JP5964757B2 - 生物学的活性型組換えヒトｇ−ｃｓｆを得るための方法 - Google Patents

Description

本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、特に組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）を高度に活性かつ純粋な形態で生産するための手順に関する。これは、封入体中に含まれる可溶化したＧ−ＣＳＦを適切なレドックス系において周囲温度にてリフォールディングし、精製プロセスにおいて少なくとも１つの逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーステップを使用することにより達成される。

Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）は、主に単核細胞および線維芽細胞により放出される造血サイトカインであり、顆粒球系の前駆細胞の増殖および分化ならびに機能的に成熟した好中球の活性化を刺激する。前記特性のために、Ｇ−ＣＳＦは、例えば化学療法もしくは放射線治療後の正常な血液細胞集団の再構成において、または感染性病原体に対する免疫応答を刺激するためのような、様々な医療分野で用いられるようになってきた。したがって、病院では、Ｇ−ＣＳＦは、抗腫瘍療法において、特に化学療法の結果としての好中球減少症の治療において主に用いられ、骨髄移植においておよび感染症の治療においてさらに用いられる。組換えＧ−ＣＳＦを用いた最初の市販のＧ−ＣＳＦ製剤は、Ａｍｇｅｎから商標名Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）で製造され、流通されている。

ヒトＧ−ＣＳＦは、その天然に存在する形態で、約２０，０００ダルトンの分子量を有し、５個のシステイン残基を有する糖タンパク質である。これらの残基のうちの４個が２つの分子内ジスルフィド架橋を形成し、これらはタンパク質の活性について非常に重要である。Ｇ−ＣＳＦの組換え型は、医薬品を製造するために主に用いられ、これは、例えば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞のようなほ乳動物細胞または大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のような原核細胞における発現によって得ることができる。組換えタンパク質が原核生物で発現される場合、タンパク質は、多くの場合、宿主細胞内で少なくとも部分的に不活性な不溶性凝集体（屈折体、封入体ＩＢ）の形態で産生される。そのようなタンパク質を使用できる前に、それらを自身の活性形態に変換しなければならない。

前記封入体の形成は、それらの活性な立体配置を維持するために好適な手段の助けを借りて中程度の速度での遠心分離による封入体の単離後にタンパク質の可溶化および復元の必要性につながる。

封入体に由来する組換えタンパク質の復元のためのプロセスは、公知であり、例えば欧州特許第０１１４５０６号明細書、国際公開第８４／０３７１１号パンフレット、米国特許第４，５３０，７８７号明細書および欧州特許第０２４１０２２号明細書に記載されている。加えて、変性タンパク質の可溶化および復元に関する一般的技術は、欧州特許第０５１２０９７号明細書、欧州特許第０３６４９２６号明細書、欧州特許第０２１９８７４号明細書および国際公開第０１／８７９２５号パンフレットに記載され、さらにタンパク質化学に関する科学文献や標準的研究から抜粋することができる。

欧州特許第０５００１０８号明細書は、還元グルタチオン（ＧＳＨ）および酸化グルタチオン（ＧＳＳＨ）レドックスシャッフリング系を用いた封入体由来の不活性形態のヒト組換えＧ−ＣＳＦを活性化するための方法、およびある条件下におけるＧ−ＣＳＦの再活性化動態の分析を記載する。しかし、下流精製プロセスは開示されていない。

欧州特許第０７１９８６０号明細書では、Ｇ−ＣＳＦ含有封入体をＮ−ラウロイルサルコシン（サルコシル）で可溶化し、続いて硫酸銅を用いた空気酸化により、リフォールディングが達成された。この方法の短所は、副反応、例えばアミノ酸側鎖上のスーパーオキシドラジカルの形成である。さらに、リフォールディングプロセスは時間がかかり、標準化リフォールディングパラメータを得るのが困難である。最後に、クロマトグラフィーステップを含む変性剤の除去は、総タンパク質収率の約２０％の損失につながる。得られたＧ−ＣＳＦをその後、アニオン交換クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーにより精製する。

欧州特許第１６３０１７３号明細書および欧州特許第１８３７３４６号明細書は、還元グルタチオン（ＧＳＨ）および酸化グルタチオン（ＧＳＳＨ）レドックスシャッフリング系を用いて封入体からヒト組換えＧ−ＣＳＦを得る方法を記載し、ここでは、リフォールディングステップを低温にて半日以上実施する。したがって、工業規模では、このプロセスは、大量のタンパク質溶液を何時間にもわたって冷却するために、エネルギーとひいてはコストがかかる。結果として得られたＧ−ＣＳＦをその後、カチオン交換クロマトグラフィーにより精製する。

国際公開第２００７／００９９５０号パンフレットでは、欧州特許第１６３０１７３号明細書で教唆されているＧ−ＣＳＦの精製法が、カチオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーをその間の中間ステップなしに連続して実施するクロマトグラフィーステップに関してさらに詳細に記載されている。特に、クロマトグラフィー精製手順は、それぞれ疎水性相互作用クロマトグラフィーの前後に実施される連続した２つのカチオン交換クロマトグラフィーステップを含む。

しかし、精製されたＧ−ＣＳＦを治療等級で提供するための手段および方法は先行技術ではよく知られていたが、Ｇ−ＣＳＦを封入体から、特に商業的規模で得るための今までに利用可能なプロセスは、一般的に、時間や労力や費用がかかる。この技術的問題は、特許請求の範囲で特徴付けられ、以下でさらに記載される実施形態により解決される。加えて、以下でさらに記載するように、これらの実施形態は、構造的Ｇ−ＣＳＦアイソフォーム、したがって非常に均一なＧ−ＣＳＦ調製物の分離を提供する。

本発明は、Ｇ−ＣＳＦ産生組換え細胞から顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）を回収し、精製するための方法を提供する。前記方法は、封入体からの組換えタンパク質を可溶化し、可溶化物をリフォールディング緩衝液内に中程度の温度、好ましくは＞１０℃で単に希釈することによってＧ−ＣＳＦ分子をリフォールディングし、そしてクロマトグラフィーによりリフォールディングされたＧ−ＣＳＦを精製することを含み、ここで、少なくとも１つクロマトグラフィーステップは、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーを含んでいた。この方法は、一般的に、（ａ）封入体中に含まれるＧ−ＣＳＦを、変性剤および還元剤を含有する可溶化緩衝液で可溶化し、（ｂ）可溶化物を、還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンを含有するリフォールディング緩衝液で温度＞１０℃にて希釈することにより、Ｇ−ＣＳＦをリフォールディングし；そして（ｃ）リフォールディングされたＧ−ＣＳＦを、好ましくは逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーを含む少なくとも１つクロマトグラフィーステップにより精製することにより、特徴づけられる。

特に、１つの態様において、本発明は、１０℃を越える温度にて半日未満以内で、有利には室温にて、すなわち２０±２℃にて３〜４時間以内で実施される好適なレドックス系におけるリフォールディングプロセスに基づく。Ｇ−ＣＳＦ分子の効率的かつ正確な復元は、これらの条件下で達成することができるという事実の他に、上述の先行技術で記載される以前の方法の欠点を回避することができる。したがって、本発明の方法は、実施するのが容易であり、時間があまりかからず、エネルギーを消費する冷却システムを伴わない。

さらに、本発明の方法は、Ｇ−ＣＳＦの産生および回収の操作中に、６０℃で分析的逆相−高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を適用することにより見ることができるようになるだけの、少なくとも１つのＧ−ＣＳＦアイソフォーム（主な形態よりも若干疎水性が低いことが明らかになる）が形成されるという意外な観察に基づく（図３を参照）。誤って折り畳まれたこの追加的なＧ−ＣＳＦアイソフォームの構造的性質を詳細に調査し、後述するようにさらに特徴付けた。全調製物中の当該追加的なＧ−ＣＳＦアイソフォームの最大含有量は、全Ｇ−ＣＳＦタンパク質収率の７％までを占める可能性があった。ＣＤ分光法を用いた詳細な分析により、このＧ−ＣＳＦアイソフォームが、α−ヘリックス構造の含有量がより高い（アイソフォームについては６６％、Ｇ−ＣＳＦ基準については５２％）点で対象のＧ−ＣＳＦ基準と異なることが明らかになった。このさらなるアイソフォームの１つの特徴的な特性は、Ｇ−ＣＳＦ標準試料および本発明のＧ−ＣＳＦ調製物の主フラクションと比較して低い疎水性であり、その理由のために、それを調製物から分離することができ、したがってほぼ完全に除去することができる。その結果、ＲＰクロマトグラフィーステップおよび特にＲＰ−ＨＰＬＣを本発明の方法内にプロセスステップとして組み入れることは、改善された、すなわち高度に精製されたＧ−ＣＳＦ調製物をもたらし、これはこのアイソフォームおよびさらなる生成物に関連する不純物が実質的になく、すなわち低疎水性Ｇ−ＣＳＦアイソフォーム含有量が全Ｇ−ＣＳＦタンパク質の１％未満にとどまる。この状況において、ＲＰクロマトグラフィーは、本発明による方法の好ましい実施形態ではない疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）から区別される。したがって、Ｇ−ＣＳＦの精製に関して、ＲＰおよびＲＰ−ＨＰＬＣは、それぞれ、これまでのところ分析目的にのみ用いられてきた；例えば、国際公開第２００７／００９９５０号パンフレットを参照のこと。前述のクロマトグラフィー原理もまた、専門家の間では明確に区別されている（例えば、Bｉｏａｎａｌｙｔｉｋ， Ｆ． Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ， Ｈ． Ｚｏｒｂａｓ （ｅｄ．）， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ， Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄ． Ｖｅｒｌａｇ １９９８を参照のこと）。例えば、ＨＩＣは、典型的には水で溶出されるが、ＲＰは溶媒で溶出され、この場合、溶出は、より高濃度の溶媒、例えばアセトニトリルまたはエタノールへの勾配で行われる。好ましくは、クロマトグラフィーステップは、カチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーの適用の後に、適切な条件下でのＲＰ−高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む。

この状況において、封入体からＧ−ＣＳＦを得るための先行技術の方法では、Ｇ−ＣＳＦのアイソフォームも同様に形成されるが、先行技術で用いられる分析的ＲＰ−ＨＰＬＣの条件下では、アイソフォームは明らかでなかったので、今までは検出されなかったと考えるのが賢明である。さらに、そのようなＧ−ＣＳＦアイソフォームの存在は知られていなかったので、探す理由がなかった。

したがって、本発明の方法、特に分取ＲＰクロマトグラフィーステップおよびＲＰ−ＨＰＬＣステップは、それぞれ、Ｇ−ＣＳＦ、特に、前述の文書で記載されているものなどの好適なレドックス系での可溶化／復元後の封入体から得られるＧ−ＣＳＦのための精製プロセスで実施することができる。さらに、先行するカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーステップと組み合わせて、これらの２つのクロマトグラフィーステップは、結果として得られるＧ−ＣＳＦを薬剤として使用するために十分な等級でヒト組換えＧ−ＣＳＦを精製するために十分である。したがって、本発明の方法は、好ましくは、図１で概説し、実施例で説明するように実施することができるが、治療等級のＧ−ＣＳＦに到達するためには、ＣＥＸクロマトグラフィーおよびその後のＲＰ−ＨＰＬＣで十分であり、他の精製ステップは変更又は省略可能であることを当業者は理解するであろう。

要約すると、技術的複雑さならびにエネルギーコストを低レベルに保ちつつ最小の製造プロセスステップで実施可能な、純粋で生物学的に活性型のヒト組換えＧ−ＣＳＦを得る方法が提供され、ここで、結果として得られるＧ−ＣＳＦ調製物は、市販の基準製品と実質的に類似し、追加的なＧ−ＣＳＦアイソフォームを含まない。

本発明の方法にしたがって得られるＧ−ＣＳＦ調製物は、純度に関してＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーを利用しない先行技術の方法に従って得られたものと比較すると有利である。すなわち、Ｇ−ＣＳＦタンパク質分子に関してより均一である。さらに、本発明のＧ−ＣＳＦ調製物の均一性のために、本発明のＧ−ＣＳＦ調製物のインビボ活性が、これまでに市販されている組換えＧ−ＣＳＦ製品に対して改善され或いは少なくとも類似していると考えることが賢明である。これはさらに、薬物動態学的特性および薬力学的特性等が市場品と類似していることを示唆する。本発明の方法にしたがって得られるＧ−ＣＳＦは、したがって、ヒト医療における使用に特に適している。

加えて、本発明のＧ−ＣＳＦ調製物は、さらなる誘導体化に特に適している。なぜなら、このように化学的に修飾された生成物は、Ｇ−ＣＳＦ調製物の高純度および均一性を保持しているからである。したがって、さらなる実施形態において、本発明の方法は、前記方法にしたがって、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような水溶性ポリマーをＧ−ＣＳＦに共有結合させることにより得られるＧ−ＣＳＦの化学修飾をさらに含む。

さらに、前記事項を考慮して、本発明は、組換えＧ−ＣＳＦまたはその誘導体および薬学的に許容される添加剤、例えば緩衝液、塩および安定剤の医薬組成物の製造法に関し、前記方法は、本明細書中や特に実施例中で開示される、Ｇ−ＣＳＦを得るための方法を含む。好ましくは、精製された、生物学的に活性型のＧ−ＣＳＦまたはその誘導体、例えばペグ化Ｇ−ＣＳＦを、１０ｍＭ酢酸（ｐＨ４．０）、０．００２５％のポリソルベート８０および５０ｇ／ｌのソルビトール中に配合する。そのようにして得られた医薬組成物もまた本発明の対象である。

本発明の方法によるＧ−ＣＳＦの単離および精製手順を示すフローチャートスキーム。例示されるように、本発明の１つの好ましい実施形態において、生物学的に活性型のヒトＧ−ＣＳＦを封入体から精製し、得るプロセスは次のステップ：（ａ）発酵および回収ａ．封入体において高密度で蓄積するｒｈＧ−ＣＳＦを過剰発現した、ｒｈＧ−ＣＳＦ産生組換え細胞の培養；ｂ．封入体の単離；ｃ．変性緩衝液中で還元剤の使用による封入体の可溶化とそれに続くろ過；ｄ．リフォールディング緩衝液を供給し、可溶化混合物を前記リフォールド緩衝液中にワンステップ希釈プロセスで移すことにより達成されるリフォールディング（ここで、酸化型グルタチオンおよび還元型グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＨ）に基づくレドックス系を弱アルカリ性アルギニン塩酸塩緩衝液中で使用し、ステンレス鋼タンク中で１０℃を越える温度で少なくとも３時間インキュベートして、生物学的に活性型の可溶性ｒｈＧ−ＣＳＦを生成させる）、及びその後のろ過；（ｂ）可溶性ｒｈＧ−ＣＳＦの精製ａ．緩衝液を交換し、変性剤の濃度を減少させ、そしてリフォールディングされたＧ−ＣＳＦを、好ましくはＭＷＣＯ １０ｋＤａの孔サイズを用いることによって濃縮する、限外ろ過およびダイアフィルトレーションステップ、及びその後のろ過；ｂ．凝集種ならびに宿主タンパク質およびＤＮＡを除去し、緩衝液を交換し、そして容積減少によりＧ−ＣＳＦフラクションを濃縮するためのカチオン交換クロマトグラフィー；ｃ．不溶性不純物を除去するための精密ろ過ステップ；ｄ．Ｇ−ＣＳＦの主フラクションの前に溶出する低疎水性Ｇ−ＣＳＦアイソフォームを除去するための、例えばＪｕｐｉｔｅｒ Ｃ４により実施される、周囲温度にて好適な条件下でのＲＰ−ＨＰＬＣ精製ステップ；ならびにＧ−ＣＳＦの酸化および還元誘導体の除去ｅ．精製されたＧ−ＣＳＦを濃縮し、そして好ましくはＭＷＣＯ ５ｋＤａの孔サイズを用いることによりＧ−ＣＳＦを所望の処方中に調節するための、限外ろ過およびダイアフィルトレーションステップ（例えば、接線流ろ過）、及びその後のろ過；ｆ．精製されたＧ−ＣＳＦの、好ましくは２〜８℃での保存を含む。個々のプロセスおよび精製ステップは、明細書の詳細な説明の記載および実施例でさらに説明する。 封入体から単離された精製ｒｈＧ−ＣＳＦのウェスタンブロット分析。精製Ｇ−ＣＳＦタンパク質を４〜２０％のＴｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ブロットした。ウェスタンブロットを一次抗Ｇ−ＣＳＦ抗体とともにインキュベートし、そして二次レポーター抗体を用いて展開させた。スロットにつきそれぞれ０．１μｇのタンパク質をロードした。３、７、９および１３、空のレーン；２、８および１４、分子量マーカー（Ｍａｇｉｃ Ｍａｒｋ ＸＰ）；４〜６、実施例で示されるような方法により得られるＧ−ＣＳＦ；１０〜１２、基準としてのＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）。レーン１０〜１２と比較してレーン４〜６で示されるように、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）およびＧ−ＣＳＦは約１８ｋＤａで流れる。その結果、本発明の方法により得られるＧ−ＣＳＦは、見かけ上、余分なバンドがなく、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）に匹敵する。 本発明の方法によるＲＰ−ＨＰＬＣ分取精製ステップ前後のｒｈＧ−ＣＳＦ調整物の分析的ＲＰ−ＨＰＬＣ分析。リフォールディングおよびＣＥＸクロマトグラフィーによる精製後に、ＲＰ−ＨＰＬＣ分取クロマトグラフィー精製ステップの前（Ａ）および後（Ｂ）でＧ−ＣＳＦ試料を採取し、試料の組成を決定するために、６０℃で分析的ＲＰ−ＨＰＬＣ分析に供した。Ｇ−ＣＳＦ★はＧ−ＣＳＦの低疎水性アイソフォームを表し、一方、Ｇ−ＣＳＦは主フラクションを表す。試料をＲＰ−ＨＰＬＣ精製ステップ前に採取する（Ａ）において、主フラクションピークの前にさらなるピークが見られる（矢印）ことに注目。試料をＲＰ−ＨＰＬＣ精製ステップ後に採取する（Ｂ）では、主ピークが見られるが、（Ａ）で矢印により強調した、低疎水性Ｇ−ＣＳＦアイソフォームに対応する第２のピークは、ほぼ完全に消失している。

本発明は、概要、基準Ｇ−ＣＳＦと比較して低疎水性のＧ−ＣＳＦアイソフォームの含有量が最少化した、高度に精製された均一なＧ−ＣＳＦ調製物の大規模製造法に関する。さらに詳細には、本発明は、Ｇ−ＣＳＦ産生組換え細胞、例えば大腸菌からＧ−ＣＳＦを得る方法であって、封入体からの組換えＧ−ＣＳＦタンパク質の可溶化と、可溶化物をリフォールディング緩衝液内で周囲温度にて、好ましくは＞１０℃にて希釈することによるＧ−ＣＳＦ分子のリフォールディングと、クロマトグラフィーによるリフォールディングされたＧ−ＣＳＦの精製とを含む方法に関し、ここで、少なくとも１つクロマトグラフィーステップは、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーを含む。言い換えると、本発明の方法は、次のステップ：
（ａ）封入体中に含まれるＧ−ＣＳＦを、変性剤および還元剤を含有する可溶化緩衝液で可溶化するステップ；
（ｂ）可溶化物を、還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンを含有するリフォールディング緩衝液で１０℃を超える温度にて希釈することによりＧ−ＣＳＦをリフォールディングするステップ；および
（ｃ）逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーを含む少なくとも１つクロマトグラフィーステップによりリフォールディングされたＧ−ＣＳＦを精製するステップ
を含む、生物学的に活性型のヒトＧ−ＣＳＦを封入体から得るための方法に関する。

本発明によれば、「生物学的に活性型のヒトＧ−ＣＳＦ」という用語は、本発明による方法により精製され、造血前駆細胞の分化および増殖の増強ならびに造血系の成熟細胞の活性化が可能である、Ｇ−ＣＳＦ調製物を意味すると理解される。したがって、本発明による方法によって得られるＧ−ＣＳＦは、Ｇ−ＣＳＦの投与が有利である適応症の治療に好適である。「生物学的に活性型のヒトＧ−ＣＳＦ」という用語はさらに、そのアミノ酸配列が野生型配列と比べて改変されているが、野生型Ｇ−ＣＳＦと類似した生物学的活性を有する、Ｇ−ＣＳＦの変異体および修飾体も包含すると理解される。Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートについても同じことがいえる。典型的には、Ｇ−ＣＳＦはヒト組換えＧ−ＣＳＦである。好ましくは、精製されるＧ−ＣＳＦは、大腸菌細胞において産生されるヒトメチオニル（Ｍｅｔ）Ｇ−ＣＳＦである。

「低疎水性アイソフォーム」という用語は、本明細書中で用いられる場合、例えばエドマン分解および等電点電気泳動法（ＩＥＦ）ゲルにより、または質量分析法により明らかにされるように、同じ質量、等電点ならびにジスルフィド架橋を含む同じペプチドマッピングを有するＧ−ＣＳＦ調製物／フラクションを指す。さらに、脂質付加物もイソアスパラギン酸塩も質量分析法により検出することができない。低疎水性Ｇ−ＣＳＦアイソフォームは、α−ヘリックス構造のより高い含有量を示す（アイソフォームについては６６％、Ｇ−ＣＳＦ基準については５２％）、近紫外領域（ＯＤ２６０〜３２０ｎｍ）におけるＧ−ＣＳＦ基準と比較したＣＤスペクトルにおけるその差で特徴付けることができる。加えて、対象のＧ−ＣＳＦおよびそのアイソフォームの疎水性における差は、６０℃での分析的ＲＰ−ＨＰＬＣにより証明することができる。これらの差のために、低疎水性アイソフォームは、６０℃で適用されるＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーにおいてＧ−ＣＳＦ基準よりも早いフラクション中に溶出される。したがって、本発明によるＧ−ＣＳＦアイソフォームは、低疎水性であり、６０℃で適用されたＲＰ−ＨＰＬＣにおいて異なるフラクション中に溶出するというその顕著な特性により定義することができ、この場合、Ｇ−ＣＳＦアイソフォームは、対象Ｇ−ＣＳＦの主ピークの前に溶出される（図３を参照）。試料を特性化するための技術には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、ＵＶ、ＣＤ、蛍光分光法およびＮＭＲが含まれていた（上記および実施例も参照のこと）。全ての情報をまとめると、低疎水性Ｇ−ＣＳＦアイソフォームは、若干改変された３Ｄ構造を有するフォールディング変異体として最もよく説明され、これは誤って折り畳まれた形態と見なされる。その除去は、より効率的かつ安全な製剤をもたらすはずである。

前述のように、本発明のＧ−ＣＳＦ調製物は、低疎水性Ｇ−ＣＳＦアイソフォームを実質的に含まない。低疎水性Ｇ−ＣＳＦアイソフォームが「実質的に含まない」または「最小量」の低疎水性Ｇ−ＣＳＦアイソフォームを有するという用語は、本発明のＧ−ＣＳＦ調製物が、典型的には５％未満の低疎水性Ｇ−ＣＳＦアイソフォーム、好ましくは１％未満、有利には０．２％未満の低疎水性Ｇ−ＣＳＦアイソフォームを含有することを意味する。

本発明によれば、「封入体」という用語は、不正確に折り畳まれた、または部分的に正しく折り畳まれた組換え発現タンパク質由来の細胞内不溶性のコンパクトな凝集体を指し、これは、細胞溶解物の遠心分離により粒状フラクションとして単離することができる。

「可溶化」という用語は、本明細書中で用いられる場合、封入体を形成するＧ−ＣＳＦが、変性剤、例えばカオトロピック剤および還元剤での処理により溶解するようになり、それによりナイーブなタンパク質中には存在しない分子間および分子内相互作用が破壊され、これにより組換えＧ−ＣＳＦのモノマー分散液が得られることを意味する。

本発明によれば、「変性剤」という用語は、タンパク質をデフォールディングすることができ、したがって天然のタンパク質コンフォメーションの減少または喪失をもたらす薬剤をさす。可溶化緩衝液中での使用に関して、好適なカオトロピック剤または変性剤は、尿素、グアニジン−ＨＣＬ、アルギニン、チオシアン酸ナトリウム、ｐＨエクストリーム（希釈された酸または塩基）、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、Ｓａｃｒｏｓｙｌ）、塩（塩化物、硝酸塩、チオシアン酸塩、トリクロロ酢酸塩）、化学誘導体化（亜硫酸分解物、塩基と無水シトラコン酸に関する反応）、溶媒（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールもしくはアルコール、ＤＭＳＯ、ＤＭＳ）または強アニオン交換樹脂、例えばＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅである。

尿素の適切な濃度は、１〜９ｍｏｌ／ｌ、好ましくは５−９ｍｏｌ／ｌである。グアニジン−ＨＣｌの適切な濃度は、１〜８ｍｏｌ／ｌ、好ましくは４〜８ｍｏｌ／ｌである。本発明による好ましい実施形態において、変性剤はグアニジン−ＨＣｌであり、好ましくはこの場合、グアニジン−ＨＣｌの濃度は６．０ｍｏｌ／ｌである（実施例も参照のこと）。

典型的には、本発明の方法における可溶化緩衝液は、変性剤に加えて還元剤を含有する。好適な還元剤は、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、システイン、β−メルカプトエタノールである。好ましくは、本発明の方法における還元剤はＤＴＴである。本発明の１つの実施形態において、可溶化緩衝液中の還元剤の濃度は１〜１００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは１〜１０ｍｍｏｌ／ｌであり、実施例にしたがって調節することができる。本発明によれば、可溶化緩衝液の好適な緩衝液成分は、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタンまたはホスフェートであり得、これは、ジスルフィド架橋の還元を可能にするためには塩基性ｐＨ値を示さなければならない。

効率的かつ完全な可溶化を確実にするために、適切な比の封入体および可溶化緩衝液が必要とされる。本発明によれば、封入体１グラムあたり１０〜１００ｍｌの可溶化緩衝液を使用し、封入体１グラムあたり、好ましくは１〜８０ｍｌ、最も好ましくは１〜４０ｍｌ、さらに好ましくは＞２０ｍｌ／ｇ、典型的には＞３０ｍｌを使用する。

さらに、本発明の１つの実施形態において、キレート剤は、例えばエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）であるか、またはジメチルアミノエタノール（ＤＭＡＥ）を可溶化および／またはリフォールディング緩衝液に添加して、水溶液中で金属イオンと錯体形成する。一旦ＥＤＴＡと結合すると、これらの金属イオンは、界面活性剤の作用を妨害しないか、または還元剤を酸化する能力を有する傾向がある。加えて、金属依存性プロテアーゼは、キレート剤により阻害される。本発明の好ましい実施形態において、可溶化緩衝液および／またはリフォールディング緩衝液は、ＥＤＴＡ二ナトリウムを、好ましくは０．５〜１０ｍＭの濃度で含有する。

本発明によれば、効率的かつ完全な可溶化を確実にするためには、本発明の方法における可溶化時間は、１〜１０時間、好ましくは４〜８時間、最も好ましくは６±１時間または５．５〜６．５時間である。さらに好ましい実施形態において、可溶化プロセスは、１０℃を越える周囲温度で、好ましくは１５〜３０℃、最も好ましくは２０±２℃で、すなわち、リフォールディングプロセスと同じかまたは類似した温度で実施される（上記および実施例を参照のこと）。

本発明にしたがって、宿主細胞片を可溶化されたＧ−ＣＳＦから除去して、リフォールディングプロセスを妨害するかく乱物質がないことを確実にすべきである。したがって、可溶化物を好ましくはろ過に供した後、リフォールディング緩衝液で希釈する。例えば、可溶化されたＧ−ＣＳＦタンパク質を、宿主細胞片、凝集した折り畳まれていないタンパク質、二量体、多量体および／またはＧ−ＣＳＦの折り畳まれていないタンパク質から、１．５μｍフィルターを通したろ過により分離する。

Ｇ−ＣＳＦタンパク質における分子内ジスルフィド結合形成は、レドックス対を含むリフォールディング緩衝液の添加により促進される。「レドックス対」は、還元型および酸化型チオール試薬の混合物を指し、例えば、還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）、システイン／シスチン、システアミン／シスタミン、ＤＴＴ／ＧＳＳＧ、およびＤＴＥ／ＧＳＳＧならびに前述のレドックス対成分のいずれか１つの混合物が挙げられる（例えば、Ｃｌａｒｋ， Ｃｕｒ． Ｏｐ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １２ （２００１）， ２０２−２０７を参照のこと）。本発明の１つの実施形態において、レドックス対はＧＳＨ／ＧＳＳＧであり、ここで、還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンの濃度は、それぞれ０．１〜２０ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．５〜１０ｍｍｏｌ／ｌ、最も好ましくは０．２〜１０ｍｍｏｌ／ｌである（実施例も参照のこと）。

生物学的に活性型のＧ−ＣＳＦを達成するためのリフォールディングは、中性または塩基性ｐＨの緩衝液中で実施することができる。好ましくは、リフォールディングプロセスは、約８のｐＨ値で実施される。リフォールディング緩衝液は、リフォールディングを増強するための他の添加剤、例えばＬ−アルギニンまたはアルギニン塩酸塩（０．４〜１ｍｏｌ／ｌ）；ＰＥＧ；低濃度の変性剤、例えば尿素（１〜２ｍｏｌ／ｌ）およびグアニジン−ＨＣｌ（０．５〜１．５ｍｏｌ／ｌ）；ならびに界面活性剤（例えば、Ｃｈａｐｓ、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、ラウリルマルトシド、ポリソルベート８０／Ｔｗｅｅｎ８０（コピーライト）、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を含み得る。本発明の１つの好ましい実施形態において、リフォールディング緩衝液はアルギニン−ＨＣｌをさらに含有する。

既知リフォールディング戦略のうち、希釈は依然として最も簡単な方法である。工業規模の適用において、希釈は、通常、封入体中で発現された組換えタンパク質のリフォールディングに用いられる。典型的には、希釈は、可溶化したタンパク質を含有する溶液を、最適レベルの希釈に達するために必要な量で可溶化剤を含有する希釈剤と混合／希釈することにより１ステップで実施される。可溶化剤の濃度がある閾値レベルよりも低い場合、タンパク質はその生物学的に活性型の３次元コンフォメーションを回復し始める。特定のタンパク質および選択されたフォールディング条件によって、リフォールディングは数ミリ秒から数秒の範囲内で開始する。この初期バースト相では、タンパク質は非常に凝集しやすい。凝集を最小限に抑えるために、タンパク質濃度をかなり低く、好ましくは２ｍｇ／ｍｌ未満に保たなければならない。この初期リフォールディング相後、タンパク質はよりコンパクトな構造を形成し、最後に、凝集しにくい天然のタンパク質コンフォメーションになる。ジスルフィド結合の形成をはじめとする完全なリフォールディングは、Ｇ−ＣＳＦについては数時間以内に達成することができる。効率的かつ完全な復元を確実にするためには、適切な比の可溶化物とリフォールディング緩衝液が必要となる。本発明によれば、可溶化物をリフォールディング緩衝液で１：１００、好ましくは１：４０、最も好ましくは１：２０の比で希釈する（実施例も参照のこと）。

「リフォールディング緩衝液で希釈する」という用語は、本発明の方法にしたがって用いられる場合、原則として、可溶化物をあらかじめ決められた量のリフォールディング緩衝液中に希釈し、リフォールディング緩衝液を可溶化物試料中に注ぐことを含む。好ましくは、可溶化物を撹拌下でリフォールディング緩衝液に添加する。本発明の好ましい実施形態において、希釈プロセスは約１時間持続する。

前述のように、本発明の方法では、好適なレドックス系におけるリフォールディングプロセスは、周囲温度、すなわち通常、１０℃を超える温度にて半日未満以内で、有利には室温、すなわち２０±２℃にて３〜４時間以内で実施することができる。周囲温度は、１０℃から３０℃の間で変化し得、好ましくは１５℃〜２５℃、さらに好ましくは１７℃〜２３℃、特に好ましくは１９℃〜２１℃である。リフォールディングの時間は、実施例で示される状態に対応させることができる。したがって、約２０±２℃でのリフォールディングプロセスが約３〜４時間持続する間、同じ時間枠またはそれより１もしくは２時間長いかもしくは短い時間枠のいずれかを、リフォールディングプロセスが１８℃未満または２２℃以上で実施されるかどうかに依存して、用いることができる。いずれにせよ、リフォールディングプロセスの期間は１２時間未満である。

本発明の方法を使用して、封入体由来の全Ｇ−ＣＳＦタンパク質含有量の７０％を生物学的に活性型のＧ−ＣＳＦにリフォールディングし得る。

リフォールディングプロセスは、リフォールディング緩衝液のｐＨを酸性ｐＨまで低下させることによって停止させることができる。本発明の１つの好ましい実施形態において、酢酸を用いて、ｐＨを３．０〜６．５、好ましくは３．５〜５．５、最も好ましくは４．０に低下させる。

Ｇ−ＣＳＦタンパク質がリフォールディングされたら、表面活性剤（tenside）または界面活性剤をタンパク質試料に添加することができる。本発明の好ましい実施形態において、非イオン性界面活性剤、好ましくはポリソルベート２０または８０、最も好ましくはポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０（コピーライト））をリフォールディングされたＧ−ＣＳＦタンパク質の試料に、Ｇ−ＣＳＦのさらなる使用に応じて、０．００１〜１％、好ましくは０．０５〜０．１％の終濃度で、最も好ましくは０．０５〜０．０６％または０．０１％の終濃度で添加する。

多くの場合、フォールディング中に形成されるタンパク質凝集体であることが多い高分子粒子を除去するために、さらなる処理の前にリフォールディングセットアップをろ過に供すのが有利であろう。本発明の方法の１つの好ましい実施形態において、リフォールディングされたタンパク質溶液を、フィルターカスケードを通して、好ましくは１０μｍおよび１．２μｍのフィルターカスケードを通してろ過する。ろ過後、溶液をホールディングステップで保存することができ、この場合、２２±２℃などの周囲温度が好ましい（図１および本発明の添付の実施例６における表１も参照のこと）。

リフォールディング後に得られるＧ−ＣＳＦのより高い生成物濃度を達成するために、Ｇ−ＣＳＦタンパク質を透析またはダイアフィルトレーションして、レドックス対および／または他の不要な緩衝液成分を除去することができる。したがって、ろ過プロセスをここで適用して、細胞片、不溶性夾雑タンパク質および核酸沈殿物を除去する。このステップは、細胞片、夾雑タンパク質および沈殿物を経済的に除去する便利な手段を提供する。フィルターまたはフィルタースキームを選択する際に、上流の変化または変動が起こる場合には、ロバスト性能を確実にする必要性がある。良好な清澄化性能とステップ収率との間のバランスを維持することは、種々のろ過媒体を有する多種多様なフィルター型の検討を必要とする。好適なフィルター型は、セルロースフィルター、再生セルロース繊維、無機ろ過助剤（例えば、珪藻土、パーライト、ヒュームドシリカ）と組み合わせたセルロース繊維、無機ろ過助剤および有機樹脂と組み合わせたセルロース繊維、またはそれらの任意の組み合わせ、およびポリマーフィルター（例としては、これらに限定されるものではないが、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホンが挙げられる）を利用して、有効な除去を達成することができる。１つの実施形態において、ろ過、例えば限外ろ過およびダイアフィルトレーションステップは、５〜１０ｋＤａのＵＦ膜および約８×緩衝液交換を用いて実施され、この場合、緩衝液は、酢酸ナトリウムおよび非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０（ｐＨ４）により交換される。

ダイアフィルトレーションは、膜を通してより小さな分子を洗い流す分画プロセスであり、目的のより大きな分子が保留物中に残る。これは、塩の除去もしくは交換、界面活性剤の除去、結合分子からの遊離分子の分離、低分子量材料の除去、またはイオン性もしくはｐＨ環境の迅速な変更のための便利かつ効率的な技術である。プロセスは、典型的にはスラリー濃度を一定に維持しつつ、スラリーから目的の生成物を除去するために、精密ろ過膜を使用する。

前述のように、本発明の方法において必須のクロマトグラフィー精製ステップは、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィー、特に工業規模の逆相−高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ステップを含む。６０℃での分析的ＲＰ−ＨＰＬＣにより、リフォールディングプロセス後に得られるＧ−ＧＳＦ試料中の低疎水性Ｇ−ＣＳＦアイソフォーム汚染物質を可視化することが可能であり、これは、６６％のαヘリックス含有量および図３で示される溶出プロファイルにより特徴づけられる。従来技術で記載されているように、Ｇ−ＣＳＦを精製するために様々なイオン交換または疎水性クロマトグラフィーステップが実施されてきたが、工業規模での精製ステップとしてＲＰ−ＨＰＬＣは想定されなかった。

逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーを実施するための手段および方法は、当業者に周知である。好ましくは、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーステップは、逆相−高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）である。典型的には、ＲＰ−ＨＰＬＣは、メチル基、ブチル基、フェニル基、プロピル基および／またはオクチル基を官能基として含有する樹脂を用い、有機溶媒含有移動相システムを使用して実施される。本発明の方法の好ましい実施形態において、ＲＰ−ＨＰＬＣは、市販のＣ４逆相クロマトグラフィー材料を用いて実施する。例示的逆相材料は：Ｇｒａｃｅ Ｄａｖｉｓｏｎから入手可能なＶｙｄａｃ ２１４ＴＰＢ１０１５， Ｃ４；ＤＡＩＳＯ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍ．社から入手可能なＤａｉｓｏｐａｋ ＳＰ−３００−１５−Ｃ４−ＢＩＯ；ＹＭＣ Ｅｕｒｏｐｅ社から入手可能なＹＭＣ Ｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ Ｓｐｈａｒｉｓｃｈ Ｃ４， １５μ， ３００Ａ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘから入手可能なＪｕｐｉｔｅｒ １５μ， Ｃ４， ３００Ａである。

本発明の方法の特に好ましい実施形態において、Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４クロマトグラフ用樹脂をＲＰ−ＨＰＬＣで使用し、Ｓｏｕｒｃｅ １５ ＲＰＣまたはＳｏｕｒｃｅ ３０ ＲＰＣクロマトグラフ用樹脂（供給元ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＲＰクロマトグラフィーで使用する。Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４は、シリカゲル粒子から構成され、その表面はＣ４−アルキル鎖を有する。本発明によれば、Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４クロマトグラフ用樹脂が最も好ましく用いられる（実施例も参照のこと）。

タンパク性不純物からのＧ−ＣＳＦの分離は、疎水性相互作用の強度の差に基づく。溶出は、水よりも極性の低い溶媒、例えばアセトニトリル、エタノールまたはメタノールの水中勾配で、好ましくは希トリフルオロ酢酸の存在下でアセトニトリルを用いて実施する。それにより、Ｇ−ＣＳＦの低疎水性アイソフォームは、異なるフラクション内で溶出されることにより、Ｇ−ＣＳＦから分離することができる。通常、全Ｇ−ＣＳＦ調製物の低疎水性アイソフォームは、Ｇ−ＣＳＦ標準よりも早いフラクション中に溶出される。Ｇ−ＣＳＦおよび低疎水性Ｇ−ＣＳＦアイソフォームは、有機溶媒の直線的勾配、例えば水、すなわち注射用水（ＷＦＩ）中０〜９０％のアセトニトリルで約０．１％のＴＦＡを含むもので溶出させることができる。好ましくは、ＲＰ−ＨＰＬＣを実施例で記載するように実施する。溶出液を好ましくは、ポリソルベート８０を含有する緩衝液であらかじめ満たしたバイアル中に集める（上記および実施例も参照のこと）。

上述し、実施例で説明するように、本発明の方法において、ＲＰクロマトグラフィーステップは、典型的には、イオン交換クロマトグラフィーの後に行われる。したがって、本発明の好ましい実施形態において、Ｇ−ＣＳＦは、宿主細胞タンパク質、特にエンドトキシンおよび宿主細胞ＤＮＡのようなすべての汚染物質を除去するために、単一のイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製する。原則として、カチオン交換クロマトグラフィーまたはアニオン交換クロマトグラフィーを用いることができる。

本発明の方法の特に好ましい実施形態において、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）は、リフォールディングされたＧ−ＣＳＦが限外ろ過またはダイアフィルトレーションされた後に実施する。実施例で示すように、選択された材料を用いるＣＥＸクロマトグラフィーステップ（ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ）を実施し、これにより特に高い流速および良好な生成物回収が可能になる。酸性環境では正に荷電するという事実のために、Ｇ−ＣＳＦは強力なバインダーであり、酸性化ｐＨの直線的塩化ナトリウム勾配で、所望の緩衝液中高濃度の小容積で溶出される。したがって、本発明にしたがって、ＣＥＸステップを、ＲＰクロマトグラフィーの前、特にＲＰ−ＨＰＬＣの前に、緩衝液交換、Ｇ−ＣＳＦの濃縮およびＧ−ＣＳＦ凝集体の除去のために使用する。カチオン交換クロマトグラフィーを実施するための手段および方法は当業者に周知である（上記背景の部分で記載する先行技術または供給元ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅも参照のこと）。例えば、従来の市販のマトリックスを使用することができる。ここで、Ｇ−ＣＳＦは、その正の全電荷のために特定のｐＨ範囲内でカチオン交換マトリックスと結合し、一方、ほとんどの汚染物質、例えば宿主細胞に由来する核酸、リポポリサッカライドおよびタンパク質ならびにＧ−ＣＳＦのイオン異性体および異なるｐＨ値を有するＧ−ＣＳＦの改変された形態は、結合することができず、フロースルー中で見られるか、または洗浄により除去される。好適なカチオン交換マトリックスとしては、これらに限定されるものではないが、カルボキシメチル（ＣＭ）セルロース、ＡＧ ５０ Ｗ、Ｂｉｏ−Ｒｅｘ ７０、カルボキシメチル（ＣＭ）Ｓｅｐｈａｄｅｘ、スルホプロピル（ＳＰ）Ｓｅｐｈａｄｅｘ、カルボキシメチル（ＣＭ）セファロースＣＬ−６Ｂ、ＣＭセファロースＨＰ、Ｈｙｐｅｒ Ｄ−Ｓセラミック（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）およびスルホネート（Ｓ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ １５ ＸＬ、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＴＳＫゲルＳＰ ５ＰＷ、ＴＳＫゲルＳＰ−５ＰＷ−ＨＲ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ−６５０Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ−６５０Ｓ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ−６５０Ｃ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭ−６５０Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭ−６５０Ｓなど、スルホプロピルマトリックス、特に製品ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬおよびＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）およびＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ（現在は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により入手可能）が挙げられる。１つの実施形態において、カチオン交換材料は、スルホプロピルカチオン交換材料である。本発明の方法の好ましい実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーはカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）であり、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦで実施される（実施例６および７も参照のこと）。

カチオン交換クロマトグラフィーに好適な緩衝液としては、マレイン酸塩、マロン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酢酸、酢酸塩、リン酸塩、ＲＥＰＥＳ、ＢｉｓｔｒｉｓおよびＢｉｃｉｎ緩衝液が挙げられる。好ましい実施形態において、酢酸を緩衝液成分として使用する。好ましくは、緩衝液の濃度は、１０〜１００ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ〜５０ｍＭにある。本発明によれば、表面活性剤も緩衝液中に含まれ、好ましくはポリソルベート２０または８０、最も好ましくはポリソルベート８０が用いられる（これもまた上記参照）。Ｇ−ＣＳＦ調製物の精製は、６．０以下、好ましくは５．５以下の緩衝液のｐＨ値を使用することにより実施される。その後、Ｇ−ＣＳＦが結合しているカラムの洗浄は、通常、酢酸、ポリソルベート８０（ｐＨ５．５）から構成される、５カラム容積（ＣＶ）の平衡緩衝液により実施される。

Ｇ−ＣＳＦを、緩衝液の変更によって、カチオン交換クロマトグラフィーの場合にはｐＨ値の増加によるか、またはイオン強度の増加によって、カラムから溶出させることができる。好ましくは、溶出は、イオン強度を増加させることにより、好ましくは直線的塩化ナトリウム勾配を使用することにより、実施される。カチオン交換クロマトグラフィーに好適な条件は、関連する文献、例えばマニュアル“Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ − Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ” ｂｙ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｆｒｅｉｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ （現在はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）， ２００２および実施例７に準ずることができる。

本発明の方法の特に好ましい実施形態において、精製プロセスは：
（ｉ）限外ろ過／ダイアフィルトレーションステップ；
（ｉｉ）カチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーステップ：
（ｉｉｉ）精密ろ過ステップ；
（ｉｖ）逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーステップ；および
（ｖ）限外ろ過／ダイアフィルトレーションステップ
を含む。

この実施形態をさらに図１で示し、実施例で説明する。最初の（ｉ）ステップである限外ろ過／ダイアフィルトレーションでは、緩衝液を酢酸ナトリウム、ポリソルベート８０（酸性ｐＨ）により交換する。最後に、１０μｍおよび１．２μｍのフィルターカスケードを通して溶液をろ過する。ろ過後、溶液を２２±２℃で保存することができる（ホールドステップ）。クロマトグラフィー精製ステップは、細胞培養成分、細菌細胞不純物ならびにプロセス関連および生成物関連不純物を除去し、さらなるプロセスのために一貫したＧ−ＣＳＦ含有量を保証するように設計される。本発明による高度に精製されたＧ−ＣＳＦの濃縮は、その後のろ過およびクロマトグラフィーステップで実施される（これもまた図１を参照のこと）。本発明の方法のさらなる実施形態において、ステップ（ｉｉ）カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）から得られるＧ−ＣＳＦ調製物を精密ろ過ステップ（ｉｉｉ）に供し、ここで、可溶性不純物を細胞ホモジネートから除去する。低疎水性アイソフォームのない純粋なＧ−ＣＳＦ調製物を得るために、ステップ（ｉｖ）ＲＰ−ＨＰＬＣをさらに実施する。その後、最終の限外ろ過／ダイアフィルトレーションステップを最終仕上げステップとして実施し、Ｇ−ＣＳＦをその所望の緩衝液中に配合する。これは、小さい最終容積の調製物を得る必要性に対応する。すなわち、ＲＰ−ＨＰＬＣプール中のＧ−ＣＳＦの濃度は、強く増大させなければならず、そしてＲＰ−ＨＰＬＣプールを好適な緩衝液中に配合して、精製されたＧ−ＣＳＦをさらに安定化させなければならない。

本発明による各種精製ステップを実施した後、Ｇ−ＣＳＦ純度は高く、それぞれＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により測定して、全タンパク質の少なくとも９８％またはさらには９９％を越える純度に達する（図２も参照のこと）。さらに、本発明による精製されたＧ−ＣＳＦ調製物の二量体／多量体含有量は、典型的には＜２％、好ましくは＜１％であり、一方、宿主細胞ＤＮＡの残りの汚染物は、それぞれ、≦１００ｐｐｍまたは≦２００ｐｐｍの宿主細胞タンパク質である。さらに、１つの好ましい実施形態において、エンドトキシンによる汚染は≦５ＥＵ／ｍｇであり、総バイオバーデンは＜１ＣＦＵ／１０ｍｌである。さらに、残留トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびアセトニトリルの最終含有量は、それぞれ、≦３０ｐｐｍおよび≦４１０ｐｐｍである。

本発明の方法にしたがって得られるＧ−ＣＳＦ調製物の高純度および均一性のために、本発明のＧ−ＣＳＦ調製物は、さらなる誘導体化に特に適している。したがって、さらなる実施形態において、本発明の方法は、前記方法にしたがって得られるＧ−ＣＳＦの、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーをＧ−ＣＳＦに共有結合させることによる化学修飾をさらに含む。タンパク質に対するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）共役は、ヒトの体内での持続時間が長い分子を産生するための重要な技術である。１０〜３０ｋＤａのＰＥＧ部分のＧ−ＣＳＦに対する付着は、（１）タンパク質をより可溶性にすることによりタンパク質沈殿を防止し、そして（２）ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ溶解度がＰＥＧ基の周りの水分子の有利な溶媒和によって媒介されるという事実のために、Ｇ−ＣＳＦよりも凝集速度を低下させる能力を有し得る。

「水溶性」という用語は、水中で検出可能な程度の溶解性を有する分子を指す。例示的水溶性ポリマーとしては、ペプチド、サッカライド、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）などが挙げられる。水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）（すなわち、ＰＥＧ）であり得る。

Ｇ−ＣＳＦに共有結合する「水溶性ポリマー」という用語は、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドと少なくとも１つのポリマーとの間のコンジュゲートを指し、コンジュゲートは、ポリマーの官能基とポリペプチドの官能基との間の共有結合により形成される。コンジュゲートは、１以上のポリマー分子を含み得る。いくつかの好適なポリマー分子またはポリマーとしては、ポリ（アルキレングリコール）、例えばＰＥＧおよびＰＰＧ、ヒドロキシアルキルデンプン、例えばヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）が挙げられる。好ましい実施形態において、前記水溶性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。そのようなペグ化Ｇ−ＣＳＦとしては、モノペグ化Ｇ−ＣＳＦおよび２以上のＰＥＧ分子で修飾されたＧ−ＣＳＦが挙げられる。さらに好ましい実施形態において、前記共有結合ポリマーは、約１０〜３０ｋＤａ、好ましくは２０ｋＤａである。Ｇ−ＣＳＦの化学修飾法、特にペグ化は、当業者に周知であり、例えば、国際公開第２００８／１２４４０６号パンフレットに記載されている。

本発明はさらに、前記定義のような本発明の方法により得られるＧ−ＣＳＦの調製物に関する。したがって、本発明のＧ−ＣＳＦ調製物は、治療用途に特に適している。この状況において、本発明はさらに、医薬組成物を製造するためのプロセスに関し、このプロセスは、前記定義のＧ−ＣＳＦを調製し、単離し、そしてそのようにして調製され、単離されたＧ−ＣＳＦと薬学的に許容される担体との混合物を提供することを含む。

好ましい実施形態は、組換えＧ−ＣＳＦおよび薬学的に許容される添加剤、例えば緩衝液、塩および安定剤の医薬組成物の製造方法であり、前記方法は、前述の本発明のＧ−ＣＳＦを得るための方法を含む。本発明にしたがって得られるＧ−ＣＳＦは、（ｉ）直接使用することができるか、または（ｉｉ）例えば、前記定義もしくは国際公開第２００８／１２４４０６号パンフレット参照のペグ化など、さらに処理することができるかのいずれかであり、次いで凍結乾燥物の形態で、または液体形態で保存することができる。

医薬組成物の活性成分としてのＧ−ＣＳＦを典型的な方法で静脈内、動脈内、腹腔内、胸骨内、経皮、経鼻、吸入剤、局所、直腸、経口、眼内または皮下経路により投与することができる。投与方法は、特に限定されないが、非経口投与が好ましく、皮下または静脈内投与がさらに好ましい。

組換え発現されたＧ−ＣＳＦの処方において好適なアジュバントは、例えば、糖や糖アルコールなどの安定剤、アミノ酸および例えばポリソルベート２０／８０などの表面活性剤、ならびに好適な緩衝物質である。本発明のＧ−ＣＳＦ処方のさらなる実施形態については、例えば、国際公開第２００９／０２７４３７号パンフレットおよび国際公開第／２００８／１２４４０６号パンフレット（その開示内容は、参照により本明細書中に組み込まれる）を参照のこと。処方の例は、“ＲＯＴＥ ＬＩＳＴＥ ２００４”の商品Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）およびＧｒａｎｏｃｙｔｅも参照のこと。本発明の方法の好ましい実施形態において、精製された生物学的に活性型のＧ−ＣＳＦを１０ｍＭの酢酸（ｐＨ４．０）、０．００２５％ポリソルベート８０および５０ｇ／ｌのソルビトール中に配合する。

本発明の方法にしたがって得られるＧ−ＣＳＦの活性をバイオアッセイにより測定し、標準である市販のＧ−ＣＳＦの活性と比較する。このために、１．５ｇ／ｌの炭酸ナトリウム、４．５ｇ／ｌのグルコース、１０ｍＭのＨｅｐｅｓおよび１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含有し、２ｍＭのグルタミン、１０％のＦＣＳ、０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび６０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦを追加したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｂａｃｈｅｒｎ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）中でＧ−ＣＳＦに反応するマウス細胞系ＮＦＳ−６０を培養する。活性試験のために、細胞を、Ｇ−ＣＳＦを含まない培地で２回洗浄し、９６ウェルプレート中に２×１０^４細胞／ウェルの濃度で入れ、３日間、３７℃および４．５％ＣＯ_２で、精製されたＧ−ＣＳＦおよび標準の濃度をそれぞれ変えてインキュベートする。その後、細胞をＸＴＴ試薬で着色し、４５０ｎｍでの吸収をマイクロタイタープレートリーダーで測定する。

本発明によれば、本発明にしたがって精製されたＧ−ＣＳＦで処理した細胞は、標準で処理した細胞とちょうど同じくらいまたはそれ以上に増殖することを証明することができる。特に、データから、本発明の方法にしたがって得られる精製されたＧ−ＣＳＦは、ＮＦＳ−６０増殖アッセイにおいてＷＨＯ−標準試料の８０〜１２５％の生物学的活性により特徴付けられることが示される。

本発明の医薬組成物は、無菌かつパイロジェンフリーであることを特徴とする。本明細書中で用いられる場合、「医薬組成物」は、ヒトおよび動物への使用のための処方を包含する。本発明の医薬組成物を調製するための方法は、当該技術分野における技術範囲内である。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １７ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ． （１９８５）および最新版Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （２０００） ｂｙ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＩＳＢＮ ０−６８３−３０６４７２で開示されているとおりであり、両文書の全開示は、参照により本明細書中に組み込まれる。

これらや他の実施形態は、本発明の説明および実施例により開示され、含まれる。本発明にしたがって用いられる材料、方法、使用および化合物のいずれか１つに関するさらなる文献は、公共図書館およびデータベースから、例えば電子デバイスを用いて検索することができる。例えば、公開データベース“Ｍｅｄｌｉｎｅ”を利用することができ、これはアメリカ国立衛生研究所の全米バイオテクノロジー情報センターおよび／または国立医学図書館が主催している。さらなるデータベースおよびウェブアドレス、例えば欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）の一部門である欧州バイオインフォーマティクス研究所（ＥＢＩ）のものは、当業者には公知であり、インターネット検索エンジンを用いて得ることもできる。バイオテクノロジーにおける特許情報ならびに遡及検索およびカレント・アウェアネスに有用な関連する特許情報源の概説は、Ｂｅｒｋｓ， ＴＩＢＴＥＣＨ １２ （１９９４）， ３５２−３６４で記載されている。

前記開示は、本発明を一般的に記載する。特に明記しない限り、本明細書中で用いられる用語は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９７， ｒｅｖｉｓｅｄ ２０００ ａｎｄ ｒｅｐｒｉｎｔｅｄ ２００３， ＩＳＢＮ ０ １９ ８５０６７３ ２で提供されているような定義を与えられている。本明細書の本文全体にわたっていくつかの文書が引用されている。すべての引用された参考文献（本出願全体にわたって引用される文献、交付済特許、公開された特許出願および製造業者の仕様書、使用説明書などを包含する）の内容は、参照により本明細書中に明らかに組み込まれる。しかし、引用された文書が本発明に関して実際の先行技術であることを認めるものではない。

以下の具体的な実施例を参照することによってさらに完全な理解を得ることができるが、これらは本明細書中で説明の目的のためだけに提供され、本発明の範囲を制限することを意図しない。特に、実施例は、本発明の好ましい実施形態に関する。

特に別段の定めのない限り、本明細書中で用いられるすべての技術的および科学的用語は、当業者（例えば、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術、タンパク質化学および生化学）により通常理解されるのと同じ意味を有する。標準的技術が、分子、遺伝子および生化学的方法（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２^ｎｄ ｅｄ． （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９９） ４^ｔｈ Ｅｄ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙと題される全版（参照により本明細書中に組み込まれる）を参照のこと）および化学的方法に用いられる。

出発物質
Ｇ−ＣＳＦを、ｐＢＲ３２２由来の発現ベクターである０３−２２１Ｃ−ｐＨＩＰ中で発現させる。大腸菌宿主株ＢＮＮ９３を、産生用にこのプラスミドで形質転換した。ＢＮＮ９３は大腸菌Ｋ１２誘導体である。Ｇ−ＣＳＦ合成を、３０℃から４２℃への温度シフトにより誘発されるラムダプロモーターにより調節し、その結果、封入体中で一次不溶性Ｇ−ＣＳＦが過剰発現される。

発酵
１，０００ｍｌのカナマイシンを含まない複合培地で希釈したワーキングセルバンク（ＷＣＢ）の１つのバイアルの内容物を用いて、予備発酵のための「希釈したワーキングセルバンク」を生成させる。希釈は、クリーンルームグレードＢで層流フード（ＬＡＦ）グレードＡ中で実施する。前培養物を、２０Ｌの予備発酵槽中に直接無菌的に移す。培養は、３０±１℃で開始し、ＯＤ_６０００．３〜０．６に達するまで２５０ｒｐｍで６〜１２時間撹拌する。カナマイシンを含まない複合培地であらかじめ満たした１０００Ｌの発酵槽中に、完全発酵ブロスを移す。培養物を、３０±１℃にて≧２００ｒｐｍで撹拌しながらインキュベートして、５〜７のＯＤ_６００に達するまでｐＯ_２≧３０％およびｐＨ７．０±０．２を９〜１１時間保証する。

封入体におけるＧ−ＣＳＦ発現
Ｇ−ＣＳＦの発現は、温度を４２℃まで上昇させ、６．７５〜７．２５時間、≧２００ｒｐｍで撹拌しながらさらにインキュベートして、ｐＯ_２≧３０％を確実にすることによって誘発する。細菌細胞を室温でディスクセパレーターにより１５０Ｌ／ｈにて採取し、その結果、約１００Ｌの濃縮された細胞懸濁液を得る。

封入体の単離
濃縮された細胞懸濁液を２００Ｌに希釈し、高圧ホモジナイザーを用いて２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０中に３００Ｌ／ｈで３回引き続いて通過させることにより、５００バールで均質化する。放出された封入体を続いて１７，０００ｒｐｍにて５０Ｌ／ｈでの円筒篭型遠心分離により採取する。１８ｍＭのリン酸ナトリウム、２％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中で１０分間再懸濁させた後、封入体を１７，０００ｒｐｍにて５０Ｌ／ｈで再度遠心分離する。結果として得られたペレットを１８ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ８．０で１０分間洗浄し、続いて１７，０００ｒｐｍにて５０Ｌ／ｈでさらに遠心分離する。ペレットを注射用水（ＷＦＩ）中に再懸濁させ、３つの等しいアリコートに分注する。封入体を次いで＜−１５℃で保存する（ホールドステップ）。

封入体の可溶化およびＧ−ＣＳＦのリフォールディング
１，０００リットルの発酵から得られる全封入体量の３分の１を解凍した後、封入体を２５ｍＭのＴｒｉｓ、６ＭのＧｕＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中で５．５〜６．５時間、撹拌しながらインキュベートすることにより可溶化し、続いて１．５μｍのフィルターを用いたろ過、例えば深層ろ過（清澄化ろ過）を行う。Ｇ−ＣＳＦを次いで、２５ｍＭのＴｒｉｓ、０．８Ｍのアルギニン、１ｍＭのグルタチオン（還元型）１ｍＭのグルタチオン（酸化型）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中に２０±２℃で希釈することによりリフォールディングする。これに続いて、ポリソルベート８０を０．０１％（ｗ／ｖ）の終濃度になるまで添加し、酢酸でｐＨ４．０に調節する。リフォールディング後、限外ろ過およびダイアフィルトレーションステップを実施し（ＭＷＣＯ １０ｋＤａ、８．４ｍ^２、約８×緩衝液交換）、この場合、緩衝液を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ４．０により交換する。最後に、１０μｍおよび１．２μｍのフィルターカスケードを通して溶液をろ過する。ろ過後、溶液を２２±２℃で保存する（ホールドステップ）。

Ｇ−ＣＳＦ精製
クロマトグラフィー精製ステップは、細胞培養化合物、細菌細胞不純物、プロセス関連および生成物関連不純物を除去し、製剤処方の調製のためまたはその後のペグ化のために一貫したＧ−ＣＳＦ含有量を保証するために設計される（以下の実施例を参照のこと）。本発明のプロセスの概要を図１に示し、下記表１に記載する。カチオン交換およびＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーの実施のさらに詳細な説明を実施例７により表２および３で提供する。

各プロセスステップで使用する緩衝液組成

カチオン交換クロマトグラフィーおよび逆相−高圧液体クロマトグラフィー
ダイアフィルトレーションした濃縮物をカチオン交換（ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ）カラム上にロードする。ロード後、カラムを５カラム容積（ＣＶ）の平衡緩衝液（２０ｍＭの酢酸、０．００４％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ５．５）で洗浄し、結合したＧ−ＣＳＦをＣＭカラムから、直線的塩化ナトリウム勾配を用いて、２０ｍＭの酢酸、ｐＨ５．５、０．００４％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０および約５０〜８０ｍｇ／ｍｌのソルビトールを含有するバッグ中に溶出させる。溶出プロファイルをＵＶ検出（２８０ｎｍ、２６０ｎｍおよび２１５ｎｍ）によりモニタリングし、伝導率を測定することにより勾配を制御する。溶出されたＧ−ＣＳＦを、伝導率および吸光度プロファイルによって同定する。Ｇ−ＣＳＦプールフラクションの濃度を、ＵＶ２８０吸光度により測定し、≦１．６ｍｇ／ｍＬまで希釈する。

カチオン交換クロマトグラフィー：ＣＭ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）−ＦＦを実施するためのパラメータ

０．４５〜０．２２μｍのフィルターユニットでろ過した後、溶液をＲＰ−ＨＰＬＣカラムにかけ、酸性化（ＴＦＡ）アセトニトリルの水中勾配を用いて、フラクションを溶出させる。溶出プロファイルをＵＶ検出（２８０ｎｍ）によりモニタリングする。ＲＰ−ＨＰＬＣプールを分析的ＲＰ−ＨＰＬＣ（６０℃）純度データに基づいて規定し、プールを、１０ｍＭの酢酸、０．００２５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、５０ｍｇ／ｍｌのソルビトール、ｐＨ４．０での接線流ろ過による、限外ろ過及びダイアフィルトレーションする（ＭＷＣＯ ５ｋＤａ、４．８ｍ^２、約８×緩衝液交換）。

逆相クロマトグラフィー：Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４を実施するためのパラメータ

充填、保存および輸送
ダイアフィルトレーションろ液を同じ緩衝液で１．０±０．１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで希釈し、次いで５±３℃で保存（ホールドステップ）するために、１つの使い捨てのバッグ（プレフィルターは、ろ過前にＬＡＦ中で最終容器に連結され、最終フィルターは、５０Ｌの一次包装バッグにあらかじめ組み立てられ、照射により滅菌され、ろ過および充填後に密封することにより無菌的に遮断される）中に直接二重ろ過した（カスケード中の２つの０．２２μｍフィルター）。

Claims (30)

1. 生物学的に活性型のヒトＧ−ＣＳＦを封入体から得るための方法であって、以下のステップ：
   （ａ）封入体中に含まれるＧ−ＣＳＦを、変性剤および還元剤を含有する可溶化緩衝液で可溶化するステップ；
   （ｂ）可溶化物を、還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンを含有するリフォールディング緩衝液で、１０℃から３０℃の間の温度にて希釈することにより、Ｇ−ＣＳＦをリフォールディングするステップ；および
   （ｃ）逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーを含む少なくとも１つクロマトグラフィーステップによりリフォールディングされたＧ−ＣＳＦを精製するステップ
   を含む、方法。
2. 変性剤がグアニジン−ＨＣｌである、請求項１記載の方法。
3. グアニジン−ＨＣｌの濃度が４．０〜８．０ｍｏｌ／ｌである、請求項２記載の方法。
4. 還元剤がＤＴＴである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 可溶化緩衝液中の還元剤の濃度が１〜１００ｍｍｏｌ／ｌである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記濃度が１〜１０ｍｍｏｌ／ｌである、請求項５記載の方法。
7. 封入体１グラムあたり１０〜１００ｍｌの可溶化緩衝液を使用する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 可溶化緩衝液および／またはリフォールディング緩衝液が、キレート剤をさらに含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. キレート剤がＥＤＴＡ二ナトリウムである、請求項８記載の方法。
10. 可溶化時間が、１〜１０時間である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 可溶化時間が、４〜８時間である、請求項１０記載の方法。
12. 可溶化時間が、６±０．５時間である、請求項１１記載の方法。
13. リフォールディング緩衝液が、アルギニン−ＨＣｌをさらに含有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンの濃度が、それぞれ０．２〜１０ｍｍｏｌ／ｌである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 可溶化物を１：２０の比にてリフォールディング緩衝液で希釈する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. リフォールディングを２０±２℃で少なくとも３時間実施する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 可溶化物を、リフォールディング緩衝液で希釈する前にろ過に供する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーステップがＲＰ高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４、Ｓｏｕｒｃｅ １５ ＲＰＣまたはＳｏｕｒｃｅ ３０ ＲＰＣクロマトグラフ用樹脂を使用する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４クロマトグラフ用樹脂を逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で使用する、請求項１９記載の方法。
21. ＲＰクロマトグラフィーステップに先行してイオン交換クロマトグラフィーを行う、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. イオン交換クロマトグラフィーがカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーである、請求項２１記載の方法。
23. ステップ（ｃ）が：
    （ｉ）限外ろ過／ダイアフィルトレーションステップ；
    （ｉｉ）ＣＥＸクロマトグラフィーステップ；
    （ｉｉｉ）精密ろ過ステップ；
    （ｉｖ）ＲＰクロマトグラフィーステップ；および
    （ｖ）限外ろ過／ダイアフィルトレーションステップ
    を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 水溶性ポリマーをＧ−ＣＳＦに共有結合させることをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 水溶性ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項２４記載の方法。
26. ポリマーの分子量が１０〜３０ｋＤａである、請求項２４または２５記載の方法。
27. ポリマーの分子量が２０ｋＤａである、請求項２６記載の方法。
28. 生物学的に活性型の組換えヒトＧ−ＣＳＦならびに薬学的に許容される添加剤からなる医薬組成物の製造法であって、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の生物学的に活性型のヒトＧ−ＣＳＦを得るための方法を含む、方法。
29. 薬学的に許容される添加剤が、緩衝液、塩および安定剤からなる群より選択される、請求項２８記載の方法。
30. 精製された生物学的に活性型のＧ−ＣＳＦを、１０ｍＭの酢酸（ｐＨ４．０）、０．００２５％のポリソルベート８０および５０ｇ／ｌのソルビトール中に配合する、請求項２９記載の方法。

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