CN103255064A - 一种防治西瓜枯萎病的真菌菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治西瓜枯萎病的真菌菌剂及其制备方法，属于瓜类土传病害的生物防治技术领域。方法包括：各级培养基的配制与吸附载体的准备；斜面菌种培养；摇瓶菌种扩繁；生产发酵罐培养；固体菌剂的制备等步骤。本发明以深绿木霉（Hypocrea atroviridis）菌株2-22CGMCCNo.7128为菌种，经发酵制备成液体和/或固体菌剂后，可推迟西瓜枯萎病的发病时间，降低发病率40％以上，西瓜连续种植二茬后，仍能保持良好的防病效果。本菌剂原料丰富、工艺简单，成本较低廉，保质期在半年以上，可在西瓜种植地区推广应用。

Description

一种防治西瓜枯萎病的真菌菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及瓜类土传病害的生物防治技术领域，尤其涉及一种防治西瓜枯萎病的真菌菌剂及其制备方法。 

背景技术

    西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f .sp. niveum）引起的一种常见土传病害，该病在世界范围内广泛传播，我国台湾、广东、浙江、福建、江苏、湖北、四川、重庆等地区严重发生。该病可造成植株大面积萎蔫死亡，一般田块发病率为10%～30%，重病田发病率高达80%以上，甚至全部死亡,导致西瓜产量严重下降，造成重大的经济损失。 

    西瓜枯萎病是目前西瓜连作生产中最常见的病害，影响最大，防治最困难。其发生程度与土壤性质、耕作、灌排水、施肥、育苗方式、苗床管理、用药种类与用量、品种、种子检疫和气候有关。目前，常见防治措施有：物理防治、化学防治、农业防治、生物防治、生态防治、综合防治等。物理方法一般费工费力，成本太高；而化学方法由于化学农药毒性大、污染环境，长期大量使用容易诱导病菌的抗药性，稍有不当，西瓜中残留大量农药，影响人体健康，不符合农业可持续发展。化学药剂对西瓜连作障碍土壤进行熏蒸，同样会残留于土壤造成污染，同时熏蒸也杀死了土壤中的有益微生物，因此也不是很好的方法。实行西瓜与其它作物轮作或连作障碍土休闲等农业防治措施，理论上可行，但是，由于我国人多地少，土地资源极度紧张，加上种植西瓜的比较经济效益很高，果农为了增加收入，一般不会轮作，更不会让土地休闲。选育抗病西瓜品种，往往需要10多年的时间，且有时虽然能抗西瓜枯萎病，但抗病西瓜可能又失去其它优良品质（如高产、含糖量等）；嫁接抗病西瓜苗，虽能暂时抗病，但是，西瓜品质风味会发生改变，且连续嫁接几年后，原来抗病的嫁接苗也变得不抗病了。因此，从保护生态环境、农业可持续发展、增加农民收入、保障食品安全的角度来说，微生物防治技术无毒无害，不污染环境，不产生抗药性，是绿色生态农业所需的关键技术，现已成为近年来农作物土传病害防治技术研究的热点，应用微生物技术防治作物土传病害，解决连作障碍是最理想的方法，是未来的发展方向。 

随着对作物连作障碍发生机制的深入研究，通过改善作物根际微生态环境来促进作物生长，以及从作物根际微环境中筛选具有良好促生和抗菌作用的有益菌群，日益为人们所重视。采用微生物防治作物土传病害已经研究了几十年，人们陆续报道了细菌中的枯草芽孢杆菌、放射土壤杆菌、荧光假单胞杆菌、节杆菌、多粘芽抱杆菌、木霉属真菌、青霉菌属等；目前，市场上已有很多利用拮抗菌防治植物土传病害的微生物菌剂、菌肥等产品，也有一些利用生物菌肥之类的产品进行西瓜枯萎病生物防治的试验报道，虽然这些微生物制剂在实验室和温室条件下有较好的效果，但是也存在多方面的局限性：首先，这些研究中报道的单一拮抗菌易受环境(气候、土壤)条件的影响效果很不稳定；其次，这些研制中的微生物制剂大都是液型的，在运输、贮藏和质量保障等方面均不方便；此外，现有的研究中对微生物制剂的制备方法及其应用配套技术尚未开展系统的研究，导致微生物技术产品防治西瓜枯萎病的实际应用成本高、效果不稳定，因此，微生物防治西瓜枯萎病技术尚难以在实践生产中广泛推广应用。因此，本发明针对西瓜连作导致的枯萎病频发问题，借助作物根际土壤中丰富的微生物资源，筛选和改造了适合当地条件的优良拮抗菌株，并充分利用农业生产中产生的大量农业废弃物资源，就地取材（麸皮、菇渣、酒糟、猪粪、草炭）开发了多种类型的固体菌剂，优化完善了菌剂制备的条件与工艺，初步实现了微生物防治西瓜土传病害的产业化，该技术的推广应用必将促进以西瓜为代表的高效农业的可持续性发展，具有显著的经济效益、生态效益和社会效益。 

发明内容

本发明目的在于，针对物理、化学等防治方法所存在的缺陷，提出一种能有效防治西瓜枯萎病的真菌菌剂；本发明的另一目的是提出该菌剂简易、低成本的制备方法；本发明的再一目的是提出该菌剂简单、有效的应用方法。 

一种深绿木霉(Hypocrea atrovirdis)菌株 2-22的筛选与鉴定： 

一、 2010年，从浙江嘉兴、金华、萧山、温岭等西瓜种植基地的西瓜枯萎病发病区挑选健康西瓜植株，共采集到21个根际土样，利用马丁氏培养基进行培养、分离，共分离到真菌270余株；然后进行平板拮抗试验，从中得到对西瓜枯萎病菌有较好拮抗效果的初筛真菌15株；通过盆栽、小区试验，从浙江嘉兴采集的土样中进一步筛选得到对西瓜枯萎病菌具有稳定拮抗效果的复筛菌株2-22；

二、菌株2-22的形态特征、培养特征及基因测序：

1. 菌落形态、显微形态及培养特征：

菌株2-22在PDA培养基上菌落生长较快，黑暗条件下，25℃培养3天菌落直径为40-50 mm；在培养基上最初产生白色絮状菌丝，继而产生浅绿色孢子随时间增长孢子变为深绿色，菌落背面呈白色或淡灰色整个菌落布满白色气生菌丝，其边缘为浅绿或深绿色的产孢区域；通过显微观察发现，菌丝体呈透明状有隔膜，分枝繁茂，直径2-10μm，孢子梗分枝、不规则，对生或互生，并有多极分枝而呈现松柏状，分支末端为小梗，分生孢子呈椭圆形或卵圆形，可产生大量的分生孢子，排列成2-4个明显的同心轮纹，形成平展的薄层或垫状结构，产孢簇直径为1-2 mm,可汇合，不产生扩散性色素，也没有明显的气味；菌落呈绿色，平铺，絮状，背面无色素；尖端生分生孢子团，含孢子4～12个；分生孢子无色，大小为 2.5～4.5×2～4μm；

2、菌株2-22的 rRNA基因序列测定：

包括18S rRNA片段，ITS1、5.8S rRNA、ITS2的全序列及28S区序列片断（测序引物：ITS4）Hypocrea atroviridis (深绿木霉/肉座菌) Trichoderma atroviride Karsten

AGGGCCTGGTCTTAGCTATAAGGCATTATACCGCGAAACTGCGAATGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTTGATAATACTTTACTACTTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAATCCCGACTTCGGAAGGGTTGTATTTATTAGATTAAAAACCAATGCCCCTCGGGGCTCTCTGGTGAATCATGATAACTAGTCGAATCGACAGGCCTTGTGCCGGCGATGGCTCATTCAAATTTCTTCCCTATCAACTTTCGATGTTTGGGTCTTGTCCAAACATGGTGGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGGCTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATCGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGTGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGTGCACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCCTCTGCGGAACCCCATGCCCTTCACTGGGTGTGGCGGGGAAACAGGACTTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGCTCAAGGCAGGCCTATGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGATGTTACATTTTTGACGCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTGCTTGGGCTCCAGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGGGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACAATGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTTTGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCCGTATTGCTTTGGCAGTACGCCGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACGGAGCCAGCGAGTACTCCCTTGGCCGGAAGGCCTGGGTAATCTTGTTAAACTCCGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATCCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTACCTGCCCTTAAAAACCCCCC

    三、菌株2-22的鉴定与保藏：

    该菌株由中国科学院微生物研究所根据该菌株的形态特征、培养特征和基因测序进行分类，鉴定为深绿木霉Hypocrea atroviridis / Trichoderma atroviridis。

Hypocrea atroviridis已于2013年1月11日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：CGMCC No.7128。 

本发明目的通过以下技术方案来实现。 

一种防治西瓜枯萎病的真菌菌剂：该菌剂以深绿木霉（Hypocrea atroviridis）菌株2-22 CGMCC No.7128为菌种，马丁氏固体培养基为斜面培养基，马铃薯蔗糖液体培养基为摇瓶菌种培养基和发酵罐培养基；经斜面、摇瓶菌种及发酵罐发酵培养后制备成液体真菌菌剂；或将该液体菌剂以灭菌麸皮、草炭、菇渣、猪粪或酒糟为吸附剂进一步制备成固体真菌菌剂而获得。 

一种防治西瓜枯萎病真菌菌剂的制备方法，该方法按以下步骤进行： 

（1）各级培养基的配制与吸附载体的准备，其中：

a）以马丁氏固体培养基为斜面培养基，备用；

b）以马铃薯蔗糖液体培养基为摇瓶菌种培养基，备用；

c) 以马铃薯蔗糖液体培养基为生产发酵罐培养基，备用；

d）吸附载体的准备：将吸附载体麸皮、草炭、菇渣、猪粪或酒糟分别调节含水率为40~50%、30~40%、40~50%、30~40%、40~50%后，在121^oC条件下高温灭菌2小时，并冷却至室温后，备用；

（2）斜面菌种培养：将深绿木霉（Hypocrea atroviridis）菌株2-22 CGMCC No.7128接种于步骤（1）斜面培养基上，在28—32℃培养箱中培养3—4天，取出后直接应用或放入冰箱中冷藏，保存； 

（3）摇瓶菌种扩繁：在无菌操作下，取一铲斜面菌种接入60ml步骤（1）马铃薯蔗糖液体培养基中，于28—32℃，120—220转/分的摇床中，培养40—64小时，取出直接应用或放入冰箱中冷藏，保存；

（4）生产发酵罐培养：将步骤（1）生产发酵罐培养基放入发酵罐中，在罐内温度121℃，经30分钟蒸汽高温灭菌；在保持罐体压力0.02－0.18 MPa条件下，冷却至28—32℃，在火焰保护下通过接种阀门将步骤（3）摇瓶菌种按3—10%的接种量迅速接入发酵罐内；在搅拌机转速120—220转/分，温度28—32℃，通气量4m³/h，罐压0.02－0.18 MPa，pH自然条件下，培养40—64小时至发酵液菌丝体鲜重为0.5g/ml时止,装瓶，即为液体真菌菌剂；

（5）固体菌剂的制备：将液体真菌菌剂与步骤（1）d)准备的吸附载体麸皮、草炭、菇渣、猪粪或酒糟，按体积1︰20比例拌匀、吸附，在28^oC，50%相对空气湿度的培养箱中培养2—7天，至检测载体中2-22的活菌量达0.2亿cfu/g以上、含水率控制在30%以下时，装袋、封口，即为固体真菌菌剂。

    本发明的有益效果是： 

一、本发明首次采用深绿木霉Hypocrea atroviridis菌株2-22为菌种，经发酵制备成液体或固体菌剂后，为西瓜枯萎病的防治提供了一种新的有效途径；

二、本菌剂通过防治西瓜枯萎病的小区试验后表明，能使西瓜枯萎病发病率明显下降，大大减轻西瓜产量损失，本菌剂防病效果可达40％以上，西瓜连续种植二茬后，本菌剂仍能保持良好的防病效果（见实施例6）。

三、使用本菌剂后可以推迟西瓜枯萎病的发病时间，降低发病程度，可减少农药的使用量，既减轻经济损失，又可减少对环境的污染； 

四、本发明菌剂所采用的土豆、麸皮、菇渣、草炭、猪粪、酒糟等原料来源丰富，发酵工艺较简单，生产成本较低廉，该菌剂有效保质期在半年以上。

附图说明 

图1 不同处理对土壤中西瓜枯萎病菌数量的影响。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作更详细的说明，但以下实施例仅是说明性的，本发明内容并不受这些实施例的限制。 

对以下实施例所涉材料的说明： 

西瓜枯萎病菌-尖孢镰刀菌：（由浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所菌种保藏库保存并提供）

蛋白胨：生化制剂，国产；

Yeast extract (酵母浸膏):生化试剂，国产；

Casein hydrolysate (洛蛋白水解物): 生化试剂，国产；

琼脂: 生化试剂，国产；

K₂HPO₄：分析纯，国产；

葡萄糖：分析纯，国产；

MgSO₄ ^.7H₂O：分析纯，国产；

孟加拉红（Rose Bengal）：分析纯，国产；

链霉素：分析纯，国产。

实施例1：（真菌分离纯化） 

真菌按以下方法步骤分离纯化：

1培养基

马丁氏（Martin）培养基：KH₂PO₄ 1.0g，葡萄糖10.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，蛋白胨5.0g，琼脂15-20g，水1000ml；此培养液1000ml加1%孟加拉红水溶液3.3ml；112.6℃灭菌30分钟；临用时每100ml培养基中加1%链霉素液0.3ml（30ppm）；

2试验步骤

2.1 培养基制备：配制马丁氏培养基，制备真菌斜面；

2.2土壤稀释液的制备

（1）称取10g土壤，加入100ml带有玻璃珠的无菌水于500ml三角瓶中，振荡15分钟，即10^-1；

（2）吸取土悬液10ml，加入90ml无菌水于500ml三角瓶中，即10^-2；

（3）从（2）中吸取10ml，加入90ml无菌水于500ml三角瓶中，即10^-3；

2.3真菌分离

（4）从（1）（2）（3）中分别吸取0.1ml，加入到马丁氏（Martin）培养基平板中进行涂布培养（28-30℃、3-5天），各3个重复；

（5）选择20-200菌落数的培养皿，挑取菌落进行斜面培养（28-30℃，3-5天）；

2.4 多个土样

（6）共21个土样，每个土样重复上述2.1～2.3步骤；

2.5 结果：分离到真菌270多株。

实施例2：（分离真菌对西瓜枯萎病菌-尖孢镰刀菌平板拮抗试验） 

1.培养基

1.1 固体培养基：

尖孢镰刀菌培养基配制：MgSO₄ ^.7H₂O0.3g，K₂HPO₄2.0g，酵母浸膏 4.0g，洛蛋白水解物 8.0g，蔗糖 10.0g，琼脂 18g，蒸馏水 1000ml；

马丁氏培养基配制：同实施例1中2.1

1.2 液体培养基：

尖孢镰刀菌液体摇瓶培养基；尖孢镰刀菌培养基不加琼脂即可；

2、试验步骤

2.1 培养基制备：

配制尖孢镰刀菌培养基（固体、液体），制备病原菌西瓜尖孢镰刀菌斜面；

配制马丁氏培养基（固体），制备真菌斜面；

2.2 平板拮抗试验

2.2.1 菌种活化

西瓜尖孢镰刀菌和真菌（实施例1分离菌）进行菌种活化；

2.2.2 制备西瓜尖孢镰刀菌平板：活化尖孢镰刀菌接入液体培养基中进行摇瓶培养，28-30℃，200转/分，隔天以西瓜尖孢镰刀菌培养基倒平板，凝固后每个平板中加入0.1ml尖孢镰刀菌发酵液（发酵约40小时），涂布，28-30℃培养过夜，备用；

2.2.3 准备分离真菌斜面

活化分离真菌接入斜面进行培养，28-30℃，培养3-5天，备用；

2.2.4 平板拮抗试验：用灭菌接种铲挖一块带分离真菌的琼脂块放入尖孢镰刀菌平板，每个平板放5株不同拮抗真菌，3个重复；24h左右观察实验结果，主要考察抑菌圈有无及大小；

3、结果：通过平板拮抗试验得到拮抗效果较好的真菌共15株，其中菌株2-22对西瓜枯萎病菌的抑制效果相对最好。

 实施例3：（菌株2-22菌剂的制备方法1） 

按以下步骤进行：

（1）各级培养基的配制与吸附载体的准备，其中：

a）以马丁氏固体培养基为斜面培养基（该基配方同实施例1）；

b）以马铃薯蔗糖液体培养基为摇瓶菌种培养基；

马铃薯蔗糖液体培养基（PDA液体培养基）： 20%马铃薯浸出液1000ml+蔗糖20g；其中，20%马铃薯浸出液的制备为：称取去皮马铃薯块200g，加水1000ml煮至马铃薯块能被玻棒戳破为止，过滤，补足原来的水量；

c) 以马铃薯蔗糖液体培养基为生产发酵罐培养基：同摇瓶菌种培养基；

d）吸附载体的准备：将吸附载体麸皮的含水率调节为40~50%，然后在121^oC的灭菌器中，高温灭菌2小时，待冷却至室温后，备用；

（2）斜面菌种培养：将深绿木霉菌株2-22接种于步骤（1）斜面培养基上，在28—32℃培养箱中培养3—4天，取出后直接应用或放入4－7℃冰箱中冷藏，保存；

（3）摇瓶菌种扩繁：在无菌操作下，取一铲斜面菌种接入60ml步骤（1）马铃薯蔗糖液体培养基中，于28—32℃，120转/分的摇床中，培养40小时，取出直接应用或放入4℃－7℃冰箱中冷藏，保存；

（4）生产发酵罐培养：将步骤（1）c）生产发酵罐培养基放入发酵罐中，在罐内温度121℃，经30分钟蒸汽高温灭菌；在保持罐体压力0.02 MPa条件下，冷却至28—32℃，在火焰保护下通过接种阀门将步骤（3）摇瓶菌种按3%的接种量迅速接入发酵罐内；在搅拌机转速220转/分，温度28—32℃，通气量4m³/h，罐压0.18 MPa，pH自然条件下，培养64小时至发酵液菌丝体鲜重为0.5g/ml时止,装瓶，即为液体真菌菌剂；

（5）固体菌剂的制备：将液体真菌菌剂与步骤（1）d)准备的吸附载体麸皮，按体积1︰20比例拌匀、吸附，在28^oC，50%相对空气湿度的培养箱中培养2-4天，至检测载体麸皮中2-22的活菌量达0.2亿cfu/g以上、含水率控制在30%以下时，装袋、封口，即为固体真菌菌剂。

 实施例4：（菌株2-22菌剂制备方法2） 

在本例中，步骤（1）d）吸附载体的准备中，将吸附载体草炭的含水率调节为30~40%；步骤（3）的摇瓶菌种扩繁中：于28—32℃，150转/分的摇床中，培养45小时；步骤（4）的生产发酵罐培养中：在保持罐体压力0.06MPa条件下，按5%接种量迅速接入发酵罐内；在转速200转/分，通气量4m³/h，罐压0.14MPa，培养60小时,装瓶，即为液体真菌菌剂；在步骤（5）固体菌剂的制备中：将液体真菌菌剂与吸附载体草炭，按体积1︰20比例拌匀、吸附，在培养箱中培养3—5天，至检测载体草炭中2-22的活菌量达0.2亿cfu/g以上、含水率控制在30%以下时，装袋、封口，即为固体真菌菌剂；其余步骤、工艺同实施例3。

 实施例5：（菌株2-22菌剂制备方法3） 

在本例中，步骤（1）d）吸附载体的准备中，将吸附载体菇渣的含水率调节为40~50%；步骤（3）的摇瓶菌种扩繁中：于28—32℃，180转/分的摇床中，培养50小时；步骤（4）的生产发酵罐培养中：在保持罐体压力0.10MPa条件下，按6.5%接种量迅速接入发酵罐内；在转速180转/分，通气量4m³/h，罐压0.10MPa，培养50小时,装瓶，即为液体真菌菌剂；在步骤（5）固体菌剂的制备中：将液体真菌菌剂与吸附载体菇渣，按体积1︰20比例拌匀、吸附，在培养箱中培养4—6天，至检测载体菇渣中2-22的活菌量达0.2亿cfu/g以上、含水率控制在30%以下时，装袋、封口，即为固体真菌菌剂；其余步骤、工艺同实施例3。

 实施例6：（菌株2-22菌剂制备方法4） 

在本例中，步骤（1）d）吸附载体的准备中，将吸附载体猪粪的含水率调节为30~40%；步骤（3）的摇瓶菌种扩繁中：于28—32℃，200转/分的摇床中，培养60小时；步骤（4）的生产发酵罐培养中：在保持罐体压力0.14MPa条件下，按8%接种量迅速接入发酵罐内；在转速150转/分，通气量4m³/h，罐压0.06MPa，培养45小时,装瓶，即为液体真菌菌剂；在步骤（5）固体菌剂的制备中：将液体真菌菌剂与吸附载体猪粪，按体积1︰20比例拌匀、吸附，在培养箱中培养5—7天，至检测载体猪粪中2-22的活菌量达0.2亿cfu/g以上、含水率控制在30%以下时，装袋、封口，即为固体真菌菌剂；其余步骤、工艺同实施例3。

 实施例7：（菌株2-22菌剂制备方法5） 

在本例中，步骤（1）d）吸附载体的准备中，将吸附载体酒糟的含水率调节为40~50%；步骤（3）的摇瓶菌种扩繁中：于28—32℃，220转/分的摇床中，培养64小时；步骤（4）的生产发酵罐培养中：在保持罐体压力0.18MPa条件下，按10%接种量迅速接入发酵罐内；在转速120转/分，通气量4m³/h，罐压0.02MPa，培养40小时,装瓶，即为液体真菌菌剂；在步骤（5）固体菌剂的制备中：将液体真菌菌剂与吸附载体酒糟，按体积1︰20比例拌匀、吸附，在培养箱中培养5—7天，至检测载体酒糟中2-22的活菌量达0.2亿cfu/g以上、含水率控制在30%以下时，装袋、封口，即为固体真菌菌剂；其余步骤、工艺同实施例3。

 实施例8：（菌株2-22菌剂的应用方法） 

上述防治西瓜枯萎病真菌菌剂2-22的应用方法是：

    （1）在西瓜苗移栽前1星期，将液体真菌菌剂2-22按每株5ml菌剂量浇在育苗盘的根部基质中；

    （2）移栽时，将育苗基质连同幼苗整体移植土壤中，待西瓜幼苗盆栽或地栽成活后，将固体真菌菌剂（按照实施例3、4、5、6、7制备，2-22的活菌量达0.2亿cfu/g以上）按每株20g的用量撒于根部土壤的表层，并浇灌适量水；

    （3）在西瓜苗移栽前1星期至本发明菌剂使用后的西瓜整茬的种植期间，要避免在植株根部使用其它消毒剂、杀菌剂及抗生素等真菌消杀类药物。

 实施例9：（菌株2-22菌剂对西瓜尖孢镰刀菌（枯萎病）的田间生防效果对比试验） 

1.PDA液体培养基和枯萎病病原菌液体培养基准备

PDA液体培养基：同实施例3

2.菌株2-22发酵液的准备

菌株2-22的活化，然后每株接液体摇瓶培养，28～30℃，200转/分钟，约培养40小时后，备用；

3.试验地点与处理设计 

试验地点选择在嘉兴市东进现代农业示范园区内。试验土壤为连续种植西瓜三年以上的连作土壤，试验种植的西瓜品种为嘉丽。西瓜枯萎病生防菌剂2-22由浙江省农科院环境资源与土壤肥料研究所提供，普通商品有机肥由浙江萧山汇仁复合有机肥公司生产。试验设处理（1）常规施肥（对照，CK）；处理（2）普通有机肥20kg/小区；处理(3)按实施例3制备的麸皮生防菌剂2-22 20g固体菌剂/株；处理（4）按实施例4制备的草炭生防菌剂2-22 20g固体菌剂/株；处理（5）按实施例5制备的菇渣生防菌剂2-22 20g固体菌剂/株；处理（6）按实施例6制备的猪粪生防菌剂2-22 20g固体菌剂/株；处理（7）按实施例7制备的酒糟生防菌剂2-22 20g固体菌剂/株；小区试验在联动大棚中进行，每个处理3次重复，随机区组排列，每个小区面积33.0m2（畦长16.5m×宽2.0m），不同小区间隔50cm。西瓜连续种植两茬，春茬西瓜3月5日播种， 4月6日移栽，5月7日开始授粉。秋茬8月2号播种，8月下旬移栽。

4.试验方法 

4.1育苗基质准备：将草炭、蛭石、珍珠岩按照6︰2︰2的比例混匀，然后用自来水调节含水率至60％，备用；

在育苗穴盘（规格90×60）中装入四分之三高左右的4.1制备基质，用手轻压，播种后再铺上一层薄薄的基质，并用塑料膜盖住穴盘，防止水分蒸发，备用；

4.2育苗：利用穴盘基质育苗，育苗数量按照各处理所需幼苗数的2倍分别进行准备，其中处理（1）与处理（2）育苗时，在育苗基质中添加营养土质量2%的普通商品有机肥；基质营养土拌匀装盆后，挑选饱满一致的种子播种于穴盘中，每孔1粒种子，保持基质含水率为50%左右，维持育苗棚内最低温度不低于10^oC。出苗后，掀掉塑料膜，培养至两子叶平展，备用；苗移栽入盆前1周，于处理（3）、（4）、（5）、（6）、（7）基质育苗盆的每穴中加入5ml菌株2-22发酵液，处理1与处理2的对照苗中不加入2-22发酵液。

4.3整地与施肥：大田翻地整地后，将化肥和普通有机肥散施畦面，再翻入土里，大田基肥统一按每亩施用复合肥30kg、硫酸钾15kg和钙镁磷肥25kg，普通有机肥作为基肥一次性全部施入土壤中，待幼苗移栽成活后，按照20g/株的用量一次性施入各固体生防菌剂2-22，其他措施与当地西瓜常规生产操作方法一致。 

4.4幼苗移栽：挑选健壮的长势一致的西瓜幼苗，连同育苗基质一起移入大田土壤中，每小区定植48株。 

4.5田间管理：在整个西瓜生长期内施肥时间、施肥品种、施肥量、中耕除草、浇水次数及每次浇水量各小区均一致，试验期间，一律不得使用土壤消毒剂之类的化学与生物制剂，其他病虫害防治所用药物及操作均完全一致， 

4.6考查记载与测试：田间观察西瓜各生育期的长势及叶片颜色等情况，记载各小区枯萎病发病情况及西瓜产量，测定各处理土壤中西瓜枯萎病菌-尖孢镰刀菌数量。

5、结果 

表1、固体发酵菌剂对西瓜枯萎病的防治效果（春茬）

注：经Tukey法多重比较，所有2-22生防菌剂处理的西瓜枯萎病平均发病率与常规化肥或有机肥处理相比，其差异均达到了5%显著水平。

表2、固体发酵菌剂对西瓜枯萎病的防治效果（秋茬） 

   注：经Tukey法多重比较，所有2-22生防菌剂处理的西瓜枯萎病平均发病率与常规化肥或有机肥处理相比，其差异均达到了5%显著水平。

 5.1 对西瓜枯萎病防治效果 

由表1可见，不同处理对西瓜枯萎病发病率的影响存在显著差异，至6月20日，对照常规化肥处理小区春茬西瓜的平均发病率达到了69.4%，而施用2-22生防菌剂的小区西瓜枯萎病初次发病时间有所推迟，其平均发病死亡株率与对照相比也显著降低，至6月20日，施用生防菌剂2-22 5个处理的西瓜枯萎病平均发病率仅为45.7%，可见施用生防菌剂2-22可降低西瓜枯萎病的发生率，具有明显的防控作用，其使用量控制在20g/株较为合适。而施用普通有机肥处理的西瓜枯萎病发病死亡率达到70.1%，与常规化肥处理相比，对西瓜枯萎病没有任何防治作用。究其原因是生防菌剂中含有高效的西瓜枯萎病活性拮抗菌2-22，这些拮抗微生物施入到土壤中后能在西瓜根际土壤迅速定殖，从而抑制了西瓜根际土壤中西瓜枯萎病菌的生长与繁殖，而普通有机肥中虽然微生物总量很多，但缺少拮抗菌的引入，难以抑制土壤中西瓜枯萎病菌的生长。

从表2中还可以看出，通过连续两茬的西瓜种植试验表明，施用生防菌剂2-22不但对春茬西瓜的枯萎病具有明显的防治效果，对于秋茬西瓜枯萎病仍然保持有良好的防效，至9月25日，对照常规化肥处理小区的平均发病率为29.8%，施用普通有机肥处理的小区西瓜枯萎病平均发病率为26.4%，而施用生防菌剂2-22处理的小区平均发病率仅为15.9%，与施化肥和普通有机肥相比，所有拮抗菌剂2-22处理的西瓜枯萎病发病率明显下降。可见，春季施用一次生防2-22固体菌剂，其对西瓜枯萎病的生防效应可连续保持两茬以上，这说明固体拮抗菌剂中2-22活菌不但能在大田土壤中迅速定殖，且能够在土壤中较长时间存活，具有良好的环境适应性，非常适宜在各地西瓜连作产区推广使用。 

5.2 对西瓜产量的影响 

不同处理对西瓜产量的影响见表3，与对照常规化肥处理相比，生防菌剂2-22处理使春茬西瓜的平均产量提高了103.5%，增加了1倍多的西瓜产量，使秋茬西瓜产量提高了19.5%，这主要表现在生防菌剂2-22增加了西瓜单株座果数；另一方面，更为重要的是由于施用生防菌剂有效减轻了西瓜枯萎病的发病死亡率，大大提高了西瓜开花结果的有效株数，从而增加了小区西瓜的总坐果数和经济产量。

表3  不同处理对西瓜产量的影响 

注：菌剂2-22的表中数值为所有应用菌剂2-22处理（3）-（7）的平均值，其中不同小写字母表示处理之间的差异达5%显著水平。

5.3 对西瓜根际土壤中枯萎病菌-尖孢镰刀菌数量的影响 

    从图1中可以看出，与对照常规化肥和普通有机肥施用相比，添加拮抗微生物2-22固体菌剂的处理，种植后西瓜根际土壤中枯萎病菌-尖孢镰刀菌平均数量显著降低，表明生防菌剂2-22不但在实验室条件下对培养基质中的西瓜枯萎病菌具有明显的抑制效果，而且在田间环境条件下对土壤中的西瓜枯萎病菌同样具有非常显著的抑制效果。结合生防菌剂2-22能够大大减轻西瓜枯萎病发病率的试验结果，本实施例充分验证了生防菌剂2-22在大田条件下对西瓜枯萎病具有稳定持久的防治效果，因此，通过进一步的试验与示范后，将该菌剂在西瓜连作生产区域广泛推广应用是完全可行的；生防菌剂2-22的推广应用，一方面可以减轻西瓜枯萎病发病率，提高西瓜产量，增加农民收入；另一方面，将大量农业废弃物资源用作生防固体菌剂的吸附载体，还可以实现变废为宝，减轻农村环境污染，并降低生防菌剂的生产成本，具有显著的经济、社会和生态环境效益。

Claims (3)

1.深绿木霉（Hypocrea atroviridis）菌株2-22 CGMCC No.7128。

2.一种防治西瓜枯萎病的真菌菌剂：其特征在于该菌剂以深绿木霉（Hypocrea atroviridis）菌株2-22 CGMCC No.7128为菌种，马丁氏固体培养基为斜面培养基，马铃薯蔗糖液体培养基为摇瓶菌种培养基和发酵罐培养基；经斜面、摇瓶菌种及发酵罐发酵培养后制备成液体真菌菌剂；或将该液体菌剂以灭菌麸皮、草炭、菇渣、猪粪或酒糟为吸附剂进一步制备成固体真菌菌剂而获得。

3.一种防治西瓜枯萎病真菌菌剂的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：

（1）各级培养基的配制与吸附载体的准备，其中：

a）以马丁氏固体培养基为斜面培养基，备用；

b）以马铃薯蔗糖液体培养基为摇瓶菌种培养基，备用；

c) 以马铃薯蔗糖液体培养基为生产发酵罐培养基，备用；

d）吸附载体的准备：将吸附载体麸皮、草炭、菇渣、猪粪或酒糟分别调节含水率为40~50%、30~40%、40~50%、30~40%、40~50%后，在121^oC条件下高温灭菌2小时，并冷却至室温后，备用；

（2）斜面菌种培养：将深绿木霉（Hypocrea atroviridis）菌株2-22 CGMCC No.7128接种于步骤（1）斜面培养基上，在28—32℃培养箱中培养3—4天，取出后直接应用或放入冰箱中冷藏，保存；

（3）摇瓶菌种扩繁：在无菌操作下，取一铲斜面菌种接入60ml步骤（1）马铃薯蔗糖液体培养基中，于28—32℃，120—220转/分的摇床中，培养40—64小时，取出直接应用或放入冰箱中冷藏，保存；

（4）生产发酵罐培养：将步骤（1）生产发酵罐培养基放入发酵罐中，在罐内温度121℃，经30分钟蒸汽高温灭菌；在保持罐体压力0.02－0.18 MPa条件下，冷却至28—32℃，在火焰保护下通过接种阀门将步骤（3）摇瓶菌种按3—10%的接种量迅速接入发酵罐内；在搅拌机转速120—220转/分，温度28—32℃，通气量4m³/h，罐压0.02－0.18 MPa，pH自然条件下，培养40—64小时至发酵液菌丝体鲜重为0.5g/ml时止,装瓶，即为液体真菌菌剂；

（5）固体菌剂的制备：将液体真菌菌剂与步骤（1）d)准备的吸附载体麸皮、草炭、菇渣、猪粪或酒糟，按体积1︰20比例拌匀、吸附，在28^oC，50%相对空气湿度的培养箱中培养2—7天，至检测载体中2-22的活菌量达0.2亿cfu/g以上、含水率控制在30%以下时，装袋、封口，即为固体真菌菌剂。