CN105779302A - 一种防治黄瓜枯萎病的成绿肉座菌复合菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种防治黄瓜枯萎病的成绿肉座菌复合菌剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种微生物复合菌剂及其制备方法，属于生物农药技术领域。本发明的微生物复合菌剂包括5～80重量份的成绿肉座菌和5～80重量份的淡紫拟青霉菌；所述成绿肉座菌的活菌数目为80～150亿/ml，所述淡紫拟青霉菌的活菌数目为80～150亿/ml。通过分别培养、按比例混合等方法得到本发明的微生物复合菌剂。本发明的微生物复合菌剂能够有效抑制黄瓜枯萎病原菌增殖，消除病原菌传播，控制发病规模和程度，实现对土壤生态环境的修复和改良，促进黄瓜的生长和产量的提高。

Description

一种防治黄瓜枯萎病的成绿肉座菌复合菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，尤其涉及一种微生物复合菌剂及其制备方法。
背景技术
黄瓜枯萎病(CucumberfusariumWilt)又称萎蔫病、蔓割病、死秧病，是一种病原菌经土壤传播，从根或根茎部侵入，在维管束内寄生的系统性病害。该病由尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)引起，在我国瓜类种植区普遍发生，是目前黄瓜连作种植的主要障碍。病发时，病原菌从根部伤口或根毛顶端的细胞间隙侵入，进入维管束，在导管内发育，由下向上发展，堵塞导管并产生毒素，使植株萎蔫；病害严重时，直接导致植株死亡。
近年来，我国黄瓜枯萎病爆发严重，在多雨、多湿年份其危害更为严重，一般病株率在10％～20％，重者达80％～90％，重茬地甚至造成绝产。枯萎病已经成为黄瓜种植中的灾难性病害之一，其发病程度和规模直接着影响瓜农经济收益。
目前防治此类病害主要是化学农药，但长期大量使用化学农药，不但严重污染环境、破坏生态平衡、威胁人类健康，而且导致病原菌的抗药性越来越强，使病害越来越难以防治。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物复合菌剂及其制备方法，发明提供的微生物复合菌剂能够有效抑制黄瓜枯萎病原菌增殖，消除病原菌传播，控制发病规模和程度，实现对土壤生态环境的修复和改良，促进黄瓜的生长和产量的提高。
本发明提供了一种微生物复合菌剂，包括5～80重量份的成绿肉座菌和5～80重量份的淡紫拟青霉；
所述的成绿肉座菌(Hypocreavirens)保藏编号为CGMCCNo.7995；
所述的淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)保藏编号为CGMCCNo.7994；
所述成绿肉座菌的活菌数目为80～150亿/ml，所述淡紫拟青霉的活菌数目为80～150亿/ml。
优选的是，所述微生物复合菌剂包括重量比为1:0.25～2，更优选为1：0.5～1.5，最优选为1：0.5的成绿肉座菌发酵液和淡紫拟青霉发酵液。
本发明还提供了上述技术方案所述微生物复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
将成绿肉座菌接种于液体培养基中，进行液体发酵，得到成绿肉座菌发酵液；
将淡紫拟青霉接种于液体培养基中，在通氧条件下进行发酵，得到淡紫拟青霉发酵液；
在无菌环境中，将所述成绿肉座菌发酵液和淡紫拟青霉发酵液混合，得到复合微生物菌剂。
优选的是，所述成绿肉座菌的液体发酵在通气条件下进行，所述通气过程包括顺次的第一通气阶段、第二通气阶段和第三通气阶段：第一通气阶段的时间优选占整个发酵过程的1/6～1/3，通气速度优选为8～12m3/h；第二通气阶段的时间占整个发酵过程的1/3～2/3，通气速度优选为14～16m3/h；第三通气阶段的时间占整个发酵过程的1/6～2/3，通气速度优选为18～25m3/h。在本发明中，所述第一阶段的通气速度更优选为10m3/h；所述第二阶段的通气速度更优选为15m3/h，所述第三阶段的通气速度更优选为20m3/h。
优选的是，所述成绿肉座菌液体发酵的时间为48～96h，更优选为72h，发酵温度为25～30℃，更优选为28℃。
优选的是，所述淡紫拟青霉的发酵在搅拌条件下进行；所述淡紫拟青霉的发酵时间为49～96h，更优选为60h，发酵温度为27～28℃。
本发明还提供了上述技术方案所述微生物复合菌剂在防治黄瓜枯萎病中的应用。
优选的是，所述应用具体包括以下处理方法中的一种或多种：
第一种处理方法：采用所述微生物复合菌剂对黄瓜种子进行浸种处理，所述浸种时间为24h；
第二种处理方法：采用所述微生物复合菌剂对黄瓜种苗进行蘸根处理；采用所述微生物复合菌剂在黄瓜定植前对沟或穴进行浇灌；
第三种处理方法：在育苗期和生长期，采用所述微生物复合菌剂对黄瓜植株的根部进行处理。
优选的是，所述应用具体为：
所述浸种处理具体为：黄瓜苗床或营养钵进行浇灌处理，所述苗床或营养钵的浇灌采用清水稀释500～700倍的复合菌剂，更优选为600倍；
所述蘸根处理具体为：子叶展开后、分苗后和定植前的黄瓜进行蘸根处理，所述蘸根采用清水稀释400～500倍的微生物复合菌剂；
所述育苗期和生长期的处理具体为：采用所述微生物复合菌剂在黄瓜开花坐果期进行灌根，所述黄瓜开花坐果期采用清水稀释200～300倍的复合菌剂，更优选为260倍。
优选的是，所述应用具体为：
采用所述微生物复合菌剂对叶面进行喷施，在整个黄瓜生育期内，喷施2～10次，每次间隔2～15天，更优选为喷施5～6次，每次间隔10～12天，所述喷施的亩用量为0.2～1kg，选为0.8kg。
本发明提供了一种微生物复合菌剂，包括5～80重量份的成绿肉座菌和5～80重量份的淡紫拟青霉，在本发明中，成绿肉座菌和淡紫拟青霉可通过营养争夺、重寄生、产生抗性物质或溶解酶类抑制多种土传植物病原真菌；并促进植物根系的生长。本发明提供的微生物符合菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果显著，能抑制原菌增殖，消除病原菌传播，控制发病规模和程度，实现对土壤生态环境的修复和改良，促进黄瓜的生长和产量的提高。
生物保藏说明
成绿肉座菌(Hypocreavirens)。本菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.7995，保藏时间为2013年8月13日。
淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)。本菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.7994，保藏时间为2013年8月13日。
具体实施方式
本发明提供了一种微生物复合菌剂，包括5～80重量份的成绿肉座菌和5～80重量份的淡紫拟青霉；
所述的成绿肉座菌(Hypocreavirens)保藏编号为CGMCCNo.7995；
所述的淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)保藏编号为CGMCCNo.7994；
所述成绿肉座菌的活菌数目为80～150亿/ml，所述淡紫拟青霉的活菌数目为80～150亿/ml。
本发明提供的微生物复合菌剂包括5～80重量份的成绿肉座菌，更优选为30～65重量份，最优选为50重量份。在本发明中，所述成绿肉座菌的活菌数目为80～150亿/ml，优选为100～135亿/ml，更优选为120亿/ml。
本发明提供的微生物复合菌剂包括5～80重量份的淡紫拟青霉，更优选为15～60重量份，最优选为25重量份。在本发明中，所述成绿肉座菌的活菌数目为80～150亿/ml，优选为100～135亿/ml，更优选为120亿/ml。
在本发明中，所述微生物复合菌剂包括重量比为1:0.25～2，更优选为1：0.5～1.5，最优选为1：0.5的成绿肉座菌发酵液和淡紫拟青霉发酵液。
本发明还提供了上述技术方案所述微生物复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
将成绿肉座菌接种于液体培养基中，进行液体发酵，得到成绿肉座菌发酵液；
将淡紫拟青霉接种于液体培养基中，在通氧条件下进行发酵，得到淡紫拟青霉发酵液；
在无菌环境中，将所述成绿肉座菌发酵液和淡紫拟青霉发酵液混合，得到复合微生物菌剂。
本发明将成绿肉座菌接种于液体培养基中，进行液体发酵，得到成绿肉座菌发酵液。在本发明中，所述成绿肉座菌使用的液体培养基优选包括以下重量份的组分：马铃薯粉10～50份，葡萄糖10～60份。在本发明中，所述成绿肉座菌使用的液体培养基优选包括10～50份马铃薯粉，更优选为12～35份，最优选为15份；所述成绿肉座菌使用的液体培养基优选包括10～60份葡萄糖，更优选为40～55份，最优选为35份。
在本发明中，所述成绿肉座菌的液体发酵在通气条件下进行，所述通气过程包括顺次的第一通气阶段、第二通气阶段和第三通气阶段：第一通气阶段的时间优选占整个发酵过程的1/6～1/3，通气速度优选为8～12m3/h；第二通气阶段的时间占整个发酵过程的1/3～2/3，通气速度优选为14～16m3/h；第三通气阶段的时间占整个发酵过程的1/6～2/3，通气速度优选为18～25m3/h。在本发明中，所述第一阶段的通气速度更优选为10m3/h；所述第二阶段的通气速度更优选为15m3/h，所述第三阶段的通气速度更优选为20m3/h。
在本发明中，所述成绿肉座菌液体发酵的时间为48～96h，更优选为72h；发酵温度为25～30℃，更优选为28℃。
在本发明中，所述成绿肉座菌液体发酵时的压力为0.1±0.02MPa。
在本发明中，所述成绿肉座菌在发酵过程中优选进行光照，所述光照条件为：功率为15W～100W，更优选为40W的白炽灯。
在本发明中，在所述成绿肉座菌的发酵过程中优选对发酵液进行pH值和活菌总数的测定，所述测定的具体程序优选为：发酵30～48h后开始进行pH值和活菌总数的测定，所述测定优选每隔1.5～3小时进行一次，更优选为2小时。在本发明中，所述开始进行测定的时间更优选在发酵36小时后。当活菌总数达80～150亿/ml，更优选为100亿/ml时停止发酵。
在本发明中，pH值的测定方法没有特殊的限定，采用常规的pH测量仪进行测量即可。
在本发明中，活菌总数的测定方法为：用血细胞计数器进行计数，即取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。
本发明将淡紫拟青霉接种于液体培养基中，在通氧条件下进行发酵，得到淡紫拟青霉发酵液。在本发明中，所述淡紫拟青霉使用的液体培养基优选包括以下重量份的组分：蔗糖1～50份，硝酸铵1～10份，磷酸氢二钠0.5～5份，硫酸镁0.1～1.0份，硫酸铁0.01～1.0份，氯化钾0.1～10份。在本发明中，所述淡紫拟青霉使用的液体培养基优选包括1～50份蔗糖，更优选为20～35份，最优选为25份；所述淡紫拟青霉使用的液体培养基优选包括1～10份硝酸铵，更优选为4～8份，最优选为6份；所述淡紫拟青霉使用的液体培养基优选包括0.5～5份磷酸氢二钠，更优选为2～3.5份，最优选为2.5份；所述淡紫拟青霉使用的液体培养基优选包括0.1～1.0份硫酸镁，更优选为0.3～0.9份，最优选为0.8份；所述淡紫拟青霉使用的液体培养基优选包括0.01～1.0份硫酸铁，更优选为0.05～0.4份，最优选为0.35份；所述淡紫拟青霉3.5份。
在本发明中，所述淡紫拟青霉的发酵优选在搅拌条件下进行，搅拌的条件优选为50～500rpm，更优选为100～300rpm；所述淡紫拟青霉的发酵时间优选为49～96h，更优选为60h；发酵温度优选为27～28℃。
在本发明中，所述淡紫拟青霉液体发酵时的压力为0.1±0.02MPa。
在本发明中，所述淡紫拟青霉在发酵过程中优选进行光照，所述光照条件为：功率为15W～100W，更优选为40W的白炽灯。
在本发明中，在所述淡紫拟青霉的发酵过程中优选对发酵液进行pH值和活菌总数的测定，所述测定的具体程序优选为：发酵30～48h后开始进行pH值和活菌总数的测定，所述测定优选每隔1.5～3小时进行一次，更优选为2小时。在本发明中，所述开始进行测定的时间更优选在发酵36小时后。当活菌总数达80～150亿/ml，更优选为100亿/ml时停止发酵。
得到成绿肉座菌发酵液和淡紫拟青霉发酵液后，本发明在无菌环境中，将所述成绿肉座菌发酵液和淡紫拟青霉发酵液混合，得到复合微生物菌剂。在本发明中，所述混合过程采用无菌的混合搅拌罐进行，通过蒸汽灭菌，以达到无菌效果。所述成绿肉座菌发酵液和淡紫拟青霉发酵液的质量比优选为1：0.25～2，更优选为1：0.5～1.5，最优选为1：0.5。
本发明还提供了上述技术方案所述微生物复合菌剂或上述技术方案所述制备方法得到的微生物复合菌剂在防治黄瓜枯萎病中的应用。
在本发明中，所述应用具体包括以下处理方法中的一种或多种：
第一种处理方法：采用所述微生物复合菌剂对黄瓜种子进行浸种处理，所述浸种时间为24h；
第二种处理方法：采用所述微生物复合菌剂对黄瓜种苗进行蘸根处理；采用所述微生物复合菌剂在黄瓜定植前对沟或穴进行浇灌；
第三种处理方法：在育苗期和生长期，采用所述微生物复合菌剂对黄瓜植株的根部进行处理。
在本发明中，所述浸种处理优选具体为：对黄瓜苗床或营养钵进行浇灌处理，所述苗床或营养钵的浇灌采用清水稀释500～700倍的复合菌剂，更优选为600倍。
在本发明中，所述蘸根处理优选具体为：对子叶展开后、分苗后和定植前的黄瓜进行蘸根处理，所述蘸根采用清水稀释400～500倍的微生物复合菌剂；在本发明中，所述蘸根处理过程中微生物复合菌剂的稀释倍数优选为450。
在本发明中，所述育苗期和生长期的处理优选具体为：采用所述微生物复合菌剂在黄瓜开花坐果期进行灌根，所述黄瓜开花坐果期采用清水稀释200～300倍的复合菌剂，更优选为260倍。
在本发明中，所述微生物复合菌剂还可以直接对黄瓜叶面进行喷施，在整个黄瓜生育期内，喷施2～10次，每次间隔2～15天，更优选为喷施5～6次，每次间隔10～12天。在本发明中，所述喷施的亩用量优选为0.2～1kg，更优选为0.8kg；本领域技术人员可根据植株的大小和种植密度设置喷施量。喷施过程中微生物复合菌剂采用清水稀释200～1500倍，更优选为800～1200倍。
下面结合具体实施例对本发明提供的微生物复合菌剂及其制备方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
将成绿肉座菌扩大培养后接种在液体培养基中，在发酵罐中进行发酵，所述液体培养基成分为马铃薯粉10重量份，葡萄糖20重量份。发酵条件为：温度为28℃、罐内压力0.1MPa，时间为90小时；发酵过程中通气分为三个阶段：第一阶段时间为20小时，通气量为8m3/h，第二阶段时间为40小时，通气量为15m3/h，第三阶段时间为30小时，通气量为22m3/h；发酵过程中的光照条件为：36V40W白炽灯；发酵36小时后每隔2小时检测发酵液的pH值和活菌总数，当活菌总数达100亿/ml停止发酵得到成绿肉座菌发酵液。
将淡紫拟青霉扩大培养后接种在液体培养中，所述液体培养基组成及其重量比为蔗糖30份，硝酸铵1.5份，磷酸氢二钠2份，硫酸镁0.25份，硫酸铁0.05份，氯化钾0.5份。发酵条件为：温度为27℃，无搅拌、通氧，罐内压力0.1MPa、时间72小时，光照：36V40W白炽灯，发酵40小时后每隔2.5小时检测发酵液的pH值和活菌总数，当活菌总数达120亿/ml停止发酵得到淡紫拟青霉发酵液。
在无菌操作室内将两种发酵液按2:1比例混合得到复合微生物菌剂，复合菌剂中成绿肉座菌为40重量份，淡紫拟青霉为20重量份。
实施例2
将成绿肉座菌扩大培养后接种在液体培养基中，在发酵罐中进行发酵，所述液体培养基成分为马铃薯粉15重量份，葡萄糖25重量份。在发酵罐中进行发酵，发酵条件为：温度为25℃、罐内压力0.1MPa，时间为60小时；发酵过程中通气分为三个阶段：第一阶段时间为12小时，通气量为12m3/h，第二阶段时间为24小时，通气量为14m3/h，第三阶段时间为24小时，通气量为18m3/h；发酵过程中的光照条件为：36V40W白炽灯；发酵24小时后每隔3小时检测发酵液的pH值和活菌总数，当活菌总数达80亿/ml停止发酵得到成绿肉座菌发酵液。
将淡紫拟青霉扩大培养后接种在液体培养中，所述液体培养基组成及其重量比为蔗糖40份，硝酸铵3份，磷酸氢二钠1份，硫酸镁0.5份，硫酸铁0.02份，氯化钾0.25份。发酵条件为：温度为28℃，无搅拌、通氧，罐内压力0.1MPa、时间84小时，光照：36V40W白炽灯，发酵36小时后每隔2小时检测发酵液的pH值和活菌总数，当活菌总数达100亿/ml停止发酵得到淡紫拟青霉发酵液。
在无菌操作室内将两种发酵液按1:1比例混合得到复合微生物菌剂.复合菌剂中成绿肉座菌为30重量份，淡紫拟青霉为30重量份。
实施例3
将成绿肉座菌扩大培养后接种在液体培养基中，在发酵罐中进行发酵，所述液体培养基成分为马铃薯粉15重量份，葡萄糖35重量份。在发酵罐中进行发酵，发酵条件为：温度为30℃、罐内压力0.1MPa，时间为80小时；发酵过程中通气分为三个阶段：第一阶段时间为18小时，通气量为10m3/h，第二阶段时间为27小时，通气量为16m3/h，第三阶段时间为35小时，通气量为25m3/h；发酵过程中的光照条件为：36V40W白炽灯；发酵48小时后每隔2小时检测发酵液的pH值和活菌总数，当活菌总数达120亿/ml停止发酵得到成绿肉座菌发酵液。
将淡紫拟青霉扩大培养后接种在液体培养中，所述液体培养基组成及其重量比为蔗糖45份，硝酸铵5份，磷酸氢二钠3份，硫酸镁0.8份，硫酸铁0.4份，氯化钾0.8份。发酵条件为：温度为28℃，无搅拌、通氧，罐内压力0.1MPa、时80小时，光照：36V40W白炽灯，发酵20小时后每隔2小时检测发酵液的pH值和活菌总数，当活菌总数达80亿/ml停止发酵得到淡紫拟青霉发酵液。
在无菌操作室内将两种发酵液按1:2比例混合得到复合微生物菌剂.复合菌剂中成绿肉座菌为30重量份，淡紫拟青霉为60重量份。
实施例4
微生物复合菌液对黄瓜枯萎病防治效果的示范试验:
试验于2014年1月1日至12月31日在吉安市樟山镇大江边村无公害蔬菜大棚基地进行，试验共设3个处理(处理1：100亿cfu/ml复合微生物菌液200倍液，处理2：50％敌克松可湿性粉剂500倍液，处理3：50％多菌灵可湿性粉剂500倍液)和1个清水对照(ck)，在黄瓜发病初期开始灌根，防治效果见表1：
表1不同药剂对黄瓜枯萎病的防治效果
第一次施药后10d，100亿cfu/ml复合微生物菌液防效达74.42％，明显高于50％敌克松可湿性粉剂的防效(64.7％)和50％多菌灵可湿性粉剂的防效(46.92％)，且第二次和第三次药后10d，100亿cfu/ml复合微生物菌液处理的防效都明显高于敌克松可湿性粉剂处理和多菌灵可湿性粉剂处理。方差结果表明，100亿cfu/ml复合微生物菌液处理的防效与敌克松和多菌灵可湿性粉剂处理的防效存在明显差异，而敌克松和多菌灵可湿性粉剂处理的效果差异不明显。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种微生物复合菌剂，包括5～80重量份的成绿肉座菌(Hypocreavirens)和5～80重量份的淡紫拟青霉菌(Paecilomyceslilacinus)；
所述的成绿肉座菌(Hypocreavirens)的生物保藏编号为CGMCCNo.7995；
所述的淡紫拟青霉菌(Paecilomyceslilacinus)的生物保藏编号为CGMCCNo.7994；
所述成绿肉座菌的活菌数目为80～150亿/ml，所述淡紫拟青霉菌的活菌数目为80～150亿/ml。
2.根据权利要求1所述的微生物复合菌剂，其特征在于，所述微生物复合菌剂包括重量比为1:0.25～2的成绿肉座菌发酵液和淡紫拟青霉菌发酵液。
3.一种微生物复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
将成绿肉座菌接种于液体培养基中，进行液体发酵，得到成绿肉座菌发酵液；
将淡紫拟青霉菌接种于液体培养基中，在通氧条件下进行发酵，得到淡紫拟青霉菌发酵液；
在无菌环境中，将所述成绿肉座菌发酵液和淡紫拟青霉菌发酵液混合，得到复合微生物菌剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述成绿肉座菌的液体发酵在通气条件下进行，所述通气过程包括顺次的第一通气阶段、第二通气阶段和第三通气阶段：第一通气阶段的时间优选占整个发酵过程的1/6～1/3，通气速度优选为8～12m3/h；第二通气阶段的时间占整个发酵过程的1/3～2/3，通气速度优选为14～16m3/h；第三通气阶段的时间占整个发酵过程的1/6～2/3，通气速度优选为18～25m3/h。。
5.根据权利要求3所述的制备方法，所述成绿肉座菌的液体发酵的时间为48～96h，发酵温度为25～30℃。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述淡紫拟青霉菌的发酵在搅拌条件下进行；
所述淡紫拟青霉菌的发酵时间为49～96h，发酵温度为27～28℃。
7.权利要求1所述的微生物复合菌剂或权利要求2～6任意一项所述制备方法得到的微生物复合菌剂在防治黄瓜枯萎病中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用具体包括以下处理方法中的一种或多种：
第一种处理方法：采用所述微生物复合菌剂对黄瓜种子进行浸种处理，所述浸种时间为24h；
第二种处理方法：采用所述微生物复合菌剂对黄瓜种苗进行蘸根处理；采用所述微生物复合菌剂在黄瓜定植前对沟或穴进行浇灌；
第三种处理方法：在育苗期和生长期，采用所述微生物复合菌剂对黄瓜植株的根部进行处理。
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