CN105002103A

CN105002103A - 一种重组g-csf（15-75）多肽毕赤酵母菌的发酵方法

Info

Publication number: CN105002103A
Application number: CN201510309230.0A
Authority: CN
Inventors: 张贵民; 马鲁南; 张苏
Original assignee: Shandong New Time Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shandong New Time Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-06-06
Filing date: 2015-06-06
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2035-06-06
Also published as: CN105002103B

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种重组人粒细胞刺激因子重组工程菌的发酵培养方法。所述工程菌为G-SCF(15-75)的巴斯德毕赤酵母菌，其发酵过程包括种子培养和发酵培养，通过优化制备方案，发酵过程中通过在发酵液中甘油补料培养、使得G-CSF(15-75)蛋白的表达量较高，每升发酵液中G-CSF蛋白含量均在2g/L以上，生物活性不低于1.0×10⁸IU/mg，电泳表达量在92％以上，显著优于现有技术。

Description

一种重组G-CSF（15-75）多肽毕赤酵母菌的发酵方法

技术领域

本发明涉及重组毕赤酵母的发酵，尤其涉及制备重组人粒细胞刺激因子多肽G-CSF(15-75)的毕赤酵母菌的发酵方法

背景技术

人粒细胞刺激因子(human granulocyte colony-stimulating factors,hG-CSF)是一种特异的作用于粒系祖细胞，促进其向成熟中性粒细胞增殖、分化并维持其功能、存活所必须的糖蛋白造血生长因子。1986年，由Nagata等从人鳞状细胞癌细胞系CHU-II中分离了hG-CSF基因，首次确定了其核苷酸序列并在COS细胞中表达(NagataS etal，Nature，1986，319：415-418)。人类有两种不同的G-CSF的cDNA，分别编码含207和204个氨基酸的前体蛋白，均有30个氨基酸的信号肽，成熟蛋白分子为177和174个氨基酸，前者除了在成熟分子N端35位处插了3个氨基酸外，其余的序列与174氨基酸分子相同。

人G-CSF分子量19.6kD，PI为6.1，O-糖基化，对酸碱(pH2～10)、热以及变性剂等相对较稳定。hG-CSF有5个半胱氨酸残基，其中4个半胱氨酸残基在Cys36与Cys42，Cys74与Cys64之间形成两对二硫键；Cys17为不配对半胱氨酸，二硫键的形成对于维持G-CSF生物学功能非常重要。G-CSF在临床应用上具有重要意义，骨髓移植时可促进中性白细胞的恢复；改善再生障碍性贫血伴随的中性白细胞缺乏症；明显改善癌症化疗时引起的严重的中性粒细胞缺乏，加大肿瘤治疗的力度，增强治疗效果；广泛应用于其他伴有中性粒细胞减少的疾病及抗感染等的治疗。

G-CSF于1991年被美国FDA批准投放市场，用于治疗放疗后中性粒细胞减少症，长效的PEG化的G-CSF也获得FDA的批准，国内开发的G-CSF二聚体F-627也已完成Ⅱ期临床，并取得较好的效果。John.F.Reidhaar-Olson研究发现G-CSF的Leu15、Glu19、Gln25、Leu31、Lys34、Lys40、Leu47、Val48、Leu49、Leu54对蛋白活性起重要作用，二硫键对于受体的二聚化，激活下游信号传导起重要作用。目前，国内生产的G-CSF大多数为大肠杆菌表达产物，在生产过程中,大肠杆菌表达蛋白的纯化工艺繁琐，周期长，回收率低的特点限制了其在大规模生产中的应用。毕赤酵母表达外源蛋白技术已经成熟，且分泌表达外源蛋白时更易于纯化，关于G-SCF的发酵，国内也有报道。

中国发明专利CN98103011.4公开了粒细胞集落刺激因子的制备的技术方案，该技术方案利用工程菌部分蛋白酶基因被突变、外膜易破裂的特点，通过控制较低的发酵温度，提高了发酵产量，使分泌速度减慢，降低了蛋白被降解的机率，利用该发明得到的蛋白经纯化后获得的蛋白纯度为99％，产品活性及稳定性达到天然G-CSF的水平。

中国发明专利CN1313612C公开了重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法，通过该技术方案中公开的发酵方法，诱导结束后虽说表达量达50％，但仍采用42℃热诱导。

中国发明专利CN10215489A公开了一种rhG-CSF重组工程菌的发酵培养方法，使用大肠杆菌发酵，但是表达量均在60％以下。

针对现有技术中采用了大肠杆菌和酵母菌进行发酵表达产生完成片段的G-CSF，但利用大肠杆菌难以解决复性问题，且要求的技术较高，由于表达的片段是完成的G-CSF，因此表达量可能会有所降低，在进行表达载体的转化过程中，带来一定的困难。

发明内容

鉴于以上技术的缺陷，本发明提供一种表达重组G-CSF(15-75)多肽的毕赤酵母的发酵方法，得到了一种表达量高，活性好的重组G-CSF(15-75)。

根据G-CSF的cDNA然后用毕赤酵母偏爱密码子对所选氨基酸序列对应的G-CSF(15-75)基因进行优化，并在其5′端加EcoRⅠ位点和kex2酶切位点，3′端加TAA终止密码子和NotⅠ位点。进一步的，将优化的G-CSF(15-75)基因克隆入pPIC9K表达载体中，制备成pPIC9K-G-CSF(15-75)表达载体，将上述重组表达载体转化到整合到毕赤酵母GS115基因组中，保存菌种并标记为CSF(15-75)的巴斯德毕赤酵母菌。

本发明中所用的工程菌保藏号为CGMCC NO:10713，分类命名为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，并于2015年4月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(CGMCC)，保藏单位地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明的一个目的在于提供一种重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的种子培养方法。重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的种子培养方法为：

①、挑取毕赤酵母菌pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115单菌落接种至含0.5mg/ml G418的10ml YPD培养基中，26-32℃，250rpm培养10-25小时，得到一级种子液。

②、将一级种子液按照2％的体积接种到200ml BMGY培养基中，26-32℃，250rpm培养10-25小时，得到二级种子液。

所述的步骤①的培养条件优选为30℃，250rpm培养18小时；所述的步骤②的培养条件优选为30℃，250rpm培养18小时，对比实验发现，合适的温度及培养时间能够使毕赤酵母菌pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115在30℃时，OD600为5，菌种的特性比较稳定，同时确保了转入G-CSF(15-75)基因的稳定性。

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的发酵培养方法为：

(1)甘油培养：

①、30L发酵罐中加入10L含有4％甘油的BMS培养基，121℃，30min灭菌；

②、待培养基冷却至30℃，调整搅拌速度400rpm，通气量0.6m/h，用pH调节剂调节pH至4.5-6.0；

③、培养基中添加适量的PTM1微量元素溶液，按照初始体积6-12％的接种量接种，开始发酵，发酵液中的溶氧量50～80％时培养18～24小时后，溶氧量值为95％～100％，细胞的湿重为160～180g/L；

(2)甘油补料培养：

每升甘油中含有12ml的PTM1微量元素溶液，进行甘油补料时，按重量比计算，甘油的浓度在1～3％，细胞湿重为240～280g/L。

(3)甲醇诱导：

调整发酵罐温度至26-32℃，开始流加甲醇，其中每升甲醇中含有12ml的PTM1微量元素溶液，诱导55-65小时之后检测细胞湿重。

所述的甘油培养步骤①的BMS培养基的配方为：85％磷酸25ml/L、硫酸钠0.4.g/L、硫酸钙0.48g/L、硫酸钾20.13g/L、氢氧化钠4g/L、硫酸镁14.9g/L、甘油45g/L。

对培养基进行优化，毕赤酵母菌pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115生长状况良好。

所述的甘油培养步骤②pH调节剂为氢氧化钠、氨水、二乙胺、三乙胺中的一种或两种，优选为氨水，pH值优选为5.0，为了下一步的甲醇诱导做准备。

所述的甘油培养步骤③中接种量优选为为初始体积的8％；所述的PTM1的用量为41.5-43.5mL，更好的接种量以及PTM1的用量有助于发酵菌种的生长以及性状的稳定，DO值接近100％充分说明发酵罐中甘油完全消耗完毕，应该进行下一步的补料培养阶段。

所述甘油补料培养中补料时的转速为450rpm，补料速度为0-2小时流速为24.35ml/(L/h)，2-4小时为18.55ml/(L/h)，4-5小时为14.25ml/(L/h)，完毕之后将转速调整为520rpm。

补加过程中的转速适当提高，可以充分使甘油混合完全，不加完毕之后的低转速有利于菌种对甘油的利用且不破坏菌种，采用不同流速进行加入甘油有利于避免发酵过程中出现气泡，同时也能控制最终的甘油浓度在1～3％内，优选为1％。检测细胞湿重240-280g/L，优选为280g/L。

所述的甲醇诱导中的转速为520rpm一直发酵结束，流加的速度为：0-3小时1.0ml/(L/h)，3-6小时2.0ml/(L/h)，6-8小时6.35～6.65ml/(L/h)，8小时至结束9.5-10.8ml/(L/h)，甲醇诱导过程的溶氧维持在50％～80％之间，pH为4.95～5.05，检测细胞湿重在350-563g/L之间。

菌体使用甲醇作为碳源需要时间限制，因此初期甲醇量应流速较慢，8小时之后菌种适应甲醇作为碳源，因此流速增加。

所述的甲醇诱导中发酵罐温度优选为26℃，诱导时间为60小时，此条件下，菌种生长以及蛋白的表达量较好。

对上述的发酵方法进行优选，优化的工艺如下：

(1)甘油培养：

②、待培养基冷却至30℃，调整搅拌速度400rpm，通气量0.6m/h，用pH调节剂调节pH至5.0；

③、培养基中添加适量的41.5-43.5mL PTM1微量元素溶液，按照初始体积8％的接种量接种，开始发酵；发酵液中的溶氧量50～80％时培养18～24小时，DO值为100％时细胞的湿重为180g/L；

(2)甘油补料培养：

甘油培养之后进行甘油补料培养，每升甘油中含有12ml的PTM1微量元素溶液，进行甘油补料时，按重量比计算，甘油的浓度为1％，细胞湿重为280g/L；

(3)甲醇诱导培养：

调整发酵罐温度至26℃，开始流加甲醇，其中每升甲醇中含有12ml的PTM1微量元素溶液，诱导60小时，细胞湿重为478g/L。

本发明与现有技术相比具有如下的突出优点：

(1)通过本发明中种子培养基、发酵培养基和补料培养基的配方优选及各工艺中各个参数的优化，经过离心收集，细胞湿重在370-563g/L之间，G-SCF(15-75)蛋白的表达量较高，电泳表达量在92％以上，显著优于现有技术。

(2)本发明的发酵方法通过多次实验优化，按照最适发酵条件进行发酵时，平均每升发酵液中蛋白表达量可达2800mg。

(3)本发明获得的G-SCF(15-75)蛋白经纯化后纯度可达99.8％以上，纯度高，杂蛋白少，经检测生物活性不低于1.0×10⁸IU/mg，降低在临床应用中的副作用。

(4)本发明的发酵过程控制在100小时以内，缩短了生产周期，适合工业化生产。

具体实施例

以下结合实施例，对发酵过程进行详细的阐述，但具体实施例并不对本发明做任何限制。

实施例1

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的种子培养方法为：

挑取单菌落接种至含0.5mg/ml G418的10ml YPD培养基中，30℃，250rpm培养18小时，得到一级种子液。

将一级种子液按照2％的体积接种到200ml BMGY培养基中，30℃，250rpm培养18小时，得到二级种子液，即发酵用种子液。

实施例2

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的种子培养方法为同实施例1。

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的发酵培养方法为：

1、甘油培养：

①、30L发酵罐中加入10L含有4％甘油的BMS培养基，121℃，30min灭菌；BMS培养基的配方为：85％磷酸25ml/L、硫酸钠0.4.g/L、硫酸钙0.48g/L、硫酸钾20.13g/L、氢氧化钠4g/L、硫酸镁14.9g/L、甘油45g/L。

②、待培养基冷却至30℃，调整搅拌速度400rpm，通气量0.6m/h，用氨水调节pH至5.0；

③、培养基中添加适量的PTM1微量元素溶液，按照初始体积8％的接种量接种，开始发酵，发酵液中的溶氧量50～80％时培养18～24小时，溶氧为95％以上时检测细胞的湿重为180g/L。

2、甘油补料培养：

每升甘油中含有12ml的PTM1微量元素溶液，进行甘油补料时，按重量比计算，甘油的浓度在1～3％，补料的转速为450rpm，补料流速为0-2小时流速为24.35ml/(L/h)，2-4小时为18.55ml/(L/h)，4-5小时为14.25ml/(L/h)，完毕之后将转速调整为520rpm。

3、甲醇诱导：

调整发酵罐温度至28℃，开始流加甲醇，其中每升甲醇中含有12ml的PTM1微量元素溶液，诱导60小时之后检测细胞湿重，流加甲醇时转速为520rpm一直保持至发酵结束，流加甲醇的速度为：0-3小时1.0ml/(L/h)，3-6小时2.0ml/(L/h)，6-8小时6.35～6.65ml/(L/h)，8小时至结束9.5-10.8ml/(L/h)，甲醇诱导过程的溶氧维持在60％，检测细胞湿重478g/L。

实施例3

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的种子培养方法为同实施例1；

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的发酵培养中BMS培养基配方为：85％磷酸25ml/L、硫酸钾0.4g/L、硫酸钙0.48g/L、硫酸钾20.13g/L、氢氧化钾4g/L、硫酸镁14.9g/L、甘油45g/L；

甘油培养之后细胞湿重为119g/L；

甲醇诱导之后细胞湿重为469g/L；

其它步骤同实施例2。

实施例4

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的种子培养方法为同实施例1；

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的发酵培养方法为的甘油培养中步骤②，使用氢氧化钠作为pH调节剂，并将pH调节至6.0；

甘油培养之后细胞湿重为105g/L；

甲醇诱导之后细胞湿重为410g/L；

其它步骤同实施例2。

实施例5

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的种子培养方法为同实施例1；

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的发酵培养方法为的甘油培养中步骤②，使用氨水作为pH调节剂，并将pH调节至4.5；

甘油培养之后细胞湿重为118g/L；

甲醇诱导之后细胞湿重为400g/L；

其它步骤同实施例2。

实施例6

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的种子培养方法为同实施例1；

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的发酵培养方法为的甘油培养中步骤③，按照初始体积6％的接种量接种；

甘油培养之后细胞湿重为121g/L；

甲醇诱导之后细胞湿重为462g/L；

其它步骤同实施例2。

实施例7

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的种子培养方法为同实施例1；

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的发酵培养方法为的甘油培养中步骤③，按照初始体积12％的接种量接种；

甘油培养之后细胞湿重为136g/L；

甲醇诱导之后细胞湿重为425g/L；

其它步骤同实施例2。

实施例8

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的种子培养方法为同实施例1；

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的发酵培养方法的甘油培养补料培养，按

按重量比计算，甘油的浓度在1～3％，补料的转速为450rpm，补料流速18.55ml/(L/h)完毕之后将转速调整为520rpm。

甘油培养之后细胞湿重为180g/L；

甲醇诱导之后细胞湿重为401g/L；

其它步骤同实施例2。

实施例9

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的种子培养方法为同实施例1；

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的发酵培养方法的甲醇诱导的调整发酵罐温度至 26℃；

甘油培养之后细胞湿重为178g/L；

甲醇诱导之后细胞湿重为365g/L；

其它步骤同实施例2。

实施例10

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的种子培养方法为同实施例1；

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的发酵培养方法的甲醇诱导的调整发酵罐温度至30℃

甘油培养之后细胞湿重为180g/L；

甲醇诱导之后细胞湿重为563g/L；

其它步骤同实施例2。

实施例11

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的种子培养方法为同实施例1；

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的发酵培养方法的甲醇诱导的调整发酵罐温度至32℃；

甘油培养之后细胞湿重为178g/L；

甲醇诱导之后细胞湿重为350g/L；

其它步骤同实施例2。

实施例12

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的种子培养方法为同实施例1；

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的发酵培养方法的甲醇诱导的调整发酵罐温度至34℃；

甘油培养之后细胞湿重为178g/L；

甲醇诱导之后细胞湿重为300g/L；

其它步骤同实施例2。

实施例13

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的种子培养方法为同实施例1；

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的发酵培养方法的甲醇诱导的调整发酵罐温度至24℃；

甘油培养之后细胞湿重为178g/L；

甲醇诱导之后细胞湿重为295g/L；

其它步骤同实施例2。

实施例14

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的种子培养方法为同实施例1；

重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母的发酵培养方法的甲醇诱导的流加速度为：：0-3小时3.60ml/(L/h)，3-6小时5.60ml/(L/h)，6-8小时7.35ml/(L/h)，8小时至结束10.9ml/(L/h)；

甘油培养之后细胞湿重为180g/L；

甲醇诱导之后细胞湿重为309g/L；

其它步骤同实施例2。

表1、不同发酵条件下G-CSF(15-75)多肽的表达量

注：湿菌重量为甲醇诱导之后检测的细胞湿重。

从表1可以看到：实施例2的发酵电泳表达量、目标蛋白表达量、比活性最高。

实施例3使用不同的甘油培养基发酵，得不到本发明的技术效果的。

实施例4、5不同的pH值对毕赤酵母菌的发酵是有影响的，最终使得目标蛋白的表达量发生变化。

实施例6、7不同的接种量最后的湿重不同，蛋白表达量以及活性相差不大，但是仍低于实施例2的技术效果。

实施例8、14不同的甘油补料速度、甲醇流加速度的改变均能对G-CSF(15-75)产生影响。尤其是甲醇的流加速度，流加太快导致发酵液中的甲醇含量过高，对菌体产生毒性，不利于菌种的生长以及蛋白的表达。

实施例9-13是不同温度的控制，对甲醇诱导的影响，最终发现，温度为26-32℃之一区间时，最终的蛋白表达效果以及表达量最好。

Claims

1.一种重组G-CSF15-75毕赤酵母的发酵方法，其特征在于，包括重组G-CSF15-75多肽毕赤酵母的种子培养和重组G-CSF15-75多肽毕赤酵母的发酵培养。

2.如权利要求1所述的重组G-CSF15-75菌的发酵方法，其特征在于，重组G-CSF15-75多肽毕赤酵母菌的种子培养为：

(1)挑取毕赤酵母菌pPIC9K-G-CSF15-75-GS115单菌落接种至含0.5mg/ml G418的10mlYPD培养基中，26～32℃，250rpm培养10～25小时，得到一级种子液。

(2)将一级种子液按照2％的体积接种到200ml BMGY培养基中，26-32℃，250rpm培养10-25小时，得到二级种子液。

3.如权利要求2所述的重组G-CSF15-75菌的发酵方法，其特征在于，所述的步骤①的培养条件为30℃，250rpm培养18小时；所述的步骤②的培养条件为30℃，250rpm培养18小时。

4.如权利要求1所述的重组G-CSF15-75菌的发酵方法，其特征在于，重组G-CSF15-75多肽毕赤酵母的发酵培养为：

(1)甘油培养：

②、待培养基冷却至30℃，调整搅拌速度400rpm，通气量0.6m/h，用pH调节剂调节pH至4.5～6.0；

③、培养基中添加适量的41.5～43.5mL PTM1微量元素溶液，按照初始体积6-12％的接种量接种，开始发酵，发酵液中的溶氧量50～80％时培养18～24小时，溶氧量值为95％～100％，细胞的湿重为160～180g/L；

(2)甘油补料培养：

每升甘油中含有12ml的PTM1微量元素溶液，进行甘油补料时，按重量比计算，甘油的浓度为1～3％，细胞湿重为240～280g/L；

(3)甲醇诱导培养：

调整发酵罐温度至26～32℃，开始流加甲醇，其中每升甲醇中含有12ml的PTM1微量元素溶液，诱导55～65小时，细胞湿重为350～563g/L。

5.如权利要求1所述的重组G-CSF15-75菌的发酵方法，其特征在于，重组G-CSF15-75多肽毕赤酵母的发酵培养为：

(1)甘油培养：

③、培养基中添加适量的41.5～43.5mL PTM1微量元素溶液，按照初始体积8％的接种量接种，开始发酵；发酵液中的溶氧量50～80％时培养18～24小时，溶氧量值为100％，细胞湿重为180g/L；

(2)甘油补料培养：

(3)甲醇诱导培养：

6.如权利要求4或5所述的重组G-CSF15-75菌的发酵培养，其特征在于，所述的甘油培养步骤①的BMS培养基的配方为：85％磷酸25ml/L、硫酸钠0.4.g/L、硫酸钙0.48g/L、硫酸钾20.13g/L、氢氧化钠4g/L、硫酸镁14.9g/L、甘油45g/L；所述甘油培养中步骤②调节pH的调节剂为氢氧化钠、氨水、二乙胺、三乙胺溶液中的一种或者两种。

7.如权利要求4或5所述的重组G-CSF15-75菌的发酵培养，其特征在于，所述甘油补料培养中补料时的转速为450rpm，补料速度为0～2小时流速为24.35ml/(L/h)，2～4小时为18.55ml/(L/h)，4～5小时为14.25ml/(L/h)，完毕之后将转速调整为520rpm。

8.如权利要求4或5所述的重组G-CSF15-75菌的发酵培养，其特征在于，所述的甲醇诱导中的转速为520rpm至发酵结束，流加的速度为0～3小时1.0ml/(L/h)，3～6小时2.0ml/(L/h)，6～8小时6.35～6.65ml/(L/h)，8小时至结束9.5～10.8ml/(L/h)，甲醇诱导过程的溶氧维持在50％～80％之间，pH为4.95～5.05。

9.如权利要求6所述的重组G-CSF15-75菌的发酵培养，其特征在于，所述甘油培养中步骤②pH的调节剂为氨水。

10.如权利要1所述的重组G-CSF15-75菌的发酵培养，其特征在于，所述的工程菌为保藏号为CGMCC NO:10713的巴斯德毕赤酵母菌。