CN110358801A - 一种通过酵母发酵获得十三肽的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通过酵母发酵获得十三肽的方法及其应用，包括以下步骤：步骤1：配制培养基，1)一级种子培养基用YPD培养基，2)发酵表达培养基用BSM培养基。步骤2：将带有十三肽表达载体的毕赤酵母菌种发酵表达，得到的发酵液与甘草、苦参、金银花、蒲公英和马齿苋的提取物混合制备成凝胶制剂，本发明得到的发酵液成分简单，发酵过程容易操作，发酵步骤容易控制，成本低廉，有利于十三肽的大规模生产应用，获得的含有十三肽的发酵液有较强抑菌活性，有很大应用价值。可以中草药提取成分一起制成凝胶制剂，该凝胶制剂可涂覆于面部，具有消炎的功效。

Description

一种通过酵母发酵获得十三肽的方法及其应用

技术领域

本发明涉及领域，特别涉及一种通过酵母发酵获得十三肽的方法。

背景技术

毕赤酵母已鉴定为用作异源蛋白质的重组表达系统的有吸引力候选对象，甲基营养酵母菌的真核亚细胞结构使得它们能进行合成生物学活性哺乳动物蛋白质所需的许多翻译后折叠、加工和修饰。与酿酒酵母中表达的蛋白质不同，甲基营养酵母菌，例如巴斯德毕赤酵母产生的蛋白质不大可能含有会妨碍异源表达糖蛋白的下游加工的高甘露糖聚糖结构。此外，甲基营养酵母菌中合成的蛋白质不含热原和抗原性化合物。

甲基营养酵母菌表达系统对于大规模蛋白质合成特别有用。例如，酵母菌巴斯德毕赤酵母的重组蛋白表达水平比酿酒酵母、细菌、昆虫或哺乳动物系统中高10-100倍。此外，不难在简单的、含盐明确的培养基中培养甲基营养型，例如巴斯德毕赤酵母，从而无需杆状病毒表达系统或哺乳动物组织培养所需的昂贵培养基添加剂和设备，此外，巴斯德毕赤酵母适于遗传操作。

十三肽是一种由发酵工程获得的多功能生物多肽，其主要作用为抗菌消炎、促进创面愈合、修复皮肤屏障、提高皮肤及黏膜免疫力，对抑制皮肤细菌生长，治疗痤疮、皮炎、皮损等病症，减少疤痕形成，修复皮肤屏障，预防创面感染，促进创面愈合都有显著作用。

实验室常通过BMMY培养基诱导带有十三肽表达载体的毕赤酵母表达获得十三肽，成本高，杂蛋白较多，不利于大规模生产和应用。

发明内容

本发明的目的是解决现有的酵母发酵法制备十三肽多采用BMMY培养基诱导带有十三肽表达载体的毕赤酵母表达获得，成本高，杂蛋白较多，不利于大规模生产和应用。

问题，提供一种通过毕赤酵母发酵获得十三肽的方法。

本发明提供的技术方案为：

一种通过酵母发酵获得十三肽的方法，包括以下步骤：

步骤1：配制培养基

1)一级种子培养基用YPD培养基

YPD培养基：将10g酵母提取物，20g蛋白胨，20g葡萄糖，溶于1000mL去离子水中，115℃高压灭菌，备用；

2)发酵表达培养基用BSM培养基

BSM培养基:在1L去离子水中按以下顺序依次分别溶解下列物质：26.7ml85％磷酸85％，18.2g硫酸钾，14.9g七水硫酸镁，0.93g二水硫酸钙，4.13g氢氧化钾；使用25％的氨水调节pH至5.5，添加0.5％的蛋白胨；

步骤2：发酵表达

1)取已鉴定活性的阳性菌落，接种于已经灭菌的200mL YPD培养基的挡板瓶中，在29℃，200rpm的条件下振荡培养24小时，使其在600nm波长处的吸光值达到4-6；

2)在种子菌发酵罐中加入YPD培养基和适量消泡剂，在115℃下，灭菌30min；

3)使用火焰接种法将挡板瓶中的种子液接入到种子菌发酵罐中，调整发酵参数，发酵12h；

4)在诱导表达发酵罐中加入改良BSM培养基和适量消泡剂，121℃，20min灭菌；

5)转接管路高压蒸汽灭菌15min后，将种子发酵罐中的种子液按照1:30的量转入诱导表达发酵罐中，调整发酵参数，开始发酵；

6)发酵6h后开始流加甲醇，发酵,72h后得到发酵产物。

优选的是，所述阳性菌落为带有十三肽表达载体的毕赤酵母菌种。

一种通过酵母发酵获得十三肽的方法的应用

所述步骤2中得到的发酵液与甘草、苦参、金银花、蒲公英和马齿苋的提取物混合，加入甘油、卡波姆和三乙醇胺，可制备成凝胶制剂，所述甘草、苦参、金银花、蒲公英和马齿苋的提取物按质量份数比为1:1:1:1:1。

优选的是，所述凝胶制剂的方法包含以下步骤：

1)将甘草、苦参、金银花、蒲公英和马齿苋的提取物溶解于10倍蒸馏水中，常温下搅拌6-8小时，使其有效成分充分溶于水中；

2)使用过滤设备将上述溶液澄清过滤；

3)将十三肽发酵液按20％比例的添加量与滤液混合，在混合液中加入总质量0.5％的卡波姆，均质10min；

4)接着转入搅拌罐中，加入总质量3％的甘油，高速搅拌；

5)缓慢滴入三乙醇胺，直到pH超过6，卡波姆形成凝胶，得到凝胶制剂。

本发明的有益效果为：本发明得到的发酵液成分简单，发酵过程容易操作，发酵步骤容易控制，成本低廉，有利于十三肽的大规模生产应用，获得的含有十三肽的发酵液有较强抑菌活性，有很大应用价值。可以中草药提取成分一起制成凝胶制剂，该凝胶制剂可涂覆于面部，具有消炎的功效。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1

步骤1：配制培养基

1)一级种子培养基用YPD培养基

YPD培养基：将10g酵母提取物，20g蛋白胨，20g葡萄糖，溶于1000mL去离子水中，115℃高压灭菌，备用；

2)发酵表达培养基用BSM培养基

BSM培养基:在1L去离子水中按以下顺序依次分别溶解下列物质：26.7ml85％磷酸85％，18.2g硫酸钾，14.9g七水硫酸镁，0.93g二水硫酸钙，4.13g氢氧化钾；使用25％的氨水调节pH至5.5，添加0.5％的蛋白胨；

步骤2：发酵表达

将15L种子罐、50L发酵罐与150L发酵罐串联。

取已鉴定活性的阳性菌落，接种于已经灭菌的200mL YPD培养基的挡板瓶中，在29℃，200rpm的条件下培养24小时，使其OD600达到4-6；

在15L发酵罐中加入7L YPD培养基和适量消泡剂，115℃，30min原位灭菌；

使用火焰接种法将挡板瓶中的种子液接入到15L发酵罐中，调整发酵参数为温度29℃，转速200rpm，通气量为0.2m³/h，发酵12h；

在50L发酵罐中加入30L改良BSM培养基和适量消泡剂，在150L发酵罐中加入90L改良BSM培养基和适量消泡剂，121℃，20min原位灭菌；

转接管路高压蒸汽灭菌15min后，将15L发酵罐中的种子液按照1:30的量分别转接入50L和150L发酵罐中，调整发酵参数分别为温度29℃，转速240rpm，通气量为1.2m³/h(50L发酵罐)；温度29℃，转速160rpm，通气量为3.6m³/h(150L发酵罐)；

6h后开始流加甲醇，所述每升甲醇中添加12ml的PTM1，流加速率均为2mL/L/h；发酵72h后得到发酵产物。

所述阳性菌落为带有十三肽表达载体的毕赤酵母菌种。

所述步骤2中得到的发酵液与甘草、苦参、金银花、蒲公英和马齿苋的提取物混合，加入甘油、卡波姆和三乙醇胺，可制备成凝胶制剂，所述甘草、苦参、金银花、蒲公英和马齿苋的提取物按质量份数比为1:1:1:1:1。

取净选后的甘草，润透，切片，加水煎煮两次；第一次加水10倍，煎煮3小时，第二次加水8倍，煎煮2小时，合并煎液，放置过夜使沉淀，取上清液浓缩至稠膏状，取出适量，测定甘草酸含量，调节使符合规定，干燥、粉碎成细粉，即得甘草提取物；

取净选后的苦参，润透，切片，加水煎煮两次；第一次加水10倍，煎煮3小时，第二次加水8倍，煎煮2小时，合并煎液，放置过夜使沉淀，取上清液浓缩至稠膏状，取出适量，测定甘草酸含量，调节使符合规定，干燥、粉碎成细粉，即得苦参提取物；

取净选后的金银花，加水煎煮两次；第一次加水10倍，煎煮3小时，第二次加水8倍，煎煮2小时，合并煎液，放置过夜使沉淀，取上清液浓缩至稠膏状，取出适量，测定甘草酸含量，调节使符合规定，干燥、粉碎成细粉，即得金银花提取物；

取净选后的蒲公英，晒干，加水煎煮两次；第一次加水10倍，煎煮3小时，第二次加水8倍，煎煮2小时，合并煎液，放置过夜使沉淀，取上清液浓缩至稠膏状，取出适量，测定甘草酸含量，调节使符合规定，干燥、粉碎成细粉，即得蒲公英提取物；

取净选后的马齿苋，晒干，加水煎煮两次，第一次加水10倍，煎煮3小时，第二次加水8倍，煎煮2小时，合并煎液，放置过夜使沉淀，取上清液浓缩至稠膏状，取出适量，测定甘草酸含量，调节使符合规定，干燥、粉碎成细粉，即得马齿苋提取物；

所述凝胶制剂的方法包含以下步骤：

1)将甘草、苦参、金银花、蒲公英和马齿苋的提取物溶解于10倍蒸馏水中，常温下搅拌6-8小时，使其有效成分充分溶于水中；

2)使用过滤设备将上述溶液澄清过滤；

3)将十三肽发酵液按20％比例的添加量与滤液混合，在混合液中加入总质量0.5％的卡波姆，均质10min；

5)接着转入搅拌罐中，加入总质量3％的甘油，高速搅拌；

5)缓慢滴入三乙醇胺，直到pH超过6，卡波姆形成凝胶，得到凝胶制剂。

实验一：对发酵产物抑菌活性进行检测：

(1)采用抑菌环实验，在LB试管中培养供试病原菌，至OD600＝0.3左右；

(2)取无菌的一次性培养平板，每个平板中倒入已灭菌的固体LB培养基20ml，冷却待用；取已经灭菌的半固体培养基，规格为每支试管7ml，水浴加热至融化；

(3)待冷却至适宜温度，在试管中加入供试病原菌50微升，摇匀后倒入已经冷却凝固的固体LB培养基中，冷却待用；

(4)用打孔器在上述平板上打孔，每个孔中分别加入供试样品100微升；

(5)将平板放置于37℃温箱中，培养12小时左右，用游标卡尺测量抑菌圈直径。

实验结果：使用金黄色葡萄球菌ATCC25923作为指示菌，检测抑菌圈结果为：28.66mm。

实验结果分析

通过本发明提供的方法制备的十三肽发酵液具有很好的杀菌效果。

实验二：对发酵产物抑菌活性进行检测：

(1)采用抑菌环实验，在LB试管中培养供试病原菌，至OD600＝0.3左右；

(2)取无菌的一次性培养平板，每个平板中倒入已灭菌的固体LB培养基20ml，冷却待用；取已经灭菌的半固体培养基，规格为每支试管7ml，水浴加热至融化；

(3)待冷却至适宜温度，在试管中加入供试病原菌50微升，摇匀后倒入已经冷却凝固的固体LB培养基中，冷却待用；

(4)用打孔器在上述平板上打孔，每个孔中分别加入供试样品100微升；

(5)将平板放置于37℃温箱中，培养12小时左右，用游标卡尺测量抑菌圈直径。

结果如下表：

凝胶制剂抑菌圈测量结果

实验结果分析：所述凝胶制剂对常见的致病菌均有抑制作用，尤其对痤疮等面部治病菌且作用效果好，说明本发明具有较好的杀菌、抑菌的效果。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (4)

1.一种通过酵母发酵获得十三肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：配制培养基

1)一级种子培养基用YPD培养基

YPD培养基：将10g酵母提取物，20g蛋白胨，20g葡萄糖，溶于1000mL去离子水中，115℃高压灭菌，备用；

2)发酵表达培养基用BSM培养基

BSM培养基:在1L去离子水中按以下顺序依次分别溶解下列物质：26.7ml85％磷酸85％，18.2g硫酸钾，14.9g七水硫酸镁，0.93g二水硫酸钙，4.13g氢氧化钾；使用25％的氨水调节pH至5.5，添加0.5％的蛋白胨；

步骤2：发酵表达

1)取已鉴定活性的阳性菌落，接种于已经灭菌的200mL YPD培养基的挡板瓶中，在29℃，200rpm的条件下振荡培养24小时，使其在600nm波长处的吸光值达到4-6；

2)在种子菌发酵罐中加入YPD培养基和适量消泡剂，在115℃下，灭菌30min；

3)使用火焰接种法将挡板瓶中的种子液接入到种子菌发酵罐中，调整发酵参数，发酵12h；

4)在诱导表达发酵罐中加入改良BSM培养基和适量消泡剂，121℃，20min灭菌；

5)转接管路高压蒸汽灭菌15min后，将种子发酵罐中的种子液按照1:30的量转入诱导表达发酵罐中，调整发酵参数，开始发酵；

6)发酵6h后开始流加甲醇，发酵,72h后得到发酵产物。

2.根据权利要求1所述的一种通过酵母发酵获得十三肽的方法，其特征在于，所述阳性菌落为带有十三肽表达载体的毕赤酵母菌种。

3.根据权利要求1所述的一种通过酵母发酵获得十三肽的方法的应用，其特征在于，所述步骤2中得到的发酵液与甘草、苦参、金银花、蒲公英和马齿苋的提取物混合，加入甘油、卡波姆和三乙醇胺，可制备成凝胶制剂，所述甘草、苦参、金银花、蒲公英和马齿苋的提取物按质量份数比为1:1:1:1:1。

4.根据权利要求3所述的一种通过酵母发酵获得十三肽的方法的应用：其特征在于，所述凝胶制剂的方法包含以下步骤：

1)将甘草、苦参、金银花、蒲公英和马齿苋的提取物溶解于10倍蒸馏水中，常温下搅拌6-8小时，使其有效成分充分溶于水中；

2)使用过滤设备将上述溶液澄清过滤；

3)将十三肽发酵液按20％比例的添加量与滤液混合，在混合液中加入总质量0.5％的卡波姆，均质10min；

4)接着转入搅拌罐中，加入总质量3％的甘油，高速搅拌；

5)缓慢滴入三乙醇胺，直到pH超过6，卡波姆形成凝胶，得到凝胶制剂。