KR20240034791A - 아데노-연관 바이러스 캡시드를 분리하는 방법, 상기 방법에 의해 수득되는 조성물 및 그의 용도 - Google Patents
아데노-연관 바이러스 캡시드를 분리하는 방법, 상기 방법에 의해 수득되는 조성물 및 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 개시는 a) 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 액체 샘플을 크로마토그래피 재료에 첨가하는 단계로서, 여기서 액체 샘플은 적어도 90%의 순도 및 적어도 1012 아데노-연관 바이러스 캡시드/ml의 농도의 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하며, 그 중 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 10%는 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드이고, 여기서 크로마토그래피 재료는, 지지체 및 아데노-연관 바이러스 캡시드에 대한 결합을 위한 리간드를 포함하는 강한 또는 부분적으로 강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료를 포함하며; 여기서 크로마토그래피 재료는 리간드를 지지체에 연결시키는 표면 연장기(extender)를 포함하고, 여기서 표면 연장기는 중합체이며, 여기서 중합체는 (i) 자연 발생 골격을 갖는 중합체, 예컨대 폴리사카라이드, 예컨대 전분, 셀룰로스, 덱스트란 또는 아가로스; 및 (ii) 합성 골격을 갖는 중합체, 예컨대 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 또는 폴리비닐 에테르로부터 선택되는 단계; b) 크로마토그래피 재료로부터, 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 용리시키는 단계를 포함하며, 여기서 단계 (b)에서 용리되는 아데노-연관 바이러스 캡시드는 용리액 분획으로 용리되고, 조합된 상기 용리액 분획은 단계 (a)에서 첨가된 액체 샘플의 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 50%를 포함하고 그 중 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 60%는 유전 물질로 완전히 패키징된 것인, 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드로부터 분리하는 방법에 관한 것이다. 추가적으로 개시되는 것은 상기 분리 방법에 의해 수득되는 제약 조성물을 포함한 조성물은 물론, 아데노-연관 바이러스 캡시드의 분리를 위한 상기 조성물의 용도 및 음이온 크로마토그래피 재료의 용도이다.
Description
본 개시는 아데노-연관 캡시드의 분리 분야에 관한 것으로서, 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드로부터 분리하기 위한 방법, 그리고 그와 같은 분리를 위한 음이온 교환 크로마토그래피 재료의 용도에 관한 것이다. 추가적으로 개시되는 것은 상기 방법에 의해 수득되는 제약 조성물을 포함한 조성물은 물론, 그와 같은 조성물의 용도이다.
아데노-연관 바이러스 (AAV)는 선형의 단일-가닥 DNA (ssDNA) 게놈을 보유하며 표적 세포에 DNA를 전달하도록 조작될 수 있는 비-외피화(non-enveloped) 바이러스이다. 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터는 가장 다기능성이며 성공적인 유전자 요법 전달 비히클들 중 하나로 부상되어 있다. 유전자 요법에 바이러스 벡터를 사용하려는 증가하는 수요가 존재한다. AAV 벡터는 근육 질환은 물론 기타 장애에서 새로운 유전자 요법을 개발하기 위한 가장 매력적인 유전자 전달 도구들 중 하나이다. 초창기 AAV 유전자 전달 연구 대부분은 AAV 혈청형 2 (AAV2)를 사용하였다. AAV-매개 유전자 전달의 효율 및 특이성을 더 향상시키기 위하여, 수많은 AAV 혈청형 및 변이체들이 바이러스 게놈 조작 및/또는 캡시드 변형에 의해 개발되어 왔다. 근년에는, AAV8 및 AAV9와 같은 혈청형의 사용이 증가하였다. 표적 기관이 혈청형의 선택을 결정한다. 요법에서 벡터로서 AAV 입자를 사용하기 위해서는, 형질감염 후 DNA와 같은 세포 불순물로부터 바이러스 입자를 정제할 필요가 있다. 초원심분리가 효율적이기는 하지만, 규모증대가 가능하지 않다. 보통, 몇 가지 여과 단계 및 몇 가지 크로마토그래피 단계가 세포 배양물로부터 AAV 입자를 분리하는 데에 사용된다 (예컨대 문헌 [Weihong Qu et al., Scalable Downstream Strategies for Purification of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in Light of the Properties, Current Pharmaceutical Biotechnology 2015 Aug; 16(8): 684-695] 참조).
AAV 벡터의 치료 효율은 해당 유전 물질로 완전히 패키징된 바이러스 입자의 높은 백분율에 달려 있다. 상류의 발현 시스템은 불순물들과 함께 완전히 패키징된 AAV 입자 (해당 유전 물질 포함), 빈 AAV 입자 및 해당 유전 물질로 부분적으로 패키징된 AAV 입자의 혼합물을 산출한다. 이에 따라, 정제 과정에서 완전히 패키징된 AAV 입자를 농축할 필요성이 존재한다. 그러나, 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드와 빈 아데노-연관 바이러스 캡시드의 효율적이고 규모증대가능한 분리를 달성하는 것과 관련하여서는, 하기와 같은 몇 가지 과제가 존재한다:
- 아데노-연관 바이러스의 각 혈청형 또는 변이체의 정제에 광범위한 최적화가 필요하다는 것을 의미하는, 완전 캡시드의 수율 면에서의 커다란 캡시드 다양성 (혈청형 및 변이체) 및 세포 배양물 차이;
- 정제에 관련된 몇 가지 파라미터, 예컨대 등전점에 있어서의 완전히 패키징된 캡시드와 빈 캡시드 사이의 작은 차이;
- 감염된 숙주 세포에서 완전히 패키징된 캡시드 및 빈 캡시드 이외에 부분적으로 패키징된 캡시드 변이체도 산출되는 것. 그와 같이 부분적으로 패키징됨으로써 치료상 덜 효과적인 캡시드는 완전히 패키징된 캡시드와 부분적으로 공동-용리될 수 있는 것으로 나타나 있음.
결론적으로, 정제 과정의 속도는 증가시키면서 비용은 감소시키고, 상이한 아데노-연관 바이러스 혈청형들의 하류 처리를 위한 대-규모 방법을 제공하는 새로운 정제 전략이 요구되고 있다.
[발명의 개요]
본 개시의 목적은 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드로부터의 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드의 향상된 분리를 제공하는 규모증대가능한 해결책을 제공하는 것이다. 이는 본원에서 개시되는 바와 같은 분리 방법을 수행할 때 완전히 패키징된 것과 완전히 패키징되지 않은 캡시드 사이의 향상된 해상도를 수득함으로써, 완전히 패키징된 캡시드 대 완전히 패키징되지 않은 캡시드의 개선된 비를 갖는 조성물을 달성하는 것을 초래하는 것에 의해 달성된다. 본 개시의 초점은 이차 또는 최종 정제로도 지칭되는 분리 방법의 폴리싱(polishing) 단계이다.
더 구체적으로, 본 개시의 제1 측면은 하기 단계:
a) 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 액체 샘플을 크로마토그래피 재료에 첨가하는 단계로서,
여기서 액체 샘플은 적어도 90%의 순도 및 적어도 1012 아데노-연관 바이러스 캡시드/ml의 농도의 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하며, 그 중 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 10%는 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드이고,
여기서 크로마토그래피 재료는 지지체 및 아데노-연관 바이러스 캡시드에 대한 결합을 위한 리간드를 포함하는 강한 또는 부분적으로 강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료를 포함하며;
여기서 크로마토그래피 재료는 리간드를 지지체에 연결시키는 표면 연장기(extender)를 포함하고, 여기서 표면 연장기는 중합체이며, 여기서 중합체는
(i) 자연 발생 골격을 갖는 중합체, 예컨대 폴리사카라이드, 예컨대 전분, 셀룰로스, 덱스트란 또는 아가로스; 및
(ii) 합성 골격을 갖는 중합체, 예컨대 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 또는 폴리비닐 에테르
로부터 선택되는 것인 단계;
b) 크로마토그래피 재료로부터, 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 용리시키는 단계
를 포함하며, 여기서 단계 (b)에서 용리되는 아데노-연관 바이러스 캡시드는 용리액 분획으로 용리되고, 조합된 상기 용리액 분획은 단계 (a)에서 첨가된 액체 샘플의 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 50%를 포함하고 그 중 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 60%는 유전 물질로 완전히 패키징된 것인, 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드로부터 분리하는 방법에 관한 것이다.
상기-개시된 방법은 추가적으로 단계 (b)에서 용리된, 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 용리액 분획을 하기 단계들 중 하나 이상에 적용함으로써, 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 제약 조성물을 수득하는 것을 포함할 수 있다:
c1) 아데노-연관 바이러스 캡시드를 제약상 관련 용량으로 농축시키는 단계,
c2) 상기-언급된 분리 방법의 단계 (b)에서 적용된 완충제를 제약상 허용되는 완충제로 대체하는 단계, 및/또는
c3) 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 용리액 분획을 멸균하는 단계.
본 개시는 또한 상기-언급된 분리 방법을 수행하는 것에 의해 수득된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 제약 조성물에서 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드 대 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드의 비가 적어도 3:2인, 대상체에서의 기관 또는 조직과 관련된 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 개시는 상기에서 상세하게 기술된 바와 같은 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드로부터분리하는 방법을 수행하는 것에 의해 수득되는 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물이며, 상기 조성물에서 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드 대 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드의 비가 적어도 3:2인 조성물에 관한 것이다.
본 개시는 또한 (상기에서 상세하게 기술된 바와 같은) 단계 c1-c3 중 하나 이상을 포함하는 상기-개시된 분리 방법을 수행하는 것에 의해 수득되는 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 제약 조성물이며, 상기 제약 조성물에서 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드 대 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드의 비가 적어도 3:2인 제약 조성물을 제공한다.
역시 제공되는 것은 요법에서 사용하기 위한, 임의로는 유전자 요법에서 사용하기 위한, 상-기 제약 조성물이다.
본 개시는 또한 지지체, 리간드, 및 리간드를 지지체에 연결시키는 표면 연장기를 포함하며 하기 화학식 IV로 정의되는 음이온 교환 크로마토그래피 재료의, 하기에서 추가적으로 상세하게 기술되는 바와 같이 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드로부터 분리하기 위한 용도를 제공한다:
특히, 본 개시는 아데노-연관 바이러스 혈청형 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 (AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 및 AAV10) 또는 그의 변이체의 아데노-연관 바이러스 캡시드의 분리 및 용도에 관한 것이다.
본 개시의 바람직한 측면들은 하기 상세한 설명 및 종속 청구항들에서 기술된다.
도 1은 본 개시에 따른 아데노-연관 바이러스 캡시드 분리 방법의 흐름도이다.
도 2는 단계 (a) 전의 추가적인 단계 (a1)을 추가적으로 포함하는, 도 1에 따른 아데노-연관 바이러스 캡시드 분리 방법의 흐름도이다.
도 3은 단계 (b) 후에 하나 이상의 추가적인 단계 (c1), (c2) 및/또는 (c3)를 추가적으로 포함하는 단계 (a) 전의 단계 (a1)을 임의 포함하는, 도 1에 따른 아데노-연관 바이러스 캡시드 분리 방법의 흐름도이다.
도 4는 하기 실시예 1에서 기술되는 바와 같은 분리 방법에 따른 완전히 패키징된 캡시드 및 빈 캡시드의 용리 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 5는 하기 실시예 1에서 기술되는 바와 같은 분리 방법에 따른 완전히 패키징된 캡시드 및 빈 캡시드의 용리 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 6 A-D는 하기 실시예 4에서 기술되는 바와 같은 분리 방법에 따른 완전히 패키징된 캡시드 및 빈 캡시드의 용리 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 7은 하기 실시예 4에서 기술되는 바와 같은 분리 방법에 따른 완전히 패키징된 캡시드 및 빈 캡시드의 용리 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 8은 하기 실시예 5에서 기술되는 바와 같은 분리 방법에 따른 완전히 패키징된 캡시드 및 빈 캡시드의 용리 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 9는 하기 실시예 6에서 기술되는 바와 같은 분리 방법에 따른 완전히 패키징된 캡시드 및 빈 캡시드의 용리 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 2는 단계 (a) 전의 추가적인 단계 (a1)을 추가적으로 포함하는, 도 1에 따른 아데노-연관 바이러스 캡시드 분리 방법의 흐름도이다.
도 3은 단계 (b) 후에 하나 이상의 추가적인 단계 (c1), (c2) 및/또는 (c3)를 추가적으로 포함하는 단계 (a) 전의 단계 (a1)을 임의 포함하는, 도 1에 따른 아데노-연관 바이러스 캡시드 분리 방법의 흐름도이다.
도 4는 하기 실시예 1에서 기술되는 바와 같은 분리 방법에 따른 완전히 패키징된 캡시드 및 빈 캡시드의 용리 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 5는 하기 실시예 1에서 기술되는 바와 같은 분리 방법에 따른 완전히 패키징된 캡시드 및 빈 캡시드의 용리 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 6 A-D는 하기 실시예 4에서 기술되는 바와 같은 분리 방법에 따른 완전히 패키징된 캡시드 및 빈 캡시드의 용리 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 7은 하기 실시예 4에서 기술되는 바와 같은 분리 방법에 따른 완전히 패키징된 캡시드 및 빈 캡시드의 용리 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 8은 하기 실시예 5에서 기술되는 바와 같은 분리 방법에 따른 완전히 패키징된 캡시드 및 빈 캡시드의 용리 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 9는 하기 실시예 6에서 기술되는 바와 같은 분리 방법에 따른 완전히 패키징된 캡시드 및 빈 캡시드의 용리 곡선을 보여주는 그래프이다.
본 개시는 하기 단계:
a) 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 액체 샘플을 크로마토그래피 재료에 첨가하는 단계로서,
여기서 액체 샘플은 적어도 90%의 순도 및 적어도 1012 아데노-연관 바이러스 캡시드/ml의 농도의 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하며, 그 중 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 10%는 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드이고,
여기서 크로마토그래피 재료는 지지체 및 아데노-연관 바이러스 캡시드에 대한 결합을 위한 리간드를 포함하는 강한 또는 부분적으로 강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료를 포함하며;
여기서 크로마토그래피 재료는 리간드를 지지체에 연결시키는 표면 연장기를 포함하고, 여기서 표면 연장기는 중합체이며, 여기서 중합체는
(i) 자연 발생 골격을 갖는 중합체, 예컨대 폴리사카라이드, 예컨대 전분, 셀룰로스, 덱스트란 또는 아가로스; 및
(ii) 합성 골격을 갖는 중합체, 예컨대 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 또는 폴리비닐 에테르
로부터 선택되는 것인 단계;
b) 크로마토그래피 재료로부터, 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 용리시키는 단계
를 포함하며, 여기서 단계 (b)에서 용리되는 아데노-연관 바이러스 캡시드는 용리액 분획으로 용리되고, 조합된 상기 용리액 분획은 단계 (a)에서 첨가된 액체 샘플의 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 50%를 포함하고 그 중 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 60%는 유전 물질로 완전히 패키징된 것인, 도 1에 도시되어 있는 바와 같은, 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드로부터 분리하는 방법을 제공하는 것에 의해, 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드의 캡시드로부터 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 분리하기 위한 기존의 방법과 연관되어 있는 문제점들을 해결하거나, 적어도 완화한다.
본원에서 개시되는 방법의 중요한 장점에는 완전히 패키징되지 않은 캡시드로부터의 완전히 패키징된 캡시드의 대-규모 분리에 그것이 적합하다는 것, 그리고 그것이 선행 기술의 방법에 비해, 완전히 패키징된 캡시드 대 완전히 패키징되지 않은 캡시드의 개선된 비를 제공한다는 것이 포함된다. 본원에서 개시되는 방법을 수행하는 것에 의해, 적어도 3:2인 완전히 패키징된 캡시드 대 완전히 패키징되지 않은 캡시드의 비를 갖는 조성물을 수득하는 것이 가능하다. 더 구체적으로, 본원에서 개시되는 방법은 완전히 패키징된 캡시드 대 빈 캡시드의 개선된 비는 물론, 완전히 패키징된 캡시드 대 부분적으로 패키징된 캡시드의 개선된 비도 제공한다.
"바이러스 입자"는 본원에서 완전한 감염성 바이러스 입자를 나타내는 데에 사용된다. 그것은 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA) 중 어느 하나의 형태인 바이러스의 게놈 (즉 바이러스 게놈)을 포함하는 코어를 포함하며, 상기 코어는 형태구조적으로 정해진 셸(shell)로 둘러싸여 있다. 상기 셸은 캡시드로 지칭된다. 캡시드 및 봉입된 바이러스 게놈은 함께 소위 뉴클레오캡시드를 구성한다. 일부 바이러스의 뉴클레오캡시드는 지질단백질 이중층 외피(envelope)로 둘러싸여 있다. 요법과 같은 다양한 적용분야를 위한 바이러스 벡터를 제조할 목적의 생물공정 분야에서, 바이러스 입자의 게놈은 해당 유전 물질을 포함하는 유전자 삽입물을 포함하도록 변형된다. 변형된 바이러스 입자는 세포 배양물 중 숙주 세포를 감염시키는 것을 가능하게 하는데, 상기 숙주 세포에서 바이러스 입자가 번식된 이후, 임의의 분리 및 정제 수단에 의해 세포 배양물로부터 바이러스 입자가 정제된다. 본원에서, 본원 개시 방법에 의해 세포 배양물로부터 분리될 바이러스 입자는 대안적으로는 "표적 분자" 또는 "표적"으로 지칭될 수 있다. "바이러스 입자"는 일 유형의 바이러스 입자를 의미하고자 하는 것이라는 것, 그리고 상기 용어의 단수 형태가 많은 수의 개별 바이러스 입자들을 포괄할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본원에서, "바이러스 입자"라는 용어는 각각 하기에서 추가적으로 정의되는 바와 같은 "벡터" 및 "캡시드"라는 용어와 호환가능하게 사용될 수 있다.
"벡터"라는 용어는 본원에서 특정 세포 유형 또는 조직을 변형시키기 위한 유전자 전달을 달성할 용도로 예정되는 바이러스 입자, 보통은 재조합 바이러스 입자를 나타내는 데에 사용된다. 바이러스 입자는 예를 들면 치료용 유전자를 발현하는 벡터를 제공하도록 조작될 수 있다. 몇 가지 바이러스 유형들이 현재 일시적이거나 영구적인 것 중 어느 하나인 이전유전자 발현을 제공하기 위하여 유전 물질 (예컨대 유전자)을 세포로 전달할 용도로 조사되고 있다. 거기에는 아데노바이러스, 레트로바이러스 (γ-레트로바이러스 및 렌티바이러스), 폭스바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 바큘로바이러스 및 헤르페스 심플렉스 바이러스가 포함된다. 본원에서, "벡터"라는 용어는 각각 "바이러스 입자" 및 "캡시드"라는 용어와 호환가능하게 사용될 수 있다.
"캡시드"라는 용어는 바이러스 입자의 셸을 의미한다. 캡시드는 바이러스 입자의 코어를 둘러싸고 있으며, 보통 바이러스 게놈을 포함해야 한다. 상류의 제조 과정에서 생성되는 바와 같은 변형된 (재조합) 캡시드는 하나 이상의 적용분야에 해당하는, 예를 들면 다양한 치료 적용분야에 해당하는 유전 물질을 포함하는 완전한 바이러스 게놈을 포함할 것으로 예정된다. 그러나, 낮은 패키징 효율로 인하여, 조립되는 캡시드는 항상 임의의 유전 물질을 포함하는 것은 아니거나 감축된 유전자 단편만을 캡시드화함으로써, 각각 소위 빈 캡시드 및 부분적으로 충진된 캡시드를 초래한다. 이러한 캡시드들은 치료 기능은 보유하지 않으면서도 세포-매개 과정 동안 수용체에 결합하는 데에 있어서 그들이 경합한다. 이는 전체적인 치료 효능을 감소시키고 바람직하지 않은 면역 반응을 촉발할 수 있다. 결과적으로, 제조 과정 전체를 통하여 이러한 캡시드들을 추적하는 것이 일관된 생성물 품질 및 적정한 투여 반응을 보장하는 데에 중요하다 (문헌 [Xiaotong Fu et al., Analytical Strategies for Quantification of Adeno-Associated Virus Empty Capsids to Support Process Development, Human gene therapy methods, 2019, 30(4): 144-152]). 세포 배양에서 인공적으로 제조되는 바이러스 입자 군집 중 20-30%까지에서, 캡시드는 부분적으로만 유전 물질에 의해 충진된다. 또한, 인공적으로 제조되는 바이러스 입자들 중 많게는 98%까지에서, 캡시드는 바이러스 게놈의 어떠한 부분도 전혀 포함하지 않는데, 다시 말하자면 그것이 비어있다. 그러나, 일반적으로는 인공적으로 제조되는 바이러스 입자들 중 80% 내지 90% 사이가 빈 캡시드를 갖는데, 현재 최고의 사례는 적게는 50%의 빈 캡시드를 달성하고 있다.
본원에서, "캡시드"라는 용어는 각각 "벡터" 및 "바이러스 입자"라는 용어와 호환가능하게 사용될 수 있다. 본 개시의 문맥에서, 캡시드는 유전 물질을 포함할 수 있거나, 포함하지 않을 수 있다.
"해당 유전 물질"이라는 용어는 생물공정 분야에서 바이러스 복제에 의해 생성되고 정제되는 데에 적격이며 가치가 있어서 비제한적으로 치료 적용분야와 같은 다양한 적용분야에서 그것이 사용될 수 있는 것으로 간주되는 유전 물질을 의미하고자 하는 것이다. 비-제한적인 예로서, 해당 유전 물질은 치료용으로 적격인 뉴클레오티드 서열과 같은 치료용으로 적격인 유전 물질을 포함할 수 있다.
"유전 물질로 완전히 패키징된 캡시드"라는 용어는 본원에서 (숙주 세포에 의해) 올바르게 생성된 캡시드, 또는 다른 말로 하면 완전한 바이러스 게놈을 포함하는 캡시드, 또는 다른 말로 하면 그의 바이러스 게놈 100%를 포함하는 캡시드, 또는 다른 말로 하면 기능성인 바이러스 게놈을 포함하는 캡시드를 나타내는 데에 사용된다.
상기 바이러스 게놈은 본원의 다른 어딘가에서 정의되는 바와 같은 해당 유전 물질을 포함하는 유전자 삽입물을 포함한다.
본원에서, 완전한 바이러스 게놈을 포함하는 캡시드는 대안적으로는 "완전 캡시드" 또는 "완전히 패키징된 캡시드"로 지칭될 수 있다. "완전 캡시드", "완전히 패키징된 캡시드" 및 "유전 물질로 완전히 패키징된 캡시드"라는 용어들은 본 문서 전체에 걸쳐 호환가능하게 사용될 수 있다.
"유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 캡시드"라는 용어는 본원에서 (숙주 세포에 의해) 올바르게 생성되지 않은 캡시드, 또는 다른 말로 하면 완전한 바이러스 게놈을 포함하지 않는 캡시드, 또는 다른 말로 하면 그의 바이러스 게놈의 100% 미만을 포함하는 캡시드를 나타내는 데에 사용된다.
유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 캡시드는 유전 물질로 부분적으로 충진되거나, 임의의 유전 물질로 전혀 충진되지 않은 것 중 어느 하나이다.
"유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 캡시드"라는 용어는 하기에서 정의되는 바와 같은 "부분적으로 충진된 캡시드" 및 "빈 캡시드"라는 용어를 포괄한다.
"부분적으로 충진된 캡시드"는 본원에서 그의 바이러스 게놈 중 결함 부분과 같은 그의 바이러스 게놈 중 일부를 포함하는 캡시드, 또는 다른 말로 하면 부분적인 바이러스 게놈을 포함하는 캡시드, 또는 다른 말로 하면 비-완전 바이러스 게놈을 포함하는 캡시드, 또는 다른 말로 하면 결함성의 바이러스 게놈을 포함하는 캡시드, 또는 다른 말로 하면 완전한 바이러스 게놈의 0% 초과 100% 미만, 예컨대 완전한 바이러스 게놈의 약 1% 내지 약 99%, 예컨대 약 5% 내지 약 95%, 예컨대 약 10% 내지 약 90%, 또는 예컨대 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99%를 포함하는 캡시드로 정의된다. 부분적으로 충진된 캡시드는 올바르지 않게 생성된 캡시드이기 때문에, 그의 예정 적용분야, 예컨대 치료 적용분야에서 사용하기 위하여 캡시드 군집을 제공하기 전에, 캡시드 군집으로부터 부분적으로 충진된 캡시드를 가능한 한 많이 분리하여 제거하는 것이 바람직하다. 본원에서, 부분적으로 충진된 캡시드는 대안적으로는 "중간 캡시드"로 지칭될 수 있다.
"빈 캡시드"는 본원에서 그의 바이러스 게놈 중 어떠한 부분도 포함하지 않는, 즉 그의 바이러스 게놈 0%를 포함하는 캡시드, 또는 다른 말로 하면 어떠한 유전 물질도 전혀 충진되지 않은 캡시드로 정의된다. 이에 따라, 빈 캡시드는 어떠한 해당 유전 물질도 포함하지 않는다. 결과적으로, 그의 예정 적용분야, 예컨대 치료 적용분야에서 사용하기 위하여 캡시드 군집을 제공하기 전에, 캡시드 군집으로부터 빈 캡시드를 가능한 한 많이 분리하여 제거하는 것이 바람직하다 (그리고 때로는 예컨대 임상 규제로 인하여, 필요함).
그의 예정 적용분야, 예컨대 치료 적용분야에서 사용하기 위하여 바이러스 입자의 군집을 제공하기 전에, 완전 캡시드를 농축시키는 것, 즉 부분적으로 충진된 캡시드 및 빈 캡시드의 백분율을 희생하여 완전 캡시드의 백분율을 증가시키는 것이 바람직하다 (때로는 심지어는 예컨대 임상 규제로 인하여, 필요하다).
캡시드 군집에서의 완전 캡시드 및 빈 캡시드의 백분율은 관련 기술분야에 알려져 있는 몇 가지 방법을 사용하여 추산 또는 분석될 수 있다. 그러한 방법들 중 일부를 하기에 간단하게 기술한다:
1. 크로마토그램 중 A260:280은 피크에 존재하는 완전 캡시드 백분율의 추산치를 제공하게 됨 (1-1.5의 비는 완전 캡시드가 농축되었음을 표시하며, 0.5-0.7의 비는 주로 빈 캡시드를 함유하고 있는 것임).
2. qPCR:ELISA 비. qPCR은 바이러스 게놈을 정량하며, ELISA는 총 바이러스 입자를 정량함. 변이를 동반하는 2종 검정의 비는 덜 정밀하며 불확실하게 됨. 확인을 위해서는 직교 분석(orthogonal analysis)을 필요로 함 (하기 3, 4 또는 5 참조).
3. 완전 및 빈 캡시드를 분리하는 분석용 음이온 교환 (백분율을 계산하기 위한 A260:280 비 및 피크 면적). 정밀도는 피크 해상도에 따라 달라짐.
4. 분석용 초원심분리 (AUC). 서로 다른 밀도의 입자들 (완전, 부분적 충진 및 빈 캡시드에 상응)을 검출하고 정량함. 이는 현재 관련 기술분야에서 "최고 표준(golden standard)"으로 알려져 있음. 그러나, 초원심분리는 규모증대가 가능하지 않으며, 그에 따라 대-규모 캡시드 배치의 분석에는 적합하지 않음.
5. 투과 전자 현미경법 (TEM). 입자 (완전, 부분적 충진 및 빈 캡시드)를 계수하는 이미지 분석. 샘플 조제물로부터 인공물을 도입할 수 있음.
캡시드 군집에서의 완전 캡시드 및 빈 캡시드의 백분율을 추산하거나 분석하기 위한 일부 방법들은 본원에 의거 참조로서 개재되는 문헌 [Xiaotong Fu et al., Analytical Strategies for Quantification of Adeno-Associated Virus Empty Capsids to Support Process Development, Human gene therapy methods, 2019, 30(4): 144-152]에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
본원에서 사용될 때의 "액체 샘플"이라는 용어가 세포 배양물, 또는 세포 배양물로부터 기원하며 임의의 분리 및 정제 수단에 의해 적어도 부분적으로 정제된 유체로부터 수득가능한 임의 유형의 샘플을 포괄한다는 것이 이해되어야 한다.
"분리 매트릭스"라는 용어는 본원에서 관능기를 포함하는 1종 이상의 리간드가 결합되어 있는 지지체를 포함하는 재료를 나타내는 데에 사용된다. 리간드(들)의 관능기는 본원에서 피분석물로도 지칭되며 액체 샘플로부터 분리되어야 하고/거나 액체 샘플에 존재하는 다른 화합물들로부터 분리되어야 하는 화합물에 결합한다. 분리 매트릭스는 또한 리간드(들)를 지지체에 결합시키는 화합물을 포함할 수 있다. 하기에서 추가적으로 기술되는 바와 같이, 그와 같은 화합물을 기술하는 데에는, "링커", "연장기" 및 "표면 연장기"라는 용어들이 사용될 수 있다. 이와 같은 분야에서는, 때로는 "수지"라는 용어가 분리 매트릭스에 사용된다. "크로마토그래피 재료" 및 "크로마토그래피 매트릭스"라는 용어는 본원에서 일 유형의 분리 매트릭스를 나타내는 데에 사용된다.
"표면"이라는 용어는 본원에서 모든 외부 표면을 의미하며, 다공성 지지체의 경우에는 외부 표면은 물론, 세공 표면도 포함한다.
본원에서, "강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료"라는 용어는 사차화된 아민 기를 포함하는 리간드를 포함하는 크로마토그래피 재료를 의미하고자 하는 것이다. 사차 아민 기는 그것이 적용되는 pH에 관계없이 항상 양으로 하전되는 강한 음이온 교환 기이다. DEAE-기재 유형 크로마토그래피 재료의 경우, 아민 기의 사차화도는 크로마토그래피 재료에 포함되어 있는 아민 기들 사이에서 가변적일 수 있다. 전체적으로 크로마토그래피 재료에서 약 12% 내지 약 100%인 아민 기의 사차화도가 일반적으로 강하거나 적어도 부분적으로 강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료처럼 거동하는 크로마토그래피 재료로 귀결되는 것으로 간주되는데, 아민 기들 중 이러한 적어도 12%가 항상 하전되기 때문이다. 사차화된 아민 기와 달리, 거의 모든 다른 이온 교환 기들은 약한데, 다시 말하자면 그의 전하가 사용되는 합리적인 pH 범위 (예컨대 pH 2-11) 내에서 완전 하전으로부터 비하전까지 가변적이며, pI에서는 중성 전하 (동일한 양의 + 및 - 전하)를 갖는다.
캅토(Capto) Q (시티바(Cytiva), 스웨덴)가 약 100%의 사차화된 아민 기를 갖는 강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료의 비-제한적인 예이다. 캅토 DEAE (시티바, 스웨덴)는 약 15%의 아민 기 사차화도를 갖는 강한 또는 부분적으로 강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료의 비-제한적인 예이다.
본원의 다른 어딘가에서 추가적으로 정의되는 바와 같이, 분리 매트릭스는 임의 유형의 분리 장치에 포함되어 있을 수 있다. 비-제한적인 예로서, 크로마토그래피 재료는 크로마토그래피 컬럼에 포함되어 있는 크로마토그래피 재료에 액체 샘플을 첨가하기 전에 크로마토그래피 컬럼에 충진될 수 있다.
이와 같은 문맥에서, "리간드"는 주어진 피분석물에 대하여 공지 또는 미지의 친화성을 갖는 분자이며, 그의 표면상에 고정된 임의의 관능기 또는 포획 요소(capturing agent)를 포함하는 반면, "피분석물"은 리간드에 대한 임의의 특이적 결합 상대물을 포함한다. "리간드"라는 용어는 본원에서 "특이적 결합 분자", "특이적 결합 상대물", "포획 분자" 및 "포획 요소"라는 용어들과 호환가능하게 사용될 수 있다. 본원에서, 리간드와 상호작용하는 액체 샘플 중 분자는 "피분석물"로 지칭된다. 본 개시에 따른 해당 피분석물은 아데노-연관 바이러스 캡시드, 더 구체적으로는 유전 물질로 완전히 패키징되거나 완전히 패키징되지 않은 것 중 어느 하나인 아데노-연관 바이러스 캡시드이다. 결과적으로, 본원에서 "피분석물", "아데노-연관 바이러스 캡시드" 및 "캡시드"라는 용어들은 호환가능하게 사용될 수 있다.
완전히 패키징되지 않은 캡시드로부터 완전히 패키징된 캡시드를 분리하기 위한 본원에서 개시되는 방법에서, 사용되는 크로마토그래피 재료는 리간드를 지지체에 연결시키는 링커를 포함하는데, 다시 말하자면 지지체에의 리간드의 결합이 지지체와 리간드 사이에 링커를 도입하는 것에 의해 제공된다. 상기 결합은 에피클로로히드린; 에피브로모히드린; 알릴-글리시딜에테르; 비스-에폭시드 예컨대 부탄디올디글리시딜에테르; 할로겐-치환된 지방족 물질 예컨대 디-클로로-프로판올; 및 디비닐 술폰의 사용에 의한 것과 같은 임의의 통상적인 공유 결합 방법론에 따라 수행될 수 있다. 적합한 링커의 다른 비-제한적인 예는 하기이다: 2-6개 탄소 원자를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 3-6개 탄소 원자를 갖는 탄수화물, 및 3-6개 탄소 원자를 갖는 폴리알콜. 이러한 방법에 대해서는 모두 관련 기술분야에 잘 알려져 있어서, 통상의 기술자에 의해 용이하게 수행된다.
리간드는 바람직하게는 "표면 연장기" 또는 간단하게 "연장기"로도 알려져 있는 더 긴 링커 분자를 통하여 지지체에 결합된다. 연장기에 대해서는 관련 분야에 잘 알려져 있는데, 통상적으로 리간드와 지지체 사이의 거리를 입체적으로 증가시키는 데에 사용된다. 연장기는 때로는 촉수 또는 유연성 팔로 표시된다. 가능한 화학적 구조에 대한 더욱 상세한 설명은 예를 들면 본원에 의거 참조로서 포함되는 US 6,428,707호를 참조하라. 간단하게 말하자면, 연장기는 단일- 또는 공중합체와 같은 중합체의 형태로 존재할 수 있다. 친수성 중합체 연장기는 합성 기원의 것, 즉 합성 골격을 갖는 것, 또는 생물학적 기원의 것, 즉 자연 발생 골격을 갖는 생체중합체일 수 있다. 통상적인 합성 중합체는 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴- 및 폴리메타크릴아미드, 폴리비닐 에테르 등이다. 통상적인 생체중합체는 폴리사카라이드, 예컨대 전분, 셀룰로스, 덱스트란, 아가로스이다. 본원의 실시예 1에 기술되어 있는 결과는 놀랍게도 표면 연장기를 포함하는 크로마토그래피 재료가 표면 연장기를 포함하지 않는 동일한 크로마토그래피 재료에 비해 빈 AAV 캡시드로부터의 완전 AAV 캡시드의 향상된 분리를 제공한다는 것을 보여준다.
"용리액(eluent)"이라는 용어는 본 분야에서의 그의 통상적인 의미, 즉 분리 매트릭스로부터 1종 이상의 화합물을 방출시키는 데에 적합한 pH 및/또는 이온 강도를 갖는 완충제로 사용된다.
"용리액"이라는 용어는 본 분야에서의 그의 통상적인 의미, 즉 크로마토그래피 컬럼상에 액체 샘플을 적재한 후 크로마토그래피 컬럼으로부터 용리되는 액체 샘플의 부분(들)으로 사용된다.
상기에서 언급된 바와 같이, 완전히 패키징되지 않은 캡시드로부터의 완전히 패키징된 캡시드의 상기 분리 방법에서, 단계 a)에서 크로마토그래피 재료에 첨가되는 액체 샘플은 적어도 90%, 예컨대 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 순도 및 적어도 1012, 예컨대 1013, 1014 또는 1015 아데노-연관 바이러스 캡시드/ml의 농도의 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하며, 그 중 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 10%, 예컨대 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%가 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드이다. 액체 샘플 중 아데노-연관 캡시드의 순도와 관련하여, 적어도 90%, 예컨대 99% 이하의 순도는 액체 샘플의 생물학적 물질 중 적어도 90%, 예컨대 99% 이하가 아데노-연관 캡시드 (완전, 빈 및 부분적으로 충진된 캡시드 포함)에 상당하는 반면, 나머지 10% 이하, 예컨대 1%는 숙주 세포 단백질 및 DNA에 상당한다는 것을 의미하고자 하는 것이다.
상기-개시된 방법 중 단계 b)의 목표는 가능한 한 높은 순도의 완전히 패키징된 캡시드를 수득하는 것이다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 이것이 다양한 서로 다른 분리 조건들을 적용하는 것에 의해 달성될 수 있다는 것을 쉽게 이해한다. 가능한 한 높은 순도의 완전히 패키징된 캡시드를 수득하기 위한 분리 조건의 비-제한적인 예에는 크로마토그래피 재료에 대한 완전히 패키징되지 않은 캡시드의 결합을 가능하게 하면서도 하기인 분리 조건들이 포함된다:
(i) 완전히 패키징된 캡시드가 크로마토그래피 재료로 실질적으로 유통되도록 하는 것 (즉 완전히 패키징된 캡시드가 크로마토그래피 재료에 실질적으로 결합하지 않는 것), 또는
(ii) 완전히 패키징된 캡시드가 크로마토그래피 재료에 결합하도록 한 후, 이어서 크로마토그래피 재료로부터 그것을 용리시키는 것. 항목 (ii)에서 기술된 결합-용리 과정에서, 완전히 패키징된 캡시드는 어떠한 분리 조건이 적용되는지에 따라 완전히 패키징되지 않은 캡시드의 전 또는 후에 크로마토그래피 재료로부터 용리될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
상기에서 언급된 바와 같이, 정제와 관련된 몇 가지 파라미터, 예컨대 그의 등전점과 관련하여, 완전히 패키징된 캡시드와 완전히 패키징되지 않은 캡시드 사이에는 작은 차이가 존재한다. 이는 종종 완전히 패키징된 캡시드 및 완전히 패키징되지 않은 캡시드의 (적어도 부분적인) 공동-용리로 이어진다. 이에 따라, 현실적으로, 상기-개시된 방법의 단계 (b)에서 용리되는 아데노-연관 바이러스 캡시드는 완전, 빈 및 부분적으로 충진된 캡시드로 완전히 분리되지 않게 된다. 그러나, 단계 (a)에서 크로마토그래피 재료에 첨가된 액체 샘플에서에 비해 실질적으로 더 높은 백분율의 완전 캡시드를 포함하는 용리액 분획이 존재하게 된다. 더 구체적으로, 상기에서 개시된 바와 같이, 단계 (b)에서 용리되는 아데노-연관 바이러스 캡시드, 즉 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드는 용리액 분획으로 용리되고, 조합된 상기 용리액 분획은 단계 (a)에서 첨가된 액체 샘플의 아데노-연관 바이러스 캡시드 중 적어도 50%, 예컨대 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90%를 포함하고 그 중 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 60%, 예컨대 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90%가 유전 물질로 완전히 패키징된 것이다. 본원에서 개시되는 방법에 의해 달성되는 완전 캡시드 회수율 및 정제율의 비-제한적인 예는 단계 (a)에서 첨가된 액체 샘플의 캡시드 중 적어도 50%이며 그 중 적어도 60%가 완전 캡시드인 회수율, 예컨대 단계 (a)에서 첨가된 액체 샘플의 캡시드 중 적어도 70%이며 그 중 적어도 80%가 완전 캡시드인 회수율이다. 하기에서 추가적으로 기술되는 실시예 1에서, 결과는 수확물로부터의 캡시드 중 적어도 60%이며 그 중 적어도 60%가 완전 캡시드인 회수율을 나타낸다. 현재, 본원에서 개시되는 방법만큼 높은 회수율 및 정제율을 제공하는 공적으로 가용한 대-규모 방법은 존재하지 않는다.
상기에서 언급된 바와 같이, 본원에서 개시되는 방법에서 적용되는 크로마토그래피 재료는 지지체 및 아데노-연관 바이러스 캡시드에 대한 결합을 위한 리간드를 포함하는 강한 또는 부분적으로 강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료를 포함한다.
상기 강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료의 리간드는 하기 화학식 I로 정의될 수 있으며:
여기서 R1은 C1-C3 알킬로부터 선택되고, R2 및 R3는 C1-C3 알킬, CH2OH 및 CH2CHOHCH3로부터 독립적으로 선택된다.
비-제한적인 예로서, R1, R2 및 R3 각각은 CH3이다.
화학식 I로 정의되며 R1, R2 및 R3 각각이 CH3인 리간드를 포함하는 크로마토그래피 재료, 예컨대 스웨덴 시티바 (www.cytivalifesciences.com)에 의해 제공되는 캅토 Q라는 명칭하에 구입가능한 크로마토그래피 재료가 현재 구입가능하다. 캅토 Q는 추가적으로 표면 연장기로서 덱스트란을 포함하며, 예컨대 단일클론 항체의 정제를 위한 산업적 정제 공정에서의 고-해상도 폴리싱 단계용 크로마토그래피 매체이다. 그러나, 이전에 그것은 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 캡시드로부터의 완전히 패키징된 아데노-연관 캡시드의 분리에는 사용된 바가 없다.
또 다른 비-제한적인 예에 따르면, R1 및 R2는 에틸이며, R3는 메틸이다.
또 다른 비-제한적인 예에 따르면, R1 및 R2는 메틸이며, R3는 CH2CHOHCH3이다.
화학식 I로 정의되는 리간드의 밀도는 강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료 ml 당 리간드 약 60 내지 약 500 μmol, 예컨대 약 160 내지 약 350 μmol, 예컨대 약 160 내지 약 220 μmol일 수 있다.
대안적으로, 상기 강한 또는 부분적으로 강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료의 리간드는 하기 화학식 II로 정의될 수 있으며:
여기서 m은 1 내지 3의 정수이고;
R1 및 R2는 C1-C3 알킬로부터 독립적으로 선택되고; R3 및 R4는 C1-C3 알킬 및 CH2CHOHCH3로부터 독립적으로 선택되고; R5는 수소, C1-C3 알킬 및 CH2CHOHCH3로부터 선택되고;
단, m이 1인 경우, 상기 강한 또는 부분적으로 강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료의 리간드는 하기 화학식 III으로 정의되고:
여기서 n은 0 내지 3의 정수이며;
단, n이 0인 경우, R3 및 R4는 C1-C3 알킬로부터 독립적으로 선택되고, R5는 수소 또는 CH2CHOHCH3이다.
비-제한적인 예로서, 리간드는 화학식 III으로 정의되며, 하기 구조 (i)-(iv) 중 2종 이상의 조합을 포함한다:
(i) n은 0이며; R3 및 R4는 에틸이고; R5는 수소 또는 CH2CHOHCH3임;
(ii) n은 1이며; R1, R2, R3, R4는 에틸이고; R5는 수소 또는 CH2CHOHCH3임;
(iii) n은 2이며; 각 R1 및 R2는 에틸이고; R3 및 R4는 에틸이며; R5는 수소 또는 CH2CHOHCH3임;
(iv) n은 3이며; 각 R1 및 R2는 에틸이고; R3 및 R4는 에틸이며; R5는 수소 또는 CH2CHOHCH3임.
화학식 III으로 정의되는 리간드를 포함하며 상기-언급된 구조 (i)-(iv)의 조합을 포함하는 한 가지 현재 구입가능한 크로마토그래피 재료는 캅토 DEAE (시티바, 스웨덴)로 지칭되는 크로마토그래피 수지이다. 캅토 DEAE는 추가적으로 표면 연장기로서 덱스트란을 포함하며, 예컨대 단일클론 항체의 정제를 위한 산업적 정제 공정에서의 고-해상도 폴리싱 단계용 크로마토그래피 매체이다. 그러나, 이전에 그것은 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 캡시드로부터의 완전히 패키징된 아데노-연관 캡시드의 분리에는 사용된 바가 없다.
또 다른 비-제한적인 예에 따르면, 리간드는 화학식 III으로 정의되며, 여기서 m은 1이고; n은 1, 2 또는 3이며; 각 R1, R2, R3 및 R4는 메틸이고; R5는 수소이다.
또 다른 비-제한적인 예에 따르면, 리간드는 화학식 III으로 정의되며, 여기서 m은 1이고; n은 1, 2 또는 3이며; 각 R1, R2, R3 및 R4는 메틸이고; R5는 CH2CHOHCH3이다.
또 다른 비-제한적인 예에 따르면, 리간드는 화학식 III으로 정의되며, 여기서 m은 1이고, 하기 구조 (i)-(iv) 중 2종 이상의 조합을 포함한다:
(i) n은 0이며; R3 및 R4는 메틸이고; R5는 수소 또는 CH2CHOHCH3임;
(ii) n은 1이며; R1, R2, R3 및 R4는 메틸이고; R5는 수소 또는 CH2CHOHCH3임;
(iii) n은 2이며; 각 R1 및 R2는 메틸이고; R3 및 R4는 메틸이며; R5는 수소 또는 CH2CHOHCH3임;
(iv) n은 3이며; 각 R1 및 R2는 메틸이고; R3 및 R4는 메틸이며; R5는 수소 또는 CH2CHOHCH3임.
화학식 II 또는 화학식 III으로 정의되는 리간드의 밀도는 강한 또는 부분적으로 강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료 ml 당 리간드 약 60 내지 약 500 μmol, 예컨대 약 160 내지 약 350 μmol, 예컨대 약 290 내지 약 350 μmol일 수 있다.
상기에서 기술된 바와 같이, 크로마토그래피 재료는 리간드를 지지체에 연결시키는 표면 연장기를 포함하며, 상기 표면 연장기는 중합체이고, 상기 중합체는 하기로부터 선택된다:
(i) 자연 발생 골격을 갖는 중합체, 예컨대 폴리사카라이드, 예컨대 전분, 셀룰로스, 덱스트란 또는 아가로스; 및
(ii) 합성 골격을 갖는 중합체, 예컨대 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 또는 폴리비닐 에테르.
비-제한적인 예로서, 상기 표면 연장기는 덱스트란이다. 덱스트란은 약 10 내지 약 2000 kDa, 예컨대 약 10, 40, 70, 250, 750 또는 2000 kDa, 예컨대 40 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 덱스트란의 밀도는 크로마토그래피 재료 ml 당 덱스트란 약 5 내지 약 30 mg일 수 있다. 크로마토그래피 재료상에 고정되는 덱스트란의 양은 예를 들면 고정되는 덱스트란의 분자량에 따라 가변적일 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 보통, 덱스트란의 분자량이 증가할수록 양은 감소될 필요가 있다.
상기-개시된 방법의 단계 (a) 및 (b)는 약 6.0 내지 약 10.5, 예컨대 약 7.0 내지 약 10.0, 예컨대 약 7.5 내지 약 9.5, 또는 약 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 또는 10.5의 pH를 갖는 완충제를 적용하는 것을 포함할 수 있다. 비-제한적인 예에 따르면, 하기 실시예 1에서 기술되는 바와 같이, 화학식 I로 정의되는 리간드를 포함하는 크로마토그래피 재료의 경우, 약 9.5의 pH가 적용될 수 있다. 또한, 화학식 II 또는 화학식 III으로 정의되는 리간드를 포함하는 크로마토그래피 재료의 경우, 약 7.5의 pH가 적용될 수 있다.
상기 완충제는 음이온 교환 크로마토그래피용으로 일반적으로 권장되는 완충제들에서 적합하게 선택되며, 예를 들면 트리스(히드록시메틸)아미노-메탄 (즉 트리스(Tris)), 1,3-비스(트리스(히드록시메틸)메틸아미노)프로판 (즉 비스-트리스 프로판), 트리에탄올아민, N-메틸디에탄올아민, 디에탄올아민, 1,3-디아미노프로판 또는 에탄올아민을 포함할 수 있다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 상기-열거된 완충제들 중 어느 하나를 위한 적합한 농도를 선택할 수 있다.
상기-개시된 방법에서, 단계 (b)는 임의로 상기 언급된 완충제들 중 하나인 완충제를 적용하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 완충제는 유전 물질로 완전히 패키징된 캡시드와 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 캡시드 사이의 분리를 향상시키는 화합물을 포함한다. 이와 같은 화합물은 단계 (a)에서 적용되는 완충제에는 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니나, 그와 같은 화합물은 예를 들면 캡시드와 리간드 사이의 상호작용 또는 캡시드와 캡시드 사이의 상호작용에 영향을 주는 것에 의해 분리를 향상시킬 수 있다. 분리를 향상시키는 상기 화합물은 예를 들면 탄수화물, 2가 금속 이온 및 세제로부터 선택될 수 있다.
분리를 향상시키는 상기 화합물이 탄수화물인 경우, 그것은 예를 들면 수크로스, 소르비톨 및 폴리사카라이드로부터 선택될 수 있다.
분리를 향상시키는 상기 화합물이 2가 금속 이온인 경우, 그것은 예를 들면 Mg2+, Fe2 + 및 Mn2 +로부터 선택될 수 있다. 상기 금속 이온은 임의로 예를 들면 클로라이드 이온 또는 술페이트 이온과 조합된 염의 형태로 존재할 수 있다. 단계 (b)의 완충제에 포함되는 적합한 금속 염의 비-제한적인 예는 MgCl2이다. 적합한 MgCl2 농도의 비-제한적인 예에는 약 0.5 내지 약 30 mM의 MgCl2, 예컨대 약 1 내지 약 20 mM, 예컨대 약 2 내지 약 10 mM, 또는 약 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 또는 30 mM의 MgCl2가 포함된다.
분리를 향상시키는 상기 화합물이 세제인 경우, 그것은 예를 들면 폴록사머, 예컨대 폴록사머 188 또는 플루로닉(Pluronic)™ F68, 및 폴리소르베이트, 예컨대 트윈(Tween) 20 또는 트윈 80으로부터 선택될 수 있다.
상-기 방법에서, 단계 (b)는 임의로 상기 언급된 완충제들 중 하나인 완충제를 적용하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 완충제는 크로마토그래피 재료에 결합된 캡시드를 용리시키는 것을 도울 수 있는 화합물을 포함한다. 이와 같은 화합물은 단계 (a)에서 적용되는 완충제에는 존재하지 않는다. 이와 같은 화합물의 비-제한적인 예는 1가 금속 이온의 염과 같은 염이다. 더 구체적으로, 상기 염은 코스모트로픽(kosmotropic) 염일 수 있다. 물 용매 중 염은 그것이 물-물 상호작용의 안정성 및 구조에 기여할 경우 코스모트로픽 (질서-야기)인 것으로 정의된다. 반면, 카오트로픽(chaotropic) (무질서-야기) 염은 물 구조를 붕괴시키고 비극성 용매 입자의 용해도를 증가시키며 용질 응집물을 불안정화하는 반대의 효과를 갖는다. 코스모트로픽 물질은 물 분자들이 친화성으로 상호작용하도록 하는데, 이는 효과상 단백질과 같은 거대분자에서 분자간 상호작용을 안정화한다 (문헌 [Moelbert S et al.]). 예를 들면 단백질을 솔트 아웃(salt out) 또는 솔트 인(salt in)하는 그의 능력 순서로의 이온의 분류인 호프마이스터(Hofmeister) 시리즈 또는 이액(lyotropic) 시리즈를 참조하여 척도가 확립될 수 있다 (문헌 [Hyde A et al.]).
더 구체적으로, 코스모트로픽 염은 (i) CO3 2-, SO4 2-, S2O3 2 -, H2PO4 -, HPO4 2 -, 아세테이트-, 시트레이트- 및 Cl-로 이루어진 군으로부터 선택된 음이온, 및 (ii) NH4 +, K+, Na+ 및 Li+로 이루어진 군으로부터 선택된 양이온을 포함할 수 있다. 본원의 바람직한 실시양태에서, 염은 소듐 아세테이트 (NaOAc)이다. 적합한 NaOAc 농도의 비-제한적인 예에는 약 5 mM 내지 약 500 mM, 예컨대 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 mM이 포함된다. 그러나, (i)에 열거되어 있는 바와 같은 음이온과 (ii)에 열거되어 있는 바와 같은 양이온의 조합으로 구성되는 다른 염들이 캡시드를 용리시키는 데에 대안적으로 사용될 수도 있다는 것이 이해되어야 한다. 비-제한적인 예로는 NaCl, LiCl, KCl, 또는 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 바와 같은 염 용리에 사용하기에 적합한 다른 등가의 금속 염이 있다. 적합한 NaCl 농도의 비-제한적인 예에는 NaCl 약 5 mM 내지 약 2 M, 예컨대 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 mM의 NaCl이 포함된다. 또한, 크로마토그래피 재료로부터의 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드의 용리를 향상시키기 위하여, 단계 (b)는 상기 화합물의 구배를 적용하는 것을 포함할 수 있다. 그와 같은 구배는 선형 구배 또는 단계 구배, 또는 이들의 조합일 수 있다.
단계 (b)에서 적용되기에 적합한 완충제의 비-제한적인 예는 20 mM 비스-트리스 프로판 (BTP), pH 9.5 (화학식 I로 정의되는 리간드) 또는 pH 7.5 (화학식 II 또는 III으로 정의되는 리간드), 2 mM MgCl2, 1% 수크로스 및 0.1% 폴록사머 188을 포함할 수 있다.
본원 개시 방법에서 적용되는 크로마토그래피 재료는 리간드가 결합되는 지지체를 포함한다. 상기 지지체는 유기 또는 무기 재료로부터 제조될 수 있으며, 다공성 또는 비-다공성일 수 있다. 일 실시양태에서, 지지체는 자연 중합체, 예컨대 가교-결합된 탄수화물 재료, 예컨대 아가로스, 아가, 셀룰로스, 덱스트란, 키토산, 곤약, 카라기난, 젤란, 알기네이트, 펙틴, 전분 등으로부터 제조된다. 자연 중합체 지지체는 용이하게 제조되며, 임의로 역 현탁 젤화(inverse suspension gelation)와 같은 표준 방법에 따라 가교-결합된다 (문헌 [S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964)]). 특히 유리한 실시양태에서, 지지체는 그의 유동 특성을 강화하는 방법에 의해 제조되는 상대적으로 경성이나 다공성인 아가로스 종류의 것이며, 예컨대 US 6,602,990호 (베르그(Berg))를 참조하라. 대안적인 실시양태에서, 지지체는 합성 중합체 또는 공중합체, 예컨대 가교-결합된 합성 중합체, 예컨대 스티렌 또는 스티렌 유도체, 디비닐벤젠, 아크릴아미드, 아크릴레이트 에스테르, 메타크릴레이트 에스테르, 비닐 에스테르, 비닐 아미드 등으로부터 제조된다. 그와 같은 합성 중합체들은 용이하게 제조되며, 임의로 표준 방법에 따라 가교-결합되는 바, 예컨대 문헌 ["Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988)]을 참조하라. 자연 또는 합성 중합체 지지체는 또한 예를 들면 다공성 입자의 형태로 스웨덴 시티바와 같은 시중 공급자로부터 구입가능하다. 다른 대안적인 실시양태에서, 지지체는 실리카와 같은 무기 중합체로부터 제조된다. 무기 다공성 및 비-다공성 지지체는 본 분야에 잘 알려져 있으며, 표준 방법에 따라 용이하게 제조된다.
크로마토그래피 재료의 지지체는 실질적으로 구형이거나, 신장형이거나 불규칙적으로 형성된 입자와 같은 입자의 형태로 존재할 수 있다.
크로마토그래피 재료가 입자의 형태인 경우, 상기 입자는 균질한 다공성을 가지며 아데노-연관 바이러스 캡시드에 대해 적어도 부분적으로 투과성인 입자일 수 있다.
본원에서, "균질한 다공성"이라는 용어는 균질한 다공성을 갖는 입자가 그의 전체 구조 또는 부피에 걸쳐 균질한 다공성을 가짐으로써 각 입자가 그의 전체 구조 또는 부피에 걸쳐 아데노-연관 바이러스 캡시드에 대해 적어도 부분적으로 투과성인 것을 의미하고자 하는 것이다. 다른 말로 하면, 균질한 다공성을 갖는 입자는 아데노-연관 바이러스 캡시드가 입자의 전체 구조 또는 부피에 걸쳐 그의 세공을 통하여 완전히 또는 적어도 부분적으로 확산되는 것을 가능하게 하는 다공성을 갖는다.
아데노-연관 바이러스는 직경이 대략 20-25 nm이다. 캡시드는 바이러스 입자의 셸이며 아데노-연관 바이러스는 캡시드를 둘러싸고 있는 지질단백질 이중층 외피를 가지며 있지 않기 때문에, 아데노-연관 바이러스 캡시드의 크기는 직경이 대략 20-25 nm이다.
따라서, 크로마토그래피 재료가 균질한 다공성을 가지며 아데노-연관 바이러스 캡시드에 대해 적어도 부분적으로 투과성인 입자의 형태로 존재하는 경우, 각 입자는 적합하게는 >25 nm, 즉 분리될 아데노-연관 바이러스 캡시드의 직경에 비해 더 커서 전체 입자 내에서의 캡시드의 확산을 가능하게 하는 직경의 세공을 포함할 수 있다. 본 개시의 구체적인 목적상, 즉 아데노-연관 바이러스 캡시드를 분리하는 데에 있어서, >25 nm의 직경은 비제한적으로 30, 50, 75, 100, 150 또는 200 nm를 포함한 >25 nm의 임의 크기일 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
또한, 그럼에도 불구하고, 그의 전체 구조 또는 부피에 걸쳐 균질한 다공성을 갖는 입자가 입자 내로 캡시드가 확산되는 것을 용이하게 가능하게 하기에 충분하게 큰 세공 및 캡시드의 확산을 가능하지 않게 하기에 충분하게 작은 세공 모두인 상이한 크기의 세공들을 포함할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 세공 크기의 이와 같은 다양성은 잘-알려져 있는 분자량 및 유체역학적 크기를 갖는 분자의 확산 계수에 의해 측정될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 140-225 kDa의 분자량 또는 20-25 nm의 유체역학적 직경 (즉 아데노-연관 바이러스 캡시드와 동일한 크기의 직경)을 갖는 덱스트란이 입자 세공 내에서의 아데노-연관 바이러스 캡시드의 확산도를 평가하는 데에 사용될 수 있다.
본원의 실시예 1에서 유리하게 사용되는 크로마토그래피 재료 캅토 Q 및 캅토 DEAE는 대략 90 μm의 직경을 갖는 실질적으로 구형인 입자 또는 비드 형태의 지지체를 포함한다. 이와 같은 유형의 입자는 (다시 말하자면 그의 전체 구조 또는 부피에 걸쳐) 균질한 다공성을 가지며 (다시 말하자면 그의 전체 구조 또는 부피에 걸쳐) 아데노-연관 바이러스 캡시드에 대해 적어도 부분적으로 투과성인 입자의 비-제한적인 예가 된다.
본원 개시 방법에서 사용하기에 적합한 크로마토그래피 재료의 입자 크기는 5-500 μm, 예컨대 10-100 μm, 예컨대 30-90 μm의 직경 범위로 존재할 수 있다. 본질적으로 구형인 입자의 경우, 평균 입자 크기는 10-500과 같은 5-1000 μm의 범위일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 평균 입자 크기는 10-200 μm의 범위이다. 본 분야 통상의 기술자라면, 사용되는 공정에 따라 적합한 입자 크기 및 다공도를 용이하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 대-규모 공정의 경우, 경제적인 이유로, 더 다공성이지만 경성인 지지체가 특히 포획 단계를 위하여 대량 부피의 처리를 가능하게 하는 데에 바람직할 수 있다. 크로마토그래피에서는, 컬럼의 크기 및 형상과 같은 공정 파라미터가 선택에 영향을 주게 된다. 팽창 상 공정(expanded bed process)에서는, 매트릭스가 보통 고밀도 충진재, 바람직하게는 스테인리스-강 충진재를 포함한다. 다른 공정의 경우, 다른 기준이 매트릭스의 특성에 영향을 줄 수 있다.
크로마토그래피 재료는 사용시 그의 원래 형태를 유지하기 위하여 액체에 침지되는 건조된 입자와 같이 건조된 것일 수 있다. 예를 들면, 그와 같은 건조된 크로마토그래피 재료는 건조된 아가로스 입자를 포함할 수 있다.
크로마토그래피 재료의 지지체는 대안적으로는 모노리스(monolith), 필터 또는 멤브레인, 모세관, 칩, 나노섬유, 표면 등과 같은 통상적으로 분리에서 사용되는 임의의 다른 형상을 가질 수 있다.
크로마토그래피 재료의 지지체가 모노리스를 포함하는 경우, 아데노-연관 바이러스 캡시드의 분리라는 목적상 적합한 모노리스의 세공 직경은 >25 nm, 즉 분리될 캡시드의 직경에 비해 더 큰 최소 세공 직경으로부터 약 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 또는 5.0 μm와 같은 약 5 μm의 최대 세공 직경까지의 범위이다.
크로마토그래피 재료의 지지체가 나노섬유를 포함하는 경우, 그와 같은 나노섬유는 예를 들면 전기방적 중합체 나노섬유를 포함할 수 있다. 사용시, 그와 같은 나노섬유는 이동상이 투과할 수 있는 다수의 세공을 포함하는 고정상을 형성한다.
크로마토그래피 재료의 지지체는 단일 멤브레인, 멤브레인 적층체 또는 필터와 같은 멤브레인성 구조를 포함할 수 있다. 상기 멤브레인은 흡착성 멤브레인일 수 있다. 크로마토그래피 재료의 지지체가 멤브레인성 구조를 포함하는 경우, 아데노-연관 바이러스 캡시드의 분리라는 목적상 적합한 멤브레인성 구조의 세공 직경은 >25 nm, 즉 분리될 캡시드의 직경에 비해 더 큰 최소 세공 직경으로부터 약 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 또는 5.0 μm와 같은 약 5 μm의 최대 세공 직경까지의 범위이다. 크로마토그래피 재료가 멤브레인성 구조를 포함하는 경우, 그와 같은 멤브레인성 구조는 예를 들면 중합체 나노섬유의 부직 웹을 포함할 수 있다.
적합한 중합체의 비-제한적인 예는 폴리술폰, 폴리아미드, 나일론, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리아크릴로니트릴, 폴리스티렌 및 포리에틸렌 옥시드, 그리고 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
대안적으로, 중합체는 셀룰로스 및 셀룰로스의 부분적 유도체, 특히 셀룰로스 에스테르, 가교-결합된 셀룰로스, 그래프팅된 셀룰로스 또는 리간드-결합된 셀룰로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것과 같은 셀루로스계 중합체일 수 있다. 셀룰로스 섬유 크로마토그래피 (피브로(Fibro) 크로마토그래피로 알려져 있음; 시티바, 스웨덴)는 짧은 공정 시간 및 높은 생산성을 위한 초고속 크로마토그래피 정제이며, 고도의 유량 및 고도의 셀룰로스 섬유 용량을 이용한다. 크로마토그래피 재료의 지지체가 피브로와 같은 셀룰로스 섬유를 포함하는 경우, 아데노-연관 바이러스 캡시드의 분리라는 목적상 적합한 셀룰로스 섬유의 세공 직경은 >25 nm, 즉 분리될 캡시드의 직경에 비해 더 큰 최소 세공 직경으로부터 약 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 또는 5.0 μm와 같은 약 5 μm의 최대 세공 직경까지의 범위이다.
"멤브레인 크로마토그래피"라는 용어는 생물공정 분야에서의 그의 통상적인 의미를 갖는다. 멤브레인 크로마토그래피에서는, 유체와 접촉하고 있는 고체 상 표면에의 유체 중 성분들, 예를 들면 개별 분자, 결합물 또는 입자의 결합이 존재한다. 고체 상의 활성 표면은 대류 수송에 의해 분자가 접근가능하다. 충진된 크로마토그래피 컬럼에 대비한 멤브레인 흡착재의 장점은 훨씬 더 높은 유량으로 전개되는 것에 대한 그의 적합성이다. 이는 대류-기반 크로마토그래피로도 지칭된다. 대류-기반 크로마토그래피 매트릭스에는 매트릭스 유입물과 유출물 사이에서의 수역학적 압력 차이의 적용이 매트릭스의 관류를 추진함으로써 높은 유량에서 매우 빠르게 수행되는 매트릭스로의, 또는 매트릭스로부터의 물질(들)의 실질적인 대류 수송을 달성하는 어떠한 매트릭스도 포함된다. 대류-기반 크로마토그래피 및 멤브레인 흡착재에 대해서는 예를 들면 그 전체가 의거 참조로서 개재되는 US20140296464A1호, US20160288089A1호, WO2018011600A1호, WO2018037244A1호, WO2013068741A1호, WO2015052465A1호, US7867784B2호에 기술되어 있다.
유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드로부터 분리하기 위한 본원 개시 방법 중, 방법의 단계 (a) 및 (b)에서 언급되는 크로마토그래피 재료인 사용 크로마토그래피 재료는 유리하게는 폴리싱 단계에서 크로마토그래피 재료가 적용되는 것을 의미하는 폴리싱 크로마토그래피 재료일 수 있다.
액체 크로마토그래피의 맥락에서, "폴리싱 단계"라는 용어는 미량의 불순물이 제거됨으로써 활성의 안전한 생성물을 남기는 최종 정제 단계를 지칭한다. 폴리싱 단계 동안 제거되는 불순물은 종종 표적 분자의 이형태체(conformer), 즉 특정 분자 입체형태를 갖는 표적 분자의 형태, 또는 추정상 누손 생성물이다. 폴리싱 단계는 대안적으로는 "이차 정제 단계"로 지칭될 수 있다.
또한, 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드로부터 분리하기 위한 본원 개시 방법의 단계 (a)에서 첨가된 액체 샘플은 유리하게는 예비-정제된 액체 샘플일 수 있다.
본 개시는 또한 도 1에 나타낸 바와 같은 방법의 단계 (a)에 따라 크로마토그래피 재료에 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 해당 예비-정제된 액체 샘플을 첨가하기 전에, 도 2에 도시되어 있는 바와 같이 아데노-연관 바이러스 캡시드-함유 세포 배양 수확물로부터 아데노-연관 바이러스 캡시드를 분리하여 아데노-연관 바이러스 캡시드를 예비-정제하는 것을 포함하는 단계 (a1)을 추가적으로 포함함으로써, 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 예비-정제된 액체 샘플을 수득하는, 도 1에 나타낸 바와 같으며 상기에서 상세하게 기술된 바와 같은 방법을 수행하는 것을 포함하는, 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드로부터 분리하는 방법을 제공한다.
이와 같은 예비-정제 단계 (a1)는 대안적으로는 "포획 단계"로 지칭될 수 있으며, 액체 크로마토그래피의 맥락에서 분리 절차의 개시 단계(들)을 지칭할 수 있다. 가장 일반적으로는, 포획 단계는 정화 (예컨대 여과, 원심분리 또는 침전에 의함), 및 보통은 또한 샘플의 농축 및/또는 안정화, 그리고 예를 들면 샘플의 상기 정화, 농축 및 안정화 후에 크로마토그래피를 적용하는 것에 의한 가용성 불순물로부터의 상당한 정제를 포함한다. 포획 단계 후에는, 나머지 양의 불순물 예컨대 숙주 세포 단백질, DNA, 바이러스, 내독소, 영양소, 세포 배양 배지 중 성분, 예컨대 소포 작용제 및 항생제, 그리고 생성물-관련 불순물, 예컨대 응집물, 잘못접힌(misfolded) 종 및 응집물을 추가적으로 감소시키는 중간 정제가 이어질 수 있다.
이와 같은 예비-정제 단계는 아데노-연관 바이러스 캡시드-함유 세포 배양 수확물을 정제 방법의 하기 비-제한적인 예들 중 1종 이상에 적용하는 것을 포함할 수 있다:
(i) 친화성 크로마토그래피,
(ii) 이온 교환 크로마토그래피,
(iii) 침전 또는 접면 유동 여과 (TFF) 후 이어지는 예를 들면 캡시드의 유통을 크로마토그래피 재료에 대한 불순물의 결합과 조합하는 캅토 코어 400 크로마토그래피 재료 (시티바, 스웨덴)의 사용에 의하는 것과 같은 크기-배제 크로마토그래피,
(iv) TFF 후 이어지는 이온 교환 크로마토그래피, 및
(v) TFF 후 이어지는 이온 교환 크로마토그래피 및 캅토 코어.
도 2에 도시되어 있으며 상기에서 기술된 방법의 예비-정제 단계에서 적용하기에 적합한 크로마토그래피 재료의 비-제한적인 예에는 각각 친화성 크로마토그래피 재료, 이온 교환 크로마토그래피 재료 및 크기-배제 크로마토그래피 재료가 포함된다. 크로마토그래피 재료는 양으로 하전된 기, 예컨대 사차 아미노, 사차 암모늄 또는 아민 기, 또는 음으로 하전된 기, 예컨대 술포네이트 또는 카르복실레이트 기에 의해 관능화될 수 있다. 크로마토그래피 재료는 이온 교환 기, 친화성 펩티드/단백질-기재 리간드, 소수성 상호작용 리간드, IMAC 리간드, 또는 DNA 기재 리간드 예컨대 올리고 dT에 의해 관능화될 수 있다.
본원에서, "세포 배양물"이라는 용어는 배양되는 세포 또는 세포 군의 배양물을 지칭하며, 여기서 세포는 세균 세포, 바이러스 세포, 진균 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포와 같은 임의 유형의 세포일 수 있다. 세포 배양물은 정화되지 않은 것, 즉 세포를 포함하는 것일 수 있거나, 또는 세포-고갈된 것, 즉 세포를 포함하지 않거나 적은 세포를 포함하며 대신 세포를 제거하기 전에 세포로부터 방출된 생체분자들을 포함하는 배양물일 수 있다. 또한, 정화되지 않은 세포 배양물은 무손상 세포, 붕괴된 세포, 세포 균질물 및/또는 세포 용해물을 포함할 수 있다.
"세포 배양 수확물"이라는 용어는 본원에서 수확된 후 세포가 배양된 용기 또는 장비로부터 제거된 세포 배양물을 나타내는 데에 사용된다.
"분리 장치"라는 용어는 생물공정 분야에서의 그의 통상적인 의미를 가지며, 화합물 제조로부터의 부산물들을 함유하는 유체로부터 화합물을 분리 및 정제할 수 있으며 거기에 적합한 모든 유형의 분리 장치를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 분리 장치는 본원의 다른 어딘가에서 추가적으로 정의되는 바와 같은 분리 매트릭스를 포함할 수 있다.
본원에서 개시되는 방법에 따른 폴리싱 단계에서 사용하기에 적합한 분리 장치의 비-제한적인 예에는 본원의 다른 어딘가에서 추가적으로 기술되는 바와 같은 크로마토그래피 컬럼 및 멤브레인 장치가 포함된다. 그와 같은 분리 장치는 적합하게는 본원의 다른 어딘가에서 상세하게 기술되는 바와 같은 화학식 I, II 또는 III으로 정의되는 리간드를 포함하는 강한 또는 부분적으로 강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료 형태의 크로마토그래피 재료를 포함할 수 있다.
본원에서 기술되는 바와 같은 포획 단계, 또는 예비-정제 단계에서 사용하기에 적합한 분리 장치의 비-제한적인 예는 여과 장치, 크로마토그래피 컬럼 및 멤브레인 장치이다. 포획 단계에서 사용하기에 적합한 크로마토그래피 컬럼에는 예를 들면 친화성 크로마토그래피 재료, 이온 교환 크로마토그래피 재료, 혼합 양식 크로마토그래피 재료 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 재료가 충진될 수 있다.
도 3에 도시되어 있는 바와 같이, 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드로부터 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 분리하기 위한 본원에서 개시되는 방법은 추가적으로 상기에서 기술된 바와 같은 방법의 단계 (b)에서 용리된, 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 용리액 분획을 하기 단계들 중 하나 이상에 적용함으로써, 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 제약 조성물을 수득하는 것을 포함할 수 있다:
c1) 아데노-연관 바이러스 캡시드를 제약상 관련 용량으로 농축시키는 단계,
c2) 방법 단계 (b)에서 적용된 완충제를 제약상 허용되는 완충제로 대체하는 단계, 및/또는
c3) 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 용리액 분획을 멸균하는 단계.
관련 기술분야 통상의 기술자라면, 제약상 관련 용량이 비제한적으로 치료될 질환 또는 장애는 물론, 제약 조성물을 사용하여 치료될 대상체의 체중 및 상태와 같은 다양한 인자들에 따라 달라지게 된다는 것을 이해하고 있다.
제약상 허용되는 완충제에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있어서, 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
생성되는 조성물이 제약 조성물의 모든 규제 요건을 충족하기 위해서는, 보통 상기-열거된 3개 단계 c1-c3 모두가 수행되어야 한다.
상기-개시된 방법에서, 아데노-연관 바이러스 캡시드는 유리하게는 아데노-연관 바이러스 혈청형 8 (AAV8), 아데노-연관 바이러스 혈청형 5 (AAV5), 아데노-연관 바이러스 혈청형 1 (AAV1), 아데노-연관 바이러스 혈청형 2 (AAV2), 아데노-연관 바이러스 혈청형 4 (AAV4), 아데노-연관 바이러스 혈청형 6 (AAV6), 아데노-연관 바이러스 혈청형 7 (AAV7), 아데노-연관 바이러스 혈청형 9 (AAV9) 또는 아데노-연관 바이러스 혈청형 10 (AAV10), 또는 그의 변이체의 캡시드일 수 있다.
상기에서 열거된 바와 같은 아데노-연관 바이러스 (AAV) 혈청형 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8 또는 10과 관련한 "변이체"라는 용어는 예를 들면 특정 표적 기관에 대한 임상 성능이 향상되도록 캡시드 구조가 변형된, 변형되거나 조작된 AAV를 의미하고자 하는 것이다. 비-제한적인 예로서, AAV8 변이체는 AAV8의 캡시드 부분을 포함하며, 추가적으로 AAV5와 같은 AAV8이 아닌 다른 AAV 혈청형의 캡시드 부분을 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 언급되는 바와 같은 AAV8 변이체는 비-변형 AAV8 캡시드 외부 표면 구조의 적어도 50%, 예컨대 60%, 70%, 80% 또는 90%를 유지하는 것과 같이, 비-변형 AAV8 캡시드에 대해 상당한 구조적 유사성을 유지해야 한다. 이는 각각 비-변형 AAV 혈청형 1, 2, 4, 5, 6, 7 또는 10과 비교하였을 때의 AAV 혈청형 1, 2, 4, 5, 6, 7 또는 10의 변이체에도 동등하게 적용된다. 또한, 비-제한적인 예로서, AAV8 변이체의 정제 또는 분리 맥락에서, "변이체"는 해당 특정 크로마토그래피 재료에 대한 원래 AAV8의 결합 능력에 비해 기능상 동등한 특정 크로마토그래피 재료의 리간드에 대한 결합 능력을 갖는 아데노-연관 바이러스로 본원에서 정의된다. 이는 각각 원래의 AAV 혈청형 1, 2, 4, 5, 6, 7 또는 10과 비교하였을 때의 AAV 혈청형 1, 2, 4, 5, 6, 7 또는 10의 변이체에도 동등하게 적용된다. 상기 특정 크로마토그래피 재료는 예를 들면 본원의 다른 어딘가에서 더욱 상세하게 개시되는 바와 같은 강한 또는 부분적으로 강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료일 수 있다. 아데노-연관 바이러스의 변이체는 예를 들면 아데노-연관 바이러스 게놈 중 하나 이상 뉴클레오티드의 자발적 돌연변이 또는 조작된 변형에 의해 수득될 수 있다 (즉 인간 상호작용에 의해 수득됨).
본원의 바람직한 실시양태에 따르면, 도 1, 도 2 및 도 3에 도시되어 있는 바와 같은 분리 방법에서, 각각 크로마토그래피 재료는 화학식 IV로 정의되며:
단계 (b)의 용리 완충제는 소듐 아세테이트를 포함한다. 상기 방법은 상기에서 기술된 바와 같은 모든 혈청형 또는 변이체의 AAV 캡시드 분리에 적용될 수 있다. 특히, 분리될 캡시드는 AAV9 혈청형 또는 그의 변이체의 캡시드일 수 있다.
본 개시는 또한 지지체, 리간드, 및 리간드를 지지체에 연결시키는 표면 연장기를 포함하며 화학식 IV로 정의되는 음이온 교환 크로마토그래피 재료의 용도이며, 하기 단계:
a. 적어도 90%의 순도 및 적어도 1012 아데노-연관 바이러스 캡시드/ml의 농도의 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하며, 그 중 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 10%는 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드인 액체 샘플을 크로마토그래피 재료에 첨가하는 단계;
b. 크로마토그래피 재료로부터, 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 용리시키는 단계
를 수행하는 것을 포함하고, 여기서 단계 (b)에서 용리되는 아데노-연관 바이러스 캡시드는 용리액 분획으로 용리되고, 조합된 상기 용리액 분획은 단계 (a)에서 첨가된 액체 샘플의 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 50%를 포함하고 그 중 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 60%는 유전 물질로 완전히 패키징된 것인, 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드로부터 분리하기 위한 용도를 제공한다.
본원의 바람직한 상기 용도 실시양태에 따르면, 단계 (b)의 용리 완충제는 소듐 아세테이트를 포함한다.
상기 용도에 따라 분리될 아데노-연관 바이러스 캡시드는 아데노-연관 바이러스 혈청형 1 (AAV1), 아데노-연관 바이러스 혈청형 2 (AAV2), 아데노-연관 바이러스 혈청형 4 (AAV4), 아데노-연관 바이러스 혈청형 5 (AAV5), 아데노-연관 바이러스 혈청형 6 (AAV6), 아데노-연관 바이러스 혈청형 7 (AAV7), 아데노-연관 바이러스 혈청형 8 (AAV8), 아데노-연관 바이러스 혈청형 9 (AAV9) 또는 아데노-연관 바이러스 혈청형 10 (AAV10), 또는 그의 변이체의 캡시드일 수 있다. 상기 용도의 특히 바람직한 실시양태에서, 아데노-연관 바이러스 캡시드는 아데노-연관 바이러스 혈청형 9 (AAV9) 또는 그의 변이체의 캡시드이다.
본 개시는 또한 (상기에서 상세하게 기술된 바와 같은) 단계 c1-c3 중 하나 이상을 포함하는 상기-개시된 분리 방법을 수행하는 것에 의해 수득된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 제약 조성물에서 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드 대 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드의 비가 적어도 3:2인, 즉 완전 캡시드의 수가 빈 캡시드 및 부분적으로 충진된 캡시드의 총 수에 비해 적어도 1.5배 더 많은, 대상체에서의 기관 또는 조직과 관련된 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드 대 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드의 상기 비는 적어도 2:1, 예컨대 3:1, 4:1 또는 5:1이다. 다시 말하자면, 바람직하게는 완전 캡시드의 수는 빈 캡시드 및 부분적으로 충진된 캡시드의 총 수에 비해 적어도 2, 예컨대 3, 4 또는 5배 더 많다.
기관 또는 조직과 관련된 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하기 위한 상기 방법은 적합하게는 유전자 요법을 포함할 수 있다. 치료용으로 적격인 유전자(들) 또는 유전 물질은 대상체에 투여되기로 되어 있는 제약 조성물에 포함되는 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드 중에 존재하는 것으로 이해되어야 한다.
기관 또는 조직과 관련된 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하기 위한 상기-개시된 방법에서, 아데노-연관 바이러스 캡시드는 유리하게는 아데노-연관 바이러스 혈청형 8 (AAV8), 아데노-연관 바이러스 혈청형 5 (AAV5), 아데노-연관 바이러스 혈청형 1 (AAV1), 아데노-연관 바이러스 혈청형 2 (AAV2), 아데노-연관 바이러스 혈청형 4 (AAV4), 아데노-연관 바이러스 혈청형 6 (AAV6), 아데노-연관 바이러스 혈청형 7 (AAV7), 아데노-연관 바이러스 혈청형 9 (AAV9) 또는 아데노-연관 바이러스 혈청형 10 (AAV10), 또는 그의 변이체의 캡시드일 수 있다.
기관 또는 조직과 관련된 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하기 위한 상기-개시된 방법에서, 기관 또는 조직은 중추 신경계, 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 광수용체 세포, 망막 색소 상피, 골격근 및 뇌에서 임의로 선택될 수 있다. 더 구체적으로는, AAV 혈청형과 기관/조직 유형의 하기 조합들이 고려된다:
(i) 캡시드는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8 및 AAV10 캡시드로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 중추 신경계이거나;
(ii) 캡시드는 AAV1 및 AAV8 캡시드로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 심장이거나;
(iii) 캡시드는 AAV2 캡시드이며, 기관 또는 조직은 신장이거나;
(iv) 캡시드는 AAV7 및 AAV8 캡시드로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 간이거나;
(v) 캡시드는 AAV4, AAV5 및 AAV6 캡시드로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 폐이거나;
(vi) 캡시드는 AAV8이며, 기관 또는 조직은 췌장이거나;
(vii) 캡시드는 AAV2, AAV5 및 AAV8 캡시드로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 광수용체 세포이거나;
(viii) 캡시드는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5 및 AAV8 캡시드로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 망막 색소 상피이거나;
(ix) 캡시드는 AAV1, AAV6, AAV7 및 AAV8 캡시드로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 골격근이거나;
(x) 캡시드는 AAV10 캡시드이며, 기관 또는 조직은 뇌이거나; 또는
(xi) 캡시드는 AAV9 캡시드 또는 그의 변이체이며, 기관 또는 조직은 중추 신경계, 심장, 간, 폐 및 골격근으로부터 선택됨.
상기-언급된 조직 유형들은 아데노-연관 바이러스 캡시드, 특히 아데노-연관 바이러스 혈청형 8 (AAV8), 아데노-연관 바이러스 혈청형 5 (AAV5), 아데노-연관 바이러스 혈청형 1 (AAV1), 아데노-연관 바이러스 혈청형 2 (AAV2), 아데노-연관 바이러스 혈청형 4 (AAV4), 아데노-연관 바이러스 혈청형 6 (AAV6), 아데노-연관 바이러스 혈청형 7 (AAV7), 아데노-연관 바이러스 혈청형 9 (AAV9) 또는 아데노-연관 바이러스 혈청형 10 (AAV10), 또는 그의 변이체의 캡시드를 포함하는 제약 조성물의 투여에 의한 치료가 적용될 수 있는 기관 및 조직 유형의 비-제한적인 예라는 것이 이해되어야 한다.
기관 또는 조직과 관련된 질환 또는 장애의 비-제한적인 예로는 아데노-연관 바이러스, 특히 AAV5, AAV8 또는 AAV10, 또는 그의 변이체의 투여에 의해 치료 또는 예방 방법이 적합하게 수행될 수 있는 척수근 위축이 있다.
기관 또는 조직과 관련된 질환 또는 장애의 또 다른 비-제한적인 예는 아데노-연관 바이러스, 특히 AAV2 또는 그의 변이체의 투여에 의해 치료 또는 예방이 적합하게 수행될 수 있는 유전성 망막 이영양증이다.
기관 또는 조직과 관련된 질환 또는 장애의 다른 비-제한적인 예는 아데노-연관 바이러스, 특히 AAV8 또는 그의 변이체의 투여에 의해 치료 또는 예방 방법이 적합하게 수행될 수 있는 췌장 종양 및 간 대사 장애, 예컨대 오르니틴 트랜스카바밀라제 (OTC) 결핍이다.
관련 기술분야 통상의 기술자라면, 원하는 의학적 효과를 달성하기 위해서는 제약 조성물이 제약 유효량 또는 유효 투여량으로 대상체에게 투여되어야 한다는 것을 알고 있다. 제약상 유효한 양 및 투여량은 비제한적으로 치료될 질환 또는 장애는 물론, 치료될 대상체의 체중 및 상태과 같은 다양한 인자들에 따라 달라진다.
본 개시는 또한 상기에서 상세하게 기술된 바와 같은, 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드로부터 분리하는 방법을 수행하는 것에 의해 수득되는 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물이며, 상기 조성물에서 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드 대 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드의 비가 적어도 3:2인, 즉 완전 캡시드의 수가 빈 캡시드 및 부분적으로 충진된 캡시드의 총 수에 비해 적어도 1.5배 더 많은 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드 대 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드의 상기 비는 적어도 2:1, 예컨대 3:1, 4:1 또는 5:1이다. 다시 말하자면, 바람직하게는 완전 캡시드의 수는 빈 캡시드 및 부분적으로 충진된 캡시드의 총 수에 비해 적어도 2, 예컨대 3, 4 또는 5배 더 많다.
본 개시는 또한 (상기에서 상세하게 기술된 바와 같은) 단계 c1-c3 중 하나 이상을 포함하는 상기-개시된 분리 방법을 수행하는 것에 의해 수득되는 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 제약 조성물이며, 상기 제약 조성물에서 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드 대 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드의 비가 적어도 3:2인, 즉 완전 캡시드의 수가 빈 캡시드 및 부분적으로 충진된 캡시드의 총 수에 비해 적어도 1.5배 더 많은 제약 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드 대 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드의 상기 비는 적어도 2:1, 예컨대 3:1, 4:1 또는 5:1이다. 다시 말하자면, 바람직하게는 완전 캡시드의 수는 빈 캡시드 및 부분적으로 충진된 캡시드의 총 수에 비해 적어도 2, 예컨대 3, 4 또는 5배 더 많다.
상-기 제약 조성물은 요법에서 사용하기 위한, 임의로는 유전자 요법에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
유전자 요법과 같은 요법에서 사용하기 위한 상-기 제약 조성물에서, 아데노-연관 바이러스 캡시드는 유리하게는 아데노-연관 바이러스 혈청형 8 (AAV8), 아데노-연관 바이러스 혈청형 5 (AAV5), 아데노-연관 바이러스 혈청형 1 (AAV1), 아데노-연관 바이러스 혈청형 2 (AAV2), 아데노-연관 바이러스 혈청형 4 (AAV4), 아데노-연관 바이러스 혈청형 6 (AAV6), 아데노-연관 바이러스 혈청형 7 (AAV7), 아데노-연관 바이러스 혈청형 9 (AAV9) 또는 아데노-연관 바이러스 혈청형 10 (AAV10), 또는 그의 변이체의 캡시드일 수 있다.
또한, 상기 제약 조성물은 유리하게는 중추 신경계, 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 광수용체 세포, 망막 색소 상피, 골격근 및 뇌로부터 선택된 기관 또는 조직과 관련된 질환 또는 장애의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
1종 이상의 언급되는 구성요소를 "포함하는" 장치 또는 조성물은 구체적으로 언급되지 않은 다른 구성요소도 포함할 수 있다. "포함하는"이라는 용어는 하위세트로서 장치 또는 조성물이 존재하는 다른 특징 또는 구성요소 없이 열거된 구성요소들을 보유한다는 것을 의미하는 "본질적으로 ~로 구성되는"을 포함한다. 마찬가지로, 1종 이상의 언급되는 단계를 "포함하는" 방법은 구체적으로 언급되지 않은 다른 단계도 포함할 수 있다.
단수 표현은 복수 표현도 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
[
실시예
]
실시예
1: 마그네슘 클로라이드 및 증가하는 소듐 클로라이드 선형
구배를
사용한 음이온 교환 크로마토그래피 재료상에서의 AAV8 캡시드의 분리
크로마토그래피 재료
하기에서 추가적으로 기술되는 바와 같이, 하기의 현재 구입가능한 음이온 교환 크로마토그래피 재료로 개선된 결과를 산출하였다:
캅토 Q (시티바, 스웨덴):
리간드: 사차 아민
입자 크기, d50V: ~90 μm
매트릭스: 덱스트란 표면 연장기를 동반한 고도로 가교-결합된 아가로스
이온 용량: 0.16-0.22 mmol Cl-/ml 매체
pH 안정성, 조정가능: 2-12
캅토 DEAE (시티바, 스웨덴):
리간드: 디에틸아미노에틸, 부분적으로 사차화된 아민 기
입자 크기, d50V: ~90 μm
매트릭스: 덱스트란 표면 연장기를 동반한 고도로 가교-결합된 아가로스
이온 용량: 0.29-0.35 mmol Cl-/ml 매체
pH 안정성, 조정가능: 2-9.
또한, 하기에서 기술되는 바와 같이, 현재 구입가능한 캅토 Q 임프레스(ImpRes) (시티바, 스웨덴)도 시험하였다. 임프레스 수지의 지지체 재료는 40 μm의 직경을 갖는 실질적으로 구형인 입자 또는 비드로 구성된다.
장비 및 샘플
각 수지를 10 cm의 비드 높이로 트리콘(Tricorn) 5 컬럼 (2 mL)에 충진하고, 아길렌트 바이오-이너트(Agilent Bio-Inert) 1260 시스템 또는 악타 퓨어(KTA pure) P25 시스템을 사용하여 1 mL/분의 유량으로 전개하였다. 적용된 샘플은 모든 수지에 있어서 완전 및 빈 캡시드 양자를 함유하는 친화성 정제된 AAV8 대략 1 x 1013 바이러스 캡시드 (>15%의 완전 캡시드)이었다. 검출은 형광 (280 nm에서 여기, 방출 348 nm) 또는 UV (280 및 260 nm)를 사용하였다.
결과
1 M NaCl까지의 염 구배를 사용하는 50 mM 아세테이트 pH 4.5 및 5.5를 사용하여, 현재 구입가능한 양이온 수지들 (SP 세파로스(Sepharose) XL, 캅토 SP 임프레스, 캅토 SP 임팩트(ImPact) 및 캅토 애드히어 임프레스(Adhere ImpRes); 시티바, 스웨덴)을 평가하였다. 20 mM 트리스(Tris) pH 6-9.5를 사용하고 1 M NaCl까지의 염 구배를 사용하여, 다중양식 음이온 교환 수지 (현재 구입가능한 캅토 애드히어; 시티바, 스웨덴)를 평가하였다. 시험된 두 유형 수지의 결과는 친화성 정제된 AAV8을 적용하였을 때 분리를 나타내지 않았으며, 단일 피크만을 나타내었다 (데이터는 나타내지 않음).
NaCl 400 mM까지의 선형 구배 용리를 사용하는 20 mM 비스-트리스 프로판 (BTP), pH 9.5 (캅토 Q 임프레스 및 캅토 Q의 경우) 또는 pH 7.5 (캅토 DEAE의 경우), 2 mM MgCl2, 1% 수크로스, 0.1% 폴록사머 188을 사용하여, 현재 구입가능한 수지들인 캅토 Q 임프레스 (도 4A), 캅토 Q (도 4B) 및 캅토 DEAE (도 5) 각각을 전개하였다. 1 미만의 UV 260:280 비를 갖는 피크 1 면적을 빈 캡시드로 정의하였으며, 1 초과의 UV 260:280 비를 갖는 피크 2 면적을 완전 캡시드로 정의하였다. UV260 및 UV280에 대한 피크 면적을 기준으로% 완전 캡시드를 계산하였다 (표 1). qPCR (바이러스 게놈, 완전 캡시드) 및 ELISA (총 캡시드)에 의해서도% 완전 및 빈 캡시드 면에서의 피크 내용물을 분석하여, 피크 정체성을 확인하였다 (데이터는 나타내지 않음).
도 4 및 도 5의 크로마토그램은 덱스트란 연장기 (캅토 Q 및 캅토 DEAE상에는 존재하나 캅토 Q 임프레스상에는 존재하지 않음)가 완전 (F) 및 빈 (E) AAV8 캡시드 사이의 분리를 급격하게 향상시킨다는 것을 보여준다. 캅토 DEAE의 경우, pH를 7.5로 감소시키는 것이 9.5까지의 더 높은 pH에 비해 분리를 향상시켰다 (데이터는 나타내지 않음).
UV260:280 비는 캅토 Q 임프레스 (어떠한 덱스트란 연장기도 포함하지 않음)에서 더 낮아서,% 완전 캡시드가 더 낮고 그에 따라 농축이 덜 효율적이라는 것을 표시하였다. 캅토 Q 및 캅토 DEAE (덱스트란 연장기 포함)의 경우, 피크 2에서의 비가 더 높아서,% 완전 캡시드가 더 높고 빈 캡시드로부터 더 우수하게 분리된다는 것을 보여주었다 (표 1). 피크 2에서의 면적을 기준으로 계산된% 완전 캡시드는 UV260:280 비에서 만큼 크게 다르지 않았으나, 캅토 Q 임프레스 (도 4A)의 경우 완전 및 빈 캡시드 사이의 분리가 저조하여 완전 캡시드에 대해 측정된 면적이 정확하지 않았다. 완전 및 빈 피크는 중복성이며, 피크의 두 번째 절반에 완전 캡시드가 농축된다.
<표 1> UV260:280 피크 면적, 그리고 피크 1 (빈 캡시드) 및 2 (완전 캡시드)에서의 UV260:280을 기준으로 계산된% 완전 캡시드. * 중복성 피크로 인한 부정확한% 완전 캡시드 계산.
실시예
2: 가변적인 조건하에서의
AAV8
캡시드의
분리
상기 실시예 1에서와 같은 장비 및 샘플을 사용하고, 추가적으로 하기와 같은 변화를 동반하여 실시예 1에서와 같은 음이온 교환 크로마토그래피 재료를 사용하여, 빈 AAV8 캡시드로부터의 완전히 패키징된 AAV8 캡시드의 분리를 위한 실험 설계를 수행한다.
표면 연장기와 관련하여:
1) 상이한 덱스트란 크기 (kDa) (T10, T70, T250);
2) 상이한 덱스트란 양;
3) 덱스트란 대신, 글리시돌 기재 폴리 알콜 사용.
리간드 밀도와 관련하여:
1) 캅토 Q: 60-160, 220-260 μmol/mL;
2) 캅토 DEAE: 150-290, 350-400 μmol/mL.
크로마토그래피 재료 지지체와 관련하여:
1) 더 작은 수지 비드 크기: 35-90 μm;
2) 캅토 Q 및 캅토 DEAE에 비해 더 큰 세공 크기를 갖는 수지 비드.
리간드 화학과 관련하여:
1) 상이한 사차화 수준을 갖는 캅토 DEAE 리간드 (화학식 III에 따른 리단드);
2) 캅토 Q 유사체 (여기서 캅토 Q 리간드는 화학식 I로 정의됨):
a. R1, R2는 에틸이며; R3는 메틸임;
b. R1, R2는 메틸이며; R3는 CH2CHOHCH3임;
3) 캅토 DEAE 유사체 (여기서 캅토 DEAE 리간드는 화학식 II 또는 III으로 정의됨):
a. m=1이며; n=1이고; R1, R2, R3 및 R4 = 메틸이며; R5 = H임;
b. m=1이며; n=1이고; R1, R2, R3 및 R4 = 메틸이며; R5 = CH2CHOHCH3임;
c. m=1이며; 하기 구조 (i)-(iv) 중 2종 이상의 조합임:
(i) n은 0이며; R3 및 R4는 메틸이고; R5는 수소 또는 CH2CHOHCH3임;
(ii) n은 1이며; R1, R2, R3 및 R4는 메틸이고; R5는 수소 또는 CH2CHOHCH3임;
(iii) n은 2이며; 각 R1 및 R2는 메틸이고; R3 및 R4는 메틸이며; R5는 수소 또는 CH2CHOHCH3임;
(iv) n은 3이며; 각 R1 및 R2는 메틸이고; R3 및 R4는 메틸이며; R5는 수소 또는 CH2CHOHCH3임.
완충제 및 용리 조건과 관련하여:
1) 1-20 mM 사이의 상이한 MgCl2 농도;
2) 1)에서와 같은 MgCl2가 있거나 없이, 상이한 NaCl 선형 구배 0.1-1 M;
3) 1)에서와 같은 MgCl2가 있거나 없이, 상이한 pH 선형 구배 pH 4 -10;
4) 상이한 완충제:
a. 트리스
b. N-메틸디에탄올아민
5) 1), 2) 및 3)에서와 같은 pH, NaCl, MgCl2를 사용한 단계적 용리;
6) 1종의 피분석물은 크로마토그래피 재료에 결합하는 반면 또 다른 피분석물은 거기에 결합하지 않는 (예컨대 빈 캡시드는 결합하는 반면 완전 캡시드는 그렇지 않은) 유통 분리에 적합한 조건;
7) 수크로스 (0.1-5%) 및 폴록사머 188 세제 (0.01-1%)와 같은 첨가제가 있거나 없는 상기 전체.
실시예
3: 가변적인 조건하에서의 상이한
아데노
-연관 바이러스 혈청형들의
캡시드
분리
상기 실시예 1 및 실시예 2의 가변적인 조건들에 따라, 아데노-연관 바이러스 혈청형 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9 및 AAV10의 빈 캡시드로부터의 완전 캡시드의 분리를 위한 실험 설계를 수행한다.
실시예
4: 마그네슘 클로라이드 및 증가하는 소듐 아세테이트 단계
구배를
사용한 음이온 교환 크로마토그래피 재료상에서의 혈청형
AAV2
,
AAV5
,
AAV8
및
AAV9의
캡시드
분리
크로마토그래피 재료
실시예 1에서 기술된 것과 동일한 음이온 교환 크로마토그래피 재료 (즉 캅토 Q, 캅토 DEAE 및 캅토 Q 임프레스)를 AAV2, AAV5, AAV8 및 AAV9의 완전 및 빈 캡시드 분리에 사용하였다.
장비 및 샘플
각 수지를 충진 지침에 따라 트리콘 5 컬럼 (2 mL)에 충진하였다. 악타 퓨어 P25 시스템 (P25-20031)을 사용하여 1 CV/분 (즉 2 mL/분)의 유량으로 전개를 수행하였으며, 사장 부피를 최소화하고 뚜렷한 전도성 단계를 수득하기 위하여 시스템의 믹서(mixer)는 연결시키지 않았다. 모세관 루프를 사용하여 미리 평형화된 컬럼에 샘플을 적용하였다. 통상적으로, 각 수지에 적용되는 샘플은 완전 및 빈 캡시드의 혼합물 (하기와 같은 >5%의 완전 캡시드: AAV2 7-10%, AAV5 47%, AAV8 11-35%, AAV9 40%)을 함유하는 각각 대략 5x1012 AAV 캡시드 농도의 친화성 정제 또는 친화성 및 크기 배제 정제된 AAV2, AAV5, AAV8 또는 AAV9로 구성되었다. 상기 재료는 음이온 교환 리간드에 대한 AAV의 결합을 보장하기 위하여 낮은 전도도 (1-3 mS/cm)를 가질 필요가 있다.
전개 동안 280 및 260 nm UV 흡광도를 모니터링하고, 260/280 비를 크로마토그램을 탐색하는 진단 도구로 사용하여, 완전 및 빈 캡시드 군집 사이를 구별하였다. 크로마토그램은 유니콘(Unicorn)의 평가 패키지를 사용하여 분석하였다. 1.2를 초과하는 260/280 비는 100% 완전 캡시드를 표시하는 것으로 간주되며, 대략 0.6-0.7 또는 그 미만인 260/280 비는 100% 빈 캡시드를 표시하는 것으로 간주된다. 필요할 경우, AAV 없이 완충제를 사용한 블랭크 전개를 수행하여 임의의 배경 신호를 차감함으로써, 완충제로부터의 잠재적인 UV 신호의 제거를 보장하였다.
공정 조건 및 결과
각각 등용매 용리 또는 연속 구배 용리를 적용하는 것에 의해, 상이한 용리 염들 (500 mM 이하의 NaCl, NaOAc, NH4Cl 또는 NH4SO4) 및 첨가제 염 (20 mM 이하의 MgCl2 및 MgSO4)과 함께 첨가제 (0.1% 폴록사머 188, 1% 수크로스)가 있거나 없이 pH 4.5 및 5에서 아세테이트 완충제를 사용하여, 현재 구입가능한 양이온 교환 수지인 캅토 S, 그리고 표준형 양이온 교환 수지인 캅토 CM Dx 임프레스를 평가하였다. 상기-언급된 조건 또는 수지들 중 어느 것도 완전 및 빈 캡시드의 우수한 기준선 분리로 귀결되지 않았다 (데이터는 나타내지 않음).
모두 20 mM 비스-트리스 프로판 (BTP) pH 9.0 및 2 mM MgCl2를 함유하며 완충제 B는 추가적으로 용리 염으로서 250 mM 소듐 아세테이트 (NaOAc)를 포함하는 완충제 A 및 완충제 B를 포함하는 완충제 시스템을 사용한 2-단계 용리 방법을 적용하는 것에 의해, 덱스트란 연장기가 있는 현재 구입가능한 음이온 교환 수지인 캅토 DEAE (강한 또는 부분적으로 강한 음이온 교환) 및 캅토 Q (강한 음이온 교환) 각각을 평가하였다.
도 6-7에서, 각 크로마토그램 우측의 y-축은 크로마토그래피 재료로부터의 용리 동안의 결과적인 용리 완충제에 포함되는 완충제 B의 백분율 (나머지는 완충제 A임)을 나타낸다.
평형화: 5 CV 완충제 A
주사: 빈 루프 /w 3 ml 완충제 A
세척: 5 CV 완충제 A
2-단계 용리: 각 혈청형에 대하여 적용된 조건은 하기에 상술함
재-평형화: 5 CV 완충제 A
캅토
Q
AAV2: 단계 1 40% B, 20 CV
단계 2 100% B, 5 CV
AAV5: 단계 1 35% B, 20 CV
단계 2 100% B, 5 CV
AAV8: 단계 1 30% B, 20 CV
단계 2 100% B, 5 CV
AAV9: 단계 1 5% B, 20 CV
단계 2 30% B, 5 CV
캅토 Q 수지를 사용한 경우, 모든 시험된 혈청형 (AAV2, AAV5, AAV8 및 AAV9)이 완전 및 빈 캡시드의 우수한 분리를 초래하였다 (도 6A-D). 완전 (F) 및 빈 (E) 캡시드의 용리, 그리고 UV260:280 비를 도 6A-D에 나타내었다.
도 6A는 AAV2의 NaOAc 2-단계 용리 크로마토그램을 나타낸다.
도 6B는 AAV5의 NaOAc 2-단계 용리 크로마토그램을 나타낸다.
도 6C는 AAV8의 NaOAc 2-단계 용리 크로마토그램을 나타낸다.
도 6D는 AAV9의 NaOAc 2-단계 용리 크로마토그램을 나타낸다.
% 완전 캡시드는 UV260 및 UV280에 대한 피크 면적을 기준으로 계산하였다. qPCR (바이러스 게놈 (VG), 완전 캡시드) 및 ELISA (총 캡시드)에 의해,% 완전 및 빈 캡시드와 관련한 피크 내용물도 분석하였다. 결과를 표 2에 요약하였다.
<표 2> 증가하는 NaOAc 농도 및 일정한 마그네슘 클로라이드 농도를 사용한 2-단계 용리를 적용하는 상이한 4종 혈청형들의 완전 및 빈 캡시드 분리 결과
캅토
DEAE
캅토 DEAE 수지를 사용한 경우, 모든 시험된 AAV 혈청형 (AAV2, AAV5, AAV8 및 AAV9)이 완전 및 빈 캡시드의 우수한 분리를 초래하였다. 그러나, 이들은 캅토 Q 수지상에서 분리되는 경우에 비해 더 낮은 완충제 B 백분율에서 용리되었다.
도 7은 캅토 DEAE 수지상에서의 AAV9 용리 결과를 나타낸다. 캅토 Q에 대하여 상기에서 기술된 것과 동일한 완충제 시스템 (완충제 A: 20 mM BTP pH 9.0, 2 mM MgCl2; 완충제 B: 완충제 A + 250 mM NaOAc)을 사용한 경우, AAV9 빈 캡시드는 유통물 중에 용리되었으며, AAV9 완전 캡시드는 4%의 완충제 B를 적용하였을 때 용리되었다. 첫 번째 피크 (즉 유통물 피크)에서는 UV 260:280 비가 0.76이어서, 주로 빈 AAV9 캡시드는 물론, 소량의 완전 캡시드도 시사하였다. 두 번째 피크에서는 UV260:280 비가 1.3이어서, 높은 순도의 AAV9 완전 캡시드를 표시하였다 (도 7).
캅토
Q
임프레스
(덱스트란
연장기가
없는 것)
높은 델타 컬럼 압력으로 인하여 1 ml/분의 유량을 적용한 것 이외에는 상기에서 기술된 것과 동일한 조건들하에서, 각각 AAV9 및 AAV5의 분리에 대하여 캅토 Q 임프레스 수지를 평가하였다. 수지는 AAV5에는 작용하지 않았으나, AAV9 빈 캡시드로부터의 AAV9 완전 캡시드의 분리를 위한 2-단계 용리에는 적정하게 작용하였다 (결과는 나타내지 않음). 그러나, 캅토 Q 임프레스 (연장기가 없는 것)는 AAV9 빈 캡시드에는 결합하지 않으며 (그에 따라 유통물 중으로 용리됨), AAV9 완전 캡시드에만 약하게 결합함으로써, 캅토 Q (연장기가 있는 것)에 비해 덜 강력한 분리 방법을 제공한다.
실시예
5: 증가하는 마그네슘 클로라이드 단계
구배를
사용한 음이온 교환 크로마토그래피 재료상에서의 혈청형 AAV5 캡시드의 분리
완충제 시스템의 완충제 A 및 완충제 B가 모두 20 mM 비스-트리스 프로판 (BTP) pH 7.0, 1% 수크로스 및 0.1% 플루로닉(Pluronic)을 포함하며 완충제 B가 추가적으로 20 mM MgCl2를 포함한다는 차이를 두어 실시예 4에서 기술된 바와 같은 2-단계 용리를 적용하는 것에 의해, AAV5의 분리에 대하여 캅토 Q 수지를 평가하였다.
평형화: 5 CV 완충제 A
주사: 빈 루프 /w 3 ml 완충제 A
세척: 5 CV 완충제 A
단계 용리: 단계 1, 50% 완충제 B, 20 CV; 단계 2, 70% 완충제 B, 20 CV
재-평형화: 5 CV 완충제 A
도 8은 첫 번째 단계에서 50% 완충제 B를, 그리고 두 번째 단계에서 70% 완충제 B를 적용하는 캅토 Q 수지상에서의 AAV5의 2-단계 용리 방법의 결과를 나타낸다. 도 8에서는, 완전 (F) 및 빈 (E) 캡시드, 그리고 UV260:280 비를 나타내었다.
실시예
6: 마그네슘 클로라이드 및 증가하는 소듐 클로라이드 단계
구배를
사용한 음이온 교환 크로마토그래피 재료상에서의 혈청형
AAV5
캡시드의
분리
완충제 시스템의 완충제 A 및 완충제 B가 모두 20 mM 비스-트리스 프로판 (BTP) pH 9.5, 18 mM MgCl2, 1% 수크로스 및 0.1% 플루로닉을 포함하며 완충제 B가 추가적으로 400 mM NaCl을 포함한다는 차이를 두어 실시예 4 및 실시예 5에서 기술된 바와 같은 2-단계 용리를 적용하는 것에 의해, AAV5의 분리에 대하여 캅토 Q 수지를 평가하였다.
평형화: 5 CV 완충제 A
주사: 빈 루프 /w 3 ml 완충제 A
세척: 5 CV 완충제 A
2-단계 용리: 단계 1, 2.5% 완충제 B, 6 CV; 단계 2, 5% 완충제 B, 6 CV
재-평형화: 5 CV 완충제 A
도 9는 첫 번째 단계에서 2.5% 완충제 B를, 그리고 두 번째 단계에서 5% 완충제 B를 적용하는 캅토 Q 수지상에서의 AAV5의 2-단계 용리 방법의 결과를 나타낸다. 도 9에서는, 완전 (F) 및 빈 (E) 캡시드, 그리고 UV260:280 비를 나타내었다. 상-기한 조건들은 AAV5 캡시드의 성공적인 기준선 분리를 초래한 것으로 보인다.
본 개시가 상-기한 그의 예시적인 실시양태들로 제한되는 것은 아니라는 것, 그리고 하기하는 청구범위의 영역 내에서 본 개시의 몇 가지 있을 수 있는 변형들이 가능하다는 것이 이해되어야 한다.
[참고문헌]
Claims (27)
- 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드로부터 분리하는 방법이며, 하기 단계:
a. 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 액체 샘플을 크로마토그래피 재료에 첨가하는 단계로서,
여기서 액체 샘플은 적어도 90%의 순도 및 적어도 1012 아데노-연관 바이러스 캡시드/ml의 농도의 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하며, 그 중 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 10%는 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드이고,
여기서 크로마토그래피 재료는, 지지체 및 아데노-연관 바이러스 캡시드에 대한 결합을 위한 리간드를 포함하는 강한 또는 부분적으로 강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료를 포함하며,
여기서 크로마토그래피 재료는 리간드를 지지체에 연결시키는 표면 연장기를 포함하고, 여기서 표면 연장기는 중합체이며, 여기서 중합체는
(i) 자연 발생 골격을 갖는 중합체, 예컨대 폴리사카라이드, 예컨대 전분, 셀룰로스, 덱스트란 또는 아가로스, 및
(ii) 합성 골격을 갖는 중합체, 예컨대 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 또는 폴리비닐 에테르
로부터 선택되는 것인 단계;
b. 크로마토그래피 재료로부터, 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 용리시키는 단계
를 포함하며, 여기서 단계 (b)에서 용리되는 아데노-연관 바이러스 캡시드는 용리액 분획으로 용리되고, 조합된 상기 용리액 분획은 단계 (a)에서 첨가된 액체 샘플의 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 50%를 포함하고 그 중 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 60%는 유전 물질로 완전히 패키징된 것인, 방법. - 제1항에 있어서, 강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료의 리간드가 하기 화학식 I로 정의되며,
여기서 R1은 C1-C3 알킬로부터 선택되고, R2 및 R3는 C1-C3 알킬, CH2OH 및 CH2CHOHCH3로부터 독립적으로 선택되는 것인 방법. - 제2항에 있어서, R1, R2 및 R3 각각이 CH3인 방법.
- 제1항에 있어서, 강한 또는 부분적으로 강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료의 리간드가 하기 화학식 II로 정의되며,
여기서 m은 1 내지 3의 정수이고;
R1 및 R2는 C1-C3 알킬로부터 독립적으로 선택되고; R3 및 R4는 C1-C3 알킬 및 CH2CHOHCH3로부터 독립적으로 선택되고; R5는 수소, C1-C3 알킬 및 CH2CHOHCH3로부터 선택되고;
단, m이 1인 경우, 상기 강한 또는 부분적으로 강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료의 리간드는 하기 화학식 III으로 정의되고:
여기서 n은 0 내지 3의 정수이며;
단, n이 0인 경우, R3 및 R4는 C1-C3 알킬로부터 독립적으로 선택되고, R5는 수소 또는 CH2CHOHCH3인
방법. - 제4항에 있어서, 리간드가 화학식 III으로 정의되며, 하기 구조 (i)-(iv) 중 2종 이상의 조합을 포함하는 것인 방법:
(i) n은 0이며; R3 및 R4는 에틸이고; R5는 수소 또는 CH2CHOHCH3임;
(ii) n은 1이며; R1, R2, R3, R4는 에틸이고; R5는 수소 또는 CH2CHOHCH3임;
(iii) n은 2이며; 각 R1 및 R2는 에틸이고; R3 및 R4는 에틸이며; R5는 수소 또는 CH2CHOHCH3임;
(iv) n은 3이며; 각 R1 및 R2는 에틸이고; R3 및 R4는 에틸이며; R5는 수소 또는 CH2CHOHCH3임. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 연장기가 덱스트란인 방법.
- 제6항에 있어서, 덱스트란이 약 10 내지 약 2000 kDa, 예컨대 약 40 kDa의 분자량을 갖는 것인 방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 덱스트란의 밀도가 강한 또는 부분적으로 강한 음이온 교환 크로마토그래피 재료 ml 당 덱스트란 약 5 내지 약 30 mg인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)가 약 6.0 내지 약 10.5, 예컨대 약 7.5 내지 약 9.5의 pH를 갖는 완충제를 적용하는 것을 포함하며, 임의로 여기서 상기 완충제는 트리스(히드록시메틸)아미노-메탄 (즉 트리스), 1,3-비스(트리스(히드록시메틸)메틸아미노)프로판 (즉 비스-트리스 프로판), 트리에탄올아민, N-메틸디에탄올아민, 디에탄올아민, 1,3-디아미노프로판 또는 에탄올아민을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가, 유전 물질로 완전히 패키징된 캡시드와 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 캡시드 사이의 분리를 향상시키는 화합물을 포함하는 완충제를 적용하는 것을 포함하며, 임의로 여기서 상기 화합물은 탄수화물, 2가 금속 이온 및 세제로부터 선택되고; 임의로 여기서 탄수화물은 수크로스, 소르비톨 및 폴리사카라이드로부터 선택되고; 임의로 여기서 2가 금속 이온은 Mg2 +, Fe2 + 및 Mn2 +으로부터 선택되고, 임의로 여기서 2가 금속 이온은, 임의로 클로라이드 이온 또는 술페이트 이온과 조합된 염의 형태로 존재하며; 임의로 여기서 세제는 폴록사머 및 폴리소르베이트로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 재료의 지지체가 입자, 나노섬유, 모노리스 또는 멤브레인성 구조를 포함하며; 임의로 여기서 입자는 균질한 다공성을 가지며 아데노-연관 바이러스 캡시드에 대해 적어도 부분적으로 투과성인 입자이며; 임의로 여기서 입자는 실질적으로 구형인 입자이고; 임의로 여기서 나노섬유는 전기방적 중합체 나노섬유를 포함하며; 임의로 여기서 멤브레인성 구조는 중합체 나노섬유의 부직 웹을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 재료가 폴리싱 크로마토그래피 재료인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항의 단계 (a)에서 첨가된 액체 샘플이 예비-정제된 액체 샘플인 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노-연관 바이러스 캡시드-함유 세포 배양 수확물로부터 아데노-연관 바이러스 캡시드를 분리하여 아데노-연관 바이러스 캡시드를 예비-정제하는 단계 (a1)을 추가적으로 포함함으로써, 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 예비-정제된 액체 샘플을 수득하며, 이후에, 상기 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 예비-정제된 액체 샘플을 제1항의 단계 (a)에 따라 크로마토그래피 재료에 첨가하고, 임의로 여기서 상기 예비-정제는 아데노-연관 바이러스 캡시드-함유 세포 배양 수확물을 크로마토그래피하거나, 또는 정화한 후 크로마토그래피하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항의 단계 (b)에서 용리된, 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 용리액 분획을 하기 단계들 중 하나 이상에 적용함으로써, 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 제약 조성물을 수득하는 것을 추가적으로 포함하는 방법:
c1) 아데노-연관 바이러스 캡시드를 제약상 관련 용량으로 농축시키는 단계,
c2) 제1항의 단계 (b)에서 적용된 완충제를 제약상 허용되는 완충제로 대체하는 단계, 및/또는
c3) 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 용리액 분획을 멸균하는 단계. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노-연관 바이러스 캡시드가 아데노-연관 바이러스 혈청형 8 (AAV8), 아데노-연관 바이러스 혈청형 5 (AAV5), 아데노-연관 바이러스 혈청형 1 (AAV1), 아데노-연관 바이러스 혈청형 2 (AAV2), 아데노-연관 바이러스 혈청형 4 (AAV4), 아데노-연관 바이러스 혈청형 6 (AAV6), 아데노-연관 바이러스 혈청형 7 (AAV7), 아데노-연관 바이러스 혈청형 9 (AAV9) 또는 아데노-연관 바이러스 혈청형 10 (AAV10), 또는 그의 변이체의 캡시드인 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 용리 완충제가 코스모트로픽 염을 포함하며, 여기서 염은 (i) CO3 2-, SO4 2-, S2O3 2 -, H2PO4 -, HPO4 2 -, 아세테이트-, 시트레이트- 및 Cl-로 이루어진 군으로부터 선택된 음이온, 및 (ii) NH4 +, K+, Na+ 및 Li+로 이루어진 군으로부터 선택된 양이온을 포함하며, 임의로 여기서 염은 소듐 아세테이트인 방법.
- 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 재료가 화학식 IV로 정의되며,
여기서 단계 (b)의 용리 완충제는 소듐 아세테이트를 포함하고,
임의로 여기서 아데노-연관 바이러스 캡시드는 아데노-연관 바이러스 혈청형 9 (AAV9) 또는 그의 변이체의 캡시드인
방법. - 임의로 유전자 요법에 의한 대상체에서의 기관 또는 조직과 관련된 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법이며, 대상체에게 제15항, 및 제15항을 인용하는 제16항 및 제17항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는 것에 의해 수득된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 상기 제약 조성물에서 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드 대 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드의 비가 적어도 3:2, 바람직하게는 적어도 4:1이고,
임의로 여기서
(i) 캡시드는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8 및 AAV10 캡시드, 또는 그의 변이체로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 중추 신경계이거나;
(ii) 캡시드는 AAV1 및 AAV8 캡시드, 또는 그의 변이체로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 심장이거나;
(iii) 캡시드는 AAV2 캡시드 또는 그의 변이체이며, 기관 또는 조직은 신장이거나;
(iv) 캡시드는 AAV7 및 AAV8 캡시드, 또는 그의 변이체로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 간이거나;
(v) 캡시드는 AAV4, AAV5 및 AAV6 캡시드, 또는 그의 변이체로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 폐이거나;
(vi) 캡시드는 AAV8 또는 그의 변이체이며, 기관 또는 조직은 췌장이거나;
(vii) 캡시드는 AAV2, AAV5 및 AAV8 캡시드, 또는 그의 변이체로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 광수용체 세포이거나;
(viii) 캡시드는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5 및 AAV8 캡시드, 또는 그의 변이체로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 망막 색소 상피이거나;
(ix) 캡시드는 AAV1, AAV6, AAV7 및 AAV8 캡시드, 또는 그의 변이체로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 골격근이거나;
(x) 캡시드는 AAV10 캡시드 또는 그의 변이체이며, 기관 또는 조직은 뇌이거나; 또는
(xi) 캡시드는 AAV9 캡시드 또는 그의 변이체이며, 기관 또는 조직은 중추 신경계, 심장, 간, 폐 및 골격근으로부터 선택되는 것인
방법. - 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드가 빈 아데노-연관 바이러스 캡시드 및/또는 부분적으로 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드인 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는 것에 의해 수득되는 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 조성물이며, 상기 조성물에서 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드 대 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드의 비가 적어도 3:2, 바람직하게는 적어도 4:1인 조성물.
- 제15항, 및 제15항을 인용하는 제16항 및 제17항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는 것에 의해 수득되는 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하는 제약 조성물이며, 상기 제약 조성물에서 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드 대 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드의 비가 적어도 3:2, 바람직하게는 4:1인 제약 조성물.
- 제22항에 있어서, 요법에서 사용하기 위한, 임의로는 유전자 요법에서 사용하기 위한 제약 조성물.
- 제23항에 있어서, 아데노-연관 바이러스 캡시드가 아데노-연관 바이러스 혈청형 8 (AAV8), 아데노-연관 바이러스 혈청형 5 (AAV5), 아데노-연관 바이러스 혈청형 1 (AAV1), 아데노-연관 바이러스 혈청형 2 (AAV2), 아데노-연관 바이러스 혈청형 4 (AAV4), 아데노-연관 바이러스 혈청형 6 (AAV6), 아데노-연관 바이러스 혈청형 7 (AAV7), 아데노-연관 바이러스 혈청형 9 (AAV9) 또는 아데노-연관 바이러스 혈청형 10 (AAV10), 또는 그의 변이체의 캡시드이며, 여기서 조성물은 유전자 요법에서 사용하기 위한 것이고; 임의로 여기서 제약 조성물은 기관 또는 조직과 관련된 질환 또는 장애의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 것이며, 여기서
(i) 캡시드는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8 및 AAV10 캡시드로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 중추 신경계이거나;
(ii) 캡시드는 AAV1 및 AAV8 캡시드로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 심장이거나;
(iii) 캡시드는 AAV2 캡시드이며, 기관 또는 조직은 신장이거나;
(iv) 캡시드는 AAV7 및 AAV8 캡시드로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 간이거나;
(v) 캡시드는 AAV4, AAV5 및 AAV6 캡시드로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 폐이거나;
(vi) 캡시드는 AAV8이며, 기관 또는 조직은 췌장이거나;
(vii) 캡시드는 AAV2, AAV5 및 AAV8 캡시드로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 광수용체 세포이거나;
(viii) 캡시드는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5 및 AAV8 캡시드로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 망막 색소 상피이거나;
(ix) 캡시드는 AAV1, AAV6, AAV7 및 AAV8 캡시드로부터 선택되며, 기관 또는 조직은 골격근이거나;
(x) 캡시드는 AAV10 캡시드이며, 기관 또는 조직은 뇌이거나; 또는
(xi) 캡시드는 AAV9 캡시드 또는 그의 변이체이며, 기관 또는 조직은 중추 신경계, 심장, 간, 폐 및 골격근으로부터 선택되는 것인,
사용하기 위한 제약 조성물. - 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드가 빈 아데노-연관 바이러스 캡시드 및/또는 부분적으로 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드인 조성물 또는 제약 조성물 또는 사용하기 위한 제약 조성물.
- 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 유전 물질로 완전히 패키징되지 않은 아데노-연관 바이러스 캡시드로부터 분리하기 위한,
지지체, 리간드, 및 리간드를 지지체에 연결시키는 표면 연장기를 포함하며 화학식 IV로 정의되는 음이온 교환 크로마토그래피 재료의 용도이며,
하기 단계:
a. 적어도 90%의 순도 및 적어도 1012 아데노-연관 바이러스 캡시드/ml의 농도의 아데노-연관 바이러스 캡시드를 포함하며, 그 중 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 10%는 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드인 액체 샘플을 크로마토그래피 재료에 첨가하는 단계;
b. 크로마토그래피 재료로부터, 유전 물질로 완전히 패키징된 아데노-연관 바이러스 캡시드를 용리시키는 단계
를 수행하는 것을 포함하고, 여기서 단계 (b)에서 용리되는 아데노-연관 바이러스 캡시드는 용리액 분획으로 용리되고, 조합된 상기 용리액 분획은 단계 (a)에서 첨가된 액체 샘플의 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 50%를 포함하고 그 중 아데노-연관 바이러스 캡시드의 적어도 60%는 유전 물질로 완전히 패키징된 것인
용도. - 제26항에 있어서, 단계 (b)의 용리 완충제가 소듐 아세테이트를 포함하며; 여기서 아데노-연관 바이러스 캡시드는 아데노-연관 바이러스 혈청형 1 (AAV1), 아데노-연관 바이러스 혈청형 2 (AAV2), 아데노-연관 바이러스 혈청형 4 (AAV4), 아데노-연관 바이러스 혈청형 5 (AAV5), 아데노-연관 바이러스 혈청형 6 (AAV6), 아데노-연관 바이러스 혈청형 7 (AAV7), 아데노-연관 바이러스 혈청형 8 (AAV8), 아데노-연관 바이러스 혈청형 9 (AAV9) 또는 아데노-연관 바이러스 혈청형 10 (AAV10), 또는 그의 변이체의 캡시드이고; 임의로 여기서 아데노-연관 바이러스 캡시드는 아데노-연관 바이러스 혈청형 9 (AAV9) 또는 그의 변이체의 캡시드인 용도.
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