PT2341061E - Um processo novo para a preparação de g-csf (fator de estimulação de colónias de granulócitos) - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "UM PROCESSO NOVO PARA A PREPARAÇÃO DE G-CSF (FATOR DE ESTIMULAÇÃO DE COLÓNIAS DE GRANULÓCITOS)"

Aspeto Técnico A presente invenção refere-se a um novo processo de isolamento e purificação do fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF) a partir de um micro-organismo de produção de G-CSF, mais especificamente, o G-CSF é um G-CSF humano metionilo recombinante (rmetHuG-CSF).

Antecedentes da Invenção 0 fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF) é uma proteína de aminoácido 175, produzida por tecnologia de ADN recombinante. 0 G-CSF é produzido por bactérias Escherichia coli (E. coli) nas quais foi inserido o gene do fator de estimulação de colónias de granulócitos humanos. A proteína tem uma sequência de aminoácidos que é idêntica à sequência natural prevista a partir da análise da sequência de ADN humano, exceto para a adição de uma metionina N-terminal necessária para a expressão em E. coli. Uma vez que o G-CSF é produzido em E. coli, o produto é não glicosilado e, assim, difere do G-CSF isolado a partir de uma célula humana. G-CSF é fornecido tanto em frascos como em seringas pré-enchidas. 0 produto está disponível em frascos de utilização única e em seringas pré-enchidas. Os frascos de utilização única contêm 300 mcg ou 480 mcg de G-CSF num volume de enchimento de 1,0 mL ou 1,6 mL, respetivamente. As seringas pré-enchidas de uso único contêm 300 mcg ou 480 mcg de G-CSF num volume de enchimento de 0,5 mL ou 0,8 mL, respetivamente. 2 A sequência de aminoácidos de G-CSF humano é mostrada na Figura 1. 0 primeiro aminoácido da proteína madura foi determinado por sequenciação direta de aminoácidos das proteínas purificadas. Os ARNms de G-CSF humano codificam uma sequência líder hidrofóbica de 30 aminoácidos típica de proteínas segregadas. O G-CSF possui duas ligações bissulfureto formadas por resíduos de cisteína homólogos (Figura 1) e um resíduo de cisteína adicional na posição 17, que não pode participar em ligações bissulfureto intramoleculares. As ligações bissulfureto nessas moléculas estabilizam as estruturas e tornam-nas resistentes a tratamentos relativamente ríspidos (algumas proteases, altas temperaturas, solventes de desnaturação, pH extremo), que levam à desnaturação após a redução de ligações dissulfeto (Nicos A. Nicola, The walter and Eliza Hall Institute of Medicai Research, "Granulocyte Colony Stimulating Fator", pág. 77-100). O G-CSF humano pode ser produzido em organismos eucarióticos (leveduras e linhas de células de mamíferos) e em organismos procarióticos como bactérias. A forma como o G-CSF é produzido depende do tipo de organismo hospedeiro utilizado para a expressão. Se o G-CSF for expresso em células eucarióticas, é produzido numa forma solúvel e segregada. Quando o GCSF for produzido em células procariotas, o produto é formado como corpos de inclusão inativos (IBs). Normalmente, os corpos de inclusão têm uma estrutura secundária e são densamente agregados. É revelado que a combinação de tantos fatores de estado fisiológico das células do hospedeiro e condições de crescimento é afetada pela formação de corpos de inclusão. 3 0 G-CSF produzido em células procariotas, tais como as de E. coli, está em corpos de inclusão. Os corpos de inclusão são agregados nucleares ou citoplasmáticos de substâncias marcáveis, usualmente proteínas. A purificação das proteínas expressas a partir de corpos de inclusão geralmente requer dois passos principais; a extração de corpos de inclusão a partir das bactérias seguido pela solubilização dos corpos de inclusão purificados. A produção de proteína de G-CSF humano biologicamente ativa a partir de corpos de inclusão inativos expressos por tecnologia de ADNr em células hospedeiras procarióticas normalmente utilizadas é muito difícil. Metodologias processuais eficientes são desejáveis para a produção de G-CSF terapeuticamente útil de a uma escala industrial. Vários métodos têm sido relatados na literatura científica para a produção de G-CSF em E. coli, levedura ou células de CHO de mamífero (ovário de hamster chinês).

Muitas patentes descrevem vários aspetos de expressão e purificação de proteína G-CSF a partir de diferentes sistemas de expressão, como as células procariotas e eucariotas. A expressão do G-CSF em sistemas bacterianos é descrita em patentes dos Estados Unidos, US 4 810 643 (03.03.1986, Kirin-Amgen Inc.) e US 4 999 291 (23.08.1985, Amgen Inc.). Nos processos preferidos, o gene de G-CSF é sintetizado, clonado e transformado em E. coli. A proteína é expressa por indução da cultura com a elevação da temperatura até 42 °C. As condições e parâmetros para a clonagem e expressão por fermentação não são claras. Um número de passos é envolvido na construção do clone. O processo é realizado sob condições de frascos e o nível de expressão de proteína é de 3-5%, com base apenas no total de proteína celular. 4 0 produto farmacêutico designado NUPOGEN®, uma marca comercial da Amgen Inc., inclui uma proteína de 175 aminoácidos, produzida por tecnologia de ADN recombinante. As informações do produto que pode ser recuperada a partir do website: http://dailvmed.nlm.nih.aov/dailymed/archives/fdaDrualn fo.cfm?archiveid=10056 divulga que o NEUPOGEN® é produzido por bactérias Escherichia coli (E. coli), que foram inseridas com o gene de fator de estimulação de colónias de granulócitos humanos. A formulação do produto contém Filgrastim, Acetato, Sorbitol, Polissorbato 80, Sódio e Água numa forma adequada para administração intravenosa e subcutânea. O documento WO 2008/096370-A2 divulga um processo para isolar e purificar a proteína G-CSF a partir de uma E. coli produtora de G-CSF compreendendo a lise do micro-organismo e a separação do G-CSF, o isolamento de corpos de inclusão compreendendo G-CSF, a solubilização de G-CSF com um agente caotrópico concentrado e um agente redutor tal como DTT, a oxidação do G-CSF, o re-enrolamento-concentração e dessalinização do mesmo, a sua sujeição a cromatografia de troca iónica, e recuperação do G-CSF purificado numa forma estável. GETZ E B ET AL: "Ά comparison between the sulfhydryl reductants tris (2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry." Analytical Biochemistry 15 agosto 1999 LNKD-PUBMED: 10452801, vol. 273, n° 1, páginas 73-80 apresenta uma comparação entre ditiotreitol (DTT) e tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) em termos de: (1) estabilidade a pH neutro, (2) capacidade de preservar a atividade enzimática, (3) interferência com fixação de 5 marcadores aos tióis proteicos, (4) redução de sondas de spin nitróxido, e (5) capacidade de causar a degradação de proteínas indesejada, a temperaturas elevadas utilizadas em preparações de eletroforese em gel. A TCEP, contudo, não é proposta para aumentar o rendimento do processo, por quebra eficiente das ligações de bissulfureto com uma atividade de desenrolamento num processo, por exemplo para a produção do fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF).

Os documentos EP 0 220 520 (30.09.1985, Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha), WO 87/01132 (23.08.1985, Kirin-Amgen Inc.) e WO 88/01297 (11.08.1986, Cetus Corporation) descrevem a clonagem do G-CSF. A patente nos Estados Unidos, US 5 055 555 (05.01.1989, Sassenfeld, Helmut) descreve um processo simplificado para a produção de G-CSF humano a partir de células eucarióticas. O alcance da secreção de proteínas através de organismos eucariotas extracelulares forma uma tecnologia totalmente diferente em comparação com a expressão da proteína através de organismos procariotas intracelulares. Embora o processo descrito na patente US 5,055,555 seja mais simples; ele não é facilmente aplicável a G-CSF recombinante, expresso em E. coli ou noutras células, onde o G-CSF é produzido na forma de um corpo de inclusão. O método acima foi desenvolvido para G-CSF solúvel expresso e segregado pela levedura recombinante no meio de fermentação. Para G-CSF derivado de E. coli, a solubilização de corpos de inclusão e o re-enrolamento de G-CSF são passos adicionais a serem tomados em consideração. Além disso, a obtenção de uma preparação de grau terapêutico de G-CSF livre de endotoxinas de lipopolissacáridos, que são suscetíveis de contaminação quando E. coli é usada como hospedeira, num procedimento 6 simples e redimensionável, não foi relatada até agora. Numa escala comercial, perdas de rendimento a partir de um processo multi-passo tornam-se altamente significativas. Assim, um procedimento simplificado, com menos passos dará maior produtividade em menos tempo, para além de ser económico. A produção de proteínas terapêuticas recombinantes utilizando Escherichia coli como sistema hospedeiro é viável se se puder estabelecer um processo a jusante simples e de baixo custo. 0 alto nível de expressão de proteínas eucarióticas em E. coli leva frequentemente à formação de IBs insolúveis no citoplasma. A formação de IBs pode ocorrer como uma consequência da acumulação intracelular de formas parcialmente desenroladas da proteína recombinante. As propriedades da proteína, tais como a carga média, fração de resíduos transformadores, frações de cisteína e prolina, hidrofilicidade, e número total de resíduos têm sido correlacionadas com a formação de corpos de inclusão. As condições de cultura, tais como temperatura, pH, e fornecimento de nutrientes desempenham um papel fundamental no controlo da partição da proteína recombinante em frações solúveis e insolúveis. Muitas vezes, é difícil recuperar a proteína a partir de IBs, devido aos problemas relacionados com os passos iniciais de recuperação, solubilização e renaturação.

Os diversos protocolos de purificação descritos nas patentes acima mencionam cromatografia múltipla e outros passos para a purificação de G-CSF. Nenhuma das patentes acima relatadas descreve um método mais simples, económico e comercial para a produção de G-CSF a uma escala comercialmente viável, que garanta a estabilidade do produto obtido pelo processo. Os processos descritos no 7 estado da técnica são complexos, demorados e os custos unitários são elevados.

Por conseguinte, para ultrapassar os principais problemas associados com a produção de G-CSF, um processo simples, económico, industrialmente aplicável e mais estável para o elevado aproveitamento de G-CSF foi agora desenvolvido e descrito na presente invenção.

Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a um novo processo de isolamento e purificação do fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF) a partir de um micro-organismo produtor de G-CSF e descreve um método industrialmente aplicável, simples, económico, com economia de tempo para a produção do fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF). 0 principal objetivo da presente invenção é o de proporcionar um novo processo para o isolamento e purificação do fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF) a partir de um micro-organismo produtor de G-CSF consistindo nos seguintes passos; a) lise do micro-organismo, ajustando a densidade e temperatura da suspensão de pasta de células e separando o material insolúvel que compreende G-CSF, b) isolamento de corpos de inclusão (IBs) compreendendo G-CSF, na presença de um agente tensioativo iónico, c) solubilização do G-CSF presente no material insolúvel, utilizando um agente caotrópico altamente concentrado e um agente desnaturante que é tris (2-carboxietil)fosfina HC1 (TCEP) 8 d) e) f) g) h) i 3 oxidação do G-CSF na presença de cistina/cisteina, em que a razão molar é de 1:10, re-enrolamento do G-CSF em condições de temperatura controlada através de um método de um passo, concentração da solução de G-CSF re-enrolado utilizando um sistema de Filtração de Fluxo Tangencial (TFF), utilizando cassetes ou cartuchos com peso molecular de 5-12 kDa, dessalinização da solução concentrada de G-CSF numa coluna com temperatura controlada e separação da solução de G-CSF a partir de caótropo por filtração em gel, submissão da solução de G-CSF a cromatografia de troca catiónica, recuperação do G-CSF purificado em tampão de formulação, na forma estável, remoção de endotoxina usando cromatografia de troca aniónica base forte.

Numa forma de realizaçao, o G-CSF é G-CSF humano metionilo recombinante (rmetHuG-CSF).

Numa forma de realização da invenção, a densidade da pasta de células do passo de lise não é inferior a 8 mL de tampão de ressuspensão por grama de IB e a temperatura está entre 5 a 20 °C, de preferência entre 5 a 15 °C.

Uma outra forma de realização da invenção é o agente tensioativo iónico, em que é desoxicolato de sódio no passo de isolamento.

Numa forma de realização, o agente caotrópico de alta concentração no passo de solubilização é guanidina HC1 na concentração de 5,4 M a 6,6 M, de preferência sendo 6M. 9

Numa forma de realização, a temperatura no passo de re-enrolamento situa-se entre 7 a 15 °C, preferivelmente entre 7 a 11 °C, mais preferivelmente de 8 a 10 °C.

De acordo com uma outra forma de realização, a coluna de filtração em gel é Sephadex G-25 Fine e o tamanho de partículas dos grânulos Sephadex G25 Fine está entre 20 e 300 pm, de preferência cerca de 80 pm.

Numa forma de realização, a coluna no passo de dessalinização é estabilizada a uma temperatura entre 4 a 20 °C, preferivelmente entre 7 a 15 °C, mais preferivelmente é entre 7 a 13 °C.

Numa forma de realização, a cromatograf ia de troca catiónica consiste de sulfopropilo e o tampão de formulação estável no passo de recuperação é uma solução aquosa de 10 mM de tampão de Acetato (ou acetato de sódio) , 5% de Sorbitol e 0,004% de Polissorbato 80, que é ajustado a um pH 4,0.

Numa outra forma de realização, o passo de cromatografia de troca aniónica de base forte usada na remoção de endotoxinas é constituída por amónio quaternário.

Numa forma de realização, o pH no passo c) é de 7,5 a 9,0, de preferência é de 8, e numa outra forma de realização, o pH no passo e) é de 7,0 a 8,0, de preferência 7,5.

De acordo com uma outra forma de realização, o micro-organismo que produz o G-CSF é E. coli. 10

Numa outra forma de realização da invenção, o método compreende ainda o passo de formular o rmetHuG-CSF para produzir um produto biofarmacêutico consistindo de;

a) 30-100 MU (300-1000 pg) de rmetHuG-CSF b) 0,50-0,80 mg de acetato (ou 0,250-1,00 mg de acetato de sódio) c) 25-100 mg de sorbitol d) 0,01-0,10 mg de polissorbato 80 e) água para injeção

f) hidróxido de sódio ou ácido acético para ajustar o pH em 1 mL de solução estéril, a qual é aceitável para enchimento em dispositivos de distribuição apropriados com resistências de dosagem definidas para a administração a pacientes.

Numa forma de realização preferida, a quantidade de acetato é de 0,59 mg.

Os produtos biofarmacêuticos obtidos por meio do processo da presente invenção podem ser úteis no tratamento de neutropenia, leucemia, mobilização de células progenitoras do sangue periférico (PBPC), infeções por VIH, tais como infeções bacterianas e em pacientes oncológicos em tratamento de quimioterapia citotóxica, quimioterapia mielossupressora e transplante de medula óssea.

No estado da técnica, diferentes tipos de micro-organismos, um tipo diferente de estirpe e também sequências de genes modificados diferentes para a produção do G-CSF são descritos. Cada processo tem condições de produção especificas e os seus problemas inerentes que podem ser obtidos a partir das condições de processo ou de proteína alvo ou impurezas produzidas. O desenvolvimento dos passos 11 de purificação na produção de proteínas depende das especificações da proteína não-purifiçada obtida a partir de processo a montante, em condições diferentes. A presente invenção está relacionada com a produção de G-CSF puro e estável (98% de acordo com o "método de exclusão de tamanho" do EP) , como um produto final, considerando o tempo, trabalho e custos. Os processos disponíveis até ao momento são geralmente morosos, trabalhosos e dispendiosos, para além de serem complicados. Além disso, eles não fornecem resultados estáveis. Há ainda uma necessidade de melhores resultados de purificação.

Descrição Detalhada da Invenção

Um método simples e inovador para a produção de G-CSF, que é G-CSF humano metionilo recombinante (rmetHuG-CSF) é realizado por utilização de células de E. coli, devido ao alto nível de expressão da proteína e para evitar complicações de glicosilação.

As células de E. coli são colhidas, depois da fermentação por centrifugação e o material proteico, que está na forma de corpo de inclusão, é extraído a partir de células por lise das células bacterianas, utilizando um disruptor de células de alta pressão, ajustando a densidade e temperatura da suspensão de pasta celular e separando materiais insolúveis compreendendo G-CSF. A parede celular bacteriana é quebrada por meios físicos, permitindo assim que os corpos de inclusão nas células se suspendam livremente em tampão. Os corpos de inclusão que estão suspensos na solução tampão são sedimentados por centrifugação a alta velocidade. 0 corpo de inclusão compreendendo G-CSF é isolado na presença de um agente tensioativo iónico. Após as etapas de lavagem e centrifugação, os corpos de inclusão são solubilizados em 12 tampão de solubilização adequado contendo um agente caotrópico altamente concentrado. 0 tampão de solubilização é uma solução aquosa com um valor de pH de 8,0 compreendendo 6M de Guanidina. HC1 como agente caotrópico e 100 mM TRIS como tampão de sal. Os corpos de inclusão são solubilizados com o tampão acima referido, à temperatura ambiente.

Purificação

Após o passo de solubilização de corpos de inclusão, existem vários diferentes materiais proteicos, não só diferentes de G-CSF, mas também várias isoformas de G-CSF. Existe uma necessidade de alterar a conformação de G-CSF não enrolado e quebrar pontes bissulfureto intermoleculares que podem formar dímeros, oligómeros e agregados. Assim, as proteínas solubilizadas com um agente desnaturante adequado são desnaturadas para se obterem cadeias não enroladas de monómeros. O passo de desnaturação das proteínas é importante e afeta o rendimento e pureza do produto final. Se a proteína não enrolada permanecer na solução, ela poderá desencadear a agregação ao longo de todos os passos de purificação. Assim, 0,5 M de tris-2-carboxietilfosfina, HC1 (TCEP) ou 0,5 M de DTT é escolhido como um agente de desnaturação forte para se obterem os níveis desejados de desnaturação. 1-2 horas de agitação à temperatura ambiente permite níveis adequados de desnaturação. O DTT é um produto químico odorífero e quando entra em contacto com o ar, ele pode ser facilmente oxidado. Devido à oxidação pelo ar, é difícil de armazenar DDT como um solvente e este é um composto relativamente instável. Assim, o TCEP é escolhido para a presente invenção. Surpreendentemente, descobriu-se que tem um efeito 13 sinérgico sobre o desenrolamento da proteína, como é mostrado na Figura 3. Como resultado deste efeito, é aumentado o rendimento, no final do processo. A Figura 2 mostra o cromatograma dos corpos de inclusão na solução tampão. Neste cromatograma é visto que todas as proteínas estão numa mistura incluindo o G-CSF, devido aos corpos de inclusão. A Figura 3 mostra o cromatograma após a adição de TCEP e DDT ao tampão de solubilização e o efeito de TCEP é claramente observado no desenrolamento do GCSF não enrolado com conformações diferentes. Na Fig. 3, o pico de DDT está abaixo de 0, 025 AU e o pico de TCEP é o superior a 0,025 AU.

Percebe-se claramente que o pico, que remete para TCEP tem um pico mais elevado e uma superfície mais plana e lisa, sem picos suplementares do que o pico que se refere a DDT. O pico de DDT tem também 3 picos pequenos, que mostram que não é completamente eficaz na obtenção de proteína desenrolada numa cadeia plana. Isto mostra o efeito sinérgico do TCEP durante a etapa de desenrolamento e a concentração de proteína total é aumentada em 10-15%. O re-enrolamento de moléculas de G-CSF é conduzido na presença de um par de agentes de oxidação/redução. O par cistina/cisteína é usado para obter uma formação de molécula de G-CSF corretamente enrolada. A razão molar de cistina para cisteína é de 1/10. A solução de re-enrolamento é uma solução aquosa com um valor de pH de 7,5 compreendendo 0,5 M de L-Arginina.HC1, 50 mg/mL de Sorbitol, 0,1 M de TRIS e 2 mM de EDTA. O re-enrolamento do volume da solução é ajustado para atingir a concentração de 14 proteína desnaturada 0,2mg/mL. A solução é mantida entre 7 a 15 °C, de preferência entre 7 a 11 °C, mais preferencialmente de 8 a 10 °C durante 16-20 horas para atingir a conformação correta de enrolamento e níveis de enrolamento desejados.

Quando o enrolamento da conformação adequada é finalizado, existe a necessidade de concentrar a solução para volumes menores para outros passos de purificação que envolvem a cromatografia. A Filtração de Fluxo Tangencial (TFF) é utilizada para remover as moléculas indesejáveis que têm pesos moleculares menores que 5-12 kDa. Desta forma, não só a solução é concentrada mas também algumas impurezas relacionadas com o processo, tais como moléculas de proteína pequenas que não poderiam ser removidas nos passos anteriores, podem ser removidas. A concentração dos efeitos de proteína afeta a concentração do produto finalizado e consequentemente a rentabilidade do processo. Assim, o uso de TFF é muito importante nesta etapa. A solução concentrada é então submetida a filtração em gel, de modo que os sais tampão são removidos conjuntamente com o material proteico de baixo peso molecular. A proteína é separada do referido sal pela grande diferença de tamanho molecular, por injeção e movimento na coluna de dessalinização. A coluna de dessalinização é embalada com Sephadex G-25 Gel, que tem um tamanho de grânulo de entre 20-300 pm, de preferência cerca de 80 pm, em que a resolução do G-CSF com outro material proteico é melhor, resultando, assim, num produto intermediário mais puro em termos de impurezas do processo. A coluna de dessalinização é arrefecida a 4-20 °C de modo que a amostra concentrada na 15 saída da coluna permanece estável. A solução concentrada do passo de TFF é injetada para a coluna e movido com uma fase móvel é o pH = 5,4, com o valor de condutividade de 1,0-2,0 uS/cm compreendendo Asetato de Sódio a 20 mM e Sorbitol a 50 mg/mL. A solução de saída de dessalinização é então submetida a cromatografia de troca catiónica. Este é o passo em que o G-CSF corretamente enrolado é removido das suas isoformas não enroladas e outras impurezas. As proteínas são alimentadas primeiramente numa coluna de troca catiónica preenchida com material forte de troca de catiões e são mantidos pelos meios. Em seguida, usando gradualmente um método de gradiente, a condutibilidade é aumentada para certos valores que permitem às impurezas e G-CSF eluir-se em tempos diferentes para a separação com respeito aos seus diferentes valores de pl. O método do gradiente utiliza o uso de duas fases móveis diferentes de dois valores de condutividade diferentes: fase móvel A e fase móvel B. A fase móvel A é uma solução de pH = 5,4, com valor de condutividade 1,0-2,0 uS/cm, compreendendo 20 mM de Asetato de Sódio e 50 mg/mL de Sorbitol. Fase móvel B é uma solução de pH = 5,4, com valor de condutividade de 40-50 uS/cm, compreendendo 20 mM de Asetato de Sódio, 50mg/mL de Sorbitol e 0,5 M NaCl. O material puro de proteína presente na solução de água tamponada é sujeito a filtração em gel para produzir o produto final. Assim, a molécula ativa de G-CSF é diretamente recuperada como um produto final com uma formulação adequada e estável evitando os problemas e complexidade de outras técnicas de recuperação, tais como a liofilização e reconstituição. A filtração em gel realiza-se com a mesma matriz no passo de dessalinização, mas com 16 uma diferente composição da fase móvel, o que é denominada de tampão de formulação. É composta por 10 mM de tampão de acetato e 50mg/mL de Sorbitol e 0,004% de Polissorbato 80 com o valor de pH 4,0 O nivel de endotoxina é essencial na produção de soluções injetáveis estéreis, tais como o produto que é produzido pela presente invenção. Na produção de substâncias ativas biológicas e biotecnológicas, as soluções estéreis, tais como tampões de lavagem, fases móveis e soluções de formulação podem ser muito caras, o que também pode exigir um ambiente controlado que também contribuirá para um custo elevado, pela sua exigência para os testes microbiológicos regulares e controlo. É um desafio manter os níveis de endotoxina se um ambiente estéril totalmente controlado não estiver disponível. A presente invenção permite que os custos de produção caiam significativamente, tornando possível trabalhar num ambiente não-estéril e manter os níveis de endotoxina em concordância com a monografia EP. A presente invenção utiliza cromatografia de troca iónica em que os meios de troca de iões é um forte permutador aniónico de base. Os meios de troca aniónica fortes podem ser de amónio quaternário. A cromatografia de troca iónica é o método mais comum de despirogenação de proteínas; no entanto, tem várias desvantagens, as quais limitam a sua utilidade como passo de despirogenação. Isso inclui os problemas de manuseamento e de uso, tais como embalamento, canalização, baixas taxas de fluxo, longos tempos de regeneração, compressão e estabilidade química limitada. Pequenas taxas de fluxo e suscetibilidade à contaminação significam que a incorporação de resinas de cromatografia em passos de purificação à escalar processual pode ser cara e problemática. Uma tecnologia de membrana de troca iónica de alta capacidade, escalonável e pronta-a-usar fornece 17 despirogenação no processo. Através da utilização de cromatografia de troca iónica com fortes permutadores de aniões básicos, os níveis de endotoxina podem ser reduzidos muito abaixo.

Tal como descrito acima em detalhe, a sequência do passo de purificação é importante de acordo com o desenvolvimento de um processo puro, simples, eficaz e comercialmente económico e mais estável para expressão de alto nível de G-CSF. 0 passo de troca catiónica é realizado a seguir ao passo de dessalinização, o que permite a remoção dos ingredientes de sal elevado. A importância da sequência é também apresentada pelos dados cromatográficos em baixo na Figura 3 por análise SDS-PAGE. As amostras marcadas com a seta, na 3a e 4a linhas entre 29 e 45 kDa no marcador de referência são as que são removidas pelo passo de troca catiónica.

Numa forma de realização preferida da invenção, o G-CSF biologicamente ativo obtido usando o processo da presente invenção pode ser usado para a preparação de medicamentos.

De acordo com esta forma de realização da invenção, um dos medicamentos é o produto biofarmacêutico fabricado de acordo com o processo da invenção descrita consistindo de

a) 30-100 MU (300-1000 pg) de rmetHuG-CSF b) 0,50-0, 80 mg de acetato, de preferência 0,59 mg de acetato c) 25-100 mg de sorbitol d) 0,01-0,10 mg de polissorbato 80 e) água para injeção 18 f) o pH é ajustado com hidróxido de sódio em 1 mL de solução estéril.

Tais medicamentos são indicados para uma grande variedade de indicações e incluem: neutropenia e sequelas clinicas relacionadas com a neutropenia, neutropenia crónica, infeções neutropénicas e não neutropénicas, redução da hospitalização por neutropenia febril após quimioterapia citotóxica e para a redução da duração da neutropenia em doentes sob terapêutica mieloablativa seguida de transplante de medula óssea que se considerem estar em risco aumentado de desenvolver neutropenia grave prolongada. 0 G-CSF também é indicado para a mobilização de células progenitoras do sangue periférico (PBPC) e condições inflamatórias crónicas. A sua administração a longo prazo é indicada para aumentar as contagens de neutrófilos e para reduzir a incidência e duração de eventos relacionados com a infeção, o tratamento de neutropenia persistente em pacientes com infeção por VIH avançado, de modo a reduzir o risco de infeções bacterianas. 0 G-CSF também é indicado para melhorar o resultado clinico em pacientes em unidades de cuidados intensivos e pacientes criticamente doentes, no tratamento e cura de feridas/úlceras de pele/queimaduras, intensificação da quimioterapia e/ou radioterapia, aumento de citocinas anti-inflamatórias, potenciação dos efeitos antitumorais da terapia fotodinâmica. 19 É indicado para prevenção e tratamento de doenças causadas por diferentes disfunções cerebrais, tratamento de doença trombótica e suas complicações e recuperação pós-irradiação da eritropoiese. Pode também ser usado para o tratamento de todas as outras doenças, que são indicativas para o G-CSF.

Uma composição biofarmacêutica contendo o G-CSF puro e biologicamente ativo obtido pelo processo da invenção pode assim ser administrada a pacientes, crianças ou adultos, numa quantidade terapêutica, que é eficaz para tratar as doenças acima mencionadas. A presente invenção é ainda descrita com referência ao exemplo seguinte. Embora o exemplo não se destine a limitar o âmbito da presente invenção, ele deve ser considerado à luz da descrição detalhada acima.

EXEMPLO

Dessalinização 0 G-CSF é separado dos agentes caotrópicos e par de oxidação/redução, assim como de outras impurezas relacionadas com o processo e sais de tampão dos passos de solubilização e renaturação. Neste passo, o produto intermediário é um concentrado a partir do passo de TFF compreendendo sais que tiveram de ser separados a partir de G-CSF e removidos. A fase móvel para este passo é uma solução aquosa com pH = 5,4, com o valor de condutividade de 1,0-2,0 uS/cm, compreendendo 20 mM de Acetato de Sódio e 50mg/mL de Sorbitol. Quando a amostra é injetada na coluna, o valor da condutividade e absorvância da solução de saída é cuidadosamente monitorizado a 280 nm de comprimento de onda para a absorvância e cerca de 1,35 umS/cm para a condutividade. A linha de base para cada parâmetro é 20 mantida até que as moléculas estejam eluídas. Uma vez que as moléculas de proteína são eluídas em primeiro lugar, o primeiro pico observado está na linha de base da absorvância que corresponde à da proteína que sai da coluna. O produto é separado até que o primeiro pico seja eluído. Em seguida, outro material proteináceo com pequenas moléculas de G-CSF dá um outro pico de eluição de UV imediatamente antes de um aumento da condutividade, que corresponde a eluiçao dos sais.

Troca Catiónica O G-CSF corretamente enrolado é removido a partir das suas impurezas e é purificado. O produto intermediário é tomado depois do passo de dessalinização e alimentado na coluna de troca catiónica com a fase móvel A, que está a um pH = 5,4, tendo o valor de condutividade de 1,0-2,0 uS/cm, compreendendo 20 mM de Asetato de sódio e 50mg/mL de Sorbitol. Enquanto a amostra está a ser alimentada na coluna, de linha de base de 280 nm UV é mantida. O aumento da linha de base é o sinal de capacidade de retenção da coluna. Um volume de coluna adequado deve ser escolhido para evitar a saturação da coluna. Após a amostra ser alimentada, continua o processo de purificação com injeção gradual da fase B na coluna com um programa de gradiente para permitir a separação da proteína e impurezas. A fase móvel B tem pH = 5,4, com valor de condutividade de 40-50 uS/cm, compreendendo 20 mM de Asetato de Sódio, 50mg/mL de Sorbitol e 0,5 M de NaCl. O valor de condutividade mais elevado permite a mudança da concentração de sal na coluna para separar as proteínas.

Filtração em Gel para o Passo Final O G-CSF é recuperado diretamente no tampão de formulação. Neste passo, o produto intermediário está no tampão de 21 saída de troca catiónica que contém 0,1-0,5 M de NaCl. Uma vez que o produto é a injeção IV, o sal e o produto devem ser separados, pelo que é conduzida a cromatografia de filtração em gel. Como mencionado acima, a fase móvel para esta etapa é o tampão de formulação que é uma solução aquosa com um pH de valor 4,0, compreendendo 10 mM de tampão de Acetato e 50mg/mL de Sorbitol e 0,004 % de Polissorbato 80. Quando a amostra é injetada na coluna, o valor da condutividade e absorvância da solução de saída é cuidadosamente monitorizado a 280 nm de comprimento de onda para a absorvância e cerca de 1,35 umS/cm para a condutividade. A linha de base para cada parâmetro é mantida até que as moléculas estejam eluídas. Uma vez que as moléculas de proteína são eluídas em primeiro lugar, o primeiro pico observado está na linha de base da absorvância que corresponde à da proteína que sai da coluna. 0 produto é separado, até um aumento na condutividade ser monitorizado, o qual corresponde à eluição dos sais que está a ocorrer.

Troca Iónica

Este é o passo opcional em que o produto contendo o G-CSF pode ser ainda removido das suas impurezas de endotoxina. Neste passo, o produto final que é o G-CSF recuperado para tampão de formulação, tal como no passo de filtração em gel, é alimentado na coluna de permutador de iões de forma contínua num modo de reciclagem por um certo número de vezes e, no final a amostra isenta de endotoxinas é filtrada de modo estéril para o enchimento.

Lisboa

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES Um processo para o isolamento < e purificação do fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF) a partir de um micro-organismo produtor de G-CSF que consiste nos seguintes passos; a) lise do micro-organismo, ajustando a densidade e temperatura da suspensão de pasta de células e separando o material insolúvel que compreende G-CSF, b) isolamento do corpo de inclusão (IB) compreendendo G-CSF, na presença de um agente tensioativo iónico, c) solubilização do G-CSF presente no material insolúvel, utilizando um agente caotrópico altamente concentrado e um agente desnaturante que é tris(2-carboxietil)fosfina HC1 (TCEP) d) oxidação do G-CSF na presença de cistina/cisteina, em que a razão molar é de 1:10, e) re-enrolamento do G-CSF em condições de temperatura controlada através de um método de um passo, f) concentração da solução de G-CSF re-enrolado utilizando um sistema de Filtração de Fluxo Tangencial (TFF), utilizando cassetes ou cartuchos com peso molecular de 5-12 kDa, g) dessalinização da solução concentrada de G-CSF numa coluna com temperatura controlada e separação da solução de G-CSF a partir de caótropo por filtração em gel, h) sujeição da solução de G-CSF a cromatografia de troca catiónica, i) recuperação do G-CSF purificado em tampão de formulação, na forma estável, 2 j) remoção de endotoxina usando cromatografia de troca aniónica base forte. 2. 0 processo de acordo com a reivindicação 1, em que o G-CSF é G-CSF humano metionilo recombinante (rmetHuG-CSF) . 3. 0 processo de acordo com a reivindicação 1 e 2, em que a densidade da pasta de células não é inferior a 8 mL de tampão de ressuspensão por grama de IB e a temperatura está entre 5 a 20° C.
2. 4. O processo de acordo com a reivindicação 1 e 2, em que o agente tensioativo iónico no passo de isolamento é desoxicolato de sódio. 5. 0 processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, em que o agente caotrópico altamente concentrado no passo de solubilização é guanidina HC1 nas concentrações de 5,4 Ma 6,6 M.
3. 6. O processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, em que a temperatura no passo de re-enrolamento está entre 7 e 15 °C.
4. 7. O processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, em que a coluna de filtração em gel é Sephadex G-25 Fine.
5. 8. O processo de acordo com a reivindicação 7, em que o tamanho de partícula dos grânulos Sephadex G25 Fine está entre 20 e 300 pm. 3 9. 0 processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, em que a coluna é estabilizada a uma temperatura entre 4 a 20 °C no passo de dessalinização. 10. 0 processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, em que a cromatografia de troca catiónica é constituída por sulfopropilo.
6. 11. O processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, em que o tampão de formulação estável no passo de recuperação é uma solução aquosa de tampão Acetato 10 mM, 5% de Sorbitol e 0,004% de Polissorbato 80 ajustado para um pH 4,0.
7. 12. O processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, em que o passo de cromatografia de troca aniónica de base forte utilizado na remoção das endotoxinas é constituído por amónio quaternário.
8. 13. O processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, em que no passo c) o pH é de 7,5 a 9, 0.
9. 14. O processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, em que no passo e) o pH é de 7, 0 a 8,0.
10. 15. O processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o micro-organismo de produção de G-CSF é E.coli.
11. 16. O processo de acordo com a reivindicação 2, compreendendo ainda o passo de formulação de rmetHuG-CSF de acordo com uma composição que consiste em: a) 30-100 MU (300-1000 pg) de rmetHuG-CSF b) 0,50-0,80 mg de acetato 4 c) 25-100 mg de sorbitol d) 0,01-0,10 mg de polissorbato 80 e) água para injeção f) hidróxido de sódio ou ácido acético para ajustar o pH em 1 mL de solução estéril. Lisboa,