CN109020727B - 一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料及其制备方法，集成现代抑菌活性物质选择和混菌微生物发酵技术，通过微生物的协同作用发酵畜禽粪便、秸秆、中草药原料和壳聚糖研制开发出高效、绿色的发酵生物有机肥料。该生物有机肥料能够高效抑制不同种植工艺条件下的芦笋茎枯病发病，改变了现有技术中预防芦笋茎枯病以化学菌剂或改变苦笋生长条件的弊端，降低了芦笋种植过程中药残，应用范围广，并具有显著的增产功效，可显著提高芦笋的食品安全和种植效益。实验结果表明本申请生物有机肥料对芦笋茎枯病的预防效果达到80％以上。

Description

一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料及其制备方法，尤其是一种利用多种益生菌协同发酵畜禽粪便、秸秆、中草药等原料制备具有显著预防芦笋茎枯病和增产功效的生物有机肥料的方法，属于生物工程领域。
背景技术
芦笋(学名：Asparagus officinalis)又名石刁柏，为天门冬科天门冬属(芦笋属)多年生草本植物，嫩苗可供蔬食，在国际市场上有“蔬菜之王”的美称。芦笋营养价值高，能润肺、镇咳、祛痰，且具有抑制肿瘤生长等功能，深受人们的喜爱。近年来，随着芦笋栽培面积扩大，病害发生逐年加重，尤其是茎枯病的发生和危害严重影响了芦笋的产量与质量。
芦笋茎枯病的病原菌为天门冬拟茎点霉，是一种世界性分布的毁灭性病害；该病害在多雨有风的条件下传染迅速，雨水溅沾也可传染。空气传染是大面积发病的主要原因.田间蔓延的方向和发病迅速常受风的影响。此外，地势低洼，土质黏重，氮肥过多等，均易加重该病发作。该病害在中国、日本、泰国、印尼等亚洲芦笋种植国家发生比较严重，尤以中国最为严重，我国芦笋生产省份均发生普遍，且南方重于北方。轻者导致芦笋生长发育不良，降低产量与品质；重者病株提前枯死，全田毁灭。
目前，芦笋茎枯病的防治主要以化学防治为主，但由于多年来大量使用化学药剂防治导致该病菌在不少地区出现了较强的抗药性而使农药的效果大打折扣。林佩力等和康业斌进行了不同农药对芦笋茎枯病菌联合作用的毒力测定；彭明生和冯晓案测定了60％盐酸多菌灵可湿性粉剂、70％甲基硫菌灵可湿性粉剂、50％苯来特可湿性粉剂、50％敌菌丹可湿性粉剂与12.5％烯唑醇可湿性粉剂等药剂的防效，但上述药剂均为使用年限较长的杀菌剂，芦笋茎枯病菌对这些杀菌剂易产生抗药性，因此寻找防治茎枯病的替代药剂尤为重要。
专利技术2017105568113公开了一种防治芦笋茎枯病、芦笋褐斑病的杀菌组合物，其主要组分为聚六亚甲基双胍盐酸盐、代森锌和甲基硫菌灵；可见该专利技术仍以化学防治为主；专利技术2013103015752公开了一种防治芦笋茎枯病的化肥及其施肥方法，其关键技术在于调整化学肥料的氮磷钾比例，使土壤保持酸性，破坏茎枯病的发病条件，属于“治标”。综上所述，现有技术中并没有公开长效、无公害防治芦笋茎枯病的组合物及其应用，对传统茎枯病防治方法的改进仍是该领域亟待解决的技术弊端。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，满足芦笋种植高效、绿色防治茎枯病，提高芦笋产量和品质的技术需求，本发明提供一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料及其制备方法，集成现代抑菌活性物质选择和混菌微生物发酵技术，研制开发出高效、绿色的发酵生物有机肥料，该生物有机肥料能够高效抑制不同种植工艺条件下的芦笋茎枯病发病，提高芦笋产品和品质，从而提高芦笋种植效益。
本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：
一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料，包括以下按重量份计的原料：畜禽粪便100～120份、秸秆40～60份、中草药原料10～20份、壳寡糖3～5份，其中所述中草药原料包括苦棟皮20～30份、石菖蒲6～9份、鱼腥草10～20份、穿心莲10～20份、淡竹叶8～12份、地耳草8～12份、功劳木4～6份、蒲公英3～5份。
优选的，一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料，包括以下按重量份计的原料：畜禽粪便110份、秸秆50份、中草药原料15份、壳寡糖4份，其中所述中草药原料包括苦棟皮25份、石菖蒲8份、鱼腥草15份、穿心莲15份、淡竹叶10份、地耳草10份、功劳木5份、蒲公英4份。
上述畜禽粪便可以是猪粪、牛粪、羊粪、鸡粪、鸭粪中的一种或几种的混合物。
上述秸秆可以是小麦秸秆、玉米秸秆、稻草中的一种或几种的混合物，粉碎后备用。
上述中草药原料通过如下步骤进行预处理：将中草药原料粉碎后加入中草药原料8～10倍的纯净水，然后加入中草药原料质量比2～3％的纤维素酶，在超声波辅助条件下酶解30～60min后备用。
上述超声波的频率为100～200kHZ。
本发明提供了一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料，其特征在于通过混菌好厌氧二步发酵工艺制得，其中一步好氧发酵菌群包括曲霉、枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌；二步厌氧发酵菌群包括地衣芽孢杆菌、嗜热乳杆菌。
上述好氧发酵菌群中曲霉、枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌的用量比为2:3:1；二步厌氧发酵菌群中地衣芽孢杆菌和嗜热乳杆菌的用量比为3:2。
上述曲霉是米曲霉、黑曲霉中的一种或两种的混合菌。
上述曲霉种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
上述枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体枯草芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
上述褐球固氮菌、地衣芽孢杆菌和嗜热乳杆菌为市售菌粉。
本发明还提供了一种预防芦笋茎枯病生物有机肥料的制备方法，其具体工艺步骤包括：
(1)配料：按照上述原料配比准确配伍原料，然后添加上述原料质量比3～5％的麸皮、1～2％纤维素酶、0.1～0.2％磷酸二氢钾、0.03％硫酸镁，调整物料的含水量40％～50％，干湿标准以用手紧握刚好能滴出水为宜；
(2)一步好氧发酵：将活化好的曲霉、枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌分别接种至培养基，总接种量为固体培养基的3～5wt％，拌匀后堆肥发酵，通风培养5～8d；
(3)二步厌氧发酵：一步好氧发酵结束后，将地衣芽孢杆菌、嗜热乳杆菌分别接种至培养基，总接种量为固体培养基的2～3wt％，拌匀后堆肥发酵，厌氧培养3～5d；
(4)干燥：二步厌氧发酵接收密封6～12h，然后进行低温通风干燥；
(5)粉碎：将干燥后的物料粉碎即得预防芦笋茎枯病的生物有机肥料。
上述一步好氧发酵通风量维持堆体氧含量在12～16％％。
本发明提供了一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料及其制备方法，所得预防芦笋茎枯病的生物有机肥料臭味全部消失，质地松软，不成团，产品中富含益生菌、水溶性有机氮等营养成分，产品中有机质含量≥60％，微生物含量≥2亿个/g；产品质量符合NY525-2011的规定，蛔虫卵死亡率和大肠杆菌群数指标符合NY884的要求，藻毒素检测量检测限(0.1μg/g)。盆栽试验结果表明本申请产品具有显著的预防茎枯病、促生长、增产、改善土壤环境等作用，是一种优良的新型生物有机肥料。
本发明提供一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料及其制备方法，与现有技术相比，具有以下显著优势：
(1)本申请通过微生物的协同作用发酵畜禽粪便、秸秆、中草药原料和壳聚糖制得生物有机肥料，产品具有显著的预防芦笋茎枯病的功效，改变了现有技术中预防芦笋茎枯病以化学菌剂或改变苦笋生长条件的弊端，降低了芦笋种植过程中药残，应用范围广，并具有显著的增产功效，可显著提高芦笋的食品安全和种植效益。实验结果表明本申请生物有机肥料对芦笋茎枯病的预防效果达到80％以上；
(2)本申请科学复配中草药原料和壳寡糖，通过中草药原料和壳寡糖的协同作用显著提升了生物有机肥料的预防芦笋茎枯病的预防效果，取得了“1+1>2”的技术效果；此外，实验结果还表明在本申请中选用的中草药原料苦棟皮、石菖蒲、鱼腥草、穿心莲、淡竹叶、地耳草、功劳木、蒲公英在相同工艺条件下单独制备生物发酵有机肥料对芦笋茎枯病几乎无预防效果，说明尽管中草药原料并无直接的预防效果，但通过中草药活性成分间的化合作用及微生物发酵转化形成了能够预防苦笋茎枯病的功能活性成分，如中草药原料不经预处理工艺直接添加到发酵物料中则对芦笋茎枯病的防治效果下降42％以上；
(3)本申请利用一步好氧菌群(曲霉、枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌)和二步厌氧菌群(地衣芽孢杆菌、嗜热乳杆菌)共同发酵饲料化综合利用畜禽粪便、秸秆、中草药原料等，充分利用微生物菌种间的协同作用，消除制约肥料化利用存在的臭味大、存在大量致病菌、重金属超标等弊端，提升了发酵生物有机肥料的肥效，从而显著提升了肥料的肥用价值。本发明制备的生物有机肥料富含大量益生菌，能有效调节土壤中微生物的平衡，分解土壤中的有机质、矿物质等有机或无机成分，消除常年依赖化肥滥用造成的土壤板结、沙化、盐化等，有效改善土壤，提高作物抗逆性的特殊功效，提高农作物产能；特别是能够促进土壤中有机质的释放，改善盐渍化土壤的理化结构，增加土壤团聚体和渗透性，改善土壤肥沃度；
(4)采用分段发酵，发酵菌株对温度、pH、通氧等要求不同，不同的反应控制条件，提高了菌体的生长速率，缩短了发酵时间，提升了生产效率；且采用固体发酵，发酵工艺条件温和，能耗低、生产成本低，本技术方案生产成本仅为目前已报道技术水平的1/2，对提升行业经济效益及规模化推广应用具有重要作用；且无环境污染、投资小、易于规模化生产。
具体实施方式
以下实施例中的发酵菌种的种子液均采用如下工艺：
(1)曲霉种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；
(2)枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体枯草芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
实施例1
一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料及其制备方法，具体工艺步骤包括：
(1)中草药预处理：按苦棟皮25份、石菖蒲8份、鱼腥草15份、穿心莲15份、淡竹叶10份、地耳草10份、功劳木5份、蒲公英4份比例准确称量原料，将中草药原料粉碎后加入中草药原料9倍的纯净水，然后加入中草药原料质量比2.5％的纤维素酶，在超声波辅助条件下酶解45min后备用；其中超声波的频率为100～200kHZ；
(2)配料：按照牛粪110份、玉米秸秆50份、中草药原料15份、壳寡糖4份，然后添加上述原料质量比4％的麸皮、1.5％纤维素酶、0.15％磷酸二氢钾、0.03％硫酸镁，调整物料的含水量40％～50％，干湿标准以用手紧握刚好能滴出水为宜；
(3)一步好氧发酵：将活化好的曲霉、枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌分别接种至培养基，总接种量为固体培养基的4wt％，拌匀后堆肥发酵，通风培养6.5d；所述好氧发酵菌群中曲霉、枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌的用量比为2:3:1；
(4)二步厌氧发酵：一步好氧发酵结束后，将地衣芽孢杆菌、嗜热乳杆菌分别接种至培养基，总接种量为固体培养基的2.5wt％，拌匀后堆肥发酵，厌氧培养4d；所述厌氧发酵菌群中地衣芽孢杆菌和嗜热乳杆菌的用量比为3:2；
(5)干燥：二步厌氧发酵接收密封9h，然后进行低温通风干燥；
(6)粉碎：将干燥后的物料粉碎即得预防芦笋茎枯病的生物有机肥料。
实施例2
一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料及其制备方法，具体工艺步骤包括：
(1)中草药预处理：按苦棟皮30份、石菖蒲6份、鱼腥草20份、穿心莲10份、淡竹叶12份、地耳草8份、功劳木6份、蒲公英3份比例准确称量原料，将中草药原料粉碎后加入中草药原料10倍的纯净水，然后加入中草药原料质量比3％的纤维素酶，在超声波辅助条件下酶解30min后备用；其中超声波的频率为100～200kHZ；
(2)配料：按照鸡粪120份、小麦秸秆40份、中草药原料20份、壳寡糖3份比例准确配伍原料，然后添加上述原料质量比5％的麸皮、2％纤维素酶、0.2％磷酸二氢钾、0.03％硫酸镁，调整物料的含水量40％～50％，干湿标准以用手紧握刚好能滴出水为宜；
(3)一步好氧发酵：将活化好的曲霉、枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌分别接种至培养基，总接种量为固体培养基的5wt％，拌匀后堆肥发酵，通风培养5d；所述好氧发酵菌群中曲霉、枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌的用量比为2:3:1；
(4)二步厌氧发酵：一步好氧发酵结束后，将地衣芽孢杆菌、嗜热乳杆菌分别接种至培养基，总接种量为固体培养基的3wt％，拌匀后堆肥发酵，厌氧培养3d；所述厌氧发酵菌群中地衣芽孢杆菌和嗜热乳杆菌的用量比为3:2；
(5)干燥：二步厌氧发酵接收密封12h，然后进行低温通风干燥；
(6)粉碎：将干燥后的物料粉碎即得预防芦笋茎枯病的生物有机肥料。
实施例3
一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料及其制备方法，具体工艺步骤包括：
(1)中草药预处理：按苦棟皮20份、石菖蒲9份、鱼腥草10份、穿心莲20份、淡竹叶8份、地耳草12份、功劳木4份、蒲公英5份比例准确称量原料，将中草药原料粉碎后加入中草药原料8倍的纯净水，然后加入中草药原料质量比2％的纤维素酶，在超声波辅助条件下酶解60min后备用；其中超声波的频率为100～200kHZ；
(2)配料：按照猪粪100份、稻草秸秆60份、中草药原料10份、壳寡糖5份比例准确配伍原料，然后添加上述原料质量比3％的麸皮、1％纤维素酶、0.1％磷酸二氢钾、0.03％硫酸镁，调整物料的含水量40％～50％，干湿标准以用手紧握刚好能滴出水为宜；
(3)一步好氧发酵：将活化好的曲霉、枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌分别接种至培养基，总接种量为固体培养基的3wt％，拌匀后堆肥发酵，通风培养8d；所述好氧发酵菌群中曲霉、枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌的用量比为2:3:1；
(4)二步厌氧发酵：一步好氧发酵结束后，将地衣芽孢杆菌、嗜热乳杆菌分别接种至培养基，总接种量为固体培养基的2wt％，拌匀后堆肥发酵，厌氧培养5d；所述厌氧发酵菌群中地衣芽孢杆菌和嗜热乳杆菌的用量比为3:2；
(5)干燥：二步厌氧发酵接收密封6h，然后进行低温通风干燥；
(6)粉碎：将干燥后的物料粉碎即得预防芦笋茎枯病的生物有机肥料。
实施例4比较不同生物有机肥料对芦笋茎枯病防治效果及增产指标的影响
1、病害调查
每小区采用对角线五点取样，每点取相连5丛芦笋，每丛芦笋随机调查3根芦笋，共调查25丛芦笋75根芦笋，记录健株数和各级病株数。病情分级标准参照杨迎青等制定的标准。0级：无发病；1级：发病面积占总面积的6％以下；2级：发病面积占总面积的6％～10％；3级：发病面积占总面积的11％～20％；4级：发病面积占总面积的21％～30％；5级：发病面积占总面积的30％以上；
2、数据处理计算方法
病情指数＝∑(各级病株数×相对级数值)/调查总株数×5×100；
防治效果＝(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数×100％；
增产率＝(处理区产量-空白对照区产量)/空白对照区产量×100％；
3、试验分组
试验分为实施例1-3试验组、空白对照组(市售生物有机肥)、对照实施例1组(原料中壳聚糖以中草药原料替代，其余发酵工艺同实施例1)、对照实施例2组(原料中中草药原料以壳聚糖替代，其余发酵工艺同实施例1)、对照实施例3组(中草药原料未经预处理直接配料，其余同实施例1)；
4、试验结果
表1不同生物有机肥料对茎枯病防治及增产指标的影响
测定指标 防效(％) 增产率(％)
实施例1试验组 87.42±1.75 20.43±1.31
实施例2试验组 83.57±1.94 18.45±1.27
实施例3试验组 80.13±1.58 19.48±1.50
对照实施例1组 45.22±1.79 10.29±1.32
对照实施例2组 19.93±1.54 3.39±0.78
对照实施例3组 50.66±1.85 12.65±1.64
上述试验结果表明，生物有机肥料中草药原料与壳聚糖间的协同作用显著提升了产品的防治茎枯病和促长增产效果，起到了“1+1>2”的技术效果。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料，其特征在于包括以下按重量份计的原料：畜禽粪便100～120份、秸秆40～60份、中草药原料10～20份、壳寡糖3～5份，其中所述中草药原料包括苦楝 皮20～30份、石菖蒲6～9份、鱼腥草10～20份、穿心莲10～20份、淡竹叶8～12份、地耳草8～12份、功劳木4～6份、蒲公英3～5份；所述中草药原料通过如下步骤进行预处理：将中草药原料粉碎后加入中草药原料8～10倍的纯净水，然后加入中草药原料质量比2～3%的纤维素酶，在超声波辅助条件下酶解30～60min后备用；
所述预防芦笋茎枯病生物有机肥料的具体制备工艺步骤包括：
（1）配料：按照上述原料配比准确配伍原料，然后添加上述原料质量比3～5%的麸皮、1～2%纤维素酶、0.1～0.2%磷酸二氢钾、0.03%硫酸镁，调整物料的含水量40%～50%，干湿标准为用手紧握刚好能滴出水；
（2）一步好氧发酵：将活化好的曲霉、枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌分别接种至培养基，总接种量为固体培养基的3～5wt%，拌匀后堆肥发酵，通风培养5～8d；
（3）二步厌氧发酵：一步好氧发酵结束后，将地衣芽孢杆菌、嗜热乳杆菌分别接种至培养基，总接种量为固体培养基的2～3wt%，拌匀后堆肥发酵，厌氧培养3～5d；
（4）干燥：二步厌氧发酵接收密封6～12h，然后进行低温通风干燥；
（5）粉碎：将干燥后的物料粉碎即得预防芦笋茎枯病的生物有机肥料。
2.根据权利要求1所述的一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料，其特征在于所述生物有机肥料包括以下按重量份计的原料：畜禽粪便110份、秸秆50份、中草药原料15份、壳寡糖4份，其中所述中草药原料包括苦楝 皮25份、石菖蒲8份、鱼腥草15份、穿心莲15份、淡竹叶10份、地耳草10份、功劳木5份、蒲公英4份。
3.根据权利要求1-2任一项所述的一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料，其特征在于所述畜禽粪便是猪粪、牛粪、羊粪、鸡粪、鸭粪中的一种或几种的混合物。
4.根据权利要求1-2任一项所述的一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料，其特征在于所述秸秆是小麦秸秆、玉米秸秆、稻草中的一种或几种的混合物。
5.根据权利要求1所述的一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料，其特征在于所述超声波的频率为100～200kHZ。
6.根据权利要求1所述的一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料，其特征在于所述好氧发酵菌群中曲霉、枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌的用量比为2:3:1；二步厌氧发酵菌群中地衣芽孢杆菌和嗜热乳杆菌的用量比为3:2；其中曲霉是米曲霉、黑曲霉中的一种或两种的混合菌。
7.根据权利要求1所述的一种预防芦笋茎枯病的生物有机肥料，其特征在于所述曲霉种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；所述枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体枯草芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
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