CN1673349A - 一种淡紫拟青霉新菌株及其利用虾壳制备杀线虫剂的方法 - Google Patents

一种淡紫拟青霉新菌株及其利用虾壳制备杀线虫剂的方法 Download PDF

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一种淡紫拟青霉新菌株及其利用虾壳制备杀线虫剂的方法，所述的淡紫拟青霉新菌株(Paecilomyces lilacinus－89，简称PL89)，具有耐碱、耐热、抗污染、生长快、产几丁质酶能力强等优点。以PL89为生产菌株，利用虾壳制备杀线虫剂，具有工艺简单、培养时间短、产孢子量大等优点。虾壳的价格低廉、作为培养基既有丰富的营养，又可以大幅度降低生产成本，产品具有杀线虫、防枯萎、促进作物生长等作用。

Description

一种淡紫拟青霉新菌株及其利用虾壳制备杀线虫剂的方法
技术领域    本发明涉及一种微生物新菌株及其制剂的制备方法，特别是一种淡紫拟青霉新菌株及其利用虾壳制备杀线虫剂的方法。
背景技术    淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)作为植物线虫卵寄生真菌引起了众多研究人员的关注，国际马铃薯中心将此菌制成商品制剂在46个国家推广实验，防治马铃薯根结线虫取得成效。淡紫拟青霉的液体培养通常使用马铃薯蔗糖培养基、玉米粉培养基或查氏培养基，固体大量培养通常使用麦麸培养基。
《微生物学通报》1997，24(2)：107-109发表了潘沧桑的文章“用啤酒厂废料生产淡紫拟青霉菌剂及防治试验”，介绍了从寄生在番茄的南方根结线虫卵块中分离到一种破坏线虫的内寄生真菌淡紫拟青霉，并利用啤酒厂的废渣、废液生产出菌剂。该菌剂每克样本含孢子量为3.4×106。用其进行防治根结线虫的盆栽试验，每1600ml土壤施8g比施用1g菌剂的根结指数、虫瘿、卵块、雌虫和幼虫分别减少65％、94％、94％、95％和97％。
专利号为95118468的发明专利“用啤酒厂废液生产淡紫拟青霉菌剂的方法”，介绍了一种用啤酒厂废料生产杀虫剂的方法，该杀虫剂可以用于许多农作物的线虫防治，且有利于啤酒厂的废料利用，减少污染。
淡紫拟青霉菌极少在生产上推广应用，主要原因是缺乏高效菌株；廉价培养基和相应的培养技术。用已公开的方法制备淡紫拟青霉菌剂，成本高且产孢率低；目前，国内外对淡紫拟青霉仍然处于研究阶段，主要目标是筛选稳定高效的生产菌株、解决菌剂培养中的高成本低产率的技术瓶颈、研制稳定高效的实用剂型。在国内淡紫拟青霉菌产品尚未在农业生产上应用。
发明内容    本发明的目的是筛选高效淡紫拟青霉菌株，研制以虾壳为培养原料的淡紫拟青霉菌培养基，制备高效低成本的淡紫拟青霉杀线虫剂。
本发明的一种淡紫拟青霉新菌株(Paecilomyces lilacinus-89，简称PL89)，是2002年11月17日从福州市黄山农场彩叶草根部的根结线虫卵囊上分离培养纯化，通过几丁质平板与明胶平板诱变和筛选，获得具有高产几丁质酶和丝氨酸蛋白酶的菌株，2004年3月12日保藏于北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1109。PL89(CGMCC No.1109)可以在马铃薯葡萄糖琼脂培养基或马铃薯蔗糖琼脂培养基上生长；能分解虾壳和几丁质；可以在虾壳和水配制的培养基上生长，培养48小时的分生孢子量超过2×108/ml；具有耐碱性，适宜在pH7～11的培养基上生长(见表1)。同样条件下加入0.4～0.8mol/L Mg+的培养基生长更快。
           表1.不同pH值对淡紫拟青霉菌落生长的影响
培养基pH值 菌  落  直  径(mm) 菌落平均生长速率mm/d
2d 4d 6d 8d 10d
    7     9.50     20.67     31.33     43.00     53.50     5.50
    9     9.50     19.50     30.50     40.50     50.50     5.125
    11     8.70     18.25     29.50     39.00     49.50     5.094
本发明的一种利用虾壳制备杀线虫剂的方法，其特征在于以PL89(CGMCC No.1109)为生产菌株，采用液体培养法或者液固两相培养法制备杀线虫剂：
(1)液体培养法：在水中加入50～200目虾壳粉1％～5％(重量百分率，以下类同)，直接热力灭菌制成液体培养基；然后在每升液体培养基中接入PL89(CGMCC No.1109)的孢子150×108～200×108个，在24～40℃、150～180r/min条件下培养48～72h，制成培养液。这种培养液可以作为种子使用，也可以直接作为液体杀虫剂使用，或者用载体吸附后成为土壤添加剂使用。
(2)液固两相培养法，包括以下步骤：
A、干料组份：麸皮40～70％(重量百分率，以下类同)，50～200目虾壳粉10～20％，谷壳或草粉20～30％；
B、固体培养基配制：在每百公斤干料中加水80～100公斤，装瓶或装袋后，121℃湿热灭菌1～2小时；
C、培养：取所述液体培养法得到的PL89(CGMCC No.1109)培养液，调整成孢子浓度为1.5×108个/ml～3×108个/ml的液体种子，按每升液体种子接种含干料1～2kg的固体培养基，浅盘开放式培养；浅盘铺放接种后的固体培养基，其厚度为3～5cm，培养温度28～35℃，培养时间4～8天。
本发明的一种淡紫拟青霉新菌株PL89(CGMCC No.1109)具有耐碱、耐热、抗污染、生长快、产几丁质酶能力强等优点，作为生产菌株利用虾壳制备杀线虫剂，工艺简单、培养时间短、产孢子量大。以虾壳作为培养基营养丰富，营养分析结果表明：虾壳粗蛋白含量为17～20％，几丁质为40～50％，含有丰富的磷、钾、镁、锌等元素。几丁质作为碳源，粗蛋白作为氮源适合PL89(CGMCC No.1109)生长。虾壳是水产品加工厂的废料，价格低廉，用于培养基可以大幅度降低产品的生产成本。生产的产品具有杀线虫、防枯萎、促进作物生长的作用。盆栽和田间试验结果表明，对作物根结线虫病害防治效果显著，同时有防枯萎、促进作物生长的作用。
用PL89(CGMCC No.1109)可湿性粉剂防治烟草根结线虫病盆栽试验和防治黄瓜根结线虫病的小区试验，都取得良好的效果。
烟草根结线虫病盆栽防治试验：用病土种植三叶期烟苗。移栽时设三种处理：3％呋喃丹颗粒剂2g/盆，PL89(CGMCC No.1109)可湿性粉剂5g/盆，不施药为对照。50d后调查防治效果：处理区烟草根结线虫病的病情指数明显下降，烟叶产量明显增加，PL89(CGMCC No.1109)可湿性粉剂的防治效果优于化学杀线虫剂呋喃丹。(见表2)
表2.PL89(CGMCC No.1109)可湿性粉剂防治烟草根结线虫病盆栽试验
处理类型       叶片       根        株高 病情指数
  鲜重    增g/株    (％)   鲜重   增g/株   (％)     cm    增(％)
PL893％呋喃丹CK   34.1    96.323.1    44.416.0   6.6    153.4.3    92.6    63.4     44.5  75.934.1  34.825.3  443978
黄瓜根结线虫病防治小区试验：选择根结线虫病和镰刀菌枯萎病发生严重的重茬土，用河砂营养袋培育黄瓜苗，移栽时每穴施PL89(CGMCC No.1109)可湿性粉剂5g(孢子量为30×108/g)。采收期调查发病率和病情指数，评价防治效果。黄瓜根结线虫病情指数下降73.2％，黄瓜枯萎病株发病率减少70.4％。防治效果分别达73.2％。防治的黄瓜植株生长旺盛，根系发达，未防治的对照区根结发生严重，根系生长脆弱。(见表3)
表3.PL89可湿性粉剂防治黄瓜根结线虫病和枯萎病小区试验
    处理类型       根结线虫病         枯萎病
  病情指数  病情下降(％) 发病率(％)  枯萎下降(％)
    防治区对照区     12.9    73.248.3     16.7    70.456.4
附图说明    图1为PL89(CGMCC No.1109)菌落形态图。
PL89(CGMCC No.1109)如图1所示，菌落厚、扁平、淡紫色、扩展，后期产生同心环纹。
具体实施方式    为了充分公开本发明的一种淡紫拟青霉新菌株及其利用虾壳制备杀线虫剂的方法，现结合实施例加以说明。
实施例一：液体培养法；
采用深层发酵，在100升发酵罐中，装入70升的3％虾壳粉液体培养基，经0.05mpa灭菌0.5小时，冷却至室温后，接入3～4升PL89(CGMCC No.1109)液体种子，培养温度28～30℃，通气量为1.5M2/h，搅拌速度150r/min，经48小时后终止培养。培养液可以作为液固两相培养法的种子，也可以直接作为液体杀虫剂，供大田生产使用；或者用草炭粉配制成土壤添加剂。土壤添加剂的制备方法是，按每升培养液用1～1.2kg的草炭粉作为载体吸附，自然晾干后成为孢子量为1.5×108个/g～3×108个/g土壤添加剂，再包装成为产品，供大田生产使用。
实施例二：液固两相培养法；
干料组份为麸皮70％、100目虾壳粉10％、谷壳20％。在每百公斤干料中加水80公斤，装袋后，121℃湿热灭菌1小时得固体培养基。采用PL89(CGMCC No.1109)液体种子，按每升液体种子接种含干料2kg的固体培养基，浅盘开放式培养。浅盘铺放接种后的固体培养基的厚度为4cm，培养温度28℃，培养5天后，自然风干，经气流粉碎机粉碎，100目过筛，用滑石粉作为载体配制成孢子量为20×108个/g～30×108个/g的可湿性粉剂，然后包装成为产品，供大田生产使用。
PL89(CGMCC No.1109)杀线虫可湿性粉剂的施用方法：1、可湿性粉剂1kg与干细砂土5～7kg混合拌匀后，于移栽前撒施种植穴内，每穴含可湿性粉剂4～5g，然后将作物苗移栽于穴内定植。2、在作物苗定殖后线虫侵染前，将可湿性粉剂1kg与50kg清水充分搅拌，然后每穴浇施可湿性粉剂溶液0.25kg。
PL89(CGMCC No.1109)土壤添加剂的施用方法：于移栽前撒施种植穴内，每穴施土壤添加剂5～10g，然后将作物苗移栽于穴内定植。
PL89(CGMCC No.1109)液体杀虫剂的施用方法：在作物苗定植后线虫侵染前，将每公斤液体杀虫剂用50kg清水稀释，然后每穴浇施液体杀虫剂溶液0.25kg。

Claims (7)

1、一种淡紫拟青霉新菌株，其特征在于该新菌株为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus-89，简称PL89)CGMCC No.1109。
2、根据权利要求1所述的PL89(CGMCC No.1109)，其特征在于可以在虾壳和水配制的培养基上生长。
3、根据权利要求1或2所述的PL89(CGMCC No.1109)，其特征在于具有耐碱性，适宜在pH7～11的培养基上生长。
4、一种利用虾壳制备杀线虫剂的方法，其特征在于以所述的PL89(CGMCC No.1109)为生产菌株，采用液体培养法制备杀线虫剂，即在水中加入50～200目虾壳粉1％～5％(重量百分率，以下类同)，直接热力灭菌制成液体培养基；然后在每升液体培养基中接入PL89(CGMCC No.1109)的孢子150×108～200×108个，在24～40℃、150～180r/min条件下培养48～72h，制成培养液。
5、一种利用虾壳制备杀线虫剂的方法，其特征在于采用液固两相培养法制备杀线虫剂，包括以下步骤：
(1)干料组份：麸皮40～70％，50～200目虾壳粉10～20％，谷壳或草粉20～30％；
(2)固体培养基配制：在每百公斤干料中加水80～100公斤，装瓶或装袋后，121℃湿热灭菌1～2小时；
(3)培养：取所述液体培养法得到的PL89(CGMCC No.1109)培养液，调整成孢子浓度为1.5×108个/ml～3×108个/ml的液体种子，按每升液体种子接种含干料1～2kg的固体培养基，浅盘开放式培养；浅盘铺放接种后的固体培养基，其厚度为3～5cm，培养温度28～35℃，培养时间4～8天。
6、根据权利要求4所述的一种利用虾壳制备杀线虫剂的方法，其特征在于所得培养液按每升用1～1.2kg的草炭粉作为载体吸附，自然晾干。
7、根据权利要求5所述的一种利用虾壳制备杀线虫剂的方法，其特征在于用滑石粉作为载体。
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