CN114774496B - 一种高密度发酵制备glp-1类似物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用重组大肠杆菌高密度发酵制备GLP‑1类似物的方法。所述方法包括如下步骤:发酵培养基配制、菌种活化、发酵培养等。本发明提供的发酵方法能够实现重组工程菌的高密度发酵表达,显著增加GPL‑1类似物的表达量。
Description
技术领域
本发明涉及微生物工程技术领域,尤其涉及一种高密度发酵制备GLP-1类似物的方法。
背景技术
糖尿病是一组因胰岛素绝对或相对分泌不足和/或胰岛素利用障碍引起的碳水化合物、蛋白质、脂肪等代谢紊乱性疾病,以高血糖为主要标志,可由遗传和环境等多种因素引起。糖尿病是人类三大致死疾病之一,它的死亡率仅次于心脑血管疾病和癌症。
糖尿病主要分为1型糖尿病和2型糖尿病,其中大多数患者为2型糖尿病患者(据统计,约占90%)。2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM),旧称非胰岛素依赖型糖尿病(noninsulin-dependent diabetes mellitus,NIDDM)或成人发病型糖尿病(adult-onsetdiabetes),患者特征为高血糖、相对缺乏胰岛素、胰岛素抵抗等。目前,临床上使用的治疗2型糖尿病的药物主要有双胍类、磺酰脲类、噻唑烷二酮类、DPP-4受体抑制剂、SGLT-2受体抑制剂和GLP-1衍生物。而其中,GLP-1衍生物由于具有与胰岛素类似的降糖效果,但同时几乎无低血糖风险、兼具减重效果和心血管保护功能,正逐渐成为2型糖尿病的主要治疗药物和研究热点。
胰高血糖素样肽1(GLP-1)是一种由肠道L细胞分泌的促胰素,具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素的释放、刺激胰岛β细胞增殖、诱导胰岛β细胞再生、阻止胰岛β细胞凋亡、改善胰岛素敏感性和增加葡萄糖的利用等作用。因此,GLP-1及其类似物和衍生物在治疗1和2型糖尿病的发生、发展中起着重要作用。GLP-1类似物和胰高血糖素的氨基酸序列有近一半相同,具有葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌和生物合成、抑制胰高血糖素分泌及抑制胃排空等多种功能(付刚,龚珉,徐为人.胰高血糖素样肽1及其受体激动剂研究进展[J] .天津医药,2012,40(2):181-184 .)。
目前,已上市的GLP-1衍生物主要有艾塞那肽、利拉鲁肽、度拉糖肽、利司那肽、艾塞那肽微球制剂、阿必鲁肽、聚乙二醇洛塞那肽和索马鲁肽(又名司美鲁肽)。其中,索马鲁肽为GLP-1衍生物药物中的代表。
索马鲁肽(Semaglutide)是由诺和诺德公司研发的长效GLP-1衍生物,该药物只需要进行每周一次的皮下注射给药,目前已在多国获批上市。而且,诺和诺德通过制剂技术,开发了索马鲁肽的口服制剂。从结构上看,索马鲁肽是将GLP-1(7-37)链上第26位Lys接上AEEA、谷氨酸和十八烷脂肪二酸侧链,并将其中第8位氨基酸采用非天然氨基酸氨基异丁酸(Aib)取代原Ala所得。与利拉鲁肽相比,索马鲁肽的脂肪链更长,疏水性增加,但是索马鲁肽经过短链的AEEA修饰,亲水性大大增强。AEEA修饰后不但可以与白蛋白紧密结合,掩盖DPP-4酶水解位点,还能降低肾排泄,延长生物半衰期,达到长循环的效果。索马鲁肽在多个临床试验研究已经证明联合不同的口服降糖药可以有效控制血糖,并能够使患者减轻体重、减少收缩压及改善胰岛β细胞功能。
目前,GLP-1类似物的制备主要由化学合成法和生物发酵法;生物发酵法逐渐成为主流制备工艺,研究主要集中在其重组工程菌构建、蛋白纯化及制剂方面。但当前对于如何提高GLP-1类似物的重组工程菌发酵密度、显著提高其表达量的研究鲜有涉及。
高密度发酵是指微生物在液体培养基中密度超过常规10倍以上进行生长发酵的技术,现代高密度发酵主要是在基因工程菌(主要是大肠杆菌)生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的。提高菌体发酵培养密度,不仅可以减少培养容器体系、培养基的消耗和下游工艺(如分离、纯化等)的效率,还可以缩短生产周期、减少设备投入和增大产能、降低成本。
为此,本发明针对前期构建的表达GLP-1类似物的重组大肠杆菌工程菌,提供一种高密度发酵方法,极大的提高了菌体发酵密度,提高了目的蛋白表达量,具有良好的产业应用前景。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种高密度发酵制备GLP-1类似物的方法。
本发明所述GLP-1类似物为在先专利CN2022101139459中公开的长效GLP-1衍生物的多肽部分(GLP-1类似物),本发明在CN2022101139459构建的GLP-1类似物的重组大肠杆菌的基础上提供一种表达高密度发酵制备工艺。
所述长效GLP-1衍生物为N-ε 34 -[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰胺基)- 4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Ile8Glu22Arg26Lys34Arg35Gly36]GLP-1(7-37),其氨基酸序列为HIEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIAWLVKRGG(SEQ ID NO.1)。
上述专利CN2022101139459的数据表明,本发明的上述GLP-1衍生物:(1)具备与索马鲁肽相似的EC50值,表明其具备与索马鲁肽相当的与人胰岛素受体的结合亲和力;(2)在db/db糖尿病小鼠模型中,在每次给药2h和48h时,均有显著优于索马鲁肽的降糖效果;(3)同样展示出优于索马鲁肽的减重效果和更好的摄食量抑制,体重变化率达到了索马鲁肽的2倍以上;(4)具备显著优于索马鲁肽的半衰期,在0.015mg/ml、0.045mg/ml和0.075mg/ml不同浓度给药情况下,半衰期分别为11.59h、12.49h、13.50h,而索马鲁肽则分别为8.28h、8.52h、8.85h。
在上述长效GLP-1衍生物中,其制备方法可以为:先构建表达GLP-1类似物的重组工程菌,再通过发酵获得所述GLP-1类似物,并通过在所述GLP-1类似物的氨基酸K残基上的ε氨基连接脂肪酸侧链,得到所述长效GLP-1衍生物。
为实现本发明的目的,本发明提供如下构建重组工程菌的方法:
(A)构建GLP-1类似物的基因表达片段,所述基因表达片段的核酸序列为ttcaaattcgaattcaaattcgaagacgacgacgacaaacacatcgaaggtaccttcacctctgacgtttcttcttacctggaagaacaggctgctcgtgaattcatcgcttggctggttaaacgtggtggt(SEQ ID NO.2);
(B)将所述基因表达片段插入原核表达质粒,得到GLP-1类似物的重组表达质粒;
(C)将所述重组表达质粒转入大肠杆菌,得到表达所述GLP-1类似物的重组大肠杆菌。
作为本发明的一种优选技术方案,步骤(B)为:将步骤(A)中所述基因表达片段插入表达载体pET-30a(+)的NdeI和XhoI酶切位点之间,构建得到所述重组表达质粒。
作为本发明的一种优选技术方案,步骤(C)为:将所述重组表达质粒通过热击法转化导入到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中,筛选得到所述重组大肠杆菌。
针对上述方法构建的重组工程菌,本发明提供了一种高密度发酵制备GLP-1类似物的方法。本发明提供的发酵方法能够显著提高重组工程菌诱导OD600nm值,并通过诱导后的发酵表达,从而实现整个发酵菌体密度和产量的显著提升。
一方面,本发明提供了一种利用重组大肠杆菌高密度发酵制备GLP-1类似物的方法,所述方法包括如下步骤:
(1)配制发酵培养基
所述发酵培养基的组成成分包括:酵母抽提粉8-15 g/L、一水合柠檬酸0.5-3 g/L、硫酸铵2-10 g/L、磷酸二氢钾5-10 g/L、七水合硫酸亚铁0.02-0.15 g/L、无水氯化钙0.001-0.01 g/L、葡萄糖8-12 g/L、七水合硫酸镁0.5-3 g/L和微量元素溶液5-10 mL/L;
其中,微量元素溶液的组成成分包括:一水合柠檬酸200-300 g/L、六水合三氯化铁10-20 g/L、硼酸0.1-1 g/L、一水合硫酸锰1-3 g/L、五水合硫酸铜II 0.1-1 g/L、二水钼酸钠0.1-1 g/L、六水合氯化钴0.1-1 g/L和氯化锌1-3 g/L;
(2)对重组大肠杆菌进行多级菌种活化培养,得活化菌种培养液;
(3)将活化菌种培养液接种至发酵培养基中进行发酵培养;
其中,所述GLP-1类似物的氨基酸序列为HIEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIAWLVKRGG(SEQID NO.1)。
作为本发明的一种优选技术方案,步骤(2)至少包括二级菌种活化培养,其中,一级培养基的组成成分包括胰蛋白胨15-20 g/L、酵母抽提粉10-15 g/L和氯化钠5-15 g/L。
二级及以上培养基与步骤(1)中所述发酵培养基相同。
作为本发明的一种优选技术方案,步骤(2)所述活化培养的方法包括:
一级菌种培养:取冻存重组大肠杆菌,以1:1000的比例接种至一级菌种培养基,恒温振荡培养,培养温度30.0±1.0℃,转速220±22rpm,培养12-16h,至菌种OD600nm值达到≥3.0,得一级菌种培养液;
二级菌种培养:将培养好的一级菌种培养液接入二级菌种培养基中,接种比例1:50,种子罐培养,培养条件:温度37.0±3.0℃,pH 6.80±0.20,初始通气量8-12 L/min,初始罐压0.050±0.005 MPa,当OD600nm值达到≥3.0,得到二级活化菌种培养液。
作为本发明的一种优选技术方案,步骤(3)所述发酵培养的方法包括:
活化菌种接种:将发酵培养基用磷酸缓冲液调节pH至6.8后,将活化菌种培养液无菌接入发酵培养基中,接种比例1:10,发酵罐培养;
初始培养条件:温度37.0±2.0℃,pH6.80±0.20,初始转速150rpm,初始通气量8-12 m3/h,初始罐压0.050±0.005 MPa;
发酵过程控制:发酵培养过程中控制pH值以及溶氧>5%,当溶氧回升,补加补料培养基,当OD600nm值≥130.0,更换补料培养基进行诱导培养至平台期停止发酵。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点:
本发明在设计得到能够稳定高表达GLP-1类似物的重组工程菌的基础上,通过提供一种高密度发酵方法,能够显著提高重组工程菌的菌体发酵密度,目标蛋白表达量在13g/L以上,甚至15 g/L以上。因此,本发明的方法能够显著提高菌体发酵表达量,降低生产成本,具有极为广阔的工业应用前景。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点,下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施;显然,说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。
实施例1
本实施例提供了一种长效GLP-1(7-37)衍生物及其制备方法,尤其是构建了一种能高效表达本发明GLP-1(7-37)类似物的重组工程菌,制备方法如下:
(1)构建编码[Ile8Glu22Arg26Lys34Arg35Gly36]-GLP-1(7-37)的表达质粒
通过大量研究和实验,本发明最终选择FKFEFKFE作为促包涵体序列,DDDDK作为EK酶切序列,并将促包涵体序列、EK酶切序列和GLP-1类似物编码基因序列依次串联融合,得到如SEQ ID NO.2所示基因片段;通过NdeI和XhoI位点,将上述片段插入原核表达质粒pET-30a(+)中并测序验证,得到表达质粒,称作pET-30a(+)-[Ile8Glu22Arg26Lys34Arg35Gly36]-Glp-1(7-37)。
(2)构建表达[Ile8Glu22Arg26Lys34Arg35Gly36]-GLP-1(7-37)的重组大肠杆菌
将BL21感受态细胞(TransGenBiotech)置于冰浴上融化(50μL),加入步骤(1)构建的表达质粒,轻轻摇匀,并在冰浴中放置30 min。继而42℃水浴热激30 s,然后快速将离心管转移到冰浴中放置2 min,该过程不要摇动离心管;
向离心管中加入500μL无菌的LB培养基(不含抗生素),混匀后置于37℃,180rpm培养1 h,使细菌复苏,然后吸取200μL已转化的感受态细胞加到含有卡那霉素抗性的LB琼脂培养基平板上,将细胞均匀涂开,将平板置于37℃至液体被吸收,倒置平板,37℃过夜培养,次日,使用接种环挑取转化平皿中的单克隆菌落,并接种于15mL的无菌LB培养基(含抗生素),30℃过夜培养。将500μL的50%无菌甘油混匀,得到甘油冻存菌,-80℃保存。
实施例2
本实施例提供了高密度发酵制备上述长效GLP-1类似物的方法。
(1)溶液配制
A. 配制微量元素溶液
微量元素的组成为:一水合柠檬酸216.960 g/L、六水合三氯化铁15.120 g/L、硼酸0.460 g/L、一水合硫酸锰1.946 g/L、五水合硫酸铜II 0.337 g/L、二水钼酸钠0.380 g/L、六水合氯化钴0.380 g/L和氯化锌1.210 g/L,0.22μm滤器过滤除菌;
B. 配制一级菌种培养基
一级菌种培养基的组成成分为:胰蛋白胨18.0g/L,酵母浸粉12.0 g/L,氯化钠10.0 g/L;121℃灭菌30min;
C. 配制二级菌种培养基和发酵培养基
配制磷酸缓冲液:磷酸二氢钾207.5 g/L和磷酸氢二铵50.0 g/L;
配制50%葡萄糖硫酸镁溶液:葡萄糖(D(+)-葡萄糖, 一水)550.0 g/L和七水合硫酸镁54.4 g/L;
二级菌种培养基和发酵培养基的组成成分为:酵母抽提粉12.857g/L、一水合柠檬酸1.457 g/L、硫酸铵6.857 g/L、磷酸二氢钾7.886g/L、七水合硫酸亚铁0.090 g/L、无水氯化钙0.00196 g/L、磷酸缓冲液40.857 mL/L、50%葡萄糖硫酸镁溶液20 mL/L和微量元素溶液8.83 mL/L;
D. 其他培养基
流加阶段补料培养基:62.5%葡萄糖硫酸镁溶液(葡萄糖(D(+)-葡萄糖, 一水)572.917 g/L和七水合硫酸镁4.125 g/L);
诱导阶段补料培养基:62.5%葡萄糖硫酸镁溶液:40%酵母抽提粉溶液=4:1(体积比)的混合溶液,40%酵母抽提粉溶液的配制比例为酵母抽提粉400.0 g/L,七水合硫酸镁4.95 g/L;
根据发酵需要,可在二级菌种培养基、发酵培养基和葡萄糖硫酸镁溶液中添加适量消泡剂。
(2)菌种活化
一级菌种培养:取实施例1中构建保存的重组大肠杆菌工作菌种1支,吸取500μL菌液接入一级菌种培养基中,接种比例1:1000,恒温振荡器培养,培养条件温度30.0±1.0℃,转速220±22rpm,培养12-16h,当OD600nm值达到≥3.0,得一级菌种培养液;
二级菌种培养:将一级菌种培养液接入二级菌种培养基中,接种比例1:50,种子罐培养,培养条件:温度37.0±3.0℃,pH 6.80±0.20,初始转速300rpm,初始通气量10.0L/min,初始罐压0.050MPa,当OD600nm值达到≥3.0即为二级菌种培养液;
(3)发酵培养
将二级菌种培养液(≈21L)无菌接入发酵培养基中,接种比例1:10,发酵罐培养,初始培养条件:温度37.0±2.0℃,pH6.80±0.20,初始转速150rpm,初始通气量10.00m3/h,初始罐压0.050MPa,发酵培养过程中用氨水控制pH值,通过搅拌、通气量、罐压、通氧量,控制溶氧>5%;
流加培养:培养过程中当溶氧开始急速回升时,开始补料,调整补料速度,使补料发酵在10-12h时OD600nm增加至130以上;
诱导阶段:当OD600nm值达≥130.0以后,更换诱导阶段补料培养基继续培养,当OD600nm值达160.0±10.0时,添加诱导剂,1mmol/mL,待罐内温度降至30.0℃±2.0℃,发酵液pH值稳定在6.80±0.20时,诱导培养;诱导培养条件:温度30.0±2.0℃,pH6.80±0.20,转速280-320rpm,通气量8.00-22.00m3/h,罐压0.040-0.100MPa,用氨水控制pH值,通过搅拌、通气、罐压、氧气,控制溶氧>5%,调整流加诱导阶段补料培养基速度,使发酵在15-18h,增加至250左右;诱导培养至平台期停止发酵。
性能分析
利用实施例2提供的方法对实施例1得到的重组大肠杆菌进行发酵,1000L,两批次发酵结果见表1:
表1
由表1可知,本发明提供的发酵方法能够显著提高重组工程菌的菌体发酵密度,其中OD600nm发酵密度能够达到255以上,且能够显著提高菌体发酵表达量,其中目标蛋白表达量在13 g/L以上。
需要说明的是,在本文中,诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来,而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个……”限定的要素,并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式,使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 北京惠之衡生物科技有限公司
吉林惠升生物制药有限公司
<120> 一种高密度发酵制备GLP-1类似物的方法
<130> KP2212911.2Z
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
His Ile Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Arg Gly Gly
20 25 30
<210> 2
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttcaaattcg aattcaaatt cgaagacgac gacgacaaac acatcgaagg taccttcacc 60
tctgacgttt cttcttacct ggaagaacag gctgctcgtg aattcatcgc ttggctggtt 120
aaacgtggtg gt 132
Claims (5)
1.一种高密度发酵制备GLP-1类似物的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
(1)配制发酵培养基
所述发酵培养基的组成成分包括:酵母抽提粉8-15 g/L、一水合柠檬酸0.5-3 g/L、硫酸铵2-10 g/L、磷酸二氢钾5-10 g/L、七水合硫酸亚铁0.02-0.15 g/L、无水氯化钙0.001-0.01 g/L、葡萄糖8-12 g/L、七水合硫酸镁0.5-3 g/L和微量元素溶液5-10 mL/L;
其中,微量元素溶液的组成成分包括:一水合柠檬酸200-300 g/L、六水合三氯化铁10-20 g/L、硼酸0.1-1 g/L、一水合硫酸锰1-3 g/L、五水合硫酸铜II 0.1-1 g/L、二水钼酸钠0.1-1 g/L、六水合氯化钴0.1-1 g/L和氯化锌1-3 g/L;
(2)对重组大肠杆菌进行多级菌种活化培养,得活化菌种培养液;
所述活化培养的方法包括:
一级菌种培养:取冻存重组大肠杆菌,以1:1000的比例接种至一级菌种培养基,恒温振荡培养,培养温度30.0±1.0℃,转速220 ± 22rpm,培养12-16h,至菌种OD600nm值达到≥3.0,得一级菌种培养液,所述一级菌种培养基的组成成分包括胰蛋白胨15-20 g/L、酵母抽提粉10-15 g/L和氯化钠5-15 g/L;
二级菌种培养:将培养好的一级菌种培养液接入二级菌种培养基中,接种比例1:50,种子罐培养,培养条件:温度37.0±3.0℃,pH 6.80±0.20,初始通气量8-12 L/min,初始罐压0.050±0.005 MPa,当OD600nm值达到≥3.0,得到二级活化菌种培养液;所述二级菌种培养基成分与发酵培养基成分相同;
(3)将二级活化菌种培养液接种至发酵培养基中进行发酵培养;
所述发酵培养的方法包括:
活化菌种接种:将发酵培养基用磷酸缓冲液调节pH至6.8后,将二级活化菌种培养液无菌接入发酵培养基中,接种比例1:10,发酵罐培养;
初始培养条件:温度37.0±2.0℃,pH6.80±0.20,初始转速150 rpm,初始通气量8-12m3/h,初始罐压0.050±0.005 MPa;
发酵过程控制:发酵培养过程中控制pH值以及溶氧>5%,当溶氧回升,补加补料培养基,当OD600nm值≥130.0,更换补料培养基进行诱导培养至平台期停止发酵;
其中,所述更换前的补料培养基为62.5%葡萄糖硫酸镁溶液,所述更换后的补料培养基为62.5%葡萄糖硫酸镁溶液:40%酵母抽提粉溶液=4:1(体积比)的混合溶液,所述62.5%葡萄糖硫酸镁溶液由572.917 g/L的一水D(+)-葡萄糖和4.125 g/L的七水合硫酸镁组成,所述40%酵母抽提粉溶液由400.0 g/L酵母抽提粉和4.95 g/L的七水合硫酸镁组成;
所述重组大肠杆菌按照如下方法构建:
(A)构建GLP-1类似物的基因表达片段,所述基因表达片段的核酸序列如SEQ ID NO.2所示;
(B)将所述基因表达片段插入表达载体pET-30a(+)的NdeI和XhoI酶切位点之间,得到GLP-1类似物的重组表达质粒;
(C)将所述重组表达质粒转入大肠杆菌,得到表达所述GLP-1类似物的重组大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(C)为:将所述重组表达质粒通过热击法转化导入到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中,筛选得到所述重组大肠杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述微量元素的组成为:一水合柠檬酸216.960 g/L、六水合三氯化铁15.120 g/L、硼酸0.460 g/L、一水合硫酸锰1.946 g/L、五水合硫酸铜II 0.337 g/L、二水钼酸钠0.380 g/L、六水合氯化钴0.380 g/L和氯化锌1.210g/L。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述发酵培养基的组成为酵母抽提粉12.857g/L、一水合柠檬酸1.457 g/L、硫酸铵6.857 g/L、磷酸二氢钾7.886g/L、七水合硫酸亚铁0.090 g/L、无水氯化钙0.00196 g/L、磷酸缓冲液40.857 mL/L、50%葡萄糖硫酸镁溶液20 mL/L和微量元素溶液8.83 mL/L;其中,50%葡萄糖硫酸镁溶液由550.0 g/L的一水D(+)-葡萄糖和54.4 g/L的七水合硫酸镁组成。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述一级菌种培养基的组成成分为:胰蛋白胨18.0g/L,酵母浸粉12.0 g/L,氯化钠10.0 g/L。
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