CN102892780B - 获得生物活性的重组人g-csf的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了从包含体获得生物活性的重组人G-CSF的方法，其中增溶和重折叠过程可以在环境温度下执行，并且纯化步骤包括反相色谱(RP)，特别是RP-HPLC。如此获得的G-CSF制备物的特征为高纯度和均质性。

Description

获得生物活性的重组人G-CSF的方法

技术领域

本发明涉及高活性和纯度形式的粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、特别是重组人G-CSF(rhG-CSF)的生产过程。其通过在环境温度下在适当的氧化还原系统中将溶解的包含体中包含的G-CSF重折叠并在纯化过程中使用至少一个反相(RP)色谱步骤而实现。

背景技术

G-CSF(粒细胞集落刺激因子)是一种主要由单核细胞和成纤维细胞释放的造血细胞因子，它刺激颗粒细胞谱系的前体细胞的增殖和分化，并激活功能成熟的中性粒细胞。由于所述特性，G-CSF已经用于不同的医学领域，像例如在化疗或放疗之后重建正常血细胞种群或刺激针对感染性病原体的免疫应答。因此在临床中，G-CSF主要用于抗肿瘤治疗，特别是治疗由于化疗造成的中性粒细胞减少，并还用于骨髓移植和治疗感染性疾病。市场上可买到的第一种基于重组G-CSF的G-CSF制备物是Amgen生产和经销的商品名为的产品。

天然存在形式的人G-CSF是分子量约20,000道尔顿并具有五个半胱氨酸残基的糖蛋白。这些残基中的四个形成两个分子内二硫桥，所述二硫桥对于蛋白质的活性具有必不可少的重要性。重组形式的G-CSF主要用于生产药品，其可以例如借助于在哺乳动物细胞如CHO(中华仓鼠卵巢)细胞中或原核细胞如大肠杆菌（E.coli）中表达而获得。当重组蛋白质在原核生物中表达时，所述蛋白质往往以至少部分无活性的、不溶的聚集体(折射体，包含体IB)形式在寄主细胞内产生。在这样的蛋白质能被使用之前，它们必须转变成它们的活性形式。

所述包含体的形成造成了在通过中速离心分离包含体之后，有必要借助合适的方法对蛋白质进行增溶和复性以保持其活性构型。

由包含体获得的重组蛋白质的复性过程通常是已知的并记载于例如EP 0114506、WO 84/03711、US 4,530,787和EP 0241022中。另外，关于变性蛋白的增溶和复性的一般技术已经记载于EP 0512097、EP 0364926、EP 0219874和WO 01/87925中并还可以获自蛋白质化学的科学文献和权威著作。

EP 0500108描述了使用还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSH)氧化还原系统激活来自包含体的无活性形式的人重组G-CSF并分析G-CSF在一定条件下的再活化动力学的方法。然而没有公开下游的纯化过程。

在EP 0719860中，将含有G-CSF的包含体用N-月桂酰肌氨酸(十二烷基肌氨酸钠)增溶，随后利用硫酸铜通过空气-氧化来实现重折叠。这种方法的缺点是副反应，例如，在氨基酸侧链上形成超氧化物自由基。此外，所述重折叠过程是耗时的并且难以得到标准化的重折叠参数。最后，除去变性剂包含色谱步骤，这导致约20%的总蛋白收率损失。得到的G-CSF随后通过阴离子交换色谱和阳离子交换色谱纯化。

EP 1630173和EP 1837346描述了使用还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSH)氧化还原系统从包含体获得人重组G-CSF的方法，其中重折叠步骤在低温下执行半天以上。因此，在工业规模下，由于要冷却大量的蛋白质溶液达许多小时，这种过程是耗能因此也是耗成本的。由此产生的G-CSF随后通过阳离子交换色谱纯化。

在WO2007/009950中，将EP 1630173中所教示的G-CSF纯化方法在色谱步骤方面进行了进一步的详细说明，即阳离子交换色谱和疏水作用层析顺序执行，两者之间没有任何居间步骤。具体是，色谱纯化步骤分别在疏水作用层析之前和之后，包含两个阳离子交换色谱步骤的序列。

然而，虽然提供治疗级的纯化G-CSF的手段和方法在现有技术中是已知的，但迄今为止从包含体获得G-CSF的过程，特别是在商业规模下，通常是耗时、耗力和耗成本的。这种技术问题通过在权利要求书中作为特征的和下文描述的实施方式得以解决。另外，如下文所述，这些实施方式提供了G-CSF构象亚型的分离，因此提供了高度均质的G-CSF制备物。

发明内容

本发明提供了从产生G-CSF的重组细胞回收和纯化粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的方法。所述方法包括对来自包含体的重组蛋白质进行增溶，通过在适度温度、优选>10°C的重折叠缓冲液内简单稀释所述增溶物而重折叠所述G-CSF分子，并通过色谱纯化重折叠的G-CSF，其中至少一个色谱步骤包含反相(RP)色谱。这种方法通常的特征在于：(a)用含有变性剂和还原剂的增溶缓冲液来增溶包含体中所含的G-CSF，(b)通过用含有还原型和氧化型谷胱甘肽的重折叠缓冲液在>10°C的温度下稀释增溶物来重折叠G-CSF；和(C)通过至少一个优选包含反相(RP)色谱的色谱步骤来纯化重折叠的G-CSF。

具体地说，在一方面，本发明基于在合适的氧化还原系统中在超过10°C的温度下在小于半天内进行的重折叠过程，并且有利地是在室温、即在20±2°C下在3至4小时内进行的重折叠过程。在这些条件下除了可以实现G-CSF分子的有效和准确的复性这一事实之外，还可以避免上文提到的现有技术中描述的现有方法的缺点。因此，本发明的方法容易执行、耗时较少并且不包括耗能的冷却系统。

此外，本发明的方法是基于意料之外的观察结果：在生产和回收G-CSF的过程中，形成了至少一种只有在60°C通过应用分析型反相高压液相色谱法(RP-HPLC)才变得可见的G-CSF亚型；参见图3，表明疏水性稍低于主要形式。这种另外的错误折叠的G-CSF亚型的结构特点如下面所述被详细研究和进一步表征。这种另外的G-CSF亚型在整体制备物中的最大含量可以高达总G-CSF蛋白质收率的7%。利用CD光谱学的详细分析揭示，所述G-CSF亚型与主题G-CSF参照的不同之处在于α-螺旋结构的含量更高(所述亚型为66%，G-CSF参照为52%)。这种另外的亚型的一种特征性质在于它与G-CSF参照标准和本发明的G-CSF制备物的主要部分相比疏水性较低，因此它可以被分离并进而几乎完全从所述制备物中排除出去。结果，在本发明方法内加入RP色谱步骤、特别是RP-HPLC作为工艺步骤，产生了改善的、即高度纯化的G-CSF制备物，其基本上不含这种亚型和其他产品相关的杂质，即疏水性较低的G-CSF亚型含量保持在总G-CSF蛋白质的低于1%。在这种情况下，RP色谱法有别于不是本发明方法的优选实施方式的疏水作用层析(HIC)。因此，对于G-CSF的纯化而言，RP和RP-HPLC迄今分别只用于分析目的；参见，例如，WO2007/009950。所提到的色谱原理在行家当中也是有明确区别的(参见，例如，Bioanalytik,F.Lottspeich,H.Zorbas(编著),Heidelberg,Berlin,Germany,Spektrum Akad.Verlag1998)。例如，虽然HIC典型是水洗脱的，但RP是溶剂洗脱的，其中洗脱以向着溶剂例如乙腈或乙醇的更高浓度的梯度来完成。优选，所述色谱步骤包括在适当条件下的RP-高压液相色谱(HPLC)，应用在阳离子交换(CEX)色谱之后。

在这种情况下，可以审慎地假定，在从包含体获得G-CSF的现有技术的方法中，也形成了G-CSF的亚型，但是迄今尚没有检出，因为在现有技术中使用的分析型RP-HPLC的条件下，所述亚型不明显。此外，因为并不知道存在这样的G-CSF亚型，所以没有寻找的理由。

因此，对于G-CSF、尤其是在合适的例如上文参考的文件中描述的那些氧化还原系统中增溶/复性之后从包含体得到的G-CSF，在其纯化过程中可以执行本发明的方法，尤其分别是制备型RP色谱步骤和RP-HPLC步骤。此外，与在先的阳离子交换(CEX)色谱步骤相结合，这两个色谱步骤足以将人重组G-CSF纯化到足以用所生成的G-CSF作为药物的等级。因此，虽然本发明的方法可以优选如图1中所概括的和实施例中所说明的那样执行，但是所属技术领域的专业人员将认识到，为了达到治疗等级的G-CSF，执行CEX色谱和后续的RP-HPLC就足矣，而任何其他纯化步骤可以被改变或全然省略。

总之，提供了获得生物活性的纯的人重组G-CSF的方法，所述方法可以用最少的留有技术复杂性的制造过程步骤以及低水平的能源成本来实施，并且其中所生成的G-CSF制备物基本上类似于市场上可买到的参照产品并且没有另外的G-CSF亚型。

因此，与依照不应用RP-HPLC色谱的现有技术方法得到的G-CSF制备物比较，依照本发明方法得到的G-CSF制备物在纯度方面、即在它的G-CSF蛋白质分子更均质方面是有优势的。此外，由于本发明的G-CSF制备物的均质性，可以审慎地预期本发明的G-CSF制备物的体内活性即便没有提高，也至少和迄今市场上可买到的重组G-CSF产品的类似。这也意味着除此以外的药代动力学和药效学性质将和市场产品的类似。因此，依照本发明方法得到的G-CSF特别适合用于人类医药。

另外，本发明的G-CSF制备物特别适于进一步衍生化，因为这样化学改性的产品保持了所述G-CSF制备物的高纯度和均质性。因此，在进一步的实施方式中，本发明的方法还包括将依照所述方法得到的G-CSF进行化学改性，例如将水溶性聚合物例如聚乙二醇(PEG)与所述G-CSF共价连接。

此外，鉴于以上考虑，本发明涉及重组G-CSF或其衍生物与可药用添加剂例如缓冲液、盐和稳定剂的药物组合物的生产方法，其中所述方法包括在此公开并特别是在实施例中公开的获得G-CSF的方法。优选，将纯化的生物活性的G-CSF或其衍生物、例如聚乙二醇化G-CSF，在pH 4.0的10mM乙酸、0.0025%聚山梨醇酯80和50g/l山梨糖醇中进行配制。这样得到的药物组合物也是本发明的主题。

附图说明

图1：示出了本发明方法对G-CSF的分离和纯化步骤的流程图示意图。如所示，在本发明的一个优选实施方式中，从包含体纯化和获得生物活性的人G-CSF的过程包括以下步骤：

(a)发酵和收获

a.培养生产rhG-CSF的重组细胞，所述重组细胞过表达rhG-CSF，而所述rhG-CSF以高密度蓄积在包含体中；

b.分离包含体；

c.通过使用变性缓冲液中的还原剂来增溶包含体，然后过滤；

d.在单步骤稀释过程中，通过提供重折叠缓冲液并将增溶混合物转移到所述重折叠缓冲液中而实现重折叠，其中在不锈钢罐中的弱碱性精氨酸-盐酸盐缓冲液中使用基于氧化型和还原型谷胱甘肽(GSH/GSSH)的氧化还原系统，并在超过10°C的温度下温育至少三小时以产生生物活性的可溶性rhG-CSF，然后过滤；

(b)可溶性rhG-CSF的纯化

a.超滤和渗滤步骤以更换缓冲液、降低变性剂浓度和浓缩重折叠的G-CSF，其优选通过使用MWCO 10kDa的孔径进行，然后过滤；

b.阳离子交换色谱以除去聚集的物质以及宿主蛋白质和DNA、更换缓冲液、和通过减少体积而浓缩G-CSF级分；

c.微量过滤步骤以除去不溶性杂质；

d.在适宜条件和环境温度下通过例如Jupiter C4执行的RP-HPLC纯化步骤，以除去疏水性较小的G-CSF亚型，其在G-CSF的主要级分之前洗脱；和除去G-CSF的氧化和还原衍生物；

e.超滤和渗滤步骤(例如切向流过滤)以浓缩纯化的G-CSF并将G-CSF调节成所需的制备物，优选通过使用MWCO 5kDa的孔径进行，并然后过滤

f.将纯化的G-CSF储存在优选2-8°C下

在说明书和实施例中对各个过程和纯化步骤作进一步解释。

图2：从包含体分离的纯化rhG-CSF的Western印迹分析。纯化的G-CSF蛋白质通过4-20%Tris-甘氨酸SDS-PAGE分离并显示印迹。Western印迹用一级抗G-CSF抗体温育并使用二级报告抗体显影。每加样孔各加载0.1μg蛋白质。3、7、9和13是空白道；2、8和14是分子量标记(Magic Mark XP)；4-6是通过实施例中说明的方法得到的G-CSF；10-12是作为参照的如4-6道与10-12道相比所示，和G-CSF跑到大约18kDa。结果，根据本发明方法得到的G-CSF明显没有附加谱带并可与相比。

图3:在本发明方法的RP-HPLC制备型纯化步骤之前或之后，分析型RP-HPLC对rhG-CSF制备物的分析。在重折叠并通过CEX色谱纯化之后，在RP-HPLC制备型色谱纯化步骤之前(A)或之后(B)获取G-CSF样品，并对其在60°C进行分析型RP-HPLC分析以确定样品的组成。G-CSF★表示疏水性较小的G-CSF亚型，而G-CSF指示主要级分。注意，在(A)中，用在RP-HPLC纯化步骤之前获取的样品，看得见在主要级分峰之前的附加峰(箭头)。在(B)中，用在RP-HPLC纯化步骤之后获取的样品，看得见主峰，而几乎完全找不到对应于(A)中由箭头突出显示的疏水性较小的G-CSF亚型的第二峰。

具体实施方式

本发明一般涉及与参照G-CSF相比具有最小量的疏水性较小的G-CSF亚型的，高度纯化和均质的G-CSF制备物的大规模的生产方法。更具体地，本发明涉及从生产G-CSF的重组细胞例如大肠杆菌获得G-CSF的方法，所述方法包括对来自包含体的重组G-CSF蛋白质进行增溶，通过在环境温度、优选>10°C的重折叠缓冲液内稀释所述增溶物来重折叠所述G-CSF分子，和通过色谱纯化所述重折叠的G-CSF，其中至少一个色谱步骤包括反相(RP)色谱。换言之，本发明的方法涉及从包含体获得生物活性的人G-CSF的方法，所述方法包含以下步骤：

(a)用含有变性剂和还原剂的增溶缓冲液来增溶包含体中所含的G-CSF；

(b)通过用含有还原型和氧化型谷胱甘肽的重折叠缓冲液在>10°C的温度下稀释增溶物来重折叠G-CSF；和

(c)通过包含反相(RP)色谱的至少一个色谱步骤来纯化重折叠的G-CSF。

根据本发明，术语“生物活性的人G-CSF”应理解为表示一种G-CSF制备物，其已经通过本发明的方法纯化并能够增强造血祖细胞的分化和增殖以及能够激活造血系统的某些成熟细胞。因此，依靠本发明方法得到的G-CSF适合治疗施用G-CSF有利的适应症。要理解，术语“生物活性的人G-CSF”还包括G-CSF的突变体和修饰体，它们的氨基酸序列与野生型序列相比较发生了改变，但具有与野生型G-CSF类似的生物活性。这也适用于G-CSF结合物。典型地，所述G-CSF是人重组G-CSF。优选，待纯化的G-CSF是在大肠杆菌细胞中产生的人甲二磺酰基(Met)G-CSF。

术语“疏水性较小的亚型”在本文中使用时是指通过例如Edman降解法和等电聚焦(IEF)凝胶或通过质谱所揭示的具有相同的质量、等电点和包含二硫桥的同样的肽图的一种G-CSF制备物/级分。此外，通过质谱均没有检出脂质加合物或异天冬氨酸。疏水性较小的G-CSF亚型的特征在于，在CD-光谱中，它与G-CSF参照相比，在近UV范围(OD260-320nm)有差异，表明α-螺旋结构的含量更高(所述亚型为66%，所述G-CSF参照为52%)。另外，主题G-CSF与其亚型的疏水性差异可以通过60°C时的分析型RP-HPLC证明。这些差异是在60°C施行的RP-HPLC色谱中，疏水性较小的亚型与G-CSF参照相比在较早的级分中被洗脱的原因所在。因此，本发明的G-CSF亚型可以依据它疏水性较小并且在60°C施行的RP-HPLC中在不同的级分中被洗脱的相异性质来定义，其中所述G-CSF亚型在主题G-CSF的主峰之前被洗脱；参见图3。表征样品的技术包括SDS-PAGE、IEF、UV、CD、荧光光谱学和NMR；也参见上文和实施例。将所有信息合在一起，疏水性较小的G-CSF亚型可以被最好地解释为三维结构稍有改变的折叠变体，这种三维结构被认为是一种错误折叠的形式。除去它应该使得药品更有效和安全。

如所提到的，本发明的G-CSF制备物基本不含疏水性较小的G-CSF亚型。术语“基本不含”疏水性较小的G-CSF亚型或“具有最小量”的疏水性较小的G-CSF亚型是指本发明的G-CSF制备物典型地含有小于5%的所述疏水性较小的G-CSF亚型，优选小于1%、有利地是小于0.2%的所述疏水性较小的G-CSF亚型。

根据本发明，术语“包含体”是指细胞内来自不正确折叠或部分正确折叠的重组表达蛋白质的不溶且紧凑的聚集体，其可以通过细胞裂解液的离心作为颗粒级分被分离。

术语“增溶”在本文中使用时，是指形成包含体的G-CSF通过用变性剂、例如离液剂和还原剂处理，破坏天然蛋白质中不存在的分子间和分子内相互作用从而产生重组G-CSF的单体分散体后，变得溶解。

根据本发明，术语“变性剂”是指一种试剂，其能够对蛋白质去折叠，由此导致天然蛋白质构象的减少或损失。用于增溶缓冲溶液的合适的离液剂或变性剂是尿素、盐酸胍、精氨酸、硫氰酸钠、pH极端物质(稀释的酸或碱)、去污剂(例如SDS、Sacrosyl)、盐(氯化物、硝酸盐、硫氰酸盐、三氯乙酸盐)、化学衍生化(亚硫酸盐解（sulfitolyse），碱性条件下和柠康酐（Citraconanhydrid）的反应)、溶剂(2-氨基-2-甲基-1-丙醇或醇类、DMSO、DMS)或强阴离子交换树脂例如Q-Sepharose。

尿素的适当浓度是1-9mol/l，优选5-9mol/l。盐酸胍的适当浓度是1-8mol/l，优选4-8mol/l。在本发明的一种优选实施方式中，变性剂是盐酸胍，优选其中盐酸胍的浓度是6.0mol/l；也参见实施例。

典型地，本发明方法中的增溶缓冲液除了变性剂之外还含有还原剂。合适的还原剂是还原型谷胱甘肽(GSH)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、半胱氨酸、β-巯基乙醇。优选，本发明方法中的还原剂是DTT。在本发明的一种实施方式中，增溶缓冲液中的还原剂浓度是1mmol/l至100mmol/l，优选1mmol/l至10mmol/l，并可以按照实施例进行调整。根据本发明，增溶缓冲液的合适的缓冲组分可以是三(羟甲基)-氨基甲烷或磷酸盐，其应该表现出碱性pH值，以允许二硫桥的还原。

为了确保有效和完全的增溶，需要包含体与增溶缓冲液的适当比率。根据本发明，使用每克包含体10ml至100ml增溶缓冲液，优选每克包含体1ml至80ml增溶缓冲液、最优选1ml至40ml增溶缓冲液，更优选>20ml/g且典型>30ml/g。

此外，在本发明的一种实施方式中，螯合剂例如乙二胺四乙酸盐(EDTA)或二甲基氨基乙醇(DMAE)被加到所述增溶和/或重折叠缓冲液中，以络合水溶液中的金属离子。一旦与EDTA结合，这些金属离子就倾向于不干扰去污剂的作用或不具有氧化还原剂的能力。另外，所述螯合剂抑制金属依赖性蛋白酶。在本发明的优选实施方式中，增溶缓冲液和/或重折叠缓冲液含有EDTA二钠，优选以0.5至10mM之间的浓度。

根据本发明，为了确保有效和完全的增溶，本发明方法中的增溶时间是1至10小时、优选4至8小时、最优选6±1小时或5.5至6.5小时。在另一个优选实施方式中，增溶过程在超过10°C、优选15-30°C之间、最优选20±2°C的环境温度下执行，即在与重折叠过程相同或相似的温度下；参见上文和实施例。

根据本发明，宿主细胞碎片应该从增溶的G-CSF中消除，以确保没有干扰物质妨碍重折叠过程。因此，所述增溶物在用重折叠缓冲液稀释之前优选经历过滤。例如，通过1.5μm滤器过滤，增溶的G-CSF蛋白与宿主细胞碎片、聚集的未折叠蛋白、G-CSF的二聚体、多聚体和/或未折叠蛋白分离。

G-CSF蛋白中的分子内二硫键通过添加包含氧化还原对的重折叠缓冲液促进其形成。“氧化还原对”是指还原型和氧化型硫醇试剂的混合物，包括例如还原型和氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)、半胱氨酸/胱氨酸、半胱胺/胱胺、DTT/GSSG、和DTE/GSSG、以及任何一个所提到的氧化还原对组分的混合物；参见，例如，Clark,Cur.Op.Biotech.12(2001),202-207。在本发明的一种实施方式中，氧化还原对是GSH/GSSG，其中还原型和氧化型谷胱甘肽的浓度各自为0.1mmol/l至20mmol/l，优选0.5mmol/l至10mmol/l，最优选0.2mmol/l至10mmol/l；参见实施例。

为了获得生物活性的G-CSF的重折叠可以在中性或碱性pH的缓冲溶液中执行。优选，重折叠过程在约8的pH值下执行。重折叠缓冲液可以包括其他添加剂以提高重折叠，例如，L-精氨酸或盐酸精氨酸(0.4-1mol/L)、PEG、低浓度变性剂例如尿素(1-2mol/L)和盐酸胍(0.5-1.5mol/L)、和去污剂(例如，Chaps，SDS，CTAB，月桂基麦芽糖苷，聚山梨醇酯和Triton X-100)。在本发明的一个优选实施方式中，重折叠缓冲液还含有精氨酸-HCl。

在已知的重折叠策略当中，稀释仍然是最简单的方法。在工业规模的应用中，稀释通常被用于包含体中表达的重组蛋白质的重折叠。典型地，通过使用达到最佳稀释水平所必需的量的含有增溶剂的稀释剂来混合/稀释含有溶解的蛋白质的溶液，一步完成稀释。当增溶剂浓度低于某个阈值水平时，所述蛋白质开始恢复它的生物活性的三维构象。取决于具体的蛋白质和所选择的折叠条件，重折叠在毫秒至秒内开始。在这个初始的突发阶段，蛋白质对聚集高度易感。为了使聚集最小化，蛋白质浓度必须保持得相当低，优选低于2mg/ml。在此初始重折叠阶段之后，蛋白质形成更致密的结构，最后形成对聚集的易感度降低的天然蛋白质构象。完全重折叠，包括形成二硫键，对于G-CSF可以在几小时内完成。为了确保有效和完全的复性，需要增溶物与重折叠缓冲液的适当比率。根据本发明，将所述增溶物用重折叠缓冲液以1比100、优选1比40、最优选1比20的比率稀释；也参见实施例。

术语“用重折叠缓冲液稀释”用于本发明的方法时，原则上包括将增溶物在预定量的重折叠缓冲液中稀释和将重折叠缓冲液倒入增溶物样品中。优选，所述增溶物在搅拌下被加到重折叠缓冲液中。在本发明的优选实施方式中，稀释过程持续约一小时。

如上所述，在本发明的方法中，在合适的氧化还原系统中的重折叠过程可以在小于半天以内，在环境温度、即通常超过10°C下实施，并有利地在3至4小时内，在室温下、即20±2°C下实施。环境温度可以在10°C和30°C之间、并优选在15°C和25°C之间、更优选在17°C和23°C之间、特别优选在19°C和21°C之间变化。重折叠时间可以适应于实施例中说明的条件。因此，当重折叠过程在大约20±2°C下持续约3至4小时，可以使用相同的时间范围，或者取决于重折叠过程是在低于18°C或超过22°C下执行可以增加或减少一个或两个小时。任何情况下，重折叠过程的持续时间小于12小时。

使用本发明的方法，来自包含体的总G-CSF蛋白质含量中的70%可以重折叠为生物活性的G-CSF。

重折叠过程可以通过将重折叠缓冲液的pH降低到酸性pH而终止。在本发明的一个优选实施方案中，使用乙酸将pH降低到3.0至6.5，优选降低到3.5至5.5，最优选降低到4.0。

一旦G-CSF蛋白质已经重折叠，则可以向蛋白质样品添加表面活性剂（tenside）或表面活性剂。在本发明的优选实施方式中，非离子型去污剂、优选聚山梨醇酯20或80、最优选聚山梨醇酯取决于G-CSF的进一步用途，以0.001至1%、优选0.05至0.1%、最优选0.05至0.06%或0.01%的终浓度被加到重折叠G-CSF蛋白质的样品中。

在许多情况下，重折叠体系在进一步处理之前进行过滤以除去高分子颗粒将是有利的，所述高分子颗粒往往是折叠期间形成的蛋白质聚集体。在本发明方法的一个优选实施方式中，将重折叠蛋白质溶液通过滤器级联过滤，优选通过10个1.2μm的滤器级联。继过滤之后，在保存步骤中储存溶液，在该步骤中优选环境温度如22±2°C；也参见图1和本发明所附实施例6中的表1。

为了在重折叠之后获得G-CSF制备物的更高产品浓度，可以对G-CSF蛋白进行渗析或渗滤以除去氧化还原对和/或其他不需要的缓冲液成分。因此，在此设置过滤过程以除去细胞碎片、不溶性污染蛋白和核酸的沉淀物。该步骤提供了经济地除去细胞碎片、污染性蛋白和沉淀物的方便的手段。在选择滤器或过滤方案中，必须确保在发生上游改变或变化的情况下有稳固的性能。保持良好净化性能和步骤收率之间的平衡，需要用各种过滤介质研究大量过滤方式。合适的滤器类型可以利用纤维素滤器、再生纤维素纤维、纤维素纤维结合无机助滤剂(例如硅藻土，珍珠岩，煅制二氧化硅)、纤维素纤维结合无机助滤剂和有机树脂、或其任何组合和聚合物过滤器(例子包括但是不限于尼龙、聚丙烯、聚醚砜)来获得有效清除。在一种实施方式中，使用5-10kDa UF膜和约8x缓冲液更换来实施过滤、例如超滤和渗滤步骤，其中缓冲液被乙酸钠和非离子型去污剂、例如pH 4的聚山梨醇酯80更换。

渗滤是将较小的分子清洗透过膜、将较大的目的分子留在保留物中的分级过程。对于去除或更换盐、去除去污剂、将游离分子与结合分子分离、去除低分子量物质、或快速改变离子或pH环境而言，这是一种方便有效的技术。所述过程典型使用微量过滤膜以从浆体取出目的产物，同时保持浆体浓度不变。

如上面描述的，本发明方法中必要的色谱纯化步骤包括反相(RP)色谱，特别是工业规模下的反相高压液相色谱(RP-HPLC)步骤。通过60°C的分析型RP-HPLC，可以看到在重折叠过程之后获得的G-GSF样品中疏水性较小的G-CSF亚型污染物，其特征为66%的α-螺旋含量和图3显示的洗脱曲线。如现有技术中所提到的，已经执行过不同的离子交换或疏水层析来纯化G-CSF，但尚未设想过在工业规模下使用RP-HPLC作为纯化步骤。

执行反相(RP)色谱的手段和方法对所属技术领域的专业人员来说是公知的。优选，反相(RP)色谱步骤是反相高压液相色谱(RP-HPLC)。典型地用包含甲基、丁基、苯基、丙基和/或辛基基团作为官能团的树脂并使用含有有机溶剂的流动相体系来执行RP-HPLC。在本发明方法的优选实施方式中，用市场上可买到的C4反相色谱材料执行RP-HPLC。示例性的反相材料是：Vydac 214TPB1015，C4，可得自Grace Davison；Daisopak SP-300-15-C4-BIO，可得自DAISO Fine Chem.GmbH；YMCGel ButylC4，15μ，300A，可得自YMC Europe GmbH；Jupiter15μ，C4,，300A，可得自Phenomenex。

在本发明方法的特别优选实施方式中，将Jupiter C4色谱树脂用于RP-HPLC中，Source 15RPC或Source 30RPC色谱树脂(供应商GEHealthcare)用于反相色谱中。Jupiter C4由硅胶颗粒构成，硅胶颗粒表面携带C4-烷基链。根据本发明，最优选使用Jupiter C4色谱的树脂；也参见实施例。

根据疏水性相互作用的强度差异，将G-CSF与蛋白质杂质分离开。用极性比水小的溶剂，例如水中的梯度乙腈、乙醇或甲醇，来执行洗脱，优选使用存在稀释的三氟乙酸的乙腈。藉此，疏水性较小的G-CSF亚型可以通过在不同的级分内洗脱而与G-CSF分离。通常，总G-CSF制备物中疏水性较小的亚型在比G-CSF标准品早的级分中被洗脱。G-CSF和疏水性较小的G-CSF亚型可以用线性梯度的有机溶剂洗脱，例如用含0至90%乙腈的水、即注射用水(WFI)并含有约0.1%TFA。优选，如实施例所述执行RP-HPLC。洗脱物优选被收集在预装有含聚山梨醇酯80的缓冲液的小瓶中；也参见上文和实施例。

如上文解释和实施例中说明，在本发明的方法中，反相色谱步骤之前典型是离子交换色谱。因此，在本发明的优选实施方式中，使用单一的离子交换色谱纯化G-CSF，以除去所有污染物如宿主细胞蛋白质，特别是内毒素和宿主细胞DNA。原则上，可以使用阳离子交换色谱或阴离子交换色谱。

在本发明方法的特别优选实施方式中，在重折叠的G-CSF被超滤和渗滤之后执行阳离子交换色谱(CEX)。如实施例中说明，用选择的材料(CMFF)执行CEX色谱可以有特别高的流速和良好的产物回收。由于在酸性环境中带正电荷的事实，G-CSF是一种强结合物，可以用线性氯化钠梯度在酸化的pH下以高浓度洗脱到小体积的所需缓冲液中。因此，根据本发明，在RP色谱之前、特别是RP-HPLC之前使用CEX步骤，用以更换缓冲液、浓缩G-CSF和除去G-CSF聚集体。执行阳离子交换色谱的手段和方法是所属技术领域的专业人员公知的；也参见背景部分、上文或供应商GE Healthcare叙述的现有技术。例如，可以使用市场上可买到的常规基质。在此，G-CSF在特定pH范围内由于它的正性总电荷与阳离子交换基质结合，而大部分污染物质如来源于宿主细胞的核酸、脂多糖和蛋白质以及G-CSF离子型亚型和具有不同pH值的G-CSF的改变形式不能和阳离子交换基质结合就会出现在通流中或可借助于洗涤除去。合适的阳离子交换基质包括但是不限于，羧甲基(CM)纤维素、AG 50W、Bio-Rex 70、羧甲基(CM)Sephadex、磺丙基(SP)Sephadex、羧甲基(CM)SepharoseCL-6B、CMSepharose HP、Hyper D-S陶瓷(Biosepra)和磺酸盐(S)Sepharose、SPSepharoseFF、SPSepharose HP、SPSepharose15XL、CMSepharoseFF、TSK凝胶SP 5PW、TSK凝胶SP-5PW-HR、Toyopearl SP-650M、Toyopearl SP-650S、Toyopearl SP-650C、Toyopearl CM-650M、ToyopearlCM-650S等。磺丙基基质、特别是产品SP Sepharose XL和SPSepharoseFF(Fast Flow)和S-Sepharose FF，可得自德国Freiburg的AmershamBiosciences(现在的GE Healthcare)。在一种实施方式中，阳离子交换材料是磺丙基阳离子交换材料。在本发明方法的优选实施方式中，离子交换色谱是阳离子交换色谱(CEX)并用CM-Sepharose FF执行；也参见实施例6和7。

阳离子交换色谱的合适缓冲液包括马来酸盐、丙二酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、乙酸、乙酸盐、磷酸盐、REPES、Bistris和Bicin缓冲液。在优选实施方式中，使用乙酸作为缓冲液成分。优选，缓冲液的浓度在10mM和100mM之间，优选在20mM和50mM之间。根据本发明，缓冲液中还包含表面活性剂，优选使用聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，最优选聚山梨醇酯80；也参见上文。通过利用pH值不高于6.0、优选不高于5.5的缓冲液，对G-CSF制备物进行纯化。通常用五个柱体积(CV)的由乙酸、聚山梨醇酯80组成的pH 5.5的平衡缓冲液对结合了G-CSF的柱子进行后续洗涤。

在阳离子交换色谱的情况下，可以通过增加pH值或增加离子强度来改变缓冲液，将G-CSF从柱上洗脱。优选，通过增加离子强度，优选通过使用线性氯化钠梯度，来完成洗脱。阳离子交换色谱的适宜条件可以取自相关的文献，例如2002年德国Freiburg的Amersham Biosciences（现在的GE Healthcare)的“离子交换色谱-原理和方法（Ion ExchangeChromatography-Principles and Methods）”和实施例7。

在本发明方法特别优选的实施方式中，纯化过程包括：

(i)超滤/渗滤步骤；

(ii)阳离子交换(CEX)色谱步骤；

(iii)微量过滤步骤；

(iv)反相(RP)色谱步骤；和

(v)超滤/渗滤步骤。

这种实施方式也在图1中显示并在实施例中说明。在第一(i)步超滤/渗滤中，缓冲液被酸性pH的乙酸钠、聚山梨醇酯80更换。最后，溶液通过10个1.2μm的滤器级联过滤。继过滤之后，溶液可以储存在22+2°C下(保存步骤)。色谱纯化步骤被设计用来除去细胞培养物组分、细菌细胞杂质和与方法与产物相关的杂质，并用来确保用于进一步处理的G-CSF的含量稳定。本发明高度纯化的G-CSF在后续的过滤和色谱步骤中得到富集；也参见图1。在本发明方法的另一种实施方式中，使从步骤(ii)阳离子交换色谱(CEX)得到的G-CSF制备物经历微量过滤步骤(iii)，其中从细胞匀浆液中除去可溶杂质。为了获得没有疏水性较小的亚型的纯G-CSF制备物，进一步执行步骤(iv)RP-HPLC。随后，最后的超滤/渗滤步骤被用作最终精整步骤，将G-CSF配制到它需要的缓冲液中。这适应了得到小的最终容积的制备物的需要，即RP-HPLC合并物中G-CSF的浓度必须强烈提高，以及适应了将RP-HPLC合并物配制在合适的缓冲液中以进一步稳定纯化的G-CSF的需要。

在已经实施本发明的不同纯化步骤之后，G-CSF纯度高，通过RP-HPLC和SDS-PAGE凝胶电泳测定分别达到了至少超过总蛋白的98%或甚至99%的纯度；也参见图2。此外，本发明的纯化的G-CSF制备物的二聚体/多聚体含量典型为<2%，优选<1%，而宿主细胞DNA或蛋白质的剩余污染物分别是<100ppm或<200ppm。另外，在一个优选实施方式中，内毒素的污染<5EU/mg，总生物负载<1CFU/10ml。此外，三氟乙酸(TFA)和乙腈的最终剩余含量分别<30ppm和<410ppm。

由于依照本发明方法得到的G-CSF制备物的高纯度和均质性，本发明的G-CSF制备物特别适于进一步衍生化。因此，在另一种实施方式中，本发明的方法还包括将依照所述方法得到的G-CSF进行化学改性，例如将水溶性聚合物例如聚乙二醇(PEG)共价连接至所述G-CSF。使聚乙二醇(PEG)和蛋白质结合是产生在人体内的时限延长的分子的重要技术。给G-CSF连接上10-至30-kDa的PEG部分能够：(1)通过使得蛋白质更可溶而防止蛋白沉淀，和(2)相比G-CSF聚集速率降低，这是由于PEG-G-CSF的溶解性是由PEG基团周围的水分子的有利溶剂化作用所介导。

术语“水溶性”是指在水中具有一定可检测溶解度的部分。示例性的水溶性聚合物包括肽、糖类、聚(醚)、聚(胺)、聚(羧酸)等等。水溶性聚合物的聚合物主链可以是聚(乙二醇)(即PEG)。

术语“水溶性聚合物”共价连接至G-CSF是指G-CSF多肽与至少一种聚合物之间的结合物，其中所述结合物通过所述聚合物的官能团与所述多肽的官能团之间的共价键连接形成。所述结合物可以包含一个或多个聚合物部分。几种合适的聚合物部分或聚合物包括聚(烷二醇)例如PEG和PPG，羟烷基淀粉例如羟乙基淀粉(HES)。在优选的实施方式中，所述水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。这样的聚乙二醇化的G-CSF包括单聚乙二醇化G-CSF和用两个或两个以上PEG分子改性的G-CSF。在另一个优选实施方式中，所述共价连接的聚合物大约10至30kDa，优选20kDa。G-CSF的化学改性方法，特别是聚乙二醇化，对所属技术领域的专业人员是公知的并描述在例如WO2008/124406中。

本发明还涉及通过以上限定的本发明方法得到的G-CSF制备物。因此，本发明的G-CSF制备物特别适于治疗应用。在本文中，本发明还涉及制造药物组合物的方法，所述方法包括如上所述制备和分离G-CSF，并提供这样制备和分离的G-CSF与可药用载体的混合物。

优选实施方式是生产重组G-CSF与可药用添加剂例如缓冲液、盐和稳定剂的药物组合物的方法，其中所述方法包括如上面所述获得本发明的G-CSF的方法。根据本发明得到的G-CSF可以(i)直接使用或(ii)进一步处理，例如如上所述的聚乙二醇化或参见WO 2008/124406，然后以冻干物的形式或液体形式储存。

G-CSF作为药物组合物的活性成分可以通过静脉内、动脉内、腹膜内、胸骨内、经皮、经鼻、吸入、局部、直肠、经口、眼内或皮下途径，用典型的方法给药。给药方法没有特别的限制，但是优选非口服给药，更优选皮下或静脉内给药。

重组表达的G-CSF的制剂中合适的佐剂是例如稳定剂如糖和糖醇、氨基酸和表面活性剂例如聚山梨醇酯20/80以及合适的缓冲物质。本发明G-CSF制剂的其它实施方式，参见例如WO 2009/027437和WO/2008/124406，它们的公开内容在此引为参考。制剂的例子也参见"ROTE LISTE 2004"中的商品和Granocyte。在本发明方法的优选实施方式中，将纯化的生物活性的G-CSF在pH 4.0的10mM乙酸、0.0025%聚山梨醇酯80和50g/l山梨糖醇中进行配制。

根据本发明方法得到的G-CSF的活性可以通过生物测定法测定，并与市场上可买到的G-CSF标准品的活性相比较。为此，在RPMI 1640培养基(Bachern,Heidelberg，德国)中培养对G-CSF起响应的小鼠细胞系NFS-60，所述培养基含有1.5g/l碳酸钠、4.5g/l葡萄糖、10mM Hepes和1.0mM丙酮酸钠，并补充有2mM谷氨酰胺、10%FCS、0.05mM 2-巯基乙醇和60ng/ml G-CSF。对于活性试验而言，将所述细胞用没有G-CSF的培养基洗涤两次，以每孔2x 10⁴个细胞的浓度放入96-孔板并在37°C和4.5%CO₂下分别与不同浓度的纯化G-CSF和标准品一起温育三天。随后，细胞用XTT试剂染色，并在微量滴定板读数器中测量450nm时的吸收。

根据本发明，可以表明用根据本发明纯化的G-CSF处理的细胞的生长与用标准品处理的细胞相同或更好。特别是，数据显示，根据本发明方法得到的纯化的G-CSF特征为，在NFS-60增殖试验中，其生物活性为WHO参照标准的80-125%。

本发明的药物组合物的特征为无菌并且无热原。在本文中使用时，“药物组合物”包括供人用和兽用的制剂。本发明的药物组合物的制备方法在本领域技术范围之内，例如，如以下文献所述：《雷明顿药物科学》，第17版（Remington's Pharmaceutical Science,17th ed.）,MackPublishing Company,Easton,Pa.(1985)和更新版本《雷明顿：药学科学与实践》（Remington:The Science and Practice of Pharmacy）(2000)，University of Sciences，Philadelphia,ISBN 0-683-306472,两个文件的整个公开内容在此引为参考。

这些还有其他实施方式由本发明的说明书和实施例公开和包涵。涉及本发明中使用的材料、方法、应用和化合物中任一项的其它文献，可以使用例如电子设备从公共图书馆和资料库检索到。例如，可以利用公众数据库“Medline”，其由国立卫生研究院（the National Institutes of Health）的国家生物技术信息中心（the National Center for Biotechnology Information）和/或国立医学图书馆（the National Library of Medicine）主办。其它数据库和网页地址，例如那些属于欧洲分子生物学实验室(EMBL)的欧洲生物信息研究所(EBI)的，是所属技术领域的专业人员知道的，并还可以使用因特网搜索引擎得到。生物技术方面专利信息的综述以及用于追溯检索和新近资料通告的相关专利信息源的纵览在Berks,TIBTECH 12(1994),352-364中提供。

以上公开内容一般性描述了本发明。除非另有说明，术语在本文中使用时给出的定义与《生物化学和分子生物学牛津词典》（Oxford Dictionaryof Biochemistry and Molecular Biology），Oxford University Press,1997,2000年修订和2003年再版,ISBN 0198506732中所提供的一样。在本说明书的整个文本中引用了若干文献。所有引用的参考(包括本申请中引用的文献参考、已授权的专利、公布的专利申请以及制造商的说明书、指导等等)中的内容，在此明确地引为参考；然而，并非承认引用的任何文献对于本发明构成现有技术。

通过参考以下具体实施例，可以获到更完全的了解，在此提供的实施例只为了例证说明的目的，并不意欲限制本发明的范围。特别是，所述实施例涉及本发明的优选实施方式。

具体实施方式

除非另有限定，所有在此使用的技术和科学的术语的含义与本技术领域的普通技术人员通常理解的相同(例如，分子遗传学，核酸化学，杂交技术，蛋白质化学和生物化学)。对化学方法以及分子、遗传和生化方法使用标准技术(后者通常参考，Sambrook等,《分子克隆：实验室手册》（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）,第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.和Ausubel等,《精编分子生物学实验指南》（Short Protocols in Molecular Biology）(1999)第4版,John Wiley&Sons,Inc.-和题为《现代分子生物学实验指南》（Current Protocols in Molecular Biology）的完整版，它们在此引为参考)。

实施例1：起始材料

G-CSF在源自于pBR322的表达载体03-221C-pHIP中表达。用这种质粒转化大肠杆菌宿主菌株BNN93进行生产。BNN93是大肠杆菌K12衍生株。通过λ启动子调节G-CSF合成，从30°C到42°C的温度变化可以诱导该启动子，导致在包含体中过表达一级不溶性G-CSF。

实施例2：发酵

一小瓶工作细胞库(WCB)内含物用1,000mL不含卡那霉素的复合培养基稀释后被用来产生“稀释的工作细胞库”供预发酵。在B级洁净室中的A级层流罩(LAF)中进行稀释。预培养物直接无菌转移到20L预发酵罐中。培养在30±1°C和250rpm的搅动下开始，为时6至12小时，直到OD₆₀₀达到0.3至0.6。完全发酵液被转移到预先装有不含卡那霉素的复合培养基的1,000L的发酵罐中。培养物在30±1°C和≥200rpm的搅动下温育，以确保pO₂≥30%和pH 7.0±0.2达9至11小时，直到OD₆₀₀达到5至7。

实施例3：包含体中的G-CSF表达

通过把温度提高到42°C来诱导G-CSF表达，并在≥200rpm搅动以确保pO₂≥30%下进一步温育6.75至7.25小时。在室温下通过盘式分离机以150L/h收获细菌细胞，产生100L左右的浓缩细胞悬液。

实施例4：包含体的分离

将浓缩的细胞悬液在pH 8.0的20mM磷酸钠中稀释到200L，并使用高压均质器以300L/h连续三次通过而匀浆。随后通过在17,000rpm以50L/h管式转筒离心，释放包含体。在pH 8.0的18mM磷酸钠、2%(w/v)Triton X-100、5mM EDTA中重悬浮10分钟后，将包含体再次在17,000rpm下以50L/h离心。用pH 8.0的18mM磷酸钠洗涤所得的沉淀团10分钟，接着再次在17,000rpm下以50L/h离心。沉淀团被重悬浮在注射用水(WFI)中并分成三等份。然后将包含体储存在<-15°C(保存步骤)。

实施例5：包含体的增溶和G-CSF的重折叠

将由1000升发酵液获得的总包含体量的三分之一解冻之后，通过在搅拌下在pH 8.0的25mM Tris、6M GuHCl、1mM EDTA中温育5.5到6.5小时，进行包含体的增溶，然后用1.5μm滤器进行过滤，例如深层过滤(澄清过滤)。然后在20+2°C下，通过在pH 8.0的25mM Tris、1mM谷胱甘肽(还原型)1mM谷胱甘肽(氧化型)、10mM EDTA中稀释，对G-CSF进行重折叠。然后添加聚山梨醇酯80至最终浓度0.01%(w/v)并用乙酸调节pH值到4.0。重折叠之后，实施超滤和渗滤步骤(MWCO 10kDa,8.4m²,大约8x缓冲液更换)，其中所述缓冲液被pH 4.0的10mM乙酸钠、0.01%(w/v)聚山梨醇酯80更换。最后，溶液通过10个1.2μm的滤器级联过滤。过滤之后，溶液被储存在22±2°C(保存步骤)。

实施例6：G-CSF纯化

色谱纯化步骤被设计用来除去细胞培养物化合物、细菌细胞杂质、方法和产物相关的杂质，并用来确保用于药物制剂的制备或后续的聚乙二醇化的G-CSF的含量稳定；参见以下实施例。本发明的方法概要在图1中给出并在下表1中描述。开展阳离子交换和RP-HPLC色谱的更详细说明由表2和3中的实施例7提供。

表1：所指出的工艺步骤中使用的缓冲液组合物

实施例7：阳离子交换色谱和反相高压液相色谱

渗滤过的浓缩物被加载到阳离子交换柱上(CMFF)。载样后，用五个柱体积(CV)的平衡缓冲液(20mM乙酸，0.004%(w/v)聚山梨醇酯80，pH 5.5)洗柱，使用线性氯化钠梯度，将结合的G-CSF从CM柱上洗脱到含有20mM pH 5.5的乙酸、0.004%(w/v)聚山梨醇酯80和大约50-80mg/ml 山梨糖醇的袋子中。洗脱曲线通过UV检测(280nm，260nm，和215nm)进行监测，并通过测量传导率控制梯度。根据传导率和吸光度特征鉴定洗脱的G-CSF。G-CSF集合级分的浓度通过UV280吸光度确定并稀释到≤1.6mg/mL。

表2：执行阳离子交换色谱的参数：CM

用0.45-0.22μm滤器单元过滤之后，将溶液施加于RP-HPLC柱并使用酸化的(TFA)乙腈梯度水溶液洗脱。洗脱曲线通过UV检测(280nm)进行监测。RP-HPLC集合物用分析型RP-HPLC(60°C)纯度数据鉴定，所述集合物用pH 4.0的10mM乙酸、0.0025%(w/v)聚山梨醇酯80，50mg/ml山梨糖醇通过切向流过滤进行超滤和渗滤(MWCO 5kDa,4.8m²,大约8x缓冲液更换)。

表3：执行反相色谱：Jupiter C4的参数

实施例8：装填、储存和运输

渗滤液用相同的缓冲液稀释到蛋白浓度为1.0±0.1mg/ml，然后直接双重过滤(两个级联的0.22μm滤器)到一个单次使用的袋子中(在过滤之前，初过滤器和LAF中的最终容器相连，终滤器预组装到50L一级包装袋上，通过辐射灭菌，在过滤和填充之后通过密封无菌断开)，用以储存在5±3°C(保存步骤)。

Claims (31)

1.从包含体获得生物活性的人G-CSF的方法，所述方法包含以下步骤：

(a)用含有变性剂和还原剂的增溶缓冲液来增溶包含体中所含的G-CSF；

(b)通过用含有还原型和氧化型谷胱甘肽的重折叠缓冲液在>10℃的温度下稀释增溶物来重折叠G-CSF；

(c)通过包含反相(RP)色谱的至少一个色谱步骤来纯化重折叠的G-CSF，其中与参照G-CSF相比，疏水性较低的G-CSF亚型被基本上移除；以及

(d)获得G-CSF制备物，其中所述疏水性较低的G-CSF亚型的含量保持在总G-CSF蛋白质的低于1％。

2.权利要求1的方法，其中变性剂是盐酸胍。

3.权利要求2的方法，其中盐酸胍的浓度是4.0mol/l到8.0mol/l。

4.权利要求1至3任一项的方法，其中还原剂是DTT。

5.权利要求1至3任一项的方法，其中增溶缓冲液中还原剂的浓度是1mmol/l至100mmol/l。

6.权利要求5的方法，其中增溶缓冲液中还原剂的浓度是1mmol/l至10mmol/l

7.权利要求1至3任一项的方法，其中使用每克包含体10ml至100ml增溶缓冲液。

8.权利要求1至3任一项的方法，其中增溶缓冲液和/或重折叠缓冲液还含有螯合剂。

9.权利要求8的方法，其中螯合剂为EDTA二钠。

10.权利要求1至3任一项的方法，其中增溶时间是1至10小时。

11.权利要求10的方法，其中增溶时间是4至8小时。

12.权利要求11的方法，其中增溶时间是6±0.5小时。

13.权利要求1至3任一项的方法，其中重折叠缓冲液还含有精氨酸-HCl。

14.权利要求1至3任一项的方法，其中还原型和氧化型谷胱甘肽的浓度各自是0.2mmol/l至10mmol/l。

15.权利要求1至3任一项的方法，其中增溶物用重折叠缓冲液以1比20的比率稀释。

16.权利要求1至3任一项的方法，其中重折叠在20±2℃进行至少3小时。

17.权利要求1至3任一项的方法，其中增溶物在用重折叠缓冲液稀释之前经历过滤。

18.权利要求1至3任一项的方法，其中反相(RP)色谱步骤是RP高压液相色谱(RP-HPLC)。

19.权利要求1至3任一项的方法，其中使用Jupiter C4、Source 15RPC或Source 30RPC色谱树脂。

20.权利要求19的方法，其中Jupiter C4色谱树脂被用在反相高压液相色谱(RP-HPLC)中。

21.权利要求1至3任一项的方法，其中RP色谱步骤之前是离子交换色谱。

22.权利要求21的方法，其中离子交换色谱是阳离子交换(CEX)色谱。

23.权利要求1至3任一项的方法，其中步骤(c)包括：

(i)超滤/渗滤步骤；

(ii)CEX色谱步骤；

(iii)微量过滤步骤；

(iv)RP色谱步骤；和

(v)超滤/渗滤步骤。

24.权利要求1至3任一项的方法，其还包括将水溶性聚合物共价连接至G-CSF。

25.权利要求24的方法，其中水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。

26.权利要求24或25的方法，其中所述聚合物的分子量为10kDa至30kDa。

27.权利要求26的方法，其中所述聚合物的分子量为20kDa。

28.通过权利要求1至27任一项的方法得到的G-CSF制备物，其中疏水性较低的G-CSF亚型的含量保持在总G-CSF蛋白质的低于1％。

29.生产包含重组G-CSF和选自缓冲液、盐和稳定剂的可药用添加剂的药物组合物的方法，其中所述方法包括权利要求1至27任一项用于获得G-CSF的方法。

30.权利要求29的方法，其中将纯化的生物活性的G-CSF在pH 4.0的10mM乙酸、0.0025％聚山梨醇酯80和50g/l山梨糖醇中进行配制。

31.药物组合物，其包含权利要求28的G-CSF制备物或通过权利要求29或30的方法得到的G-CSF制备物，其中疏水性较低的G-CSF亚型的含量保持在总G-CSF蛋白质的低于1％。