KR20110034578A - 연작 담배의 풋마름병을 예방하고 제거하기 위한 길항세균 및 그것의 미생물 유기질 비료 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 농업 집약적 생산(intensive production)을 위한 기술에 속하는 연작 담배의 풋마름병(bacterial wilt)을 예방하고 제거하기 위하여 사용되는 길항세균(antagonistic bacteria) 및 그것들의 미생물 유기질 비료에 관한 것이다. 본 발명은 담배 풋마름병의 병원체에 대하여 주목할만한 길항 작용을 가지는 두개의 길항세균(브레비바실러스 브레비스 NJL-25 및 바실러스 세레우스 NJL-14)을 분리하였다. 미생물 유기질 비료는 이들 길항세균 및 유기질 퇴비로부터 생산된다. 여기에서, 각각 NJL-25 및 NJL-14의 함량은 1 x 1010cfu/g 이상이고, 전체 질소의 함량은 4~5%(상기 질소의 90% 이상이 유기 질소)이고, 전체 질소-인-칼륨 영양소의 함량은 6~10%이고, 유기 물질의 함량은 30~35%이다. 실험에서 나타난 것과 같이, 미생물 유기질 비료를 토양에 적용한 후, 그것은 길항 세균을 토양에서 우세한 미생물총으로 빠르게 증식시킬 것이며 담배 풋마름병으로 고통받는 토양에서 담배 풋마름병의 97.6% 이상의 생물학적 방제율을 달성한다. 만일 긴 시간 동안 연작 장애 없이 토양에 미생물 유기질 비료가 사용된다면, 대부분의 연작 담배의 풋마름병의 발생을 예방할 수 있다.
Description
본 발명은 농업 집약적 생산(intensive production)을 위한 기술에 속하며 연작 담배의 풋마름병(bacterial wilt)을 극복하고 제거하기 위하여 독점적으로 사용되는, 연작 담배의 풋마름병을 예방하고 제거하는데 사용될 수 있는 길항세균(antagonistic bacteria) 및 그것들의 미생물 유기질 비료에 관한 것이다.
담배는 중국에서의 주요 경제적 작물이며, 그것의 품질은 국가 경제 및 사람들의 생계와 관련이 있다. 담배 풋마름병은 심각한 피해를 주며 소위 "담배의 암(cancer of tobacco)"이라 불리는, 담배의 주요 질병 중 하나이다. 그것은 1880년대에 미국에서 처음으로 발견되었다. 현재, 그것은 중국 서남의 담배 생산 지역에서 널리 발생하고 있으며, 종종 영향을 받은 지역에서 전염병 창궐의 형태로 발생하여 엄청난 손실을 가져오며, 심각한 경우에는 약 80%의 수확 손실을 가져온다. 담배 풋마름병은 심각한 토양 유래의(soilborne) 세균성 질병이다. 그것은 세계에서 열대(tropical zone), 아열대(subtropical zone) 및 몇몇의 따뜻한 지역에 널리 분포하고 있다. 중국에서, 상기 질병은 허난성(Henan), 산둥성(Shandong), 장쑤성(Jiangsu), 원난성(Yunnan), 광서성(Guangxi), 허베이성(Hebei), 후난성(Hunan), 광둥성(Guangdong) 및 푸젠성(Fujian)에서 널리 발생하며, 그것은 중국 담배 수확 및 품질 감소의 원인 중 하나이다. 담배 풋마름병의 병원체(랄스토니아 솔라나세아룸(ralstonia solanacearum))는 토양, 유수(flowing water)(예를 들어, 관개(irrigation)), 시드(seed) 및 다른 수단을 통하여 확산될 수 있으며, 환경에 매우 잘 적응한다. 토양의 랄스토니아 솔라나세아룸의 감염 초기 단계에서는 그것의 양이 적기 때문에, 식물들은 하기의 증상을 가진다: 성장이 제한되며, 식물들은 짧고, 작고, 기형이며 감염되기 쉽다. 농부들은 종종 영양 부족의 문제로 증상들을 간주하기 때문에 더욱 많은 질소 비료를 사용한다. 그 결과, 토양에서의 미생물총(microflora)의 불균형은 점점 더 나빠지고, 병원체가 근권(rhizosphere)에서 우세한 위치를 차지하게 되므로 담배 풋마름병이 발생한다. 고온 및 고습의 환경하에서 상기 질병은 빠르게 발병되며, 질병의 심각한 발병과 함께 필드(field)에서의 질병율(morbidity)은 100%이며, 수확을 거둘 수 없게된다.
다른 한편으로는, 벼(paddy), 밀(wheat), 옥수수(corn), 평지(rape) 및 다른 작물들의 짚은 즉시 태워지고, 규모있게 기르는 가축 및 가금류의 배설물은 버려졌다. 그것은 환경을 심각하게 오염시킬 뿐만 아니라, 유기질 비료 및 생 유기질(bio-organic) 비료 제품을 생산하는데 사용될 수 있는 원료를 크게 낭비하고; 거대한 영양 자원(C, N, P, K, S 및 미량 원소들)을 토양 밖으로 잃어버리는 것이다 - 식물 시스템 및 중국 농업의 지속적인 성장 가능성은 두드러지게 약화되었다. 어떻게 하면 작물의 수확 때문에 토양으로부터 빠져나간 영양 성분들을 최대한으로 되돌릴 수 있을 것인가? 이러한 고형의 유기 폐기물을 상업용 유기질 비료로 만들고 토양에 비료를 사용하는 것만이 유일한 방법이다. 만일 이러한 고형의 유기 폐기물들이 고온 발효를 통하여 고급 유기질 퇴비(high-grade organic compost)로 합성된다면, 그 후 상기 혼합비료는 미생물 유기질 비료를 제조하기 위한 기능성 세균의 담체로서 사용되며, 그 기능은 명확해질 것이며 거기에는 충분한 적용 전망이 있을 것이다.
본 발명의 목적은 담배 풋마름병을 예방하고 제거할 수 있는 길항적 미생물 유기질 비료를 개발하는 것이다. 상기 비료의 예방 및 치유율(cure rate)은 80% 이상이다. 그것은 연작 장애를 가지는 토양을 생물학적으로 회복시킬 수 있으며, 집약 농업의 원활한 성장을 보장한다.
본 발명은 담배 풋마름병을 예방하고 제거할 수 있는 길항 미생물 유기질 비료를 제공한다.
본 발명은 연작 담배의 풋마름병을 극복하거나 제거할 수 있는 미생물 유기질 비료 및 그것의 생산 방법에 관한 것이다. 상기 미생물 유기질 비료를 생산하기 위하여, 돼지 배설물 퇴비 및 유채씨 깻묵의 효소적 가수분해로부터 얻은 아미노산 혼합물을 길항세균 용액과 함께 혼합하였다. 현재 시장에서의 제품들과 비교하여, 상기 제품은 하기의 이점을 가진다:
1) 상기 비료 제품은 담배 풋마름병의 병원균의 성장을 억제하는 두개의 특정한 고성능 균주(브레비바실러스 브레비스 및 바실러스 세레우스)를 포함한다. 억제 효과는 매우 주목할만 하다. 실험 결과는 상기 제품이 연작 담배의 풋마름병으로 고통받는 토양에 적용된 후, 담배 풋마름병의 생물학적 방제율은 80% 이며, 3년 연속으로 비료가 적용된 토양에서의 담배 풋마름병의 생물학적 방제율은 심지어 더욱 높다는 것을 보여준다.
2) 상기 비료는 유기질 비료이며, 풍부한 유기 물질(함량은 30-35%)을 함유하고, 대부분이 아미노산과 미세분자 펩티드인 유기 질소 함량은 4%이다. 상기 제품에서 전체 인(phosphor)의 함량은 4%이다. 게다가, 상기 제품은 훌륭한 생물학적 이용 가능성을 가진다. 상기 제품이 사용된 후, 작물들은 묘목 단계(seedling stage)에서 포스포린 민감성 시기(phosphorine sensitive period)를 원활하게 벗어날 수 있다. 비교적으로, 인산 비료를 토양에 적용한 후의 생물학적 이용 가능성은 바람직하지 못하다. 유기질 비료에서의 풍부한 영양소는 또한 길항세균이 토양에서 살아남을 수 있고 우세한 미생물총을 형성하여 질병을 예방하는 데 중요한 역할을 하도록, 비료에서의 길항세균의 성장 및 증식을 위한 조건을 제공한다.
3) 생-균주(bio-strain) 제조물이기 때문에, 화학 살충제의 사용에 의하여 야기되는 임의의 문제들을 가지지 않으며, 무공해 담배 생산에 기여한다. 농부들은 풋마름병을 예방하고 치유하는 다른 화학 살충제를 사용하지 않거나 그 양을 감소시킬 것이다. 이것은 농부들의 지출을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 농작물의 품질을 향상시킬 수 있다. 한편, 미생물 비료는 수율을 증가시키는 기능을 가지므로 농부들의 수입을 증가시킬 수 있다.
도 1은 길항세균 NJL-25 및 NJL-14의 억제환(inhibition zone)을 나타내는 것이다.
A : 길항세균 NJL-25의 억제환 B: 길항세균 NJL-14의 억제환
도 2는 온실내 포트 실험에서의 예방 및 치유 효과를 나타내는 것이다.
A : 길항세균 NJL-25의 억제환 B: 길항세균 NJL-14의 억제환
도 2는 온실내 포트 실험에서의 예방 및 치유 효과를 나타내는 것이다.
연작 담배의 풋마름병을 예방하고 제거하기 위하여 사용되는 길항 세균은 균주 NJL-25 및 균주 NJL-14를 포함하며, 여기에서
균주 NLJ-25는 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis)에 속하고, 2009년 7월 9일에 중국 일반 미생물 보존센터(China General Microbial Culture Collection Center; CGMCC)에 의하여 보존되었다. 그것의 보존 번호(culture collection number)는 CGMCC No. 3175이다. 그것의 주요 생물학적 특성은: 그람 양성(gram-positive)이고; 세포들은 막대 모양이며; 팽창된 포자낭은 타원형의 포자를 포함하고; 콜로니들은 매끈하고 엄격한 호기성 조건 하에서 자라며; 카탈라아제(catalase)에는 음성이고; V.P. 반응은 음성이며; 메틸 레드 테스트는 음성이고; 수크로오스, 프룩토오스, 만니톨 및 소르비톨의 발효는 산을 생성하지만 가스는 생성되지 않으며; 질소 환원 효소(nitrate reductase)에는 음성이고; 녹말 가수분해(starch hydrolysis)는 음성이며; 글루틴 가수분해(glutin hydrolysis)는 양성이고; 카제인의 분해는 양성이고, 하이드로겐 설파이드(hydrogen sulfide)는 생성하지만 인돌(indole)은 생성하지 않으며; 최적 성장 온도는 30℃이고 최적 pH 값은 7.0이다.
균주 NJL-14는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 속하며, 2009년 7월 10일에 중국 일반 미생물 보존센터에 의하여 보존되었다. 그것의 보존 번호는 CGMCC No.3174이다. 그것의 주요 생물학적 특성은: 그람 양성이고; 세포들은 막대 모양이며; 포자낭은 명백하게 팽창되어 있지 않고; 포자들은 둥글거나 원통형이며, 그것은 세포 중심(central spore) 또는 세포 중심에 근접하게 형성되며; 콜로니 표면은 거칠고, 납작하며 불규칙적이고; 조건적(facultative) 호기성 조건하에서 자라며; 카탈라아제에는 양성이고; V.P. 반응은 양성이며; 메틸 레드 테스트에는 양성이고; 글루코오스, 수크로오스, 프룩토오스, 말토오스 및 소르비톨의 발효는 산을 생성하지만, 가스는 생성하지 않고; 질소 환원 효소는 양성이며; 녹말 가수분해는 양성이고; 글루틴 가수분해는 양성이며; 카제인 분해는 양성이고, 하이드로겐 설파이드 또는 인돌은 생성하지 않고; 최적 성장 온도는 30℃이고 최적 pH 값은 7.0이다.
상기 언급한 길항 세균으로부터 생성되는 연작 담배의 풋마름병을 예방하고 제거하기 위한 미생물 유기질 비료는 비료 내에 각각의 길항세균 NJL-25 및 NJL-14 1 x 1010cfu/g 이상, 총 질소 4~5 중량%(총 질소의 90%(중량) 이상은 유기 질소), 총 질소-인-칼륨 영양소 6~10 중량% 및 유기 물질 30~35 중량%를 포함하는 것을 특징으로 한다.
연작 담배의 풋마름병을 예방하고 제거하는 미생물 유기질 비료는 하기의 방법에 의하여 생산된다:
1) 하기의 조건 하에서 액상 발효 생산을 수행하기 위하여, 균주 NJL-25 및 균주 NJL-14를 각각 감자-덱스트로오스-아가(potato-dextrose-agar; PDA) 배지에서 배양하였다: pH 값의 초기 범위 7.0-7.2, 배양 온도 30℃, 용존산소(dissolved oxygen; DO): 환기 범위 30~100%, 170rpm, 포자가 발효 중간 및 마지막 단계에서 형성됨, 발효된 길항 용액(antagonist liquor)에서 세균 및 포자의 양 ≥1 x 1010cfu/mL, 사용된 PDA 배지의 제조 방법(예를 들어, 1L의 배양 배지의 제조)은 하기와 같음: 200g의 껍질을 벗기지 않은 감자를 작은 입방체로 자르고, 끓는 물에 넣고 30분간 끓이고 혼합물을 여과한 후, 여과물 안으로 20g의 상용 수크로오스를 첨가하여 부피를 1000mL로 맞추고, pH 값을 7.2-7.4로 조정한 후 20분간 121℃에서 상기 용액을 멸균하였다.
2) 고형 발효를 수행하기 위하여, NJL-25 및 NJL-14 액상 미생물 제제를 각각 성숙한 돼지의 배설물 퇴비 및 50L/t.의 양으로 유채씨 깻묵(rapeseed meal)의 미생물 효소 가수분해로부터 얻은 혼합물에서 배양하였다. 발효 온도는 30-50℃이다. 발효하는 동안, 상기 물질을 하루에 한 번 뒤집어주었다. 길항세균의 함량을1 x 108cfu/g 이상으로 확보하기 위하여 5-7일에 발효를 완료하였다. 마지막으로, 길항세균 NJL-25 및 NJL-14의 고형 미생물 제제를 얻었다; 성숙한 돼지 배설물 퇴비의 발아지수(germination index)는 98%이상이고, 유기 물질의 함량은 ≥35%이며, 유기 질소의 함량은 1.2-2%이고, 물의 함량은 25-30%이다.
3) 두가지 타입 - 퇴비 및 유채씨 깻묵의 미생물 분해로부터 얻은 혼합물에 의한, 퇴비의 혼합된 고형 미생물 제제 및 유채씨 깻묵의 미생물 분해로부터 얻은 혼합물의 혼합된 고형 미생물 제제를 얻기 위하여, 길항세균 NJL-25 고형 미생물 제제 및 길항세균 NJL-14 고형 미생물 제제를 1:1의 부피비로 혼합하였다.
4) 퇴비로부터 만들어진 혼합된 고형 미생물 제제(50-70% v/v) 및 유채씨 깻묵의 미생물 효소 가수분해로부터 얻은 혼합물로부터 만들어진 혼합된 고형 미생물 제제(30-50% v/v)를 완전하게 혼합하였다. 상기 언급한 혼합물을 2-3일간 숙성시켰다. 숙성시키는 동안 2번 뒤집어 주었다. 마지막으로, 미생물 유기질 비료를 그것의 물의 함량이 30% 보다 적어질 때까지 60℃를 넘지 않는 온도에서 증발시켰다. 패키징한 후, 연작 담배의 풋마름병을 예방하고 제거하는 미생물 유기질 비료를 얻었다.
상기 미생물 유기질 비료는 연작 담배의 풋마름병을 예방하고 제거하는데 독점적으로 사용될 수 있다.
실시예
(Ⅰ) 균주 제조 및 확인
연작 장애와 풋마름병의 심각한 증상을 가지는 식물 뿐만 아니라 주변 토양의 샘플을 수집하고, 저온에 보관하였다. 병원체 - 랄스토니아 솔라나세아룸(ralstonia solanacearum)을 분리하기 위하여, 켈만의 TTC 아가 선별 배양 배지(Kelman's TTC Agar selective culture medium)를 채택하였다. 그 후, 시들음병(wilt)의 병원균을 지표(indicator)로 사용하였고, 길항세균을 풋마름병으로 고생하는 담배의 연작을 위한 필드에서의 건강한 담배 식물의 근권 토양(rhizosphere soil)으로부터 분리하였다. 마지막으로, 포트 실험과 필드 실험을 통하여, 고성능 길항세균 NJL-25 및 NJL-14를 2차 선별에 의하여 얻었다. 상기 균주들을 확인하였다. 그것들을 -70℃에서 30% 글리세린에 저장하였다. 길항세균 NJL-25의 억제환의 지름은 24mm였고, NJL-14의 억제환의 지름은 29mm였다(도 1).
균주 NLJ-25는 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis)에 속한다. 그것의 주요 생물학적 특성은: 그람 양성(gram-positive)이고; 세포들은 막대 모양이며; 팽창된 포자낭은 타원형의 포자를 포함하고; 콜로니들은 매끈하고 엄격한 호기성 조건 하에서 자라며; 카탈라아제(catalase)는 음성이고; V.P. 반응은 음성이며; 메틸 레드 테스트는 음성이고; 수크로오스, 프룩토오스, 만니톨 및 소르비톨의 발효는 산을 생성하지만 가스는 생성하지 않으며; 질소 환원 효소(nitrate reductase)에는 음성이고; 녹말 가수분해(starch hydrolysis)는 음성이며; 글루틴 가수분해(glutin hydrolysis)는 양성이고; 카제인의 분해는 양성이고, 하이드로겐 설파이드(hydrogen sulfide)는 생성하지만 인돌(indole)은 생성하지 않으며; 최적 성장 온도는 30℃이고 최적 pH 값은 7.0이다.
균주 NJL-14는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 속한다. 그것의 주요 생물학적 특성은: 그람 양성이고; 세포들은 막대 모양이며; 포자낭은 명백하게 팽창되어 있지 않고; 포자들은 둥글거나 원통형이며, 그것은 세포 중심(central spore) 또는 세포 중심에 근접하게 형성되며; 콜로니 표면은 거칠고, 납작하며 불규칙적이고; 조건적(facultative) 호기성 조건하에서 자라며; 카탈라아제에는 양성이고; V.P. 반응은 양성이며; 메틸 레드 테스트에는 양성이고; 글루코오스, 수크로오스, 프룩토오스, 말토오스 및 소르비톨의 발효는 산을 생성하지만, 가스는 생성하지 않고; 질소 환원 효소는 양성이며; 녹말 가수분해는 양성이고; 글루틴 가수분해는 양성이며; 카제인 분해는 양성이고, 하이드로겐 설파이드 또는 인돌은 생성하지 않고; 최적 성장 온도는 30℃이고 최적 pH 값은 7.0이다.
(Ⅱ) 세균 제조물의 제조
1) 하기의 조건하에서 액상 발효 생산을 수행하기 위하여, 균주 NJL-25 및 NJL-14를 각각 PDA 배지에서 배양하였다: 초기 pH 범위 7.0-7.2, 배양 온도 30℃, 용존산소(dissolved oxygen; DO): 환기 범위 30~100%, 170rpm, 포자가 발효 중간 및 마지막 단계에서 형성됨, 발효된 길항 용액(antagonist liquor)에서 세균 및 포자의 양 ≥1 x 1010cfu/mL,
사용된 PDA 배지의 제조 방법(예를 들어, 1L의 배양 배지의 제조)은 하기와 같음: 200g의 껍질을 벗기지 않은 감자를 작은 입방체로 자르고, 끓는 물에 넣고 30분간 끓이고 혼합물을 여과한 후, 여과물 안으로 20g의 상용 수크로오스를 첨가하여 부피를 1000mL로 맞추고, pH 값을 7.2-7.4로 조정한 후 20분간 121℃에서 상기 용액을 멸균하였다.
2) 고형 발효를 수행하기 위하여, NJL-25 및 NJL-14 액상 미생물 제제를 각각 성숙한 돼지의 배설물 퇴비 및 50L/t.의 양으로 유채씨 깻묵(rapeseed meal)의 미생물 효소 가수분해로부터 얻은 혼합물에서 배양하였다. 고형 발효의 온도를 30-50℃로 유지하기 위하여, 발효하는 동안 상기 물질을 하루에 한 번 뒤집어주었다. 길항세균의 함량을1 x 108cfu/g 이상으로 확보하기 위하여 5-7일에 발효를 완료하였다. 마지막으로, 길항세균 NJL-25 및 NJL-14의 고형 미생물 제제를 얻었다; 성숙한 돼지 배설물 퇴비의 발아지수(germination index)는 98%이상이고, 유기 물질의 함량은 ≥35 중량%이며, 유기 질소의 함량은 1.2-2 중량%이고, 물의 함량은 25-30 중량%이다.
유채씨 깻묵의 미생물 분해로부터 얻은 혼합물은 하기의 방법에 의하여 생산된다(공중에 의하여 공지되고 사용됨, 중국 발명 특허 ZL200610086126.0("a biological preparation method of amino acids for agricultural use and their fertilizer product")를 참조): 가공하지 않은 유채씨 깻묵 내로 균주 37-1의 발효액을 첨가하고, 물의 함량을 55-65% 및 pH 값을 6.0-7.5로 조정하고, 개방형 고형 발효(oepn solid fermentation)를 수행하고, 발효 온도가 50℃로 올라가면 한번 뒤집고, 그때부터 매일 뒤집어 5일 동안 온도를 35-50℃로 유지하였다. 고형 발효 시작 후, 물질의 pH 값은 계속 올라갈 것이다. 뒤집을 때마다 물의 함량과 pH 값을 조정하기 위하여 산성 용액이 첨가되어야 하며, 물의 함량은 55-65% 및 pH값은 6.0-7.0으로 유지한다. 발효가 종료될 때, 물질의 pH 값이 약 5.0이 될 때까지 산성 용액을 다시 뿌려주어야 할 것이다. 그 후, 상기 물질을 저온에서 건조시키거나 자연건조시킨다. 최종 생성물은 유채씨 깻묵의 미생물 분해로부터 얻은 혼합물이다(아미노산을 포함하는 혼합물).
3) 두가지 타입 - 퇴비 및 유채씨 깻묵의 미생물 분해로부터 얻은 혼합물에 의한, 퇴비의 혼합된 고형 미생물 제제 및 유채씨 깻묵의 미생물 분해로부터 얻은 혼합물의 혼합된 고형 미생물 제제를 얻기 위하여, 길항세균 NJL-25 고형 미생물 제제 및 길항세균 NJL-14 고형 미생물 제제를 1:1의 부피비로 혼합하였다.
4) 개개의 - 퇴비(70% v/v)의 세균성 또는 혼합된 세균성 고형 미생물 제제 및 유채씨 깻묵(30% v/v)의 미생물 효소 가수분해로부터 얻은 혼합물의 혼합된 고형 미생물 제제를 완전히 혼합하였다. 상기 혼합물을 2-3일간 숙성시켰다. 숙성시키는 동안, 두 번 뒤집어 주었다. 마지막으로, 상기 미생물 유기질 비료를 그것의 물 함량이 30%를 넘지 않도록 60℃ 이상이 아닌 온도에서 증발시켰다. 연작 담배의 풋마름병을 예방하고 제거하는 개개의- (각각 균주 NJL-25 및 NJL-14를 포함하는) 세균성 미생물 유기질 비료 및 혼합된 미생물 유기질 비료를 얻을 것이다.
상기 길항세균으로부터 생산된 혼합된 미생물 유기질 비료에서(상기 미생물 유기질 비료는 연작 담배의 풋마름병을 예방하고 제거하는데 독점적으로 사용된다), 각각 길항세균 NJL-25 및 NJL-14의 함량은 1 x 1010cfu/g 이상이고, 전체 질소의 함량은 4-5 중량%이고, 상기 전체 질소의 90% 이상은 유기 질소이며, 전체 질소-인-칼륨 영양소는 6-10 중량%이고, 유기 물질은 30-35 중량%이다.
(Ⅲ) 그린하우스 포트 실험
실험용 토양은 심각한 풋마름병을 가지는 담배 연작을 위한 토양이다. 채택된 담배 종자는 담배 풋마름병에 민감한 "Yun Yun 97"이다. 처리는 다음과 같다:
CK1 : 건강한 벼 토양; CK2 : 담배 연작을 위한 토양; T1 : CK2 + 아미노산 유기질 비료; T2 : CK2 + NJL-25 발효액; T3 : CK2 + NJL-14 발효액; T4 : CK2 + NJL-14 및 NJL-25 발효액의 혼합물(1:1); T5 : CK2 + NJL-25 미생물 유기질 비료; T6 : CK2 + NJL-14 미생물 유기질 비료; T7 : CK2 + NJL-14 및 NJL-25가 혼합된 미생물 유기질 비료
각각의 처리를 4번 반복하였다. 각각의 반복은 포트 당 23kg의 병든 토양을 사용한다. 토양에서의 길항세균의 농도를 건조 토양의 108cfu/g에 도달하도록 길항세균을 배양하였다. T5-T7에서, 각 포트에 115g의 미생물 유기질 비료를 사용하였다. 비옥성(fertility)의 차이점을 만드는 데 화학 비료를 사용하였다. 담배 묘목을 이식하기 전에, 30분간 세균 현탁액에 담가두었다. 질병율을 배양 후 10일째에 기록하였다. 25일 후, CK2의 질병율은 100%인 반면, 길항세균액 또는 미생물 유기질 비료의 배양은 풋마름병의 질병율을 효과적으로 감소시킬 수 있다. NJL14 및 NJL-25로부터 생산된 혼합된 미생물 유기질 비료는 0%의 질병율을 가지는 가장 우수한 예방 및 치유 효과를 가진다(도 2).
길항세균의 사용은 담배 풋마름병을 예방하고 치유하고, 토양에서의 랄스토니아 솔라나세아룸의 양을 크게 감소시키고, 담배의 근권에서 미생물총의 변화를 촉진하고, 유익한 세균총을 현저하게 증가시키고, 유해한 진균 및 병원총을 현저하게 감소시킬 뿐만 아니라(표 1), 담배의 바이오매스를 현저하게 증가시킬 수 있다(표 2). 길항세균의 사용, 특히 미생물 유기질 비료의 사용은 바이오매스의 측면에서 CK1 및 CK2로부터 현저한 차이를 보여준다. 미생물 유기질 비료는 액상 세균 제조물보다 더욱 나은 생물학적 방제 효과를 가진다(바이오매스는 1.65배 증가됨).
길항세균을 사용한 후, 담배의 계통적 질병(systematic disease)에 대한 내성이 어느 정도 강화될 뿐만 아니라 관련 효소의 활성 또한 현저하게 올라간다. 길항세균의 첨가는 담배 식물의 계통적 내성의 생성을 야기할 것이다.
(Ⅳ) 필드 실험
2009년도 보지앙 빌리지(Bojian Village), 후앙두 타운쉽(Huangdu Township), 쉬안청 시티(Xuancheng City), 안후이 프로방스(Anhui Province)에서, 담배 풋마름병에 의해 심각하게 공격당한 필드에 미생물 유기질 비료를 사용하였다.
필드 실험의 처리: 1. 담배에 대한 국부적 복합 비료(compound fertilizer)를 사용한다; 2. NJL-14 및 NJL-25로부터 생산된 혼합된 미생물 유기질 비료를 사용한다. 심각한 담배 풋마름병으로 고통받는 필드를 4의 재현(repetition)으로 랜덤하게 배열하였다. 각각의 재현은 2번 처리하였다. 총 8개의 플롯(plots)이 있다. 담배의 종류는 지방 특산 종류인 "Yun Yun 97"이다. 담배 묘목 및 비료 모두 홀 적용(hole application)을 채용한다. 생-유기질 비료의 용량은 30kg/mu이다. 화학 비료는 처리 1 및 처리 2 간의 비옥성 차이를 만들기 위하여 사용하였다.
규칙적으로 필드로부터 데이터를 수집하였다. 질병율, 질병 지수(disease index) 및 미생물총 상의 통계를 수행하였다. 최종 수확 후, 서로 다른 처치 사이에서의 바이오매스의 차이를 계산하였다. 혼합된 길항세균을 사용한 미생물 유기질 비료의 사용은 풋마름병의 발생을 현저하게 감소시킬 수 있고, 97.6% 이상의 방제율을 달성할 수 있을 뿐만 아니라 담배 잎의 수확 또한 2.27배 증가하였다(표 4).
본 발명은 미생물총으로부터 시작하였으며, (안후이에서의 필드 실험에서) 연작 담배의 풋마름병의 발생을 현저하게 제거할 수 있고, 97.6% 이상의 방제율을 달성할 수 있는 미생물 유기질 비료 제품을 개발하였다. 비료 제품의 메카니즘은 기능성 세균 및 비료 제품에 의해 제공되는 그것들의 활성 탄소 및 질소원이 연작 장애를 가지는 토양에서 유익한 미생물총의 배양을 위한 매우 우수한 조건을 제공하며, 토양이 외생적인 기능성 세균성 유기체의 생태 및 먹이사슬을 빠르게 회복하고 확립할 수 있게하고; 다른 한편으로는, 상기 비료 제품은 높은 함량의 유기 질소 및 유기 인을 가진다. 이들 영양 물질들은 연작 장애를 가지는 토양에서 작물의 성정에 유익하며, 담배 묘목의 지속율(seedling standing rate) 및 내성을 크게 향상시킨다.
< 서로 다른 처리하에서 화분에 심은 담배의 뿌리 표면상의 미생물 함량간의 차이 >
< 서로 다른 처리하에서 화분에 심은 담배의 생중량(fresh weight) 및 건조중량(dry weight)간의 차이 >
< 서로 다른 처리하에서 지상 부분에서의 계통적 내성 효소 및 2차 대사산물 관련 효소의 변화 >
< 안후이에서의 필드 실험의 효과 >
주 : 질병 예방율 = 100 x (대조군의 질병 지수 - 처리군의 질병 지수) / 대조군의 질병 지수
담배 질병의 분류를 위한 산업 코드 : 레벨 0 : 전체 식물이 질병에 걸리지 않음. 레벨 1 : 줄기상에 드문드문 백색 반점(chlorotic spots) 또는 줄기에 줄무늬가 있는 측면상의 소수의 엽층(laminae). 레벨 2 : 줄기상에 검은 줄무늬가 나타나지만, 상부 또는 감염된 측면 줄기상의 엽층의 반 이상에서는 발생하지 않음. 레벨 3 : 레벨 4 : 감염된 식물은 일반적으로 죽음.
Claims (7)
- 균주 NJL-25 및 균주 NJL-14를 포함하고, 여기에서
균주 NLJ-25는 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis)에 속하고, 2009년 7월 9일에 중국 일반 미생물 보존센터(China General Microbial Culture Collection Center; CGMCC)에 의하여 보존되었다. 그것의 보존 번호(culture collection number)는 CGMCC No. 3175이다. 그것의 주요 생물학적 특성은: 그람 양성(gram-positive)이고; 세포들은 막대 모양이며; 팽창된 포자낭은 타원형의 포자를 포함하고; 콜로니들은 매끈하고 엄격한 호기성 조건 하에서 자라며; 카탈라아제(catalase)에는 음성이고; V.P. 반응은 음성이며; 메틸 레드 테스트는 음성이고; 수크로오스, 프룩토오스, 만니톨 및 소르비톨의 발효는 산을 생성하지만 가스는 생성되지 않으며; 질소 환원 효소(nitrate reductase)에는 음성이고; 녹말 가수분해(starch hydrolysis)는 음성이며; 글루틴 가수분해(glutin hydrolysis)는 양성이고; 카제인의 분해는 양성이고, 하이드로겐 설파이드(hydrogen sulfide)는 생성하지만 인돌(indole)은 생성하지 않으며; 최적 성장 온도는 30℃이고 최적 pH 값은 7.0이고,
균주 NJL-14는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 속하며, 2009년 7월 10일에 중국 일반 미생물 보존센터에 의하여 보존되었다. 그것의 보존 번호는 CGMCC No.3174이다. 그것의 주요 생물학적 특성은: 그람 양성이고; 세포들은 막대 모양이며; 포자낭은 명백하게 팽창되어 있지 않고; 포자들은 둥글거나 원통형이며, 그것은 세포 중심(central spore) 또는 세포 중심에 근접하게 형성되며; 콜로니 표면은 거칠고, 납작하며 불규칙적이고; 조건적(facultative) 호기성 조건하에서 자라며; 카탈라아제에는 양성이고; V.P. 반응은 양성이며; 메틸 레드 테스트에는 양성이고; 글루코오스, 수크로오스, 프룩토오스, 말토오스 및 소르비톨의 발효는 산을 생성하지만, 가스는 생성하지 않고; 질소 환원 효소는 양성이며; 녹말 가수분해는 양성이고; 글루틴 가수분해는 양성이며; 카제인 분해는 양성이고, 하이드로겐 설파이드 또는 인돌은 생성하지 않고; 최적 성장 온도는 30℃이고 최적 pH 값은 7.0인,
연작 담배의 풋마름병(bacterial wilt)을 예방하고 제거하는데 사용되는 길항세균(antagonistic bacteria). - 제1항에 따른 연작 담배의 풋마름병을 예방하고 제거하는 길항세균으로부터 생산된 미생물 유기질 비료.
- 제2항에 있어서,
상기 미생물 유기질 비료에서 각각의 길항세균 NJL-25 및 NJL-14의 함량은 1 x 1010cfu/g 이상이고, 전체 질소의 함량은 4~5 중량%이고, 전체 질소의 90 중량% 이상은 유기 질소이고, 전체 질소-인-칼륨 영양소의 함량은 6~10 중량%이며, 유기 물질의 함량은 30~35 중량%인 것을 특징으로 하는 미생물 유기질 비료. - 제2항 또는 제3항에 있어서,
상기 미생물 유기질 비료는 연작 담배의 풋마름병을 방제하며, 하기의 방법
1) 하기의 조건 하에서 액상 발효 생산을 수행하기 위하여, 제1항에 따른 균주 NJL-25/NJL-14를 PDA 배지에서 배양하였다: pH 값의 초기 범위 7.0-7.2, 배양 온도 30℃, 용존산소(dissolved oxygen; DO): 환기 범위 30~100%, 170rpm, 포자가 발효 중간 및 마지막 단계에서 형성되고, 발효된 길항 용액(antagonist liquor)에서 세균 및 포자의 양 ≥1 x 1010cfu/mL이며,
2) 고형 발효를 수행하기 위하여, NJL-25 및 NJL-14 액상 미생물 제제를 각각 성숙한 돼지의 배설물 퇴비 및 50L/t.의 양으로 유채씨 깻묵(rapeseed meal)의 미생물 효소 가수분해로부터 얻은 혼합물에서 배양하였다. 발효 온도는 30-50℃이다. 발효하는 동안, 상기 물질을 하루에 한 번 뒤집어주었다. 길항세균의 함량을1 x 108cfu/g 이상으로 확보하기 위하여 5-7일에 발효를 완료하였다. 마지막으로, 길항세균 NJL-25 및 NJL-14의 고형 미생물 제제를 얻고;
3) 두가지 타입 - 퇴비 및 유채씨 깻묵의 미생물 분해로부터 얻은 혼합물에 의한, 퇴비의 혼합된 고형 미생물 제제 및 유채씨 깻묵의 미생물 분해로부터 얻은 혼합물의 혼합된 고형 미생물 제제를 얻기 위하여, 길항세균 NJL-25 고형 미생물 제제 및 길항세균 NJL-14 고형 미생물 제제를 1:1의 부피비로 혼합하고;
4) 퇴비의 혼합된 고형 미생물 제제(50-70% v/v) 및 유채씨 깻묵의 미생물 효소 가수분해로부터 얻은 혼합물의 혼합된 고형 미생물 제제(30-50% v/v)를 완전하게 혼합하였다. 상기 언급한 혼합물을 2-3일간 숙성시켰다. 숙성시키는 동안 2번 뒤집어 주었다. 마지막으로, 미생물 유기질 비료를 그것의 물의 함량이 30% 보다 적어질 때까지 60℃를 넘지 않는 온도에서 증발시켰다. 패키징한 후, 연작 담배의 풋마름병을 예방하고 제거하는 미생물 유기질 비료를 얻는 것;
에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 미생물 유기질 비료. - 제4항에 따른 미생물 유기질 비료의 생산방법.
여기에서, 단계 (1)에서 사용된 PDA 배지는 하기의 방법(예를 들어, 1L의 배양 배지의 제조)에 의하여 제조된다; 200g의 껍질을 벗기지 않은 감자를 작은 입방체로 자르고, 끓는 물에 넣고 30분간 끓이고 혼합물을 여과한 후, 여과물 안으로 20g의 상용 수크로오스를 첨가하여 부피를 1000mL로 맞추고, pH 값을 7.2-7.4로 조정한 후 20분간 121℃에서 상기 용액을 멸균하였다. - 제4항 또는 제5항에 따른 미생물 유기질 비료의 생산방법.
여기에서, 단계 (2)에서 사용된 성숙한 돼지 배설물은 퇴비의 발아지수(germination index)가 98%이상이고, 유기 물질의 함량은 ≥35 중량%이며, 유기 질소의 함량은 1.2-2 중량%이고, 물의 함량은 25-30 중량%이다. - 제2항에 따른 미생물 유기질 비료의 사용.
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