CN109055465B - 一种生产重组人脑利钠肽的培养基及生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生产重组人脑利钠肽的培养基，所述培养基按每100mL的体积计算，包括以下质量的组分：酵母提取物1.3g～4.5g，干酪素1.2g～5g，氯化钠0.5g～1.8g，甘油0.5g～3g，Na2HPO4·7H2O 0.04g～0.1g，柠檬酸铁铵0.022g～0.09g，醋酸铵0.075g～0.55g；本发明所提供的培养基通过干酪素、柠檬酸铁铵和醋酸铵三者协同发挥作用，促进了重组人脑利钠肽及其前体合成，经过测试，表达量可达到44％以上，重组人脑利钠肽的产量可达到520mg/L，相比传统的培养基，表达量更高，产量更高，对于实际生产具有重要的价值。

Description

一种生产重组人脑利钠肽的培养基及生产方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种生产重组人脑利钠肽的培养基及生产方法。
背景技术
脑利钠肽(BNP)在1988年首先由Sudoh从猪脑组织中分离出来，是内源性利钠肽家庭的重要成员之一，主要由心脏分泌，其中60％～80％来自于心室肌细胞，具有利钠、利尿、扩张血管和抑制肾素固酮分泌等作用。人脑利钠肽的主要作用与血管和肾脏的血流动力学平衡有关。大量的国内外临床试验结果表明，人脑利钠肽并不直接增强心肌收缩力，它主要通过降低外周血管阻力，降低心脏前后负荷，通过利钠、利尿作用降低体液负荷，提高心排血量，综合改善心脏功能，并且在体内能抑制血液中肾上腺素-血管紧张素系统的激活，同时也抑制了由于血管扩张效应引起的反射性心率增加，避免心率失常的发生。因此，人脑利钠肽在综合改善心肌作用的同时，不增加心肌耗氧，也不存在许多化学药物的不良反应。
重组人脑利钠肽，是通过基因工程技术制备的一种重组的人脑利钠肽，适用于患有休息或轻微活动时呼吸困难的急性失代偿心力衰竭患者的静脉治疗。由32个氨基酸组成，其中10位和26位有一对二硫键相连。
目前，生产重组人脑利钠肽的技术，主要应用传统的大肠杆菌培养基，如LB培养基或TB培养基进行发酵生产，由于这些种培养基均为传统的大肠杆菌的经典培养基，用其作为重组人脑利钠肽的生产培养基则显贫瘠，导致生产过程中菌浓度不高，从而产品重组人脑利钠肽产量不高，其表达量一般为30％以下，产量在200mg/L以下。
CN105198972A公开了一种高纯度重组人脑利钠肽(hBNP)的制备方法，该制备方法包括优化人成熟脑利钠肽的编码基因，通过接头在其编码的成熟脑利钠肽N端融合一个在大肠杆菌中易于高效表达的融合标签。此方法制备的重组人脑利钠肽具有与天然蛋白相同的生物活性，纯度高，成本低等优点。但是，此方法在制备过程中，应用的培养基为TB培养基，产量较低。
CN103923937A公开了一种可溶性表达人脑利钠肽重组蛋白的方法和应用，包括以下步骤：获得重组基因：获得表达人脑利钠肽重组蛋白的重组基因rhBNP，所述重组基因rhBNP的序列包括5'至3'方向依次排列的纯化标签基因序列、分子伴侣蛋白基因序列、柔性连接肽基因序列、蛋白酶识别位点序列和人脑利钠肽基因序列；获得重组质粒：将上一步获得的重组基因rhBNP插入质粒，获得含有重组基因rhBNP的重组质粒；获得基因工程菌：将上一步获得的重组质粒转化宿主细胞获得基因工程菌；表达外源基因：基因工程菌发酵表达含有重组人脑利钠肽的融合蛋白；纯化目的蛋白：裂解菌体，收集融合蛋白，通过融合蛋白的酶切、纯化步骤获得重组人脑利钠肽重组蛋白。但是，这种方法在发酵时，采用的同样是TB培养基，导致表达量较低，脑利钠肽的产量不高，有待进一步提升。
目前，关于生产重组人脑利钠肽的培养基，主要使用的为LB培养基或TB培养基等传统的培养基，效果一般，而如何开发一种新型的用来生产重组人脑利钠肽的培养基，以提升重组人脑利钠肽的产量，对于实际生产具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于生产重组人脑利钠肽的培养基及生产方法。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供了一种生产重组人脑利钠肽的培养基，所述培养基按每100mL的体积计算，包括如下质量的组分：酵母提取物1.3g～4.5g(例如可以是1.3g、1.5g、1.8g、2g、2.2g、2.5g、3g、3.5g、4g或4.5g等)，干酪素1.2g～5g(例如可以是1.2g、1.5g、2g、2.5g、3g、3.5g、4g、4.5g或5g等)，氯化钠0.5g～1.8g(例如可以是0.5g、0.8g、1g、1.3g、1.5g或1.8g等)，甘油0.5g～3g(例如可以是0.5g、1g、1.5g、2g、2.5g或3g等)，Na2HPO4·7H2O 0.04g～0.1g(例如可以是0.04g、0.05g、0.06g、0.07g、0.08g、0.09g或0.1g等)，柠檬酸铁铵0.022g～0.09g(例如可以是0.022g、0.03g、0.04g、0.05g、0.06g、0.07g、0.08g或0.09g等)，醋酸铵0.075g～0.55g(例如可以是0.075g、0.08g、0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g或0.55g等)。
本发明提供的生产重组人脑利钠肽的培养基，可以为生产重组人脑利钠肽的菌株提供丰富的营养物质，通过干酪素、柠檬酸铁铵和醋酸铵三者的添加，协同发挥作用，为培养基中提供了更加丰富的氨基酸，促进了重组人脑利钠肽及其前体合成，经过测试，表达量可达到44％以上，重组人脑利钠肽的产量可达到520mg/L，相比传统的培养基，表达量更高，产量更高，对于实际生产具有重要的价值。
在本发明中，如果仅仅添加干酪素、柠檬酸铁铵或醋酸铵中的一种或两种，重组人脑利钠肽的产量会产生下降。
而目前，干酪素应用在微生物培养基中，还比较少见，目前公开的酪素培养基也主要用于产蛋白酶菌株的筛选。而本发明中，干酪素与柠檬酸铁铵、醋酸铵协同发挥作用，可大大提升重组人脑利钠肽的产量。
在本发明中，培养基所使用的溶剂为灭菌后的无菌水。
优选地，所述培养基还包括硝酸锰0.015g～0.05g，例如可以是0.015g、0.02g、0.03g、0.04g或0.05g等。
在本发明中，意外地发现，当培养基中添加一定量的硝酸锰时，可提升培养基的培养效果，从而提升表达量和重组人脑利钠肽的产量。但是，硝酸锰的含量不宜过高或者过低，这可能是由于Mn2+的浓度，会影响菌体的代谢通路，从而影响菌体的生产重组人脑利钠肽的产量。
优选地，所述培养基的pH值为6.0～8.0，例如可以是6.0、6.2、6.5、6.7、7.1、7.5、7.8或8等。
优选地，所述培养基的pH值为6.5～7.5。
优选地，所述培养基按每100mL的体积计算，包括如下质量的组分：酵母提取物2.5g～3.5g，干酪素3g～4g，氯化钠1g～1.2g，甘油1g～2g，Na2HPO4·7H2O 0.08g～0.09g，柠檬酸铁铵0.05g～0.07g，醋酸铵0.2g～0.3g。
优选地，所述培养基按每100mL的体积计算，包括如下质量的组分：酵母提取物2.5g～3.5g，干酪素3g～4g，氯化钠1g～1.2g，甘油1g～2g，Na2HPO4·7H2O 0.08g～0.09g，柠檬酸铁铵0.05g～0.07g，醋酸铵0.2g～0.3g，硝酸锰0.02g～0.04g。
另一方面，本发明提供了一种生产重组人脑利钠肽的方法，所述方法包括如下步骤：将菌液接种至如上所述的培养基中，通气，补加干酪素和甘油，使用IPTG诱导后，继续发酵培养得到重组人脑利钠肽。
在本发明中，菌液中的细菌一般可以使用重组后的大肠杆菌、酵母等模式生物进行发酵生产重组人脑利钠肽。
优选地，所述培养基的温度为34℃～40℃，例如可以是34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃等。
优选地，所述通气为向培养基中的通气量为1～4vvm，例如可以是1vvm、1.5vvm、2vvm、2.5vvm、3vvm、3.5vvm或4vvm等。
优选地，所述通气的通气量为1.5～3vvm，优选为2vvm。
优选地，所述通气时，保持培养基的溶氧为30％～80％，例如可以是30％、40％、50％、60％、70％或80％等，优选为40％～60％。
优选地，所述补加干酪素和甘油的方法为：每2小时补加0.1％～0.3％(例如可以是0.1％、0.15％、0.2％、0.25％或0.3％等)的干酪素，优选为0.2％。
优选地，每小时补加0.3％～0.4％(例如可以是0.3％、0.32％、0.35％、0.38％或0.4％等)的甘油，优选为0.35％。
在本发明中，补加干酪素和甘油的步骤是必不可缺的，需要始终保持培养基中有足够的干酪素和甘油，才能够使得重组人脑利钠肽处于较高产量的水平。
优选地，所述补加干酪素和甘油后，当培养基中的菌液浓度OD600达到40以上后，使用IPTG诱导。
优选地，所述IPTG的浓度为0.01％～0.08％，例如可以是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％或0.08％等，优选为0.02％～0.05％。
优选地，所述发酵培养的时间为2～8h，例如可以是2h、3h、4h、5h、6h、7h或8h等，优选为4～5h。
优选地，所述方法包括如下步骤：将菌液接种至如上所述的培养基中，维持培养基的温度为34℃～40℃，保持通气量为1.5～3vvm，溶氧为30％～80％，控制培养基的pH值为6.0～8.0，每2小时补加0.1％～0.3％的干酪素，每小时补加0.3％～0.4％的甘油，在菌液浓度OD600达到40以上后，使用浓度为0.01％～0.08％的IPTG诱导，继续发酵培养2～8h得到重组人脑利钠肽。
在本发明的生产重组人脑利钠肽的方法中所涉及到的浓度指的是，所添加的物质占整体培养基的质量百分比。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的生产重组人脑利钠肽的培养基，可以为生产重组人脑利钠肽的菌株提供丰富的营养物质，并且通过干酪素、柠檬酸铁铵和醋酸铵三者的添加，协同发挥作用，为培养基中提供了更加丰富的氨基酸，促进了重组人脑利钠肽及其前体合成，经过测试其表达量可达到44％以上，重组人脑利钠肽的产量可达到520mg/L，相比传统的培养基，表达量更高，产量更高，为重组人脑利钠肽的生产提供了新的生产策略，对于降低生产成本具有重要的意义，对于实际生产具有重要的价值。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例通过以下方法，生产重组人脑利钠肽，其中，培养基的配方为酵母提取物3g，干酪素3.5g，氯化钠1g，甘油1.5g，Na2HPO4·7H2O 0.08g，柠檬酸铁铵0.05g，醋酸铵0.25g，硝酸锰0.03g，无菌水100mL。
将重组大肠杆菌接种至培养基中，维持培养基的温度为37℃，保持通气量为2vvm，溶氧为50％，控制pH值为7，每2小时补加0.2％的干酪素，每小时补加0.35％的甘油，在菌液浓度OD600达到40以上后，使用浓度为0.05％的IPTG诱导，继续发酵培养4h得到重组人脑利钠肽。
实施例2
本实施例通过以下方法，生产重组人脑利钠肽，其中，培养基的配方为酵母提取物2.5g，干酪素3g，氯化钠1g，甘油1g，Na2HPO4·7H2O 0.08g，柠檬酸铁铵0.05g，醋酸铵0.2g，硝酸锰0.05g，无菌水100mL。
将重组大肠杆菌接种至培养基中，维持培养基的温度为36℃，保持通气量为1.5vvm，溶氧为30％，控制培养基的pH值为6.0，每2小时补加0.1％的干酪素，每小时补加0.3％的甘油，在菌液浓度OD600达到40以上后，使用浓度为0.02％的IPTG诱导，继续发酵培养6h得到重组人脑利钠肽。
实施例3
本实施例通过以下方法，生产重组人脑利钠肽，其中，培养基的配方为酵母提取物3g，干酪素4g，氯化钠1.2g，甘油2g，Na2HPO4·7H2O 0.09g，柠檬酸铁铵0.07g，醋酸铵0.3g，无菌水100mL。
将重组大肠杆菌接种至培养基中，维持培养基的温度为38℃，保持通气量为3vvm，溶氧为50％，控制培养基的pH值为7.5，每2小时补加0.3％的干酪素，每小时补加0.4％的甘油，在菌液浓度OD600达到40以上后，使用浓度为0.08％的IPTG诱导，继续发酵培养8h得到重组人脑利钠肽。
实施例4
本实施例通过以下方法，生产重组人脑利钠肽，其中，培养基的配方为酵母提取物3.5g，干酪素4g，氯化钠1.2g，甘油2g，Na2HPO4·7H2O 0.09g，柠檬酸铁铵0.07g，醋酸铵0.3g，无菌水100mL。
将重组大肠杆菌接种至培养基中，维持培养基的温度为40℃，保持通气量为3vvm，溶氧为80％，控制培养基的pH值为8.0，每2小时补加0.3％的干酪素，每小时补加0.4％的甘油，在菌液浓度OD600达到40以上后，使用浓度为0.08％的IPTG诱导，继续发酵培养8h得到重组人脑利钠肽。
实施例5
本实施例通过以下方法，生产重组人脑利钠肽，其中，培养基的配方为酵母提取物2.5g，干酪素3g，氯化钠1g，甘油1g，Na2HPO4·7H2O 0.08g，柠檬酸铁铵0.05g，醋酸铵0.2g，无菌水100mL。
将重组大肠杆菌的种子接入培养基中，维持培养基的温度为34℃，保持通气量为1.5vvm，溶氧为30％，控制培养基的pH值为6.0，每2小时补加0.1％的干酪素，每小时补加0.3％的甘油，在菌液浓度OD600达到40以上后，使用浓度为0.01％的IPTG诱导，继续发酵培养2h得到重组人脑利钠肽。
实施例6
本实施例与实施例1的区别仅在于，本实施例中培养基使用0.07g的硝酸锰，然后进行发酵，得到重组人脑利钠肽。
实施例7
本实施例与实施例1的区别仅在于，本实施例中培养基使用0.003g的硝酸锰，然后进行发酵，得到重组人脑利钠肽。
对比例1
本对比例与实施例1的区别仅在于，本对比例培养基中不包括干酪素3.5g，其余均与实施例1相同，生产得到重组人脑利钠肽。
对比例2
本对比例与实施例1的区别仅在于，本对比例培养基中不包括柠檬酸铁铵0.05g，其余均与实施例1相同，生产得到重组人脑利钠肽。
对比例3
本对比例与实施例1的区别仅在于，本对比例培养基中不包括醋酸铵0.25g，其余均与实施例1相同，生产得到重组人脑利钠肽。
对比例4
本对比例与实施例1的区别仅在于，本对比例发酵过程中，不包括每2小时补加0.2％的干酪素的步骤，其余均与实施例1相同，生产得到重组人脑利钠肽。
将上述实施例1-7与对比例1-4的样品表达量(采用SDS-PAGE凝胶电泳法《中国药典》2015年版四部通则0542进行检测)和重组人脑利钠肽的产量(使用高效液相色谱法)进行检测。检测得到的数据如下表1所示：
表1
样品 表达量(％) 产量(mg/L)
实施例1 47 542
实施例2 46 540
实施例3 44 525
实施例4 45 522
实施例5 46 528
实施例6 45 534
实施例7 44 536
对比例1 32 125
对比例2 31 134
对比例3 30 124
对比例4 29 136
通过实施例1-7与对比例1-4的对比可知：当培养基中不包括干酪素、柠檬酸铁铵或醋酸铵时，样品的表达量以及重组人脑利钠肽的产量大幅度下降，表达量仅有30％左右，产量在150mg/L以下，说明了三者的添加，会促进菌体合成重组人脑利钠肽；而通过实施例1-2与实施例3-4对比可知，当培养基中含有硝酸锰时，也会对于重组人脑利钠肽的合成产生促进左右。因此，本发明提供的培养基，能够使得表达量达到最高，产量达到最优，适于工业化生产重组人脑利钠肽。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的生产重组人脑利钠肽的培养基及生产方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (21)

1.一种生产重组人脑利钠肽的培养基，其特征在于，所述培养基按每100mL的体积计算，为如下质量的组分：酵母提取物2.5g～3.5g，干酪素3g～4g，氯化钠1g～1.2g，甘油1g～2g，Na2HPO4·7H2O 0.08g～0.09g，柠檬酸铁铵0.05g～0.07g，醋酸铵0.2g～0.3g和硝酸锰0.015g～0.05g。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基的pH值为6.0～8.0。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述培养基的pH值为6.5～7.5。
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基按每100mL的体积计算，为如下质量的组分：酵母提取物2.5g～3.5g，干酪素3g～4g，氯化钠1g～1.2g，甘油1g～2g，Na2HPO4·7H2O 0.08g～0.09g，柠檬酸铁铵0.05g～0.07g，醋酸铵0.2g～0.3g，硝酸锰0.02g～0.04g。
5.一种生产重组人脑利钠肽的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将菌液接种至如权利要求1-4中任一项所述的培养基中，通气，补加干酪素和甘油，使用IPTG诱导后，继续发酵培养得到重组人脑利钠肽；
所述菌液中的细菌为重组大肠杆菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养基的温度为34℃～40℃。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述通气的通气量为1～4vvm。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述通气的通气量为1.5～3vvm。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述通气的通气量2vvm。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述通气时，保持培养基的溶氧为30％～80％。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述通气时，保持培养基的溶氧为40％～60％。
12.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述补加干酪素和甘油的方法为：每2小时补加0.1％～0.3％的干酪素。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述补加干酪素和甘油的方法为：每2小时补加0.2％的干酪素。
14.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述补加干酪素和甘油的方法为：每小时补加0.3％～0.4％的甘油。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述补加干酪素和甘油的方法为：每小时补加0.35％的甘油。
16.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述补加干酪素和甘油后，当培养基中的菌液浓度OD600达到40以上后，使用IPTG诱导。
17.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述IPTG的浓度为0.01％～0.08％。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述IPTG的浓度为0.02％～0.05％。
19.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的时间为2～8h。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的时间为4～5h。
21.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将菌液接种至如权利要求1-4中任一项所述的培养基中，维持培养基的温度为34℃～40℃，保持通气量为1.5～3vvm，溶氧为30％～80％，控制培养基的pH值为6.0～8.0，每2小时补加0.1％～0.3％的干酪素，每小时补加0.3％～0.4％的甘油，在菌液浓度OD600达到40以上后，使用浓度为0.01％～0.08％的IPTG诱导，继续发酵培养2～8h得到重组人脑利钠肽。
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