CN1236051C - 一种哈茨木霉真菌菌株 - Google Patents

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Abstract

一种哈茨木霉真菌菌株，属于微生物技术领域，将其命名为哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株B，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2003年6月18日，保藏号：CGMCC No.0955，属于半知菌亚门(Deuteromycotina)，丝孢纲(Hyphomycetidae)，丝孢目(Hyphomycetales)，淡色孢科(Moniliaceae)。本发明的哈茨木霉真菌菌株产孢量多、高效且具有广谱植物病害生防能力、能促进植物生长并适于工业化生产。

Description

一种哈茨木霉真菌菌株
技术领域
本发明属于微生物技术领域，主要是一种具有广谱抑制植物病害及促进植物生长的哈茨木霉真菌菌株。
背景技术
在发展持续农业呼声越来越高，对绿色产品需求日愈加大的今天，化学农药由于其药效时间短、易造成环境污染及在植物上的残留等，逐渐被减少使用。为此，很多人都在致力于研究不利用化学方法、不会造成污染的植物生防技术。随着生物防治技术的日趋成熟，木霉菌作为一类资源丰富的拮抗微生物，在植物病害生防中具有越来越重要的作用。木霉菌是一类分布范围极为广泛、具有对土传植物病原真菌有抑制作用的真菌，由于其通过寄生作用、拮抗作用明显，且适应性广，已有许多菌株及剂型被正式商业注册登记。然而，正是因为菌株来源广泛，导致其在使用中应用条件要求严格，各个菌株有自己特有的作用范围，也就是说它们防治病害的效果具有明显的生态依赖性，即依大气环境条件(包括温度、湿度、雨日、雨量、大气压、光照、紫外线强度等)、作物对象(包括作物种类、罹病部位、发育阶段、生长姿势、外泌性物质组成、作物体表或体内其他微生物种类等)、土壤条件(包括温度、湿度、理化性质、有机质含量、其他生物种群结构等)的不同，防病效果差异很大。现有的木霉菌株，产孢量较小，高效、稳定且适合工厂化生产的菌株不多，而且每一种菌株一般只能用于少数几种植物病菌的抑制，使用范围非常有限。
发明内容
本发明的目的正是为了克服上述现有技术的不足而提供一种产孢量多、高效且具有广谱植物病害生防能力、能促进植物生长和适于工业化生产的哈茨木霉真菌菌株。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
本发明的哈茨木霉真菌菌株命名为哈茨木霉(Trichoderma harzianumRifai)菌株B，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2003年6月18日，保藏号：CGMCC No.0955，属于半知菌亚门(Deuteromycotina)，丝孢纲(Hyphomycetidae)，丝孢目(Hyphomycetales)，淡色孢科(Moniliaceae)。
附图说明
图1是本发明哈茨木霉菌株B在光学显微镜(640×)下的菌体形态照片，
图2是本发明哈茨木霉菌株B在PSA固体培养基上的形态照片。
实施例
首先从云南省昆明市呈贡县斗南大棚土壤中分离出供试的哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株B(下简称Th-B)，在PSA固体培养基上，于28℃下培养该真菌菌株，可观察到，菌株生长很快。该真菌菌株可采用两种方法培养，一种为平板法，即将菌株的分生孢子稀释成100倍显微镜视野下50-100个分生孢子，涂布在PSA平板上，置于20℃下，培养至第5天便可收获大量分生孢子；另一种为半液体半固体法，即是将分生孢子液放入PS液体培养基中，震荡培养3-4天，然后按1∶5～8比例与灭菌的米糠或麦麸混匀，覆盖以70％酒精消过毒的塑料膜，置于23-28℃的消过毒的室内培养3-4天，打开塑料膜，产孢3-5天；连同培养料收起，晾干，包装好后贮藏在冷凉处备用。在光学显微镜下观察，该真菌菌株的形态为：菌落生长速度快，气生菌丝发达，新鲜的菌丝呈白色或无色，羊绒状，菌落老熟时暗绿色，通常形成明显的突起直达培养皿的顶部；菌丝生长与产孢同时发生，产孢簇紧密，成单环，草绿色；分生孢子梗呈树状分枝，主轴比较长，二次分枝多而短，很少有再次分枝，瓶梗稍长，基部变细，中间膨大，以大角度伸出，终极瓶梗细长，无明显缢缩，3个左右轮状排列；分枝上可产生多轮的产孢瓶体，分生孢子球形，绿色，单胞，光滑，循序连续产孢，常于瓶状产孢口处聚集为孢子球。图1和图2分别为本发明哈茨木霉菌株B在光学显微镜(640×)下的菌体形态照片和在PSA固体培养基上的形态照片。
将平板法上培养的孢子按1∶500的比例与米糠或麦麸混匀施入植物的根围，或者将半液体半固体法培养的菌制剂直接施入根围，也可以1∶20比例与泥炭混合，接种体量针对不同对象和作物而异。一般1株辣椒和番茄苗接种体量0.5～1.0克，1株甜瓜接种体量约100克。
选择水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)等18个病原真菌菌株(见表1)作为指示菌株。进行平板对峙培养：将木霉菌株和18个指示菌株用打孔器打成直径0.60cm的菌丝饼，同时接入9cm的加有PSA的培养皿内，两者相距4.5cm，以不接木霉为对照。将培养皿置于常温下，培养100h和168h后，测定木霉和指示菌的菌落直径，每处理设2组重复。抑菌率的计算式为：
抑菌率(％)＝[(对照平均直径-处理平均直径)/对照平均直径]×100％
表1列出了对峙培养后第100h和168h测量的结果。从表1可看出，木霉菌株对供试的指示菌的抑制效果均是随着时间的推移，逐渐提高。从对18种植物病原菌的抑制作用来看，Th-B在100h时的平均抑制作用达58.31％；在168h时，它的抑制效果平均达89.99％。在168h时，完全抑制生长的病菌菌株数达10个，占55.56％。
表1：木霉菌株对指示真菌的生长抑制率(％)(抑菌率)
  菌株            Th-B
  100h   168h
  棉花炭疽病菌棉花枯萎病菌棉花立枯病菌   100.022.672.4   100.043.7100.0
  棉花红腐病菌小麦根腐病菌小麦雪腐病菌油菜菌核病菌枝孢菌稻瘟病菌水稻纹枯病菌稻恶苗病菌稻球小菌核病菌辣椒早疫病菌辣椒炭疽病菌黄瓜炭疽病菌黄瓜腐霉病菌苹果斑点病菌灰霉病菌   48.032.233.047.554.9100.073.84.8100.081.433.063.680.241.860.3   100.046.282.680.8100.0100.0100.0100.0100.0100.066.5100.0100.0100.0100.0
实验一：对辣椒灰霉的预防与治疗作用：依对峙培养拮抗试验和生长速度及产孢能力测定的结果，将菌株Th-B做防治辣椒灰霉病试验。结果表明(见表2)，Th-B对灰霉病的预防效果好于治疗效果。无论是治疗试验还是预防试验，木霉菌株处理的辣椒苗的叶片与未加入木霉处理的辣椒苗叶片相比，前者更为浓绿、生长势强、秧苗略高一些，而后者淡绿、色浅、生长势稍弱。
表2：Th-B和LTR-2对辣椒灰霉病的防冶效果
  处理   发病率(％)   防冶效果(％)
  CKTh-B治疗Th-B预防   22.6713.107.89   -42.2165.20
实验二：防治甜瓜枯萎病效果：在甜瓜移栽时，将木霉菌株Th-B混合泥炭施于瓜穴中，在盛花结果期调查病株。所得结果表明，Th-B具有良好的防治效果，达到84.81％(见表3)。这高于一般的化学农药的防治效果。另外，从瓜苗的生长势来看，用了Th-B木霉菌的处理，叶片浓绿，节数也略多于对照，且开花也早于空白对照3-5天。
表3：甜瓜枯萎病防治效果
处理          病株数/总株数 总株数 发病株 发病率％ 防效％
  I   II   III
  Th-BCK   1/4010/40   2/4012/35   2/409/38   120113   531   4.1727.43   84.81
实验三：对小麦纹枯病和棉花立枯病的防治效果：Th-B对小麦纹枯病的防效较为明显。经Th-B防治后，小麦纹枯病的病株率与病情指数分别比对照下降了48.75％和39.68％，防治效果达到了68.64％。Th-B对棉花立枯病的防效与其对小麦纹枯病的防效相当。经Th-B防治后，棉花立枯病的病株率与病情指数分别比对照下降了35.00％和67.71％，防治效果达到了68.42％。此外，Th-B还能提高棉花和小麦的生物学产量。在防治棉花立枯病的实验中生物量增加的幅度达9.51％，在防治小麦纹枯病时，小麦生物量增加25.66％(见表4)
表4：生防菌株Th-B对不同病害的防治及增加生物量效果
  生防菌株   病原菌   病株率％   病情指数％   防效％  植株干重(g)   增重％
  CKTh-BCKTh-B   小麦纹枯病小麦纹枯病棉花立枯病棉花立枯病   83.7535.00100.0065.00   57.8118.1398.9631.25 68.6468.42   1.061.333.173.47 25.669.51
实验四：防治辣椒疫病效果：将土壤分高温灭菌和不灭菌处理，分别接种培养好的辣椒疫病菌，设不用Th-B和农药甲霜锰锌粉剂为对照，以Th-B做为处理，用于防治辣椒疫病处理；设不用Th-B为空白对照，以Th-B做为处理，用于防治辣椒立枯病处理。Th-B用量为每株0.3克产品(自行生产)。在用药后的两个月内的调查结果表明(见表5)，Th-B防治辣椒疫病效果在灭菌条件下达66.21％，在自然土条件下达57.18％，而用药处理显著低于木霉菌处理。
表5：Th-B防治辣椒疫病效果
  土壤处理   制剂   发病率(％)   防效(％)
  灭菌土自然土   木霉甲霜锰锌粉剂木霉甲霜锰锌粉剂   23.8333.1729.3342.87   66.2152.9657.1837.42
实验五：促进辣椒和番茄生长的作用：Th-B不仅对辣椒常见病害疫病和有较好的防治效果，而且还能显著地促进辣椒和番茄的生长，提高它们的生物量。用不加接种的温室土壤，分高温灭菌和不加灭菌处理，设不加木霉菌为空白对照，设加木霉菌为促生长处理，木霉的用量为每株加0.3克，在播种前先于种子播到土壤内，在播种后20天，拔起各处理植株，测量株高和最大一片叶片面积、称其鲜重、在烘箱中烘至植株接近恒重时称其干重，重复了10次。所得结果表明(见表6)，Th-B有明显地促进辣椒和番茄的生长及提高生物学产量的作用。在自然土条件下，它可以提高辣椒和番茄的鲜重量达30％左右，干重的34.09％和44.34％，植株高度也提高了20％以上。
表6：Th-B促进辣椒与番茄生物量增产百分率(％)
  全株鲜重*   全株干重   株高   最大叶面积
  辣椒   番茄   辣椒   番茄   辣椒   番茄   辣椒   番茄
  灭菌土木霉自然土木霉   38.9631.14   19.7829.35   36.9134.09   43.6944.34   19.6420.77   16.5221.11   59.3475.18   24.1740.82
生长速度和产孢能力：在基质上的生长速度和产孢能力是判断一个良好的生防菌株的两项标准。经试验结果比较(见表7)，Th-B的生长速度和现有的木霉菌株(以国家已注册的木霉菌株LTR-2为例)基本相同，但产孢量多30％以上。
           表7：2个木霉菌株菌落直径和产孢量
 菌株   生长速度(cm)   产孢量(个/640倍视野)
  45h   68h   89h   89h   113h   162h
 Th-BLTR-2   4.634.48   7.887.77   8.638.77   4318   6958   8061
实验证明，本发明的哈茨木霉菌株B(Th-B)能有效地抑制棉花炭疽病菌、棉花立枯病菌、棉花红腐病菌、稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、稻恶苗病菌、稻球小菌核病菌、辣椒早疫病菌、黄瓜炭疽病菌、黄瓜腐霉病菌、苹果斑点病菌、灰霉病菌、枝孢菌的生长，亦对小麦雪腐病菌、油菜菌核病菌和辣椒炭疽病菌有较好的抑制作用。田间试验对西瓜枯萎病防治效果高达84.81％。盆栽试验对辣椒灰霉病和疫病的防治效果分别达65.20％和66.21％，对小麦纹枯病和棉花立枯病防治效果分别达68.64％和68.42％。此外，该菌株还能显著促进植物生长，增加生物学产量。它在自然土条件下施用，能提高辣椒和番茄植株鲜重的31.14％和29.35％，提高植株干重的34.09％和44.34％，能提高小麦和棉花植株干重的25.66％和9.51％。菌株生长速度快，在马铃薯培养基上菌落直径可日长2.3厘米，产孢量比现有的木霉菌多30％。该菌株是一株具有广谱植物病害生防潜力、促进植物生长和适于工业化生产的优良菌株。
值得提出的是，Th-B是一种来自土壤的真菌，将它生产成制剂后，再施入到土壤中则没有环境污染的问题，能生产出绿色产品，符合农业持续发展的需要。

Claims (1)

1、一种哈茨木霉真菌菌株，其特征在于，命名为哈茨木霉(Trichodermaharzianum Rifai)菌株B，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2003年6月18日，保藏号：CGMCC No.0955，属于半知菌亚门(Deuteromycotina)，丝孢纲(Hyphomycetidae)，丝孢目(Hyphomycetales)，淡色孢科(Moniliaceae)。
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