 의해 CEX 컬럼으로부터 용출될 수 있다. 이러한 방법은 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다. 결합된 G-CSF의 탈리를 위한 용출 방법은 단계식 용출 또는 구배식 용출 중 어느 하나에 의한 염 농도의 증가를 포함할 수 있거나, 대안적으로, G-CSF의 용출은 예를 들어 pH 값을 pI보다 높게 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 또, 이는 단계식 용출에 의해 또는 pH 구배에 의해 달성될 수 있다. pH 단계식 용출이 적용될 경우, 이것은 신속한 완충제 및 pH 교환에 대한 가능성을 추가로 제공한다.

적합한 작용기가 폴리펩티드의 크로마토그래피에 사용되는 AEX 수지에 대하여 공지되어 있다. 이들 기는 디에틸아미노에틸(DEAE), 트리메틸아미노에틸(TMAE), 4차 아미노에틸(Q), 및 4차 아미노에틸(QAE)을 포함한다. 이들은 바이오크로마토그래피 공정에 일반적으로 사용되는 작용성 음이온 교환 기이다. 적합한, 상업적으로 입수가능한 제품은 예를 들어 마크로-프렙 하이(Macro-Prep High) Q, 마크로-프렙 DEAE, 누비아(Nuvia) Q(바이오라드, 미국), 토요펄(TOYOPEARL) DEAE-650, 토요펄 수퍼Q(SuperQ)-650, 토요펄 QAE-550(토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience), 일본), 프락토겔(Fractogel) EMD DEAE, 프락토겔 EMD TMAE(머크(Merck), 독일), 바이오세프라(Biosepra) Q 세라믹 하이퍼D(Ceramic HyperD), 바이오세프라 DEAE 세라믹 하이퍼D(폴 코포레이션(Pall Corporation), 미국), DEAE-세파로스 FF, DEAE-세파로스 CL-4B, Q-세파로스 FF, Q-세파로스 CL-4B, Q-세파로스 HP, Q-세파로스 XL, Q-세파로스 빅 비즈(Big Beads), QAE-세파덱스, DEAE-세파덱스, 캅토(Capto) DEAE, 캅토 Q, 캅토 Q 임프레스(ImpRes), 소스(Source) 15Q, 소스 30Q, 및 DEAE 세파셀(Sephacel)(지이 헬스케어(GE Healthcare), 미국)을 포함한다.

바람직한 실시 양태에서, AEX 수지는 DEAE이다. DEAE는 고전적인 약음이온 교환 기이며, 이는 본 발명자의 실험에서 탁월한 해상도 및 빠른 평형 프로파일을 나타냈다.

CEX 수지에 사용되는 적합한 작용기는 카르복시메틸(CM), 술포네이트(S), 술포프로필(SP) 및 술포에틸(SE)을 포함한다. 이들은 생물크로마토그래피 공정에 일반적으로 사용되는 양이온 교환 작용기이다. 적합한 상업적으로 입수가능한 제품은 예를 들어 마크로-프렙 하이 S, 마크로-프렙 CM, 누비아 S(바이오라드, 미국), 토요펄 CM-650, 토요펄 SP-650, 토요펄 SP-550(토소 바이오사이언스, 일본), 프락토겔 EMD COO-, 프락토겔 EMD SO3-(머크, 독일), 바이오세프라 CM 세라믹 하이퍼D, 바이오세프라 S 세라믹 하이퍼D(폴 코포레이션, 미국), CM-세파로스 FF, SP-세파로스 FF, S-세파로스 FF, SP-세파로스 HP, SP-세파로스 XL, SP-세파로스 빅 비즈, CM-세파덱스, 캅토 S, 캅토 SP 임프레스, 소스 15S, 소스 30S(지이 헬스케어, 미국)를 포함한다.

바람직한 실시 양태에서, CEX 수지는 작용기로서 SP를 갖는 수지이다. SP는 고전적인 강한 양이온 교환 기이며, 본 발명자의 실험에서 우수한 해상도, 빠른 평형 및 탁월한 재현성을 제공하였다.

따라서, 본 발명의 일부 실시 양태에서, 가용화제의 제거(및 산화제의 제거 및 다른 오염물질의 제거)에 사용되는 AEX 크로마토그래피는 비결합 모드로 수행되며, 생성된 통과액은 임의의 확대 없이, 후속 컬럼 상에 직접적으로 러닝된다.

바람직한 실시 양태에서, 2개의 컬럼(AEX+CEX)은 직접적으로 연결되어 있으며, G-CSF는 CEX 수지에 결합한다.

본 발명의 일부 실시 양태에서, AEX 수지는 약음이온 교환자이며, 바람직하게는 DEAE 작용기를 지닌다. 가장 바람직하게는, 상기 수지는 DEAE 마크로-프렙(바이오라드, 미국)이다.

일부 실시 양태에서, 샘플 로드는 5 미만의 pH 값, 바람직하게는 pH 4.3-4.5에서, 가장 바람직하게는 pH 4.5의 아세트산나트륨 완충제 중에서 수행된다.

본 발명의 일부 실시 양태에서, CEX 수지는 강양이온 교환자이며, 바람직하게는 SP 작용기를 지닌다. 가장 바람직하게는, 상기 수지는 토요펄 SP-650(토소, 토키오)이다.

바람직한 실시 양태에서, CEX 수지로부터의 G-CSF의 용출은 용출 완충제 중에서 pH 값의 증가에 의해 수행된다. 더 바람직하게는, 용출은 pH 단계적 구배를 이용하여 수행된다.

일부 실시 양태에서, CEX 용출 완충제는 알칼리 pH, 바람직하게는 pH 8을 가지며, 가장 발마직하게는 용출 완충제는 20 mM 트리스-HCl/pH 8이다.

가장 바람직한 실시 양태에서, DEAE 마크로-프렙 컬럼은 토요펄 SP-650 컬럼에 직접적으로 연결되며, 샘플 로드는 pH 4.5의 아세트산나트륨 완충제 중에서 수행되었으며, G-CSF의 용출은 pH 8의 트리스-HCl 완충제를 사용하여 pH 단계적인 것에 의해 수행되었다.

본원에 기술된 방법의 일부 실시 양태에서, 가용화제 및 다른 불순물은 하기 단계의 순차적 적용에 의해 제거된다:

a) AEX,

b) 산 침전,

c) AEX, 및

d) CEX.

단계 a)에서, 가용화제는 음이온 교환 수지에 결합한다. 수지 물질은 여과에 의해 제거될 수 있다.

단계 b)에서, pH는 pH 5 미만, 예를 들어 4와 5 사이일 수 있다. 침전물은 여과에 의해 제거될 수 있다.

단계 c)에서, 잔여 가용화제는 수지에 결합한다. G-CSF는 통과액 중에 잔존한다.

단계 d)에서, G-CSF는 수지에 결합한다. 잔여 가용화제는 통과액 중에 잔존한다.

이것 후에, 결합된 G-CSF, 또는 이의 기능성 변이체를 단계식 또는 구배식 용출에 의해 CEX 수지로부터 용출시키는 단계가 이어질 수 있다. 용출 환충제는 증가된 pH 또는 염 농도를 가질 수 있다. 증가된 pH는 단계 b)에서보다 더 높은 pH, 즉, 5 초과 또는 6 초과 또는 7 초과의 pH를 의미한다.

제2 재폴딩(폴딩의 완료)

이미 언급된 바와 같이, 놀랍게도, 단량체형의 용해성 활성 G-CSF의 수율은 제2 사이클의 재폴딩이 수행될 때 유의하게 증가될 수 있음이 관찰되었다. 실험에 의하면, "고전적" 사르코실/CuSO₄ 방법을 이용하여 수득된 G-CSF는 완전히 재폴딩되는 것은 아님이 제안되었다.

제2 재폴딩 단계는 부분적으로 재폴딩된 G-CSF를 희석시키고 그 후 인큐베이션하는 것을 포함한다.

희석에 바람직한 용매는 저 전도도 완충제 또는 더 바람직하게는 물이다. 희석은 5배, 또는 4배, 또는 3배 또는 바람직하게는 2배 희석일 수 있다. 저 전도도는 적어도 2 mS/cm 미만, 더 바람직하게는 1 mS/cm 미만의 전도도를 의미한다. 적합한 완충제 시스템은 예를 들어 10 mM 트리스 이하의 농도의 트리스/HCl이며, 이때 pH 값은 7 초과이다. 상기 저 전도도 및 pH를 갖는 다른 완충제가 또한 사용될 수 있다.

어떠한 이론에도 구애되지 않고서, 본 발명자는 본 발명자는 하기와 같은 관찰을 하였다. 종래 기술(문헌[Lu 1992])에 공지된 바와 같이, G-CSF의 제2 디술피드 가교체의 형성은 상대적으로 느린 동역학적 특성을 갖는다. 환원된 자유 시스테인 모이어티를 지닌 완전히 재폴딩된 것은 아닌 중간체는 응집 및/또는 침전의 위험이 있다(문헌[Rudolph 1990], 문헌[Rudolph 1996]). G-CSF의 경우, Cu² ⁺ 농도 및 온도에 따라, 쌍을 형성하지 않은 3개의 시스테인을 갖는 중간체가 꽤 긴 시간 동안 존재할 수 있다(문헌[Lu 1992]). 응집 및 침전은 여과 및 크로마토그래피 단계 동안 G-CSF의 손실을 야기한다. 본 발명자는 향상된 폴딩 효능이 하류 공정에서의 수율을 증가시킬 수 있다는 가설을 세웠다. 본 발명자는 제2 재폴딩 단계가 상기 수율을 향상시킴을 알아냈다.

놀랍게도, 본 발명자는 약알칼리 pH에서의 제2 재폴딩 단계 동안의 인큐베이션이 유익함을 알아냈다.이는 G-CSF, 특히 필그라스팀이 그의 pI(5.65) 초과의 pH 값에서 더욱 적은 용해성 및 안정성을 갖는 상대적으로 소수성인 단백질이라는 사실을 보면 특히 놀라운 것이다. 최상의 용해성 및 안정성은 pH 4 이하의 산성 환경에서 있다. 따라서, 고전적 정제 절차, 예컨대 크로마토그래피는 더욱 낮은 pH 값, 바람직하게는 pH 4-5.5에서 아세테이트 완충제 중에서 수행된다. 이와는 대조적으로, 본 발명자는 알칼리 pH에서의 인큐베이션이 수율 증가를 추가로 용이하게 함을 알아냈다. 본 발명자는 산화제의 부재 하에서의 알칼리 pH가 술프히드릴의 완전한 산화에 중요하며 따라서 G-CSF의 둘 모두의 천연 디술피드 가교체의 형성에 중요하다고 간주한다.

따라서, 제2 재폴딩 단계는 알칼리 pH, 즉, 7 이상의 pH에서 수행될 수 있다. pH는 7 초과일 수 있다. 제2 재폴딩 단계는 7 내지 10, 또는 7 내지 9, 또는 7 내지 8.5, 또는 7 내지 8, 또는 7.5 내지 10, 또는 7.5 내지 9, 또는 7.5 내지 8.5의 pH에서 또는 약 8의 pH에서 또는 8의 pH에서 수행될 수 있다.

제2 재폴딩 단계의 인큐베이션은 가용화제의 부재 하에 수행된다.

바람직한 실시 양태에서,

제2 재폴딩 단계는 예를 들어 하기 완충제 중 1가지의 완충제에서 수행될 수 있다: 포스페이트, 카르보네이트, 보레이트, 트리스, HEPES, MOPS, HEPPS, EPPS, CAPS, CAPSO, CHES, TES, BES, TAPS, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트리신, 비신, 아세트아미도글리신, 글리신아미드 또는 다른 생체적합성 완충제 물질로서 pKa가 7 초과인 것. 제2 재폴딩 단계에 바람직한 완충제는 트리스-HCl/pH 8, 우선적으로 10 mM 트리스-HCl/pH 8이다.

제2 재폴딩 단계는 예를 들어 잔여 세제의 낮은 농도, 예컨대 0.01 mg/ml 이하에서 수행될 수 있다.

제2 재폴딩 단계는 예를 들어 0.02 mol/l 이하의 용액 중 이온 강도에서 수행될 수 있다.

제2 재폴딩 단계는 예를 들어 0-20℃, 또는 2-8℃, 또는 2-5℃의 온도 범위에서 수행될 수 있다.

제2 재폴딩 단계는 예를 들어 24시간 이상, 또는 24시간 초과, 또는 30-48시간, 또는 32-42시간의 인큐베이션 기간 동안 수행될 수 있다.

제2 재폴딩 단계는 용액 중에서 저 전도도에서, 예컨대 0.1-2 mS/cm, 또는 0.2-1.5 mS/cm, 또는 0.5-1.0 mS/cm에서 수행될 수 있다.

제2 재폴딩 단계는 냉각 하에 수행될 수 있다.

제2 재폴딩 단계는 연속 교반 하에 수행될 수 있다.

이들 파라미터 중 1가지 이상이 본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있다.

일부 실시 양태에서, 부분적으로 정제된 G-CSF가 재폴딩의 완료에 사용되며, 이때 우선적으로 순도는 약 80-90%이다.

바람직하게는 재폴딩은 냉각된 조건 하에서 12시간 초과의 시간 동안 저 전도도 완충제 중에서 부분적 재폴딩 G-CSF의 인큐베이션에 의해 완료된다.

바람직하게는 재폴딩의 완료는 2 mS/cm 미만의 전도도에서 수행되며; 가장 바람직하게는 전도도는 1 mS/cm 미만이다.

일부 실시 양태에서, 재폴딩의 완료는 7 초과의 pH 값, 바람직하게는 (약) pH 8에서 수행된다.

제2 폴딩 인큐베이션용 완충제는 10 mM 트리스-HCl, 바람직하게는 (약) pH 8의 것일 수 있다.

일부 실시 양태에서, 제2 폴딩을 위한 인큐베이션은 냉각된 조건 하에서, 우선적으로 2-8℃에서 수행된다.

바람직한 실시 양태에서, 제2 폴딩의 인큐베이션 시간은 12시간 초과, 더 바람직하게는 24시간 초과, 가장 바람직하게는 32-42시간이다.

다양한 최적화 실험을 기반으로 하면, 폴딩(제2 재폴딩)의 완료에 특히 바람직한 조건은 표 I에 "제2 재폴딩" 컬럼 하에 나타낸 것이다.

최종 정제(폴리싱 단계(들))

상기에 기술된, 제1 및 제2 재폴딩 단계의 조합은 단량체형 활성 G-CSF의 수율을 증가시킨다.

임의로, 그리고 수득된 G-CSF의 의도된 용도에 따라, 후속적인 하류 공정, 예컨대 1개 이상의 폴리싱 단계(들)가 수행될 수 있다. 본원에 기술된 방법은 1개 이상의 폴리싱 단계(들)를 추가로 포함할 수 있다. 폴리싱 단계(들)는 제2 재폴딩 단계 후 재폴딩된 G-CSF의 추가의 정제로 이어진다.

후속적인 하류 공정(폴리싱)은 AEX 및 CEX 크로마토그래피, 또는 G-CSF 폴리싱/정제를 위하여 당업계에서 사용되는 다른 방법, 예컨대 HIC, IMAC, SEC 또는 RP-HPLC의 이용을 포함할 수 있다(배경기술 섹션의 참고 문헌 참조). 폴리싱 단계(들)는 또한 이들 방법 중 2가지 이상의 방법의 조합을 포함할 수 있다.

제2 폴딩 단계 후, G-CSF의 순도는 전형적으로 80-90%이다(표 III). 이는 의약품 품질에 따르지 않는 것이다. 생성물이 활성 의약품 성분으로 사용되어야 할 경우, 1개 이상의 추가의 폴리싱 단계를 수행하여 요망되는 순도를 달성한다. 이러한 폴리싱 단계는 숙주 또는 공정에서 생기는 잔여 오염물질을 제거한다. 게다가, 임의의 생성물 관련 물질 및 관련 불순물이 제거된다.

AEX

하류 폴리싱은 1개 이상의 AEX 단계(들)를 포함할 수 있다. 폴리싱 단계는 AEX를 포함할 수 있다.

당업자라면 적합한 AEX를 선택할 수 있다. 수지의 선택은 요망되는 분리 성능, 공정 시간, 세정의 강함(cleaning robustness), 재현성, 결합능, 로트마다의 일관성(lot-to-lot consistency), 및 전반적인 경제 상황 등을 바탕으로 하여 이루어질 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 작용기 DEAE가 사용된다. 당업자라면, 작용기 외에 AEX 수지의 골격의 성질 뿐만 아니라 비드의 크기도 고려될 필요가 있음을 알고 있다. 특히 바람직한 실시 양태에서, 메타크릴레이트 유도체를 기반으로 하는 매트릭스(예를 들어, 마크로-프렙^® 및 토요펄^®)가 사용된다. 이러한 매트릭스는 특히 우수한 해상도 및 재현성을 나타냈다. 메타크릴레이트 물질은 예를 들어 빈번하게 사용되는 가교결합된 아가로스 매트릭스(예를 들어, 세파로스^®)보다 더 강성이며 더 우수한 수명 주기를 갖는다. 이제 AEX는 (가용화제의 이전의 제거 단계와는 대조적으로) 결합 모드로 사용될 수 있기 때문에, 단계식으로 또는 구배식으로 염 농도를 증가시킴으로써 또는 단계식으로 또는 구배식으로 용출 완충제의 pH를 감소시킴으로써 제공되는 선택적 용출 조건이 사용될 수 있다.

AEX 수지 물질은 상기에 논의되었다.

당업자라면 이전에 사용된 조건, 예컨대 완충제 등에 따라 적절한 하류 폴리싱 방법을 선택할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시 양태에서, 제2 재폴딩 단계는 약 pH 8에서 저 전도도 완충제 중에서 수행된다. 이는 결합 모드의 AEX 폴리싱 단계에 있어서의 이상적인 초기 상황이며, 요망될 경우, 완충제가 저 pH 완충제로 용이하게 교환되게 하고 오염물질이 추가로 제거되게 하며, 여기서, G-CSF는 더욱 큰 용해성 및 더욱 큰 안정성을 갖는다.

CEX

하류 폴리싱은 1개 이상의 CEX 폴리싱 단계(들)를 포함할 수 있다. 폴리싱 단계는 CEX를 포함할 수 있다.

AEX 단계에 대한 대안으로서(또는 AEX 단계 외에), CEX 크로마토그래피가 효율적인 폴리싱 단계로서 또한 사용될 수 있다. 이 방법에 있어서, 샘플 로딩 이전에 5.5 미만의 pH로의 pH 수정이 결합 모드의 크로마토그래피의 허용에 요구되는데, 이는 충분한 단백질 분리에 중요하다. 작용성 양이온 교환 기 및 매트릭스는 AEX에 대하여 언급된 것과 동일한 기준에 따라 선택될 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 메타크릴레이트 골격 상의 SP 및 CM 작용기(토요펄^®, 마크로-프렙^®)가 사용된다. 특히 바람직한 실시 양태에서, 토요펄 CM-650이 사용되며, 더 바람직하게는 토요펄 SP-650이 사용된다.

CEX 수지 물질은 상기에 언급되었다.

일단 CEX 수지에 결합되면, G-CSF는 단계식으로 또는 구배식으로 염 농도를 증가시킴으로써 또는 단계식으로 또는 구배식으로 용출 완충제의 pH를 증가시킴으로써 선택적 조건에 의해 용출될 수 있다.

당업자라면 크로마토그래피의 해상도를 최적화하는 방법을 알고 있다.

일부 실시 양태에서, 1개의 크로마토그래피 단계, AEX 또는 CEX가 G-CSF 생성물의 요망되는 품질의 달성에 충분하다.

다른 실시 양태에서, 하류 프로세싱(processing)은 2개 이상의 폴리싱 단계를 포함한다. 예를 들어, 폴리싱은 2개 이상의 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있다. 따라서 요망되거나 필요할 경우, 2개 이상의 이온 교환 폴리싱 단계가 수행될 수 있다. 2개의 폴리싱 단계를 사용할 경우, AEX, 이어서 CEX를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 경우, 상기 둘 모두의 단계는 결합 모드로 수행된다. 이 순서의 1가지 이점은 G-CSF가 결국에는 산성 pH에서 수득된다는 것인데, 이는 예를 들어 농축된 G-CSF의 장시간 보관을 허용한다. 2개의 IEX 폴리싱 단계의 사용은 특히 높은 순도로 이어지는 것으로 입증되었다(표 IV).

하류 폴리싱 단계(들)는 G-CSF의 순도가 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.5%, 99%, 또는 99.5%가 되게 한다.

본 발명에 따른 순도의 계산에 있어서(실시예 13 참조), HPLC 크로마토그램을 사용하였으며, 이는 주 피크에 대하여 적분되었다(면적). 임의의 잔존 "불순물"은 소위 "생성물 관련된 불순물"이며, 이는 상기 불순물이 변형, 예컨대 산화(상이한 화학종), 탈아미드화, 이량체화, 응집을 갖거나, 어느 정도까지만 구조적으로 명확하게 되지 않은 이성질체화를 갖는 G-CSF 분자임을 의미한다(표 IV). 물론, 이들 생성물 관련 물질은 단지 미량으로 존재한다. 마지막으로 정제된 G-CSF 제제에 있어서 "공정 관련된 불순물", 예컨대 HCP, DNA, 또는 박테리아 내독소는 단지 매우 낮은 ppm 수준으로 검출가능하거나 전혀 검출가능하지 않음이 주목된다(표 IV). 이러한 순도는 겉보기 균질도로서 다른 곳에 보고되어 있다. 순도를 측정하는 분석적 방법이 실시예 13에 개시되어 있다. 도 3은 정제된 G-CSF의 뱃치(도 3b)를, 기준물로서 사용되는, 상업적으로 구매된, EU 승인된 의약 제품(도 3a)과 비교한 SEC-HPLC 크로마토그램의 예를 나타낸다. 응집체의 자취가 주 피크로부터 좌측에 보인다. 주 피크로부터의 우측의 피크는 용매에 의해 야기된 것으로서, 불순물에 의해 야기된 것이 아니다. 이들 크로마토그램은 개시된 방법에 따라 정제된 충분한 품질의, 심지어 의약품 등급용으로 충분한 품질의 G-CSF를 분명히 보여준다.

본 발명의 일부 실시 양태에서, 완전히 재폴딩된 G-CSF는 추가로 정제되며, 이는 1가지 이상의 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다.

바람직하게는, 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피, 이어서 양이온 교환 크로마토그래피를 포함한다.

일부 실시 양태에서, 순도가 약 80-90%인 부분 정제된 G-CSF는 2개의 폴리싱 단계, AEX 및 CEX를 사용하여 95% 초과의 순도로 추가로 정제된다.

일부 실시 양태에서, AEX 단계 후에 CEX 단계가 이어진다. 바람직하게는, 상기 둘 모두의 단계는 결합 모드로 수행된다.

본원에 기술된 방법을 이용하여 G-CSF를 의약품 등급의 품질로 수득할 수 있다. 이러한 G-CSF 제제는 치료 응용에 적합하거나 후속 콘쥬게이션, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜과의 후속 콘쥬게이션을 위한 중간체로서 사용될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 G-CSF의 정제 방법을 제공한다. 이 방법은 본원에서 논의된 제1 재폴딩 단계와 제2 재폴딩 단계 사이의 가용화제의 제거에 또한 사용될 수 있다. 본원에 제공된 것은 봉입체로부터의 G-CSF의 정제 및/또는 봉입체로부터의 G-CSF의 가용화에 사용되는 가용화제의 제거 방법이며, 본 방법은 하기 단계를 포함한다:

e) G-CSF가 수지에 결합되는 조건 하에서 행해진 음이온 교환 크로마토그래피; 및

f) 감소된 pH 또는 증가된 염 농도를 갖는 용출 완충제를 이용한 단계식 또는 구배식 용출에 의한 결합 G-CSF의 용출; 및

g) G-CSF가 수지에 결합되는 조건 하에서 행해진 양이온 교환 크로마토그래피; 및

h) 증가된 pH 또는 염 농도를 갖는 용출 완충제를 이용한 단계식 또는 구배식 용출에 의한 결합 G-CSF의 용출.

"감소된/증가된 pH" 또는 "증가된 염 농도"는 용출에 사용된 완충제를 컬럼 평형화, 샘플 로딩 또는 세척용의 완충제와 비교한 것을 나타낸다.

AEX 및 CEX와 관련하여, 적합한 재료 및 조건이 상기에서 논의되었다. 바람직한 실시 양태에서, 본 방법은 음이온 및 양이온 교환 수지 둘 모두의 골격 중합체가 메타크릴레이트 유도체를 포함한다는 것을 특징으로 한다.

일부 실시 양태에서, AEX 수지의 작용기는 디에틸아미노에틸(DEAE) 기이다.

일부 실시 양태에서, CEX 수지의 작용기는 카르복시메틸(CM) 기이다.

일부 실시 양태에서, 음이온 및 양이온 교환 수지의 골격 중합체는 예를 들어 세파로스^®와 같이 가교결합된 아가로스를 포함하지 않는다.

바람직한 실시 양태에서, AEX 및/또는 CEX 음이온 및/또는 양이온 교환 수지의 골격 중합체는 메타크릴레이트 유도체를 포함한다.

더 바람직한 실시 양태에서, AEX 수지는 DEAE 마크로-프렙(바이오라드)이며 CEX 수지는 토요펄 CM-650(토소)이다.

일부 실시 양태에서, AEX 컬럼은 7 초과의 pH에서 저 전도도 완충제를 이용하여, 바람직하게는 10 mM 트리스-HCl/pH 8을 이용하여 평형화된다.

일부 실시 양태에서, G-CSF는 염 농도를 증가시킴으로써, 바람직하게는 구배애 의해, 가장 바람직하게는 선형 구배에 의해 AEX 컬럼으로부터 용출된다. 바람직하게는 용출은 트리스-HCl/pH 8 완충제 중에서 선형 NaCl 구배에 의해 수행된다.

일부 실시 양태에서, CEX 단계 이전에, AEX 컬럼으로부터 용출된 G-CSF의 pH 값은 조정되며, 바람직하게는 상기 pH는 5.5 미만의 pH, 가장 바람직하게는 (약) pH 4.5로 조정된다.

우선적으로, AEX 컬럼으로부터 용출된 G-CSF는 물로 2배 희석되며, pH는 50% 아세트산을 이용한 적정에 의해 (약) 4.5로 조정된다.

일부 실시 양태에서, CEX 컬럼은 5.5 미만의 pH 의 저 전도도 완충제를 이용하여, 바람직하게는 20 mM 아세트산나트륨/pH 5.3을 이용하여 평형화된다.

일부 실시 양태에서, G-CSF는 염의 증가에 의해, 바람직하게는 구배에 의해, 가장 바람직하게는 선형 구배에 의해 CEX 컬럼으로부터 용출된다.

우선적으로, CEX 컬럼으로부터의 G-CSF의 용출은 pH 5.3에서 선형 아세트산나트륨 구배에 의해 수행된다.

바람직한 실시 양태에서, G-CSF는 도 2의 정제 방법에 개시된 순서의 단계에 따라 IB로부터 가용화되고, 재폴딩되고, 정제된다.

본 발명의 일부 실시 양태에서, 폴리싱 후 마지막으로 정제된 G-CSF는 겔 크로마토그래피에 의해, 바람직하게는 세파덱스 G-25를 사용하여 제형화된다.

일부 실시 양태에서, 제형화 완충제는 소르비톨 및 폴리소르베이트를 함유하며; 더 바람직하게는 제형화 완충제는 10 mM 아세트산나트륨/pH 4/5%(w/v) 소르비톨/0.006%(w/v) 폴리소르베이트 80을 포함한다.

도 1은 2단계 재폴딩 방법을 도시하며, 이의 임의적 하류 폴리싱 단계는 생물학적 활성 G-CSF의 제조를 위한 것이다. 추가의 상세 사항이 실시예에 개시되어 있다.
도 2는 바람직한 실시 양태, 즉, G-CSF 함유 봉입체에서 시작하여 완전히 재폴딩되고 정제된 G-CSF에 이르게 되는 단계의 순서를 개시한다. 추가의 상세 사항이 실시예에 개시되어 있다.
도 3은 기준물로서 사용되는 상업적으로 입수가능한 필그라스팀 약물 제품(도 3a) 및 도 2에 요약된 순서에 따라 정제된 생성물(도 3b)의 순도 분석으로부터의 SEC-HPLC 크로마토그램을 비교한 것이다. 본 방법의 추가의 상세 사항이 실시예에 상세하게 기술되어 있다.
표의 간단한 설명
표 I은 2개의 재폴딩 단계에 바람직한 조건을 열거한다. 제1 재폴딩 인큐베이션에서의 농도는 가용화된 G-CSF를 물로 2배 희석한 것에서 생긴다. 제2 재폴딩 인큐베이션에는 제1 재폴딩으로부터의 시약인 사르코실 및 CuSO₄가 없다. 추가의 상세 사항이 실시예에 언급되어 있다.
표 II는 세척되고 냉동된 650 g의 봉입체에서 시작하여 3회의 생성 실행(run)의 순도 및 수율을 나타낸다. 수율의 계산은 봉입체의 습윤 질량을 나타낸다. 최종 순도는 생성물 관련 물질(G-CSF 이성질체) 및 생성물 관련 불순물을 제외한 RP-HPLC에서의 주 피크 면적으로부터 계산된다. 추가의 상세 사항이 실시예에 언급되어 있다.
표 III은 G-CSF의 정제 동안 2가지의 선택된 공정 관련 불순물(사르코실, 내독소)의 값 및 총 순도의 값을 나타낸다. 범위는 상이한 분석 방법을 사용한 3가지의 G-CSF 생성 로트의 분석 결과를 나타낸다. 추가의 상세 사항이 실시예에 언급되어 있다.
표 IV는 3가지의 후속적인 G-CSF 생성 로트의 특정 불순물 및 생물학적 활성에 대한 상이한 방법의 분석 결과를 나타낸다. 데이터는 일상적인 뱃치 릴리스 테스트로부터 취해진다. 추가의 상세 사항이 실시예에 언급되어 있다.

실시예 1: 발효 및 발현

G-CSF(필그라스팀)를 재조합 이. 콜라이 C2523 T7 pol pRG/GCSFa 클론(G-CSF를 포함하는 발현 벡터로 형질전환시킨 이. 콜라이)을 이용하여 생성하였다. 무균 조건 하에서, 액체 질소 중에서 보관한 해동시킨 제조용 세포 은행 바이알로부터 수득한 0.10-0.15cm³의 세포 현탁액을 제조된 시드 배양 배지에 접종하였다. 접종된 시드 배양 플라스크를 37℃에서 185 rpm에서 24-28시간 동안 선회 진탕기 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 600 nm에서 6개의 진탕 플라스크 배양물의 광학 밀도(OD)의 평균 값이 0.9-1.1에 도달했을 때, 플라스크의 내용물을 실리콘 튜브를 갖춘 살균 5 dm³ 유리 플라스크 내에 수집하였다. 수집된 3 dm³ 부피의 시드 배양물을 WM323U/R 펌프를 이용하여, 살균 보충 생산 배지(GBA, 탄소원으로서 글리세롤을 포함하는 합성 배지)로 75 dm³까지 충전된 100 dm³ 발효기로 옮겼다. 37℃에서 액중 배양으로 엄격한 호기성 조건 하에서 배양을 수행하였다. 탄소원이 배지로부터 고갈되게 되었을 때, 글리세롤 공급 용액을 적절한 속도로 상기 배양물에 첨가하였다. 전체 배양 기간 동안 용존 산소 장력을 30% 이상의 수준으로 유지하였다. 배양물의 OD 값이 30에 도달하였을 때, 온도를 32℃로 감소시키고, 0.33 mM IPTG를 첨가하여 G-CSF의 발현을 유도하였다. 80-95의 OD까지 5시간 동안 박테리아를 추가로 배양하여 G-CSF를 생성하였다.

실시예 2: 박테리아의 수확

교반, 통기 및 탄소원의 공급을 중지하고, 배양물을 15℃ 미만으로 냉각시키고, 박테리아를 11000 g에서의 분리에 의해 수확하였다. 세포는 회전자에서 침강되었으며, 이를 물에 의해 세출하였다(배출하였다). 박테리아 세포 농축물을 수집하고, 물로 다시 그의 절반 부피로 희석시키고, 0.5 M NaH₂PO₄를 10 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 습윤 박테리아 세포의 총 질량(바이오매스)은 약 10-11.5 kg이었다.

실시예 3: 박테리아의 용해 및 봉입체의 제조

분리하고 세척한 박테리아를 균질화기에 3회 통과시킴으로써 가압(100 MPa) 하에 파괴하였다. 11000 g에서 분리기에서 침강시킴으로써 봉입체를 세포 잔사로부터 분리하였다. 침강된 봉입체를 5 mM DTT, 10 mM NaH₂PO₄, 5 mM EDTA, 및 2% 트윈 20(pH 7.2)을 함유하는 세척 완충제 중에 배출하였다. 진한 IB 현탁액을 동일 완충제로 2배 희석시키고, 다시 침강시켰다. 이러한 세척 절차를 희석 없이 제2 절차의 마지막에 10 mM NaH₂PO₄ 완충제를 사용하여 2회 반복하였다. IB의 최종 침강물을 -80℃에서 냉동 보관하였다.

실시예 4: 봉입체의 가용화

냉동된 봉입체(650 g의 습윤 질량)를 해동시키고, pH 8의 40 mM 트리스-HCl, 및 1%(w/v) N-라우로일사르코신(사르코실)을 함유하는 가용화 완충제 중에 32.5 dm³의 총 부피로 용해시켰다. 상기 현탁액을 연속 교반 하에 실온에서 인큐베이션하였다.

실시예 5: 산화적 재폴딩(제1 재폴딩)

가용화된 IB 현탁액을, 최종 농도로서 0.5% 사르코실 및 20 mM 트리스-HCl이 되도록 65 dm³의 총 부피로 물로 2배 희석시켰다. CuSO₄를 40 μM의 최종 농도로 첨가하였다. G-CSF를 연속 교반 및 상부 공간에서의 공기 유동 동안 실온에서 20시간 이상 동안 산화시키고 부분적으로 재폴딩시켰다. EDTA를 1 mM의 최종 농도로 첨가함으로써 산화를 종결시켰다.

실시예 6: AEX 뱃치식 흡착에 의한 사르코실의 제거

사르코실을 뱃치식으로 음이온 교환(AEX) 수지에 흡착시켰다. 사르코실 1 g당 20 g의 양의 AG 1-X8 수지(바이오라드(BioRad), 미국)를 상기 용액에 적용 및 첨가하였다. 상기 현탁액을 2시간 동안 교반시켜 대부분의 사르코실에 결합시켰다. 100 μm의 기공 크기의 나일론 백 필터 메시를 통한 여과에 의해 상기 수지를 제거하였다. 여과액 중 잔존 사르코실을 후속적인 정제 단계(실시예 7 및 실시예 8)에 의해 생성물로부터 완전히 제거하였다.

실시예 7: 산성 pH에서의 오염물질의 침전

pH 4.3-4.5에서의 산성 침전에 의해, 일부 불순물을 용이하게 제거한 반면, G-CSF는 용해성으로 잔존한다. G-CSF의 임의의 잠재적인 비특이적인 그리고 요망되지 않는 동시침전을 1 M의 최종 농도의 우레아의 첨가에 의해 방지하였다. 우레아를 6 M 원액에 의해 제공하였으며, 1 dm³/min의 속도로 실시예 6의 여과액에 서서히 첨가하였다. 후속적으로, 1/20의 부피의 pH 4.8의 1 M 아세트산나트륨의 첨가에 의해 상기 pH를 감소시켰다. 50% 아세트산으로 적정함으로써 상기 pH를 4.3-4.5로 추가로 저하시켰다. 1시간 이상 동안 침전시켰다. 그 후, 침전된 물질을 뎁스 필터(depth filter)(폴(Pall) K700/KS50 이중층)를 통한 여과에 의해 제거하였다.

실시예 8: 시리즈로 연결된 AEX + CEX 크로마토그래피에 의한 잔여 사르코실의 제거 및 완충제의 교환

50 mM/pH 4.5의 아세트산나트륨 완충제를 1) DEAE 마크로-프렙(바이오라드, 미국) AEX 수지가 패킹된(packed) 4 dm³ 컬럼, 및 2) 토요펄 SP-650C(토소, 일본) CEX 수지가 패킹된 8 dm³ 컬럼의 평형화에 사용하였다. 상기 둘 모두의 컬럼을

공정 크로마토그래피 시스템(지이 헬스케어, 스웨덴)에 평행 배열로 직접적으로 연결하였다. 0.2 ㎛ 살균 필터를 통한 클리어런스(clearance) 후, 실시예 7의 여과액을 제1 컬럼 상에 로딩하였다. 잔여 사르코실이 DEAE 수지에 결합된 반면, G-CSF는 여전히 결합되지 않은 채 있었고(비결합 모드) 제1 컬럼의 통과액 중에 나타났다. 이러한 통과액을 제2 컬럼(SP 수지) 상에 직접적으로 로딩하였는데, 이는 G-CSF에 결합하였다(결합 모드). 20 mM 트리스-HCl/pH 8을 이용한 간단한 단계의 용출은 G-CSF를 상기 수지로부터 탈리시켰다. 잔여 사르코실의 제거 외에, 아세트산나트륨/pH 4.5로부터 트리스-HCl/pH 8로의 완충제 교환을 이 방법에 의해 또한 달성하였다.

실시예 9: 제2 재폴딩(폴딩의 완료)

이 단계에서, 약 절반의 단백질 분획물의 폴딩이 완료된 반면, 잔존 단백질은 불완전하게 폴딩되거나 잘못 폴딩되었다(misfolded). G-CSF 용액을 pH 8의 20 mM 트리스-HCl 중 토요펄 SP-650C로부터 용출시키고, 0.2 μm 살균 필터에 통과시켜 스테인리스 강 용기 내에 넣었다. 여과시킨 용액을 물로 2배 희석시켰다. 단백질 폴딩을 위한 제2 인큐베이션(제2 재폴딩)을 2-8℃에서의 냉각 하에 32-42시간 동안 pH 8에서 저 전도도 환경(< 1 mS/cm)에서 실시하였다.

실시예 10: AEX 크로마토그래피에 의한 정제(폴리싱 단계 1)

컬럼에 DEAE 마크로-프렙(바이오라드, 미국)을 패킹시키고, 이를 10 mM 트리스-HCl/pH 8로 평형화하였다. 제2 재폴딩(실시예 9)에서 생긴 용액을 상기 DEAE 컬럼에 로딩하였다. 올바르게 폴딩된 G-CSF를 10 mM 트리스-HCl/pH 8 중의 0 mM로부터 200 mM까지의 증가하는 선형 NaCl 구배에 의해 용출시켰다. 용출된 G-CSF를 풀링하고(pooled), 물로 2배 희석시켰다. 50% 아세트산을 이용한 적정에 의해 pH를 4.5로 조정하였다.

실시예 11: CEX 크로마토그래피에 의한 정제(폴리싱 단계 2)

최종 폴리싱 단계를 위하여, 올바르게 폴딩된 단백질로 이루어진, AEX 크로마토그래피(실시예 10)로부터 수집한 G-CSF 풀을 토요펄 CM-650S 수지가 패킹된 CEX 컬럼 상에 직접적으로 적용하였다. 상기 컬럼을 pH 5.3의 20 mM 아세트산나트륨으로 평형화하였다. 결합된 G-CSF를, pH 5.3에서 24배의 컬럼 부피 내에서 20 mM로부터 400 mM까지의 아세트산나트륨의 증가하는 선형 염 구배에 의해 용출시켰다. 순수 G-CSF를 포함하는 분획물을 제형화용으로 수집 및 풀링하였다.

실시예 12: 겔 크로마토그래피에 의해 정제된 G-CSF의 제형화

CEX 컬럼으로부터 용출된 정제된 G-CSF(실시예 11)를 0.2 μm 살균 필터를 통하여 여과시키고, 제형화 완충제(10 mM 아세트산나트륨, pH 4, 5% 소르비톨, 및 0.006% 폴리소르베이트 80)로 평형화한, 세파덱스(Sephadex) G-25 미세 수지가 패킹된 14 dm³ 컬럼에 통과시켰다. 동일 완충제를 러닝 완충제로서 사용하였다. G-CSF는 제형화 완충제 중 공극 부피 내에 용출되었다. 전체 뱃치(35-48 g의 G-CSF)에 있어서, 러닝 각각이 여과 CEX 용출액의 1/3을 포함하는 세파덱스 G-25에서의 3회의 후속 제형 러닝을 수행하였다. 제형화된 G-CSF를 제형화 완충제를 이용한 희석에 의해 0.9-1.0 mg/ml의 농도로 조정하고, 마지막으로, 0.2 μm 살균 필터 캡슐을 통하여 여과하였다. 살균 용액으로 제형화된 G-CSF는 매우 안정하며, 수년간은 아니라 해도, 몇 달 동안은 2-8℃에서 보관될 수 있다.

실시예 13: 분석 방법

공지된 표준 분석 방법을 유럽 약전(European Pharmacopoeia; Ph. Eur.)에 따라 수행하였는데, 상기 유럽 약전은 특정 분석 방법을 기술한 필그라스팀에 대한 모노그래프를 포함한다(문헌[European Directorate for the Quality of Medicines & Health Care (EDQM) (2010): Filgrastim concentrated solution. European Pharmacopoeia 7.0, 2015-2018]). 기본적인 기술에 있어서, 상기 모노그래프는 유럽 약전 내의 다른 장(chapter)과 교차 참고된다. 상기 기술의 더욱 상세한 설명을 제공하는 이러한 구체적으로 언급된 장은 하기 실시예에서 꺾쇠 괄호 내에 인용되어 있다. 이용한 기준 표준물은 유럽 연합에 의해 의약용으로 승인된, 상업적으로 구매된 인가된 약물 제품(필그라스팀), 또는 이러한 상업적 기준물을 사용하여 보정된 사내(in-house) 표준물 중 어느 하나였다. 국제 단위(IU) 면에서의 상대적인 효력의 분석을 위하여, 세계 보건 기구(WHO)의 국제 G-CSF 표준물을 추가로 사용하였다. 순도, 특정 불순물, G-CSF 관련 단백질 및 생물학적 활성(효력)의 분석에 사용한 테스트 방법은 유럽 약전의 모노그래프를 단지 약간 변형한 것에 따라 적용하였다. 따라서, 하기에서, 당업계에 공지된 이러한 표준 분석 방법을 단지 간략하게 설명한다.

실시예 13.1: 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDDS-PAGE): 문헌[Ph. Eur. 7, 2.2.31]. SDS-PAGE를 사용하여 G-CSF의 분자 크기, 아이덴티티 및 순도를 결정하였다. 겔은 12%의 PA를 가졌으며, 소듐 도데실술페이트(SDS)를 포함한다. 상기 방법을 환원 및 비환원 조건 하에서 사용하였다. 겔을 사이프로 루비(Sypro ruby)로 염색하였다. 상대적인 분자 질량(Mr)을 계산하기 위하여, 규정된 질량을 갖는 마커 단백질의 패널을 사용하였다.

실시예 13.2 - 고성능 크기 제외 크로마토그래피(SEC-HPLC): 문헌[Ph. Eur. 7, 2.2.30]. SEC를 이용하여 필그라스팀(이량체, 응집체)의 분자 질량보다 더 큰 분자 질량을 갖는 불순물 또는 G-CSF 관련 물질을 검출하였다. 단백질의 검출은 UV 흡광도를 기반으로 하였다. 순도(주 피크) 및 불순물(이량체, 응집체)을 각각의 성분에 있어서의 활성 물질의 면적(%)으로 표현하였다. 테스트 결과를 반복 측정치의 평균으로부터 계산하였다. 도 3은 정제된 G-CSF의 뱃치(3B)를 기준 표준물(3A)과 비교한 SEC 크로마토그램의 예를 나타낸다. 응집체의 자취가 주 피크로부터 좌측에 보인다. 주 피크로부터의 우측의 피크는 용매에 의해 야기된 것으로서, 불순물에 의해 야기된 것이 아니다.

실시예 13.3 - 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC): 문헌[Ph. Eur. 7, 2.2.29]. RP-HPLC를 이용하여 G-CSF의 아이덴티티를 결정하고, G-CSF의 함량 및 순도를 계산하였다. 또한 상기 방법을 이용하여 생성물 관련 물질을 확인 및 정량화하였다. 단백질의 검출은 UV 흡광도를 기반으로 하였다. 관련 단백질 불순물을 활성 물질의 백분율(면적(%))로 표현하였다. 테스트 결과를 반복 측정치의 평균으로부터 계산하였다.

실시예 13.4 - 등전 집속 겔 전기영동(IEF): 문헌[Ph. Eur. 7, 2.2.54]. 이 방법을 이용하여, G-CSF와 상이한 전하를 갖는 불순물 또는 생성물 관련 물질(예를 들어, 탈아미드화 G-CSF)을 검출하였다. 양성전해질(ampholyte)을 기반으로 한 고정화된 pH 구배를 포함하는 폴리아크릴아미드 겔에서 분리를 실시하였다. 추가로, 각각의 단백질 밴드의 등전점(pI)을 규정된 pI를 갖는 마커 단백질 세트를 사용하여 계산하였다.

실시예 13.5 - 효소 결합된 면역흡착 검정법(ELISA): 이 방법을 이. 콜라이 숙주 세포 단백질(HCP) 수준의 정량적 측정에 사용하였다. 상업적으로 구매한 (일반) 면역효소적 검정 키트(사이그누스 테크놀로지즈(Cygnus Technologies), 번호: F410)를 사용하여 상기 테스트를 수행하였다. 마이크로타이터(microtiter) 스트립의 고체상을 친화성 정제된 폴리클로날 항-이. 콜라이 항체로 코팅하였는데, 상기 항체는 테스트 샘플로부터의 HCP를 포착하였다. 서양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)로 표지한 트레이서(tracer) 항-이. 콜라이 항체는 HCP에 동시에 결합하였으며, 생성된 샌드위치(sandwich)는 세척 절차를 견뎌냈다. 결합된 HCP, 각각의 HRP는 과산화수소의 존재 하에 기질인 테트라메틸벤지딘(TMB)의 산화에 의해 검출하였다. 광학 밀도를 ELISA 판독기로 측정하였다. 상이한 농도의 HPC 보정자(키트에 의해 제공됨)의 측정에 의해 수득된 보정 그래프를 이용하여 정량화를 수행하였다. 공급자의 지시에 따라 상기 방법을 정확하게 수행하였다. HCP 농도를 ng/ml 또는 ng/mg(ppm)의 단위로 표현하였다.

실시예 13.6 - 정량적 폴리머라아제 연쇄 반응(qPCR): 이 검정법을 이. 콜라이 숙주 세포 DNA의 결정에 사용한다. 상업적으로 입수가능한 키트를 적용하였는데, 이는 "resDNASEQ^TM 이. 콜라이 잔여 DNA 정량화 시스템"으로 표기되고, 이는 실시간 탁맨(TaqMan)^® qPCR 기술(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))을 기반으로 한다. 상기 방법은 DNA 오염의 검출에 있어서 매우 민감하고 특이적이다. 상기 검정법은 서열 특이적 프라이머(SSP) 및 형광 표지된 혼성화 프로브(탁맨^®)를 사용한 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의한 명확한 DNA 단편의 서열 특이적 증폭 및 실시간 형광 검출을 기반으로 한다. 기구류, 시약, 샘플링 및 소프트웨어 기반의 계산을 포함하는 전 방법을 공급자의 지시에 따라 수행하였다.

실시예 13.7 - 박테리아 내독소: 문헌[Ph. Eur. 7, 2.6.14, method C]. 그람 음성 박테리아의 내독소의 검출은 투구게(리물루스 폴리페무스(Limulus polyphemus))로부터의 변형세포(amoebocyte) 용해물을 기반으로 한 전세계적으로 맞추어진 표준 방법이다. 이러한 리물루스 테스트("LAL 테스트")를 유럽 약전에 따라 동역학적 비탁 기술(turbidimetric kinetic technique)(방법 C)을 이용하여 실시하였다. 그 결과를 국제 내독소 표준 BRP에 관련된 국제 단위(IU)로 표현하였다.

실시예 13.8 - 생물학적 활성(상대적인 효력)의 검정: 하기와 같이 변형시킨, 필그라스팀 모노그래프에 기술된 세포 기반 시험관내 증식 검정법으로 G-CSF 샘플의 생물학적 활성을 테스트하였다. 상기 생물검정법은 쥐과 골수아구 세포주에서 기원한 NFS-60 세포의 세포 증식의 변화의 비교를 기반으로 하였다. NFS-60 세포를 연속 희석시킨 테스트 샘플 및 기준 용액으로 동시에 처리하였다. NFS-60 세포의 증식은 G-CSF에 의해 유의하게 그리고 특이적으로 자극될 수 있다. 상기 세포의 번식을 마이크로테스트(microtest) 플레이트에서 72시간 동안 수행하였다. 생존성 세포에 의해 형광 염료 레소루핀으로 전환되는 기질인 레사주린(알라마르(alamar)^® 블루)을 사용하여 증식 효과를 검출하였다. 형광 신호는 고감도로 검출되었다. 용량 응답 곡선의 평행선 검정 계산을 통계학적 평가로서 사용하였으며, 이때 상기 곡선의 선형 부분에서의 3개의 점을 이용하였다. 허용 범위는 기준 용액과 비교하여 80% 내지 125%였다. 상대적인 효력을 국제 단위(IU)로 표현하였는데, 상기 국제 단위는 필그라스팀의 국제 WHO 표준물에 대하여 보정한 내부 표준물에 의해 정의되었다. 완전 활성형 순수 인간 G-CSF는 1.0 x 10⁸ IU/mg의 생물학적 비활성을 보유한다.

실시예 13.9 - 펩티드 지도화(mapping): 문헌[Ph. Eur. 7, 2.2.55]. 펩티드 지도화, 이어서 질량 분광(MS) 분석을 디술피드 가교체의 분석에 사용하였다. 펩티드 결합의 효소적 절단의 절차는 필그라스팀에 대한 유럽 약전의 모노그래프를 기반으로 하여 개발되었다. 절단에 사용한 프로테아제는 글루타밀 엔도펩티다아제(엔도Glu-C)였다. 인큐베이션을 37℃에서 24시간 동안 실시하고, 8 M GuHCl의 첨가 및 비등에 의해 중지하였다. 펩티드 지도화 절차를 환원 및 비환원 조건 하에서 수행하였다. 환원 및 비환원 조건에 있어서 펩티드의 MS 스펙트럼의 프로파일의 생성된 차이는 디술피드 결합의 위치를 입증한다. 완전히 폴딩된 온전한 G-CSF(필그라스팀)는 Cys37- Cys43 및 Cys65- Cys75 위치에 2개의 디술피드 가교체를 갖는 반면, 1개의 시스테인 잔기는 18 위치에서 자유롭다.

대안적으로, 단백질 분해적 소화 후 G-CSF 샘플로부터 수득된 펩티드를 RP-HPLC 시스템에서 분리하고 UV로 검출한다. 이 방법은, 테스트 용액에서 수득되는 핑거프린트 유사 크로마토그램을 기준 물질에서 수득되는 크로마토그램과 비교할 때 비교 데이터를 제공한다.

참고 문헌의 목록

표 I:

표 II:

표 III:

표 IV:

SEQUENCE LISTING <110> Richter Gedeon Nyrt. <120> METHODS FOR REFOLDING G-CSF FROM INCLUSION BODIES <130> HE 162 844 <150> HU P1200172 <151> 2012-03-19 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 174 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 1 5 10 15 Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln 20 25 30 Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val 35 40 45 Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys 50 55 60 Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser 65 70 75 80 Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser 85 90 95 Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp 100 105 110 Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro 115 120 125 Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 130 135 140 Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe 145 150 155 160 Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 165 170 <210> 2 <211> 174 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 2 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Arg Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 1 5 10 15 Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu Gln 20 25 30 Glu Arg Leu Cys Ala Ala His Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Met 35 40 45 Leu Leu Arg His Ser Leu Gly Ile Pro Gln Ala Pro Leu Ser Ser Cys 50 55 60 Ser Ser Gln Ser Leu Gln Leu Arg Gly Cys Leu Asn Gln Leu His Gly 65 70 75 80 Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser 85 90 95 Pro Glu Leu Ala Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Thr Asp 100 105 110 Phe Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Gly Ala Ala Pro 115 120 125 Ala Val Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe 130 135 140 Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser Gln Leu His Arg Phe 145 150 155 160 Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Gly Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro 165 170 <210> 3 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 20 25 30 Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 35 40 45 Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 65 70 75 80 Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 85 90 95 Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 100 105 110 Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 115 120 125 Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 145 150 155 160 Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 165 170 175

Claims

봉입체로부터의 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)의 재폴딩 방법으로서,
a) 가용화제의 존재 하에서 G-CSF를 가용화하는 단계;
b) 산화제 및 가용화제의 존재 하에서 가용화 G-CSF를 인큐베이션하는 것을 포함하는, 산화 및 제1 재폴딩 단계를 수행하는 단계;
c) 이온 교환 수지 흡착 및/또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 가용화제를 제거하고, 임의로, 산 침전을 수행하는 단계; 및
d) 단계 (c)의 G-CSF를 희석 및 인큐베이션하는 것을 포함하는, 제2 재폴딩 단계를 수행하는 단계
를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 봉입체가 미생물, 바람직하게는 이. 콜라이(E. coli)로부터 유래된 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, G-CSF가 재조합 소 또는 인간 메티오닐-G-CSF인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 가용화제가 N-라우로일사르코신인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 산화제가 CuSO₄인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, G-CSF의 가용화를 pH 7 초과의 pH 값에서 수행하는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 가용화제가 약 0.5% 내지 약 1.5% 농도의 N-라우로일사르코신인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 및 제1 재폴딩 단계를 2시간 이상 동안 수행하는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 및 제1 재폴딩 단계를 기류 하에 냉각 없이 수행하는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 및 제1 재폴딩 단계를 약 7 내지 9의 pH 값에서 및/또는 약 20 내지 28℃의 온도에서 및/또는 약 15 내지 25시간 동안 수행하는 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서의 가용화제의 제거가, AEX 및 CEX를, 임의로 이 순서로 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서의 가용화제의 제거가
a) G-CSF 용액을 현탁 수지 물질과 혼합시킴으로써 음이온 교환 수지 물질에의 결합 및 여과에 의한 수지 물질의 제거, 및/또는
b) 가용화제가 수지에 결합되고 G-CSF가 통과액(flow through) 중에 잔존하는 조건 하에서의 이온 교환 크로마토그래피, 및/또는
c) G-CSF가 수지에 결합되고 가용화제가 통과액 중에 잔존하는 조건 하에서의 이온 교환 크로마토그래피
를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 가용화제 및 다른 불순물을
(i) AEX 단계,
(ii) 산 침전 단계,
(iii) AEX 단계, 및
(iv) CEX 단계
의 순차적 적용에 의해 제거하는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 가용화제 및 다른 불순물을
a) G-CSF 용액을 현탁 수지 물질과 혼합시킴으로써 음이온 교환 수지 물질에의 가용화제의 결합 및 여과에 의한 수지 물질의 제거 단계;
b) pH의 pH 5 미만으로의 저하 및 여과에 의한 침전물 제거에 의한 불순물의 침전 단계;
c) 잔여 가용화제가 수지에 결합되고 G-CSF가 통과액 중에 잔존하는 조건 하에서 행해진 음이온 교환 크로마토그래피 단계;
d) G-CSF가 수지에 결합되고 잔여 가용화제가 통과액 중에 잔존하는 조건 하에서 행해진 양이온 교환 크로마토그래피 단계; 및
e) 증가된 pH 또는 염 농도를 갖는 용출 완충제를 이용한 단계식 또는 구배식 용출에 의한 양이온 교환 수지로부터의 결합 G-CSF의 용출 단계
의 순차적 적용에 의해 제거하는 것인 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 재폴딩 단계를 저 전도도 완충제 중에서 및/또는 냉각된 조건 하에서 및/또는 12시간 초과의 시간 동안 수행하는 것인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 재폴딩 단계를 2.0 mS/cm 미만의 전도도에서 및/또는 약 2 내지 8℃의 온도에서 및/또는 24시간 이상 동안 수행하는 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 재폴딩 단계를 pH 7 초과의 pH 값에서 수행하는 것인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 폴리싱 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제18항에 있어서, 폴리싱 단계에서의 하나 이상의 이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피에 이어서 양이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법.
a) G-CSF가 수지에 결합되는 조건 하에서 행해진 음이온 교환 크로마토그래피 단계;
b) 감소된 pH 또는 증가된 염 농도를 갖는 용출 완충제를 이용한 단계식 또는 구배식 용출에 의한 결합 G-CSF의 용출 단계;
c) G-CSF가 수지에 결합되는 조건 하에서 행해진 양이온 교환 크로마토그래피 단계; 및
d) 증가된 pH 또는 염 농도를 갖는 용출 완충제를 이용한 단계식 또는 구배식 용출에 의한 결합 G-CSF의 용출 단계
를 포함하는 봉입체로부터의 G-CSF의 가용화에 사용되는 가용화제의 제거 및/또는 G-CSF의 정제 방법으로서, 음이온 및 양이온 교환 수지의 골격 중합체가 모두 메타크릴레이트 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.