CN113186147A - 一种提高毕赤酵母工程菌生产猪肌红蛋白的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高毕赤酵母工程菌生产猪肌红蛋白的发酵方法，属于生物工程技术领域。本发明是以产猪肌红蛋白毕赤酵母工程Pichia pastoris X33‑GAP‑Mb为出发菌株，在摇瓶水平进行培养基和培养条件的初步优化。以Pichia pastoris X33‑GAP‑Mb、Pichia pastorisX33‑G1‑Mb为出发菌株，在发酵罐水平进行发酵条件优化，发现DO为30％，血红素流加浓度为150mg/L时，可显著提升猪肌红蛋白的产量，达到285.42mg/L。本发明中猪肌红蛋白的生物制造具有污染少、产品质量高等优点，具有发展前景，这对于猪肌红蛋白的工业化生产具有重要的应用意义。

Description

一种提高毕赤酵母工程菌生产猪肌红蛋白的发酵方法
技术领域
本发明涉及一种提高毕赤酵母工程菌生产猪肌红蛋白的发酵方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
肌红蛋白是一种存在于动物肌肉细胞中的蛋白质，在生物体中具有补铁、运输氧、呼吸等重要的生理功能，可赋予肌肉组织鲜红的颜色。近年来，随着人造肉技术的发展，肌红蛋白的添加可以使得人造肉制品模拟出真肉的颜色。
目前，猪肌红蛋白主要从心肌组织中提取。这种方法存在高成本、长周期、得率低、工艺复杂以及副产物多不利于分离等问题。而利用微生物细胞工厂异源合成猪肌红蛋白这种方法目前还未有报道，且尚无关于毕赤酵母工程菌生产猪肌红蛋白的发酵方法的报道，因此很有必要开展相应研究。微生物合成法相较于传统的化学法，有着很多的优势，比如减少环境污染、产品质量稳定、下游提取相对简单，实现低成本成产的可能性更大。Impossible Foods采用甲醇诱导型的毕赤酵母生产了大豆血红蛋白。猪肌红蛋白和大豆血红蛋白均为单亚基蛋白，因此可将毕赤酵母作为生产猪肌红蛋白的宿主菌株。虽然，甲醇诱导型表达系统具有较高的表达水平，但是甲醇是一种有毒物质，在生产过程中容易造成环境污染，不适合用于食品级蛋白的生产。而以GAP启动子为代表的组成型表达已经在部分外源表达蛋白中进行了应用。但目前，采用组成型表达系统进行猪肌红蛋白的生产存在产量不高、发酵底物昂贵等问题，因此需要对发酵条件进行优化，提高猪肌红蛋白的产量。
利用重组毕赤酵母合成猪血红蛋白需要解决两个方面的难题：第一，确定重组猪肌红蛋白发酵合适的培养基，由于在此之前猪肌红蛋白从未在基因工程菌株中进行表达；第二，确定发酵策略，提高猪肌红蛋白的产量。通过对毕赤酵母表达系统有对应的高密度表达的过程控制策略的探索，从而提高猪肌红蛋白的产量。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种提高毕赤酵母工程菌株产猪肌红蛋白的发酵方法，在毕赤酵母发酵环境中加入血红素进行发酵，并且通过优化血红素的浓度、培养基中的氮源、碳源以及溶氧条件，来进一步提升猪肌红蛋白的产量。
本发明的第一个目的是提供一种提高重组毕赤酵母产猪肌红蛋白的发酵方法，所述方法是将重组毕赤酵母在含有血红素的体系中发酵，所述重组毕赤酵母表达了NCBIReference Sequence为NP_999401.1的猪肌红蛋白。
在一种实施方式中，所述毕赤酵母以Pichia pastoris X33为宿主，以GAP启动子或G1启动所述猪肌红蛋白的表达。
在一种实施方式中，所述G1启动子的序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的第二个目的是提供一种生产猪肌红蛋白的方法，所述方法将表达猪肌红蛋白的重组毕赤酵母在含有血红素的体系中发酵，所述体系以甘油或葡萄糖为碳源；所述猪肌红蛋白的NCBI Reference Sequence为NP_999401.1。
在一种实施方式中，将OD600＝8～10的所述重组毕赤酵母加入摇瓶或发酵罐中发酵生产猪肌红蛋白；发酵体系中含有20～40mg/L的血红素。
在一种实施方式中，在摇瓶发酵时，将重组毕赤酵母接种至发酵体系中，在25～35℃，pH＝4.0～7.0，150～300rpm发酵至少60h。
在一种实施方式中，摇瓶体系中培养基为BMGY培养基或YPD培养基。
在一种实施方式中，在发酵罐发酵时，将重组毕赤酵母接种至发酵体系中，在25～35℃，pH＝4.0～7.0，通气量为1.0～2.0VVM，DO控制在20％～30％发酵至少70h。
在一种实施方式中，发酵罐体系中为BMGY培养基或YPD培养基。
在一种实施方式中，当DO不低于30％，向发酵体系中添加50～150mg/L的血红素。
在一种实施方式中，当DO不低于30％，向发酵体系中添加甘油。
在一种实施方式中，发酵体系中含有10～30g蛋白胨、5～15g甘油、5～15g酵母提取物和1×10-4～5×10-4g生物素。
本发明的第三个目的是提供所述提高重组毕赤酵母产猪肌红蛋白的发酵方法，或生产猪肌红蛋白的方法在生产猪肌红蛋白或其衍生产品方面的应用。
有益效果：本发明通过对发酵过程中溶氧条件的优化、血红素流加浓度增强菌体的生长和分泌合成猪肌红蛋白的能力，实现了发酵罐水平猪肌红蛋白在毕赤酵母中的高效表达。在发酵罐水平，所得猪肌红蛋白产量可达285.42mg/L，该结果为猪肌红蛋白在人造肉等食品加工领域的应用奠定了基础。
附图说明
图1为摇瓶水平发酵培养基、最适碳源、最适氮源优化结果图。
图2为摇瓶水平发酵条件(温度、血红素添加浓度)优化结果图。
图3为发酵罐水平溶氧优化结果图。
图4为发酵罐水平血红素流加浓度优化结果图。
图5为分别含有GAP和G1启动子的重组毕赤酵母的发酵罐水平培养对比结果图。
具体实施方式
YPD培养基组成：每升YPD培养基中含有20g蛋白胨，20g葡萄糖和10g酵母提取物，定容后，121℃，灭菌15min。固体培养基每升加入20g琼脂粉。
BMGY培养基组成：每升BMGY培养基中含有20g蛋白胨，10g甘油，10g酵母提取物，4×10-4g生物素。
发酵罐发酵培养基组成：BMGY培养基外加终浓度为40mg/L血红素。
摇瓶发酵培养基组成：BMGY培养基外加终浓度为40mg/L血红素。
蛋白含量的测定：使用碧云天生物技术研究所研发的Bradford蛋白浓度测定试剂盒进行检测，具体操作步骤参看试剂盒使用说明。
实施例1：表达猪肌红蛋白毕赤酵母重组菌的构建
(1)P.pastoris X33-αGAP-Mb菌株的构建
将猪肌红蛋白基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)，连接至整合型表达载体pGAPZαA的多克隆位点，构建得到重组质粒pGAPZα-A-Mb。
将构建得到的重组质粒pGAPZα-A-Mb，转化至大肠杆菌DH5α中，将转化液涂布于含有20μg/mL Zeocin的LB平板上，在37℃至长出单克隆，将单克隆经菌落PCR和测序验证后，从正确的阳性克隆中提取质粒，将提取的质粒通过电转的方法分别转化至毕赤酵母X33中，构建得到重组菌P.pastoris X33-αGAP-Mb。
(2)Pichia pastoris X33-αG1-Mb菌株的构建
合成G1启动子序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，以质粒pGAPZα-A-Mb作为模板，通过酶切酶连的方式，以G1启动子替换GAP启动子，得到重组质粒pG1-Mb。
将重组质粒pG1-Mb，转化至大肠杆菌DH5α中，将转化液涂布于含有Zeocin的LB平板上，在37℃至长出单克隆，将单克隆经菌落PCR和测序验证后，从正确的阳性克隆中提取质粒，将提取的质粒通过电转的方法转化至毕赤酵母X-33菌株，构建得到重组菌P.pastoris X33-G1-Mb。
实施例2摇瓶水平发酵培养基及发酵条件优化
1、一级种子液制备：将-80℃保藏的实施例1构建得到的菌种Pichia pastorisX33-αGAP-Mb于平板上划线，挑取单菌落接种于含5mL YPD培养基的50mL无菌摇菌管中，30℃，220rpm，摇床培养16～18h即为一级种子液。
2、二级种子液制备：将一级种子液以1％的接种量接种至含50mL YPD培养基的250mL摇瓶中，30℃，220rpm，摇床培养22h，培养至OD600＝8～10。
3、发酵条件：
(1)基因工程菌在不同培养基中发酵生产猪肌红蛋白
将二级种子液以2％的接种量接种到含49mL发酵培养基(分别为YPG、BMGY、YPD培养基)的250mL摇瓶中，发酵培养基中含有10g/L的甘油和终浓度为20mg/L的血红素，在30℃、220rpm下发酵至少60h。
结果如图1A所示，在培养基BMGY中培养重组菌株，猪肌红蛋白的产量最高。
(2)基因工程菌在不同碳源下发酵生产猪肌红蛋白
将二级种子液以2％(2mL/100mL)的接种量接种到含49mL发酵培养基(每升培养基中含有20g蛋白胨，10g酵母提取物，4×10-4g生物素，终浓度为20mg/L的血红素)的250mL摇瓶中，发酵培养基中另外分别添加10g/L的甘油、10g/L葡萄糖、10g/L山梨醇和，发酵至少60h。
结果图1B所示，当碳源为甘油时，猪肌红蛋白的产量最高。
(3)基因工程菌在不同氮源下发酵生产猪肌红蛋白
将二级种子液以2％(2mL/100mL)的接种量接种到含49mL发酵培养基(每升培养基中含有10g甘油，10g酵母提取物，4×10-4g生物素，终浓度为20mg/L的血红素)的250mL摇瓶中，发酵培养基中另外添加20g/L的蛋白胨、20g/L玉米浆、20g/L牛肉膏、20g/L磷酸氢二铵、20g/L硫酸铵，发酵至少60h。
结果图1C所示，当氮源为蛋白胨时，猪肌红蛋白的产量最高。
(4)基因工程菌在不同温度下发酵生产猪肌红蛋白
将二级种子液以2％的接种量接种到含49mL发酵培养基(发酵培养基为BMGY)的250mL摇瓶中，发酵培养基中含有10g/L的甘油和终浓度为20mg/L的血红素，发酵至少60h。
结果图2A所示，菌体在30℃的条件下进行发酵时，蛋白表达能力最强。
(5)基因工程菌在不同血红素水平下发酵生产猪肌红蛋白
将二级种子液以2％(2mL/100mL)的接种量接种到含49mL发酵培养基(发酵培养基为BMGY)的250mL摇瓶中，发酵培养基中含有终浓度分别为5，10，20，40mg/L的血红素，发酵至少60h。结果图2B所示，培养基中的血红素终浓度为40mg/L时，猪肌红蛋白产量高于其它条件。
实施例3在不同溶氧条件下生产猪肌红蛋白(发酵罐水平)
1、一级种子液制备：将-80℃保藏的实施例1构建得到的菌种Pichia pastorisX33-αGAP-Mb于平板上划线，挑取单菌落接种于含5mL YPD培养基的50mL无菌摇菌管中，30℃，220rpm，摇床培养16～18h即为一级种子液。
2、二级种子液制备：将一级种子液以1％(1mL/100mL)的接种量接种至含50mL YPD培养基的250mL摇瓶中，30℃，220rpm，摇床培养22h，培养至OD600＝8～10。
3、发酵条件：将二级种子液以10％(10mL/100mL)的接种量接种到含1.8L发酵培养基(发酵培养基为BMGY)的5L发酵罐中，发酵培养基中含有10g/L的甘油和终浓度为40mg/L的血红素。pH控制在5.50左右。分别采用DO 20％-Stat、30％-Stat、40％-Stat对猪肌红蛋白的发酵进行控制，在30℃、200-800rpm，1.5VVM的条件下发酵84h。
猪肌红蛋白产量检测结果如图3，DO控制在20％、30％、40％时产量分别为219.13、235.70、103.94mg/L。
实施例4流加不同浓度血红素生产猪肌红蛋白
(一)Pichia pastoris X33-αGAP-Mb发酵生产猪肌红蛋白
1、一级种子液制备：将-80℃保藏的实施例1构建得到的菌种Pichia pastorisX33-αGAP-Mb于平板上划线，挑取单菌落接种于含5mL YPD培养基的50mL无菌摇菌管中，30℃，220rpm，摇床培养16～18h即为一级种子液。
2、二级种子液制备：将一级种子液以1％的接种量接种至含50mL YPD培养基的250mL摇瓶中，30℃，220rpm，摇床培养22h，培养至OD600＝8～10。
3、发酵条件：将种子液以10％的接种量接种到含1.8L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵培养基中含有10g/L的甘油和终浓度为20mg/L的血红素。按照30％DO-Stat发酵策略进行发酵，通气量为1.5VVM，搅拌转速为200-800rpm。发酵12h左右，甘油耗尽，此时开始流加补料。补料的速度主要依靠DO、搅拌进行自动控制，当DO>30％时，开始补加甘油，甘油流加量刚好满足菌体生长所需，当DO<30％时，搅拌速度提高(初始转速为200rpm，最高转速为800rpm)。甘油流加进行补料的过程中，同时分别加入了终浓度为50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L的血红素，发酵84h。
猪肌红蛋白产量检测结果如图4，血红素终浓度为150mg/L时产量最高，为243.43mg/L，血红素终浓度为50mg/L、100mg/L、200mg/L时，猪肌红蛋白产量分别为218.96、242.92、204.45mg/L此时对应发酵菌株为P.pastoris X33-GAP-Mb。将得到的猪肌红蛋白进行分离纯化并进行血红素提取，发现在血红素终浓度为150mg/L时，肌红蛋白结合上的血红素最多，为0.22mol血红素/mol猪肌红蛋白。
(二)Pichia pastoris X33-αG1-Mb发酵生产猪肌红蛋白
将Pichia pastoris X33-αG1-Mb按照上述步骤进行种子液的制备、并进行发酵，结果如图5所示。P.pastoris X33-G1-Mb和P.pastoris X33-GAP-Mb两个菌株对应的猪肌红蛋白产量检测结果如图，P.pastoris X33-GAP-Mb两个菌株对应的猪肌红蛋白产量为243.43mg/L，P.pastoris X33-G1-Mb菌株对应猪肌红蛋白的产量为285.42mg/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
江苏东汇生物科技有限公司
<120> 一种提高毕赤酵母工程菌生产猪肌红蛋白的发酵方法
<130> BAA210622A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 465
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgggtttgt ctgatggtga atggcaattg gttttaaatg tttggggtaa agttgaagct 60
gatgttgcag gtcatggtca agaagttttg atcagattgt ttaaaggtca tccagaaact 120
ttggaaaagt tcgataagtt taaacatttg aagtctgaag atgaaatgaa ggcttcagaa 180
gatttgaaga aacatggtaa cactgttttg acagctttgg gtggtatttt gaaaaagaaa 240
ggtcatcatg aagcagaatt gactccatta gctcaatctc atgcaacaaa gcataagatc 300
cctgttaagt atttggaatt catttctgaa gcaatcatcc aagttttaca atcaaaacat 360
cctggtgact ttggtgctga tgcacaaggt gctatgtcaa aggcattgga attgtttaga 420
aacgatatgg ctgcaaagta caaggaatta ggttttcaag gttaa 465
<210> 2
<211> 476
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tttttgtaga aatgtcttgg tgtcctcgac caatcaggta gccatccctg aaatacctgg 60
ctccgtggca acaccgaacg acctgctggc aacgttaaat tctccggggt aaaacttaaa 120
tgtggagtaa tagaaccaga aacgtctctt cccttctctc tccttccacc gcccgttacc 180
gtccctagga aattttactc tgctggagag cttcttctac ggcccccttg cagcaatgct 240
cttcccagca ttacgttgcg ggtaaaacgg aggtcgtgta cccgacctag cagcccaggg 300
atggaaagtc ccggccgtcg ctggcaataa ctgcgggcgg acgcatgtct tgagattatt 360
ggaaaccacc agaatcgaat ataaaaggcg aacacctttc ccaattttgg tttctcctga 420
cccaaagact ttaaatttaa tttatttgtc cctatttcaa tcaattgaac aactat 476

Claims (10)

1.一种提高重组毕赤酵母产猪肌红蛋白的发酵方法，其特征在于，将重组毕赤酵母在含有血红素的体系中发酵，所述重组毕赤酵母表达了NCBI Reference Sequence为NP_999401.1的猪肌红蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述毕赤酵母以Pichia pastoris X33为宿主，以GAP启动子或G1启动子对所述猪肌红蛋白进行表达。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述G1启动子的序列如SEQ ID NO:2所示。
4.一种生产猪肌红蛋白的方法，其特征在于，将表达猪肌红蛋白的重组毕赤酵母在含有血红素的体系中发酵，所述体系以甘油或葡萄糖为碳源；所述猪肌红蛋白的NCBIReference Sequence为NP_999401.1。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将OD600＝8～10的所述重组毕赤酵母加入摇瓶或发酵罐中发酵生产猪肌红蛋白；发酵体系中含有20～40mg/L的血红素。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在摇瓶发酵时，将重组毕赤酵母接种至发酵体系中，在25～35℃，pH＝4.0～7.0，150～300rpm发酵至少60h。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在发酵罐发酵时，将重组毕赤酵母接种至发酵体系中，在25～35℃，通气量为1.0～2.0VVM，pH＝4.0～7.0，DO控制在20％～30％发酵至少70h。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当DO不低于30％，向发酵体系中添加50～150mg/L的血红素。
9.根据权利要求4～8任一项所述方法，其特征在于，发酵体系中含有10～30g蛋白胨、5～15g甘油、5～15g酵母提取物和1×10-4～5×10-4g生物素。
10.权利要求1～9任一项所述方法在生产猪肌红蛋白或其衍生产品方面的应用。
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