CN116239677B - 一种重组抗体纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗体纯化技术领域，尤其涉及一种重组抗体纯化方法。所述方法包括：S1、对包含重组抗体的细胞培养上清进行亲和层析；S2、过滤；S3、进行离子交换层析，离子交换层析依次包括阴离子层析柱和阳离子层析柱；S4、进行透析处理，得到纯化后的重组抗体，其中，透析缓冲液包括：0.2‑2mg/mL Poloxamer188、10‑50mg/mL PEG3350和磷酸盐缓冲液。本发明的细胞培养上清依次经过亲和层析捕获富集抗体、阴离子层析分离核酸及核酸酶等杂质、阳离子层析进一步除杂处理，可收集得到纯度较高的离子层析洗脱液，最后通过透析处理，大大减少抗体聚集体的产生，且抗体纯度高。

Description

一种重组抗体纯化方法

技术领域

本发明涉及抗体纯化技术领域，特别涉及一种重组抗体纯化方法。

背景技术

随着生物医药行业的快速发展，蛋白质药物成为现代药物研发的重要方向之一，其中重组抗体类药物占据主要份额，需求日益庞大。抗体药物作为一种高剂量使用的生物制品，对其纯度以及杂质残留量有极高的要求，以保证其通过注射等给药方式直接进入体内的安全性和有效性，因此，需要严格的质量监管措施。如何快速获得抗体的纯化产品以及优化其生产工艺，成为药物研发公司关注的要点。

重组抗体药物在生产过程中，宿主核酸的残留引起可能带来的传染性或者致瘤的风险而被作为生物制品安全监管中的重要一项。世界卫生组织（World HealthOrganization，WHO）及世界各国对宿主核酸的残留都有严格的规定。因此，解决宿主核酸的残留是生物制品生产过程中必须面对的问题。核酸酶是一种可以降解核酸的酶，可将宿主核酸消化成3-8个碱基长度的5’-单磷酸寡核苷酸，且不具有碱基识别特异性。因此，在一些重组抗体药物的生产工艺中常使用核酸酶去除残留核酸，然而，在通过核酸酶处理生物制品的过程中，可能会引入微量核酸酶残留。由于核酸酶本身也属于外源性物质，这些微量残留会对后续生物制品的应用造成一定的影响，并可能会引起毒性或免疫反应。

目前多采用高温高压方式使酶失活，但灭活条件较为苛刻，且仅能使酶失活，不能有效控制和去除核酸酶。另有通过层析等方式如ProteinA层析柱来捕获抗体，并利用离子交换层析作为精纯步骤，但容易引入抗体大小变异体和电荷变异体，由于一些物理的和化学的因素，导致抗体聚集现象发生，聚集体不但会使病人产生免疫反应，甚至会使人对药物产生免疫耐受性，从而大大降低了药物的药效。除此之外，聚集体还会影响抗体药物的生物活性、稳定性以及保存期等，这些问题使得抗体药物聚集体的控制及其去除成为药物开发过程中的一大挑战。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种重组抗体纯化方法，以解决现有技术中重组抗体核酸残留以及抗体纯化过程中聚集体形成的技术问题。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种重组抗体纯化方法，包括以下步骤：

S1、对包含重组抗体的细胞培养上清进行亲和层析，收集亲和层析洗脱液；

S2、过滤所述亲和层析洗脱液，收集滤液；

S3、对所述滤液进行离子交换层析，所述离子交换层析依次包括阴离子层析柱和阳离子层析柱，收集离子层析洗脱液；

S4、对所述离子层析洗脱液进行透析处理，得到纯化后的重组抗体，其中，透析缓冲液包括：0.2-2mg/mL Poloxamer188、10-50mg/mL PEG3350和磷酸盐缓冲液。

进一步地，所述透析缓冲液包括：0.2mg/mL Poloxamer188、10mg/mL PEG3350和磷酸盐缓冲液。

进一步地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M。

进一步地，步骤S1中，所述亲和层析的层析柱为protein A层析柱。

更进一步地，步骤S1中，所述亲和层析包括下述步骤：

S11、将细胞培养上清加载到平衡好的所述protein A层析柱上；

S12、用磷酸盐缓冲液淋洗所述protein A层析柱，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4；

S13、用由0.1M甘氨酸和150mM NaCl组成的亲和层析洗脱液淋洗所述protein A层析柱，所述亲和层析洗脱液的pH为2.2-4.0。

进一步地，步骤S3中，所述阴离子层析柱为Diamond Q Mustang层析柱。

进一步地，步骤S3中，所述阳离子层析柱为SP Bestarose BB层析柱。

进一步地，步骤S3中，所述阴离子层析柱和所述阳离子层析柱串联设置。

更进一步地，步骤S3中，所述离子交换层析包括以下步骤：

S31、将所述滤液加载到串联好的所述阴离子层析柱和所述阳离子层析柱上，其中，所述滤液的pH为5.5，电导≤5 mS/cm，上样流速为1mL/min；

S32、用50mM醋酸钠溶液淋洗所述阴离子层析柱和所述阳离子层析柱，直至电导基线趋于平衡，所述醋酸钠溶液的pH为5.5；

S33、拆下所述阴离子层析柱，之后采用200mM NaCl溶液对所述阳离子层析柱进行线性梯度洗脱，洗脱体积2-5CV，收集洗脱峰，直至电导基线趋于平衡，之后采用1M NaCl溶液对所述阳离子层析柱进行线性梯度洗脱，洗脱体积2CV，收集洗脱峰，直至电导基线趋于平衡，将电泳检测纯度高于95%的200mM、1M NaCl溶液洗脱的所述洗脱峰合并作为所述离子层析洗脱液。

进一步地，所述细胞培养上清中的细胞活率为70-90%。

本发明的优点及积极效果为：

本发明以生产重组抗体的细胞培养上清为样本，依次经过亲和层析捕获富集抗体、阴离子层析分离核酸及核酸酶等杂质、阳离子层析进一步除杂处理，收集得到纯度较高的离子层析洗脱液，最后通过透析除去离子层析洗脱液，采用含有Poloxamer188、PEG3350等的透析缓冲液来防止抗体聚集，有效减少纯化后的抗体聚集体的产生，纯化后的抗体纯度在95%以上，符合品控要求，使用安全性高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例不同活率下细胞培养上清中DNA酶残留检测结果图；

图2为本发明实施例不同活率下细胞培养上清中RNA酶残留检测结果图；

图3为本发明实施例的重组抗体经protein A层析和离子交换层析纯化后的DNA酶残留检测结果图；

图4为本发明实施例的重组抗体经protein A层析和离子交换层析纯化后的RNA酶残留检测结果图；

图5为本发明实施例经组合1配方的透析缓冲液处理后的抗体胶图；

图6为本发明实施例经组合2配方的透析缓冲液处理后的抗体胶图；

图7为本发明实施例经组合3配方的透析缓冲液处理后的抗体胶图；

图8为本发明实施例经组合4配方的透析缓冲液处理后的抗体胶图；

图9为本发明实施例经组合5配方的透析缓冲液处理后的抗体胶图；

图10为本发明实施例经组合6配方的透析缓冲液处理后的抗体胶图；

图11为本发明实施例经组合1配方的透析缓冲液处理后的抗体高效液相色谱图；

图12为本发明实施例经组合2配方的透析缓冲液处理后的抗体高效液相色谱图；

图13为本发明实施例经组合3配方的透析缓冲液处理后的抗体高效液相色谱图；

图14为本发明实施例经组合4配方的透析缓冲液处理后的抗体高效液相色谱图；

图15为本发明实施例经组合5配方的透析缓冲液处理后的抗体高效液相色谱图；

图16为本发明实施例经组合6配方的透析缓冲液处理后的抗体高效液相色谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。另外，术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。

本发明实施例提供了一种重组抗体纯化方法，包括以下步骤：

S1、对包含重组抗体的细胞培养上清进行亲和层析，收集亲和层析洗脱液；

S2、过滤所述亲和层析洗脱液，收集滤液；

S3、对所述滤液进行离子交换层析，所述离子交换层析依次包括阴离子层析柱和阳离子层析柱，收集离子层析洗脱液；

S4、对所述离子层析洗脱液进行透析处理，得到纯化后的重组抗体，其中，透析缓冲液包括：0.2-2mg/mL Poloxamer188、10-50mg/mL PEG3350和磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。

本发明依次经过亲和层析、阴离子层析、阳离子层析和透析处理，亲和层析用于捕获富集细胞培养上清中的重组抗体，之后依据抗体中残留的核酸及核酸酶与抗体在不同pH下所带电荷性质不同，先采用阴离子层析柱处理，核酸及核酸酶由于带负电荷而吸附结合在柱子上，抗体由于带正电荷而不与柱子作用并位于流穿液中，由此可初步分离核酸及核酸酶等杂质，之后将阴离子层析柱的流穿液采用阳离子层析柱处理，此时抗体可挂柱结合以保留在柱子上，而杂质流穿，因此，收集阳离子层析柱的洗脱液（即离子层析洗脱液）可达到提高抗体纯度的作用，最后通过透析除去离子层析洗脱液，由于前述纯化过程中，对重组抗体的电荷性质产生了较大影响，容易使其产生聚集，由此在透析换液时，本发明采用含有0.2-2mg/mL 泊洛沙姆188（Poloxamer188）和10-50mg/mL 聚乙二醇3350（PEG3350）的0.01M磷酸盐缓冲液（PBS）溶液（pH 7.4）的透析缓冲液来防止抗体聚集，有效减少纯化后的抗体聚集体的产生，纯化后的抗体纯度在95%以上，符合品控要求，使用安全性高。

本发明在抗体透析缓冲液中加入复合稳定剂，可有效减少抗体的聚集。泊洛沙姆188和聚乙二醇3350两种表面活性剂主要通过降低表面张力来减少抗体聚集体的产生，复配以后具有协同增效作用，主要是因为在分子间的相互作用下，基团间的静电互斥作用减小，排列更为紧密，另外二者之间的碳氢链也由于疏水作用相互吸引，由此复配之后对于表面或界面吸附和溶液种胶束形成都有一定的促进作用。本发明中将特定浓度的Poloxamer188和EG3350作为复合稳定剂，与0.01M磷酸盐缓冲液配置成透析缓冲液，对比不加稳定剂的透析缓冲液，能够有效解决抗体聚集的问题。优选地，所述透析缓冲液包括：0.2mg/mL Poloxamer188、10mg/mL PEG3350和磷酸盐缓冲液。

可选地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M。

可选地，所述亲和层析的层析柱为protein A层析柱，所述亲和层析包括下述步骤：

S11、将细胞培养上清加载到平衡好的protein A层析柱上；

S12、用磷酸盐缓冲液淋洗所述protein A层析柱，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4，用于将杂蛋白洗脱下来；

S13、用由0.1M甘氨酸和150mM NaCl组成的亲和层析洗脱液淋洗所述protein A层析柱，所述亲和层析洗脱液的pH为2.2-4.0，用于将吸附的目的抗体洗脱下来，进而收集亲和层析洗脱液用于离子交换层析。

可选地，所述阴离子层析柱为Diamond Q Mustang层析柱，所述阳离子层析柱为SPBestarose BB层析柱。

可选地，所述阴离子层析柱和所述阳离子层析柱串联设置。此设置能够使得阴离子层析柱的流穿液直接作为上样溶液进入到阳离子层析柱中，无需更换缓冲液，可以大大缩短离子交换层析时间，进一步提高纯化效率。

具体地，当所述阴离子层析柱和所述阳离子层析柱串联设置时，所述离子交换层析包括以下步骤：

S31、将所述滤液加载到串联好的所述阴离子层析柱和所述阳离子层析柱上，其中，所述滤液的pH为5.5，电导≤5 mS/cm，上样流速为1mL/min；

S32、用50mM醋酸钠溶液淋洗所述阴离子层析柱和所述阳离子层析柱，直至电导基线趋于平衡，所述醋酸钠溶液的pH为5.5；

S33、拆下所述阴离子层析柱，之后采用200mM NaCl溶液对所述阳离子层析柱进行线性梯度洗脱，洗脱体积2-5CV，收集洗脱峰，直至电导基线趋于平衡，之后采用1M NaCl溶液对所述阳离子层析柱进行线性梯度洗脱，洗脱体积2CV，收集洗脱峰，直至电导基线趋于平衡，将200mM、1M NaCl溶液洗脱下的所述洗脱峰进行电泳，将纯度高于95%的所述洗脱峰进行合并，即为离子层析洗脱液，后续进行透析换液处理。

可选地，所述细胞培养上清中的细胞活率为70-90%。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南（第四版）》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

本实施例以重组抗体为来源，首先通过检测证明其细胞代谢上清具有核酸酶残留，通过控制收获细胞时活率结合抗体表达产量，选择表达量较高且核酸酶较少的重组抗体样品用于后续纯化过程，通过核酸及核酸酶自身性质匹配不同的纯化方式，依次经过阴、阳离子层析柱，之后通过自配的透析缓冲液进行透析换液，达到去除核酸酶的同时防止抗体聚集体产生，使生产的重组抗体符合质控要求。

Trypan Blue Solution（购自gibco，货号：15250061），聚乙烯亚胺（购自polysciences，货号：24765-1）。

所采用的质粒DNA及其浓度见下表1，质粒为实验室自制，其中，重链质粒和轻链质粒需稀释到统一浓度；

表1 质粒DNA及其浓度

将上述的质粒样品转染到HEK293F细胞中，培养细胞，收集上清液获得重组抗体，具体包括以下操作：

（1）转染前，将细胞密度调节到2.6×10⁶个/mL；

（2）在无菌试管中用1.5mL Opti-MEM减血清培养基稀释总质粒（重链：轻链=1：1）DNA 30μg；

（3）将90μL聚乙烯亚胺（PEI）（1mg/mL、pH 7.1）加入到稀释的1.5mL Opti-MEM减血清培养基中，混匀静置5min；

（4）将步骤（3）的混合溶液加入到步骤（2）的DNA的混合溶液中，翻转或移液混合（混匀的过程要求缓慢进行），之后在室温下孵育20min（不要超过）；

（5）将DNA/PEI混合物加入到细胞中，通过轻轻旋转将它们充分混合，混合后细胞总体积30mL；

（6）取转染后96h后的细胞悬液20μL和0.2% Trypan Blue Solution（购自gibcolot，货号：15250061））1:1混合，吸取20μL混合液加入到细胞计数板孔中，使用细胞计数仪读数测得活率及密度，样品1的收细胞活率为70%，样品2的收细胞活率为80%，样品3的收细胞活率为90%；

（7）收获转染后的细胞，收集上清液。

采用琼脂糖电泳法检测脱氧核糖核酸酶（DNA酶）残留，具体操作包括：取上清液5μL与500ng的pUC19质粒（购自Takara，货号：3219）混合，加水补足50μL，在37℃孵育4h；孵育后的混合物进行琼脂糖凝胶电泳，观察带型变化，结果见图1。

采用琼脂糖电泳法检测核糖核酸酶（RNA酶）残留，具体操作包括：取上清液5μL与500ng的RNA混合，加水补足50μL，在37℃孵育4h；孵育后的混合物进行琼脂糖凝胶电泳，观察带型变化，结果见图1。

从图1-2中可以看出，每1000mL细胞（Cells）中，样品1的重组抗体的表达量为97mg，细胞上清中DNA酶和RNA酶残留较多，样品2的重组抗体的表达量为85mg，细胞上清中DNA酶和RNA酶残留较多，样品3的重组抗体的表达量为50mg，细胞上清中DNA酶和RNA酶残留较少。样品3的收细胞活率最高，在细胞活率较高时，细胞状态完整，因此较少检测到核酸酶残留，细胞活率较低时，核酸酶残留的浓度则较高。由于酶来源于死细胞的释放，控制收获细胞的活率，可减少酶的释放，结合不同细胞收获活率下纯化所得抗体的量，后续选择样品2的细胞上清进行纯化。

首先采用protein A层析柱富集足够多的抗体，根据抗体中可能残留的核酸及核酸酶性质（核酸带负电，RNA酶等电点为2-2.5，DNA酶等电点约为4.7，目的抗体等电点为7.4）设计采用阴离子层析柱，使得核酸及核酸酶结合在柱子上，而抗体不与阴离子层析柱作用而位于流穿液中，收集流穿液即可分离核酸及核酸酶等杂质，之后采用阳离子层析柱，此时抗体可挂柱结合，收集洗脱液，可进一步提高抗体纯度，达到安全的纯度。最后通过透析除去洗脱用的缓冲液，由于抗体容易产生高聚，在透析换液时，采用含有Poloxamer188和PEG3350的PBS溶液（pH 7.4），可有效减少抗体聚集体的产生。

1、protein A层析柱捕获抗体

采用AT Protein A Diamond层析柱（购自上海博格隆，货号：AA0272），操作流程如下：

（1）孵育

取出灭菌的10mL纯化柱管，用无内毒素水冲洗柱管1-2次。从4℃冰箱取出ProteinA基质，用无内毒素水清洗6个柱体积，之后用Binding Buffer平衡6个柱体积（CV），将平衡好的基质加入细胞培养上清液中，用封口膜封口，置于旋转培养器上，20rpm、4℃旋转振荡4hr至过夜；

（2）收集流穿液

孵育结束后，将离心管配平离心，600rpm、4℃离心10min，将离心后的上清倒入新的离心管中，即为流穿液；

（3）洗杂与洗脱

a、向纯化柱管中加入3mL的Washing Buffer洗柱，洗下基质中的杂蛋白，重复洗脱5次直至杂蛋白洗脱干净。

b、加入0.5mL Elution Buffer 1洗柱，洗下与基质结合的蛋白，流出液用1.5mL无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温，并预先加入0.5mL 的1M Tris（pH8.0）用于调节蛋白溶液的pH。可用G250检测直到G250不变蓝，结束Elution Buffer 1预洗脱。

c、加入0.5mL Elution Buffer 2洗柱，洗下与基质结合的蛋白，流出液用1.5mL无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温，并预先加入0.5mL的1M Tris（pH8.0）用于调节蛋白溶液的pH。流完后用G250检测直到G250不变蓝，结束Elution Buffer 2洗脱。

d、加入0.5mL Elution Buffer 3洗柱，洗下与基质结合的蛋白，流出液用1.5mL无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温，并预先加入0.5mL的1M Tris（pH8.0）用于调节蛋白溶液的pH。流完后用G250检测直到G250不变蓝，结束Elution Buffer 3洗脱。

e、将上面收集的流穿液与各洗脱梯度下的洗脱液制样，进行SDS-PAGE电泳。上述所用的缓冲液的成分见下表2。

表2 protein A层析柱捕获抗体时所用的缓冲液及其成分配比

f、根据电泳结果，选择电泳胶图有条带的洗脱液作为亲和层析粗纯样本（即亲合层析洗脱液）进行后续离子交换纯化。

2、强阴离子层析

采用Diamond Q Mustang层析柱（购自上海博格隆，货号：AI0171），操作流程如下：

（1）上样前过滤

亲和层析粗纯样本使用0.22μm滤膜进行过滤。

（2）层析工作站（苏州Inscinstech Autopure）纯化

a、Q柱上样前使用50mM醋酸钠（NaAc，pH5.5）进行平衡，平衡体积4-6CV，直至电导平衡；

b、上样样品要求pH 5.5，电导≤5 mS/cm，上样1mL/min，上样后继续使用50mMNaAC（pH5.5）冲洗层析柱直至电导平衡；

c、收集流穿组分。

3、强阳离子串联层析

在进行离子交换层析（IEC）纯化时依次将阴离子层析柱和阳离子层析柱进行串联，抗体样本经过阴离子层析柱后，可保证流穿液直接进入到阳离子层析柱中，在相同的纯化时间内可以同时完成阴阳离子纯化。

采用SP Bestarose BB层析柱（购自上海博格隆，货号：AI0241），操作流程如下：

（1）层析工作站（苏州Inscinstech Autopure）纯化；

（2）Q柱和SP柱上样前分别使用50mM NaAC（pH5.5）进行平衡，平衡体积8-12CV，将平衡好的Q柱和SP柱按先后顺序进行串联；

（3）上样样品要求pH 5.5，电导≤5 mS/cm，上样流速1mL/min，样品流经Q柱后，流出液立即流入SP柱中，上样后使用50mM NaAC（pH5.5）清洗10CV以上，直至电导基线趋于平衡；

（3）拆下Q柱，仅对SP柱进行洗脱操作，使用200mM NaCl进行线性梯度洗脱，洗脱体积2-5CV，收集洗脱峰，直至电导基线趋于平衡；之后使用1M NaCl进行线性梯度洗脱，洗脱体积2CV，收集洗脱峰，直至电导基线趋于平衡。

（4）依次取200mM NaCl、1M NaCl洗脱组分20μL与5μL 6× loading buffer混合，95℃加热变性1min；采用15%的SDS-PAGE胶对洗脱组分进行鉴定，上样量10μL，将电泳胶图有条带的洗脱液合并作为混合洗脱液进行后续处理。

（5）进行琼脂糖电泳检测核酸酶残留：取混合洗脱液10μL与500ng的pUC19质粒混合进行DNA酶残留鉴定，加水补足50μL，在37℃孵育4h；孵育后的混合物进行琼脂糖凝胶电泳，观察带型变化，结果见图3。另取取洗脱组分10μL与500ng的RNA混合进行RNA酶残留鉴定，加水补足50μL，在37℃孵育4h；孵育后的混合物进行琼脂糖凝胶电泳，观察带型变化，结果见图4。

Poloxamer188（购自Merck，货号：P5556），PEG3350（购自Merck，货号：202444），操作流程如下：

（1）配置透析缓冲液：透析缓冲液含有Poloxamer188、PEG3350的0.01M PBS溶液，将其pH调节至7.4，即为透析缓冲液，不同配比的透析缓冲液配方具体见下表3；

（2）透析：将混合洗脱液于透析缓冲液中进行换液。

表3 透析缓冲液中不同稳定剂配方优化

（3）检测

SDS-PAGE检测：取透析后的抗体样品20μL与5μL 6× loading buffer混合，95℃加热变性1min；采用15%的SDS-PAGE胶对样品进行鉴定，上样量10μL，进行电泳；电泳结束后，拆胶，对胶进行染色、脱色操作之后，拍胶；对所得胶图进行编辑，结果见图5-10，图5-10分别为经组合1-6透析缓冲液处理后的抗体胶图。

高效液相色谱（HPLC）检测：采用Agilent1100洗脱柱（TSK superSW3000），具体操作包括：1）流动相准备：配置50mM PB，500mM NaCl，pH6.4，使用0.45um滤膜进行过滤处理，超声脱气30min；2）样本准备：透析后的样品进行过滤处理，上样20μL，浓度0.1ug/mL，buffer为流动相；3）按照说明书操作进行样品检测；4）以HPLC检测中A280波长下的峰面积百分比来反应抗体的聚集程度，结果见图11-16，图11-16分别为经组合1-6透析缓冲液处理后的高效液相色谱图，其中，横坐标为时间轴，单位为分钟（min），对应的是保留时间；纵坐标为电信号，单位为mAU，对应的是峰高，并将抗体聚集体占比统计在表3中。抗体聚集体占比表示抗体聚集体占抗体总量的百分比。

通过电泳图5-10和HPLC检测结果图11-16以及表3可知，在以上6种组合测试中，抗体的聚集程度为：组合1＞组合2＞组合4＞组合5=组合3=组合6，在稳定剂添加量均较低的情况下，不能有效防止抗体聚集，当Poloxamer188浓度超过0.2mg/mL、PEG3350添加量超过10mg/mL时，抗体均可处于较稳定的情况，且聚集程度得到有效减少，为避免体系中引入过多的稳定剂影响抗体活性，Poloxamer188浓度为0.2mg/mL、PEG3350添加量为10mg/mL与0.01M磷酸盐缓冲液体系为最优，得到的抗体聚集体少且活性高；此外，通过上述纯化步骤后的抗体DNA酶和RNA酶均未检出，纯化后所得抗体纯度达95%以上，满足质控要求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种重组抗体纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、对包含重组抗体的细胞培养上清进行亲和层析，收集亲和层析洗脱液；

S2、过滤所述亲和层析洗脱液，收集滤液；

S3、对所述滤液进行离子交换层析，所述离子交换层析依次包括阴离子层析柱和阳离子层析柱，收集离子层析洗脱液；

S4、对所述离子层析洗脱液进行透析处理，得到纯化后的重组抗体，其中，透析缓冲液由0.2-2mg/mL Poloxamer188、10-50mg/mL PEG3350和磷酸盐缓冲液组成。

2. 根据权利要求1所述的重组抗体纯化方法，其特征在于，所述透析缓冲液由0.2mg/mL Poloxamer188、10mg/mL PEG3350和磷酸盐缓冲液组成。

3.根据权利要求1所述的重组抗体纯化方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M。

4. 根据权利要求1所述的重组抗体纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述亲和层析的层析柱为protein A层析柱。

5.根据权利要求4所述的重组抗体纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述亲和层析包括下述步骤：

S11、将细胞培养上清加载到平衡好的所述protein A层析柱上；

S12、用磷酸盐缓冲液淋洗所述protein A层析柱，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4；

S13、用由0.1M甘氨酸和150mM NaCl组成的亲和层析洗脱液淋洗所述protein A层析柱，所述亲和层析洗脱液的pH为2.2-4.0。

6. 根据权利要求1所述的重组抗体纯化方法，其特征在于，步骤S3中，所述阴离子层析柱为Diamond Q Mustang层析柱。

7. 根据权利要求1所述的重组抗体纯化方法，其特征在于，步骤S3中，所述阳离子层析柱为SP Bestarose BB层析柱。

8.根据权利要求1所述的重组抗体纯化方法，其特征在于，步骤S3中，所述阴离子层析柱和所述阳离子层析柱串联设置。

9.根据权利要求8所述的重组抗体纯化方法，其特征在于，步骤S3中，所述离子交换层析包括以下步骤：

S31、将所述滤液加载到串联好的所述阴离子层析柱和所述阳离子层析柱上，所述滤液的pH为5.5，电导≤5 mS/cm，上样流速为1mL/min；

S32、用50mM醋酸钠溶液淋洗所述阴离子层析柱和所述阳离子层析柱，直至电导基线趋于平衡，所述醋酸钠溶液的pH为5.5；

S33、拆下所述阴离子层析柱，之后采用200mM NaCl溶液对所述阳离子层析柱进行线性梯度洗脱，洗脱体积2-5CV，收集洗脱峰，直至电导基线趋于平衡，之后采用1M NaCl溶液对所述阳离子层析柱进行线性梯度洗脱，洗脱体积2CV，收集洗脱峰，直至电导基线趋于平衡，将电泳检测纯度高于95%的200mM、1M NaCl溶液洗脱的所述洗脱峰合并作为所述离子层析洗脱液。

10.根据权利要求1所述的重组抗体纯化方法，其特征在于，所述细胞培养上清中的细胞活率为70-90%。