CN111909955B

CN111909955B - 重组MANNase-GLP-1及同源物的制备及应用

Info

Publication number: CN111909955B
Application number: CN202010795389.9A
Authority: CN
Inventors: 姜伟; 楼慧强; 王岩; 余卫雄; 徐冲
Original assignee: Anhui Xinximeng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Anhui Xinximeng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-08-10
Filing date: 2020-08-10
Publication date: 2021-12-31
Anticipated expiration: 2040-08-10
Also published as: WO2022032991A1; US20230295594A1; CN111909955A

Abstract

本发明涉及一种甘露聚糖酶及其同源物与GLP‑1重组融合蛋白的高效表达纯化及应用，通过基因重组技术，利用毕赤酵母高密度发酵诱导分泌表达获得甘露聚糖酶及其同源物与GLP‑1重组融合蛋白，经过滤和浓缩的分离纯化方法获得高收率的甘露聚糖酶及其同源物与GLP‑1重组融合蛋白，发酵表达量高、分离步骤简单，解决了目前GLP‑1类似物药物收率低、成本高、需要频繁注射等局限性。本发明所述甘露聚糖酶及其同源物与GLP‑1重组融合蛋白，不仅注射剂具有降血糖效果，还可以通过口服给药进行降血糖和减轻体重，在肥胖及糖尿病前期患者中具有很好的应用价值。同时为进一步研究甘露聚糖酶及其同源物与GLP‑1重组融合蛋白的降血糖及减重的机理提供基础。

Description

重组MANNase-GLP-1及同源物的制备及应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种甘露聚糖酶及其同源物与GLP-1重组融合蛋白的高效表达纯化及应用。

背景技术

糖尿病是现代社会严重威胁全球人类生命健康的重要疾病之一。糖尿病是一种以慢性高血糖为特征的内分泌代谢综合征。据国家卫计委，目前有50.1％的成年人正处于糖尿病前期，每天都有可能变成新的糖尿病患者。更有数据显示，中国的糖尿病患病率近几十年来快速增长：从80年代的0.67％升高到2010年的11.6％，增加了17倍，而且越来越呈年轻化趋势。

近年来胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)不仅具有优异的降糖效果，还有控制体重，调节血脂，改善胰岛β细胞功能等特点，同时低血糖的不良反应发生率较低。GLP-1及其类似物在治疗2型糖尿病及减重方面的优良效果，使其近年来在糖尿病治疗药物市场中逐渐占据重要地位。通常对GLP-1的结构进行修饰，延长其半衰期。目前已上市的长效GLP-1类似物有两种，均融合了大分子蛋白，分别为度拉糖肽和阿必鲁肽，前者是融合了G4免疫白蛋白，后者融合了血清白蛋白，延长了药物代谢的半衰期，可实现每周注射一次。但是阿必鲁肽和度拉糖肽均为每周注射一次的药物，无法实现口服给药的局限性。注射后会出现注射部位及恶心呕吐腹痛等胃肠道不良反应。

甘露聚糖广泛存在于自然界的各种植物中，β-甘露聚糖酶是甘露聚糖降解过程中最重要的酶，在工业中应用十分广泛，可将甘露聚糖水解成甘露寡糖，在动物体内由于缺少相应的酶而不能被充分降解的寡糖，但是它们却能够被动物体内存在的益生菌吸收代谢，例如乳酸菌和双歧杆菌等。代谢的产物包括乙酸、丙酸、丁酸等短链的脂肪酸(SCFA)，反过来SCFA能够对机体产生重要的作用，例如抑制病原细菌的生长，在肌肉、肾脏、心脏、脑等部位供能量。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种甘露聚糖酶及其同源物与GLP-1重组融合蛋白的高效表达纯化及应用。本发明以毕赤酵母为工程菌株，能高效表达甘露聚糖酶(MANNase)及其同源物，通过将甘露聚糖酶及其同源物与GLP-1构成融合蛋白，经过高密度发酵培养，能够高效分泌表达该融合蛋白，既具有甘露聚糖酶及其同源物活性，又具有GLP-1活性，发酵过程中通过甲醇诱导表达，上清液中目的蛋白表达量高，纯度高，且纯化工艺仅仅是过滤浓缩，是一种低成本高效率的制备方法，与此同时，该融合蛋白注射和口服给药均具有良好的降血糖效果。

本发明所采用的技术方案为：

一种甘露聚糖酶及其同源物与GLP-1重组融合蛋白的高效表达纯化，包括如下步骤：

(1)将编码GLP-1与甘露聚糖酶或其同源物的基因序列连接到pPICZα质粒上，得到重组表达载体；

(2)将步骤(1)所述重组表达载体转化到毕赤酵母感受态细胞中，构建得到重组工程菌；

(3)将所述重组工程菌进行发酵培养，诱导表达融合蛋白；

(4)步骤(3)得到发酵液进行离心，取上清液依次进行纯化、浓缩、干燥后，即得所述甘露聚糖酶及其同源物与GLP-1重组融合蛋白。

步骤(1)中，所述质粒为：pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC中的任一种。

步骤(3)中，所述毕赤酵母的菌株为X-33、GS115、KM71、SMD1168、SMD1168H中的任一种。

步骤(1)中，所述编码GLP-1与甘露聚糖酶的基因序列分别如SEQ ID NO.1所示和SEQ ID NO.2所示。

步骤(1)中，具体操作为：

采用引物对克隆编码GLP-1和甘露聚糖酶或其同源物的目的片段，PCR扩增后进行双酶切，之后将得到的编码GLP-1与甘露聚糖酶或其同源物的基因序列连接到pPICZα质粒上，即完成重组表达载体的构建。

所述引物对包括扩增编码GLP-1与甘露聚糖酶的基因序列的引物对，所述扩增编码GLP-1的基因序列引物对的序列如SEQ ID NO.3所示和SEQ ID NO.4所示；所述扩增编码甘露聚糖酶的基因序列引物对的序列如SEQ ID NO.5所示和SEQ ID NO.6所示。

步骤(3)中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

步骤(3)中，所述重组工程菌发酵培养、诱导表达融合蛋白MANNase-31P的具体步骤为：

(S1)将所述重组工程菌的单菌落接种于含有博来霉素的YPD液体培养基试管中，在30℃、200rpm条件下振荡培养12h；将菌液倒入装有YPD培养基中，在30℃、200rpm条件下培养12h，即得一级种子液；

(S2)将所述一级种子液按10％的接种量接种于YPD培养基中，在30℃、200rpm条件下培养22h，即得二级种子液；

(S3)将所述二级种子液按10％的接种量接入发酵培养基中，进行发酵培养，当发酵液OD₆₀₀达到60-120以上时加入诱导剂进行诱导，诱导完成后放罐，离心收集菌体。

步骤(S3)中，所述发酵培养为高密度发酵培养；

所述诱导剂为甲醇，加入所述诱导剂的体积百分数为0.2％-3％。

步骤(S4)中，进行所述发酵培养时，初始发酵温度为30℃，搅拌速度为300rpm，通气量为4L/min，pH为5.5。

步骤(4)中，对所述上清液进行纯化、浓缩、干燥的具体步骤如下：

(SS1)取上清液，先用0.8um的滤膜过滤，再用0.2um的滤膜过滤，收集滤液；

(SS2)将所述滤液先用超滤膜包浓缩10倍，加去离子水后再浓缩10倍，得到浓缩液；

(SS3)将所述浓缩液进行冷冻干燥，即得所述甘露聚糖酶及其同源物与GLP-1重组融合蛋白。

所述甘露聚糖酶及其同源物与GLP-1重组融合蛋白在制备治疗糖尿病或高脂高糖饮食诱导的代谢综合症药物中的应用。

毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，能在以甲醇为唯一碳源的培养基上生长。毕赤酵母上的醇氧化酶基因AOX1启动子是目前已知的最严格的启动子之一，AOX1在甲醇氧化过程中起重要作用，当以甲醇为唯一碳源时，产生的醇氧化酶蛋白约占菌体可溶性蛋白总量的30％。将外源基因置于AOX1启动子的控制之下，在甲醇诱导下可实现高水平表达。

甘露聚糖酶是甘露聚糖降解过程中最重要的酶，在工业中应用十分广泛，可将甘露聚糖水解成甘露寡糖，甘露寡糖作为一种益生元，能够被动物体内存在的益生菌吸收代谢，例如乳酸菌和双歧杆菌等，同时甘露聚糖酶还具有不易被消化酶降解的特性。本申请发明人创新性的将甘露聚糖酶及其同源物蛋白载体与GLP-1重组，构建重组蛋白。毕赤酵母具有严格的醇氧化酶启动子调控机制，可以利用甲醇作为唯一碳源，细胞生长快，易于高密度发酵，因此本申请发明人通过采用毕赤酵母(Pichia pastoris)重组蛋白高分泌表达体系，高效表达重组蛋白MANNase-GLP-1及其同源物。经过一系列分离纯化方法，获得高效、稳定、低成本的口服降糖肽，突破现有GLP类似物融合蛋白不耐胃酸且易被各种消化道蛋白酶降解的共性瓶颈，实现降糖口服给药。

本发明的有益效果为：

本发明所述的甘露聚糖酶及其同源物与GLP-1重组融合蛋白的高效表达纯化，通过先从已有的GLP-1合成序列和含有MANNase(甘露聚糖酶)或其同源物的质粒上将两个目的片段分别进行克隆，PCR扩增，之后进行双酶切，得到的两个片段连接到pPICZα质粒上，构建得到重组表达载体，将所述重组表达载体转化到毕赤酵母感受态细胞中，构建得到重组工程菌，所述重组工程菌发酵诱导表达融合蛋白；本发明以毕赤酵母为工程菌株，能高效表达甘露聚糖酶，通过将甘露聚糖酶及其同源物与GLP-1构成融合蛋白，经过高密度发酵培养，能够高效分泌表达该融合蛋白，既具有甘露聚糖酶活性，又具有GLP-1活性；本发明发酵过程中通过甲醇诱导表达，获得上清液中目的蛋白表达量高，纯度高；本发明纯化工艺仅仅是过滤浓缩，是一种低成本高效率的制备方法。本发明所述甘露聚糖酶及其同源物与GLP-1重组融合蛋白，同时适合于注射和口服给药，均具有良好的降血糖和减轻体重效果，在肥胖及糖尿病前期患者中具有很好的应用价值，同时为进一步研究所述甘露聚糖酶及其同源物与GLP-1重组融合蛋白的降血糖及减重的机理提供基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1所述重组工程菌MANNase-31P-X-33的发酵曲线图；

图2为本发明实施例1所述重组工程菌MANNase-31P-X-33的表达量示意图；

图3为对照组和模型组小鼠的血糖水平统计分析对比图；

图4为对照组和模型组小鼠的体重水平统计分析对比图；

图5为对照组和模型组小鼠的糖耐量曲线对比图；

图6为对照组和模型组小鼠的的肝脏和脂肪组织的HE染色切片分析图；

图7为不同时间检测小鼠体重水平变化示意图；

图8为不同时间检测小鼠血糖水平变化示意图；

图9为注射给药对小鼠血糖水平的影响对比图；

图10为本发明实施例3所述重组工程菌MANNase-31P-X-33的表达量示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

下述实施例中的YPD培养基、发酵培养基以及其他涉及到的试剂等均为本领域技术人员所知晓的市售产品。

实施例1

本实施例提供一种甘露聚糖酶与GLP-1重组融合蛋白(MANNase-GLP-1)的高效表达纯化，包括如下步骤：

(1)采用引物对克隆编码GLP-1和甘露聚糖酶的目的片段，PCR扩增后进行双酶切，之后将得到的编码GLP-1与甘露聚糖酶的基因序列连接到pPICZαA质粒上，构建得到重组表达载体pPICZαA-MANNase-31P；

所述编码GLP-1与甘露聚糖酶的基因序列分别如SEQ ID NO.1所示和SEQ ID NO.2所示；所述扩增编码GLP-1的基因序列引物对的序列如SEQ ID NO.3所示和SEQ ID NO.4所示；所述扩增编码甘露聚糖酶的基因序列引物对的序列如SEQ ID NO.5所示和SEQ ID NO.6所示；所述融合蛋白MANNase-31P的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

(2)将步骤(1)所述重组表达载体转化到毕赤酵母X-33感受态细胞中，构建得到重组工程菌MANNase-31P-X-33；

(3)将所述重组工程菌进行发酵培养，诱导表达融合蛋白MANNase-31P；具体步骤为：

种子液制备：挑取所述重组工程菌MANNase-31P-X-33的单菌落接种于5ml含有博来霉素的YPD液体培养基试管中，在30℃、200rpm条件下振荡培养12h；将菌液倒入装有50mlYPD培养基中，在30℃、200rpm条件下培养12h，即得一级种子液；将所述一级种子液按10％的接种量接种于500ml的YPD培养基中，在30℃、200rpm条件下培养22h，即得二级种子液；

发酵罐培养：将所述二级种子液按10％的接种量接入4.5L发酵培养基(7.5L发酵罐)中，进行高密度发酵培养，初始发酵温度为30℃，搅拌速度为300rpm，通气量为4L/min，pH为5.5。发酵过程包括四个阶段，第一阶段是以甘油为基础碳源的生长阶段，主要是用于细胞生物量的初步积累，随着菌体密度的逐渐增加，培养基的溶氧量会迅速升高，此时进入甘油补料阶段，通过流加甘油提供碳源，菌体继续生长，溶氧量保持在20％以上；当菌体密度达到60OD后，经过2h的饥饿期，进入甲醇诱导阶段，当发酵液OD₆₀₀达到60以上时加入诱导剂甲醇进行诱导，加入甲醇占发酵液的体积百分数为0.2％，期间每隔四小时取样测菌体OD600值，留样进行SDS-PAGE电泳检测蛋白表达量，如图1和图2中所示(箭头所指)，图中可以看出：目标蛋白表达大幅度提高。经过连续5天诱导后，目的蛋白分泌到胞外，诱导结束后下罐，收集发酵液经6000rpm离心15min后，收集上清液；上清液中目的蛋白的含量约为1-2mg/ml；

(4)对步骤(3)得到上清液依次进行纯化、浓缩、干燥后，即得所述重组MANNase-GLP-1；

对所述上清液进行纯化、浓缩、干燥的具体步骤如下：

(SS2)将所述滤液(约3L)先用10kd超滤膜包浓缩10倍，加3L去离子水后再浓缩10倍，得到浓缩液；

(SS3)将所述浓缩液进行冷冻干燥，即得所述重组MANNase-GLP-1。

实施例2

本实施例提供一种甘露聚糖酶与GLP-1重组融合蛋白的高效表达纯化，包括如下步骤：

(1)采用引物对克隆编码GLP-1和甘露聚糖酶的目的片段，PCR扩增后进行双酶切，之后将得到的编码GLP-1与甘露聚糖酶的基因序列连接到pPICZαB质粒上，构建得到重组表达载体pPICZαB-MANNase-31P；

所述编码GLP-1与甘露聚糖酶的基因序列分别如SEQ ID NO.1所示和SEQ ID NO.2所示；所述扩增编码GLP-1的基因序列引物对的序列如SEQ ID NO.3所示和SEQ ID NO.4所示，所述扩增编码甘露聚糖酶的基因序列引物对的序列如SEQ ID NO.5所示和SEQ ID NO.6所示；所述融合蛋白MANNase-31P的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

(2)将步骤(1)所述重组表达载体转化到毕赤酵母GS115感受态细胞中，构建得到重组工程菌MANNase-31P-GS115；

种子液制备：挑取所述重组工程菌MANNase-31P-GS115的单菌落接种于5ml含有博来霉素的YPD液体培养基试管中，在30℃、200rpm条件下振荡培养12h；将菌液倒入装有50mlYPD培养基中，在30℃、200rpm条件下培养12h，即得一级种子液；将所述一级种子液按10％的接种量接种于500ml的YPD培养基中，在30℃、200rpm条件下培养22h，即得二级种子液；

发酵罐培养：将所述二级种子液按10％的接种量接入4.5L发酵培养基(7.5L发酵罐)中，进行高密度发酵培养，初始发酵温度为30℃，搅拌速度为300rpm，通气量为4L/min，pH为5.5。发酵过程包括四个阶段，第一阶段是以甘油为基础碳源的生长阶段，主要是用于细胞生物量的初步积累，随着菌体密度的逐渐增加，培养基的溶氧量会迅速升高，此时进入甘油补料阶段，通过流加甘油提供碳源，菌体继续生长，溶氧量保持在20％以上；当菌体密度达到120OD后，经过5h的饥饿期，进入甲醇诱导阶段，当发酵液OD₆₀₀达到120以上时加入诱导剂甲醇进行诱导，加入甲醇占发酵液的体积百分数为3％，期间每隔四小时取样测菌体OD600值，留样进行SDS-PAGE电泳检测蛋白表达量。经过连续5天诱导后，目的蛋白分泌到胞外，诱导结束后下罐，收集发酵液经6000rpm离心15min后，收集上清液；上清液中目的蛋白的含量约为1-2mg/ml；

对所述上清液进行纯化、浓缩、干燥的具体步骤如下：

(SS3)将所述浓缩液进行冷冻干燥，即得所述重组MANNase-GLP-1。

实施例3

(1)采用引物对克隆编码GLP-1和甘露聚糖酶的目的片段，PCR扩增后进行双酶切，之后将得到的编码GLP-1与甘露聚糖酶的基因序列连接到pPICZαC质粒上，构建得到重组表达载体pPICZαC-MANNase-31P；

(2)将步骤(1)所述重组表达载体转化到毕赤酵母KM71感受态细胞中，构建得到重组工程菌MANNase-31P-KM71；

种子液制备：挑取所述重组工程菌MANNase-31P-KM71的单菌落接种于5ml含有博来霉素的YPD液体培养基试管中，在30℃、200rpm条件下振荡培养12h；将菌液倒入装有50mlYPD培养基中，在30℃、200rpm条件下培养12h，即得一级种子液；将所述一级种子液按10％的接种量接种于500ml的YPD培养基中，在30℃、200rpm条件下培养22h，即得二级种子液；

发酵罐培养：将所述二级种子液按10％的接种量接入4.5L发酵培养基(7.5L发酵罐)中，进行高密度发酵培养，初始发酵温度为30℃，搅拌速度为300rpm，通气量为4L/min，pH为5.5。发酵过程包括四个阶段，第一阶段是以甘油为基础碳源的生长阶段，主要是用于细胞生物量的初步积累，随着菌体密度的逐渐增加，培养基的溶氧量会迅速升高，此时进入甘油补料阶段，通过流加甘油提供碳源，菌体继续生长，溶氧量保持在20％以上；当菌体密度达到90OD后，经过3.5h的饥饿期，进入甲醇诱导阶段，当发酵液OD₆₀₀达到90以上时加入诱导剂甲醇进行诱导，加入甲醇占发酵液的体积百分数为1.6％，期间每隔四小时取样测菌体OD600值，留样进行SDS-PAGE电泳检测蛋白表达量，如图1和图2中所示(箭头所指)，图中可以看出：目标蛋白表达大幅度提高。经过连续5天诱导后，目的蛋白分泌到胞外，诱导结束后下罐，收集发酵液经6000rpm离心15min后，收集上清液；上清液中目的蛋白的含量约为1-2mg/ml；

对所述上清液进行纯化、浓缩、干燥的具体步骤如下：

(SS3)将所述浓缩液进行冷冻干燥，即得所述重组MANNase-GLP-1。

实施例4

本实施例4与实施例1的区别仅在于，步骤(3)中，所述毕赤酵母的菌株为SMD1168，其他均与实施例1相同。

实施例5

本实施例5与实施例1的区别仅在于，步骤(3)中，所述毕赤酵母的菌株为SMD1168H，其他均与实施例1相同。

实施例6

本实施例6与实施例1的区别仅在于：步骤(3)中，对所述重组工程菌进行发酵培养、诱导表达的步骤不同；本实施例中所述重组工程菌发酵培养、诱导表达融合蛋白MANNase-31P的具体步骤为：

将构建成功的毕赤酵母表达工程菌MANNase-31P-X-33挑取单菌落，接种到5ml的YPD液体培养基，于30℃、250rpm摇床过夜培养。将培养好的菌种按1％的比例接种于BMGY培养基，继续震荡培养24h，之后再将菌体转入BMMY培养基中，调整OD600为1.0左右，继续于30℃、200rpm摇床中培养中诱导培养，每24h按照体积百分比0.5％加入甲醇，连续诱导4天。上清液中目的蛋白的含量约为0.2mg/ml。SDS-PAGE电泳检测蛋白表达量如图10所示。

实验例

一、实施例1所得重组MANNase-GLP-1在高脂高糖饮食诱导的代谢综合症中的应用

1-1)高脂高糖饮食诱导代谢综合征小鼠模型的构建

100只6周龄(18-20g)C57-6J小鼠(4-6周龄，雄性)，将小鼠分笼饲养，控制动物房温度25±2℃，湿度50±10％，光照12h黑暗12h循环，适应环境一周。将小鼠以5-6只/组随机分笼。所有小鼠禁食12h后测定体重及空腹血糖(Fasting blood-glucose，FBG)，对照组以标准饲料继续饲喂，模型组以高脂高糖(HFSD)饲料持续饲喂24周。结束后，测定各组小鼠体重及FBG。

高脂高糖饮食小鼠的体重约为42.5g左右，正常饮食小鼠体重约30g左右，高脂高糖饮食小鼠的空腹血糖约5.67，正常饮食小鼠的空腹血糖4.62，具有统计学差异(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。如下图3和图4所示，可以看出：C57-6J小鼠经过高脂高糖饮食诱导24周后，体重超过正常饮食41.67％，符合肥胖模型的标准(20％)；经过高脂高糖饮食诱导的C57-6J小鼠，空腹血糖超过正常饮食22.73％，血糖显著升高。

普通饮食小鼠和高脂高糖小鼠过夜禁食12h后，按2g/kg(体重)灌胃D-葡萄糖，分别于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h的血糖，得到口服葡萄糖耐量(OGTT)曲线，如图5所示，可以看出：经过高脂高糖饮食诱导24周后，其葡萄糖耐量明显受损。口服葡萄糖耐量试验是一种葡萄糖负荷试验，糖耐量受损表明胰岛β细胞功能和机体对血糖的调节能力下降，用以诊断糖尿病前期的轻度高血糖。

对高脂高糖饮食小鼠和正常饮食小鼠的肝脏和脂肪组织进行HE染色切片分析，如图6所示，从图中可以看出：高脂高糖饮食的小鼠有明显的脂肪肝，且两组小鼠脂肪细胞的大小也有显著差异。

建模成功后，以11只/组进行随机分组，加上正常饲料组，进行后续灌胃实验。

1-2)MANNase-GLP-1口服给药对高脂高糖饮食诱导的代谢综合症的影响

将小鼠随机分成5组：融合蛋白高剂量组(0.7mg/kg·d)、融合蛋白低剂量组(0.14mg/kg·d)、30mg/kg奥利司他作为正对照组，正常饲料对照组和高脂高糖饲料负对照组均给予相同体积的水，所有小鼠在不改变饮食的情况下，分别进行灌胃。测定每周体重变化，每两周测定空腹血糖的变化。结果如图7和图8所示。可以得出：本发明实施例1所述MANNase-GLP-1融合蛋白具有明显的减重和降血糖效果。

二、实施例1所得重组MANNase-GLP-1注射给药对Ⅱ型糖尿病的影响

2-1)Ⅱ型糖尿病小鼠模型的构建：

将50只6周龄(18-20g)BALB/C小鼠(雄)以8只/组随机分笼。所有小鼠禁食12h后测定体重及空腹血糖(Fasting blood-glucose，FBG)，对照组以标准饲料继续饲喂4周，建模组以高脂饲料持续饲喂4周后，测定各组小鼠体重及FBG。禁食12h后，按60mg/kg·Bw的剂量腹腔注射STZ，连续注射3天。

分别于建模后第3、7、10、14天测定建模组小鼠体重及FBG，选取FBG≥11.1mmol/L且稳定一周的小鼠作为Ⅱ型糖尿病模型小鼠，以8只/组随机分笼进行注射给药降血糖实验。

将小鼠随机分三组：糖尿病负对照组(生理盐水)，糖尿病正对照组(Lir)，糖尿病治疗组(MANNase-GLP-1)，每组8只小鼠。所有小鼠过夜禁食12h后，按1.5g/kg(体重)灌胃D-葡萄糖。然后皮下注射(s.c.)MANNase-GLP-1(250ug/50g)。注射后0、15、30、60、120、180min、300min后断尾取血，用罗氏血糖试纸测定血糖水平。结果如图9所示。

本发明的目的在于提供一种能够改善高脂高糖饮食诱导的代谢综合症患者体重和血糖甘露聚糖酶及其同源物与GLP-1重组融合蛋白的制备方法，通过基因重组技术，利用毕赤酵母高密度发酵诱导分泌表达获得可溶性蛋白后，经过滤和浓缩的分离纯化方法获得高收率的目的蛋白，发酵表达量高、分离步骤简单，解决了目前GLP-1类似物药物收率低、成本高、需要频繁注射等局限性，更重要的是，该融合蛋白不仅注射剂具有降血糖效果，还可以通过口服给药进行降血糖和减轻体重，在肥胖及糖尿病前期患者中具有很好的应用价值。同时为进一步研究甘露聚糖酶及其同源物与GLP-1重组融合蛋白的降血糖及减重的机理提供基础。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽新熙盟生物科技有限公司

<120> 重组MANNase-GLP-1的高效表达纯化及应用

<130> 2010

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cacgctgaag gtaccttcac ctctgacgtt tcttcttacc tggaaggtca ggctgctaaa 60

gaattcatcg cttggctggt tcgtggtcgt ggt 93

<210> 2

<211> 1089

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttgccaaagg cttctccagc tccatctact tcttcttctt ctgcttctac ttcttttgct 60

tctacttctg gtttgcaatt tactattgat ggtgaaactg gttactttgc tggtactaac 120

tcttactgga ttggtttttt gactgatgat tctgatgttg atttggttat gtctcatttg 180

aagtcttctg gtttgaagat tttgagagtt tggggtttta acgatgttac tactcaacca 240

tcttctggta ctgtttggta ccaattgcat caagatggta agtctactat taacactggt 300

gctgatggtt tgcaaagatt ggattacgtt gtttcttctg ctgaacaaca tggtattaag 360

ttgattatta actttgttaa ctactggact gattacggtg gtatgtctgc ttacgtttct 420

gcttacggtg gttctgatga aactgatttt tacacttctg atactatgca atctgcttac 480

caaacttaca ttaagactgt tgttgaaaga tactctaact cttctgctgt ttttgcttgg 540

gaattggcta acgaaccaag atgtccatct tgtgatacta ctgttttgta cgattggatt 600

gaaaagactt ctaagtttat taagggtttg gatgctgatc atatggtttg tattggtgat 660

gaaggttttg gtttgaacac tgattctgat ggttcttacc cataccaatt tgctgaaggt 720

ttgaacttta ctatgaactt gggtattgat actattgatt ttgctacttt gcatttgtac 780

ccagattctt ggggtacttc tgatgattgg ggtaacggtt ggatttctgc tcatggtgct 840

gcttgtaagg ctgctggtaa gccatgtttg ttggaagaat acggtgttac ttctaaccat 900

tgttctgttg aatctccatg gcaacaaact gctttgaaca ctactggtgt ttctgctgat 960

ttgttttggc aatacggtga tgatttgtct actggtgaat ctccagatga tggtaacact 1020

atttactacg gtacttctga ttacgaatgt ttggttactg atcatgttgc tgctattgat 1080

tctgcttaa 1089

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgggatccga ctacaaggac gacgacgac 29

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctctagatt aacctctacc tctaacca 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cggaattctt gccaaaggct tctccagc 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgggatccag cagaatcaat agcagcaa 28

<210> 7

<211> 401

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Leu Pro Lys Ala Ser Pro Ala Pro Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ala Ser

1 5 10 15

Thr Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe Thr Ile Asp Gly Glu

20 25 30

Thr Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp Ile Gly Phe Leu Thr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Val Asp Leu Val Met Ser His Leu Lys Ser Ser Gly

50 55 60

Leu Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp Val Thr Thr Gln Pro

65 70 75 80

Ser Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln Asp Gly Lys Ser Thr

85 90 95

Ile Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Asp Tyr Val Val Ser

100 105 110

Ser Ala Glu Gln His Gly Ile Lys Leu Ile Ile Asn Phe Val Asn Tyr

115 120 125

Trp Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Gly Gly

130 135 140

Ser Asp Glu Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr Met Gln Ser Ala Tyr

145 150 155 160

Gln Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr Ser Asn Ser Ser Ala

165 170 175

Val Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg Cys Pro Ser Cys Asp

180 185 190

Thr Thr Val Leu Tyr Asp Trp Ile Glu Lys Thr Ser Lys Phe Ile Lys

195 200 205

Gly Leu Asp Ala Asp His Met Val Cys Ile Gly Asp Glu Gly Phe Gly

210 215 220

Leu Asn Thr Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr Gln Phe Ala Glu Gly

225 230 235 240

Leu Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr Ile Asp Phe Ala Thr

245 250 255

Leu His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser Asp Asp Trp Gly Asn

260 265 270

Gly Trp Ile Ser Ala His Gly Ala Ala Cys Lys Ala Ala Gly Lys Pro

275 280 285

Cys Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn His Cys Ser Val Glu

290 295 300

Ser Pro Trp Gln Gln Thr Ala Leu Asn Thr Thr Gly Val Ser Ala Asp

305 310 315 320

Leu Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr Gly Glu Ser Pro Asp

325 330 335

Asp Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp Tyr Glu Cys Leu Val

340 345 350

Thr Asp His Val Ala Ala Ile Asp Ser Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp

355 360 365

Asp Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu

370 375 380

Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg

385 390 395 400

Gly

Claims

1.一种甘露聚糖酶与GLP-1重组融合蛋白的高效表达纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将编码GLP-1与甘露聚糖酶的基因序列连接到pPICZα质粒上，得到重组表达载体；所述编码GLP-1的基因序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）将步骤（1）所述重组表达载体转化到毕赤酵母感受态细胞中，构建得到重组工程菌；

（3）将所述重组工程菌进行发酵培养，诱导表达融合蛋白；

（4）步骤（3）得到发酵液进行离心，取上清液依次进行纯化、浓缩、干燥后，即得所述甘露聚糖酶与GLP-1重组融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的甘露聚糖酶与GLP-1重组融合蛋白的高效表达纯化方法，其特征在于，步骤（1）中，所述甘露聚糖酶的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的甘露聚糖酶与GLP-1重组融合蛋白的高效表达纯化方法，其特征在于，步骤（1）中，具体操作为：

采用引物对克隆编码GLP-1和甘露聚糖酶的目的片段，PCR扩增后进行双酶切，之后将得到的编码GLP-1与甘露聚糖酶的基因序列连接到pPICZα质粒上，即完成重组表达载体的构建。

4.根据权利要求3所述的甘露聚糖酶与GLP-1重组融合蛋白的高效表达纯化方法，其特征在于，所述引物对包括扩增编码GLP-1与甘露聚糖酶的基因序列的引物对，所述扩增编码GLP-1的基因序列引物对的序列如SEQ ID NO.3所示和SEQ ID NO.4所示；

所述扩增编码甘露聚糖酶的基因序列引物对的序列如SEQ ID NO.5所示和SEQ IDNO.6所示。

5.根据权利要求1所述的甘露聚糖酶与GLP-1重组融合蛋白的高效表达纯化方法，其特征在于，步骤（3）中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

6.根据权利要求1所述的甘露聚糖酶与GLP-1重组融合蛋白的高效表达纯化方法，其特征在于，步骤（3）中，所述重组工程菌发酵培养、诱导表达融合蛋白的具体步骤为：

（S1）将所述重组工程菌的单菌落接种于含有博来霉素的YPD液体培养基试管中，在30℃、200rpm条件下振荡培养12h；将菌液倒入装有YPD培养基中，在30℃、200rpm条件下培养12h，即得一级种子液；

（S2）将所述一级种子液按10%的接种量接种于YPD培养基中，在30℃、200rpm条件下培养22h，即得二级种子液；

（S3）将所述二级种子液按10％的接种量接入发酵培养基中，进行发酵培养，当发酵液OD₆₀₀达到60-120以上时加入诱导剂进行诱导，诱导完成后放罐，离心收集菌体。

7.根据权利要求6所述的甘露聚糖酶与GLP-1重组融合蛋白的高效表达纯化方法，其特征在于，步骤（S3）中，所述发酵培养为高密度发酵培养；

所述诱导剂为甲醇，加入所述诱导剂的体积百分数为0.2%-3%。

8.根据权利要求6所述的甘露聚糖酶与GLP-1重组融合蛋白的高效表达纯化方法，其特征在于，步骤（S3）中，进行所述发酵培养时，初始发酵温度为30℃，搅拌速度为300rpm，通气量为4L/min，pH为5.5。

9.根据权利要求1所述的甘露聚糖酶与GLP-1重组融合蛋白的高效表达纯化方法，其特征在于，步骤（4）中，对所述上清液进行纯化、浓缩、干燥的具体步骤如下：

（SS1）取上清液，先用0.8um的滤膜过滤，再用0.2um的滤膜过滤，收集滤液；

（SS2）将所述滤液先用超滤膜包浓缩10倍，加去离子水后再浓缩10倍，得到浓缩液；

（SS3）将所述浓缩液进行冷冻干燥，即得所述甘露聚糖酶GLP-1重组融合蛋白。

10.根据权利要求1-9任一所述高效表达纯化方法获得的甘露聚糖酶与GLP-1重组融合蛋白在制备治疗糖尿病或高脂高糖饮食诱导的代谢综合症药物中的应用。