CN117586980A - 一种经过突变改造的高性能腺苷蛋氨酸合成酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种经突变改造的腺苷蛋氨酸合成酶，属于生物技术领域。经突变改造后的腺苷蛋氨酸合成酶在配合氨基型酶载体使用时，能够使固定化时的酶取向性与结合区域分布更优，使酶分子与载体成键密度更好，结合更加牢度。因此，具有更高的酶活保留率、更好的底物转化率以及更长的使用寿命。重组酶于大肠杆菌工程菌中的表达量也可达30％以上的高水平。极大程度地提升了重组腺苷蛋氨酸合成酶的利用效率，大幅降低了酶促制备腺苷蛋氨酸的成本，提高了生产过程控制的稳定性、升级了其工业化生产水平。具有显著的实用性与经济价值。

Description

一种经过突变改造的高性能腺苷蛋氨酸合成酶及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种经突变改造的用于固定化使用的高性能腺苷蛋氨酸合成酶。经改造后的腺苷蛋氨酸合成酶在配合氨基型酶载体固定化使用时具有更高的酶活保留、更好的底物转化率以及更长的使用寿命，且重组酶于大肠杆菌工程菌中的表达量可达30％以上。
背景技术
S-腺苷-L-蛋氨酸(英文名S-adenosyl-L-methionine，简称腺苷蛋氨酸、SAM)是一种肝胆疾病常用药物的活性成分。它作为生物体最为重要的甲基供体具有转甲基作用，也具有转硫基、转丙胺基等作用，广泛分布于人体内各种组织和细胞中。在人体内能够发挥解毒、抗氧化作用，减少肝细胞的损伤；能够使质膜磷脂甲基化而调节肝脏细胞膜的流动性；只要肝内腺苷蛋氨酸的生物利用度在正常范围内，这些反应便有助于防止肝内胆汁淤积。其临床应用广泛，多应用于肝硬化前和肝硬化所致肝内胆汁淤积；妊娠期肝内胆汁淤积；抗脂肪肝等。另据国外报道，丁二磺酸腺苷蛋氨酸在治疗急慢性肝炎和妊娠黄疸方面均有明显疗效。国内报道该药品用于黄疸性肝炎的治疗时，其退黄作用显著。
S-腺苷-L-蛋氨酸的化学名称为5`-[[(3S)-3-氨基-3-羧基-丙基]甲基-(S)-砜]-5`-脱氧腺苷，其分子结构式参见附图1。SAM是一种双手性物质，(R,S)-SAM与(S,S)-SAM两种异构体，其中只有后者才具有生物活性。S-腺苷-L-蛋氨酸的制备方法主要有三种：(1)天然酵母菌(或经育种的筛选菌株)发酵后提取SAM；(2)利用重组腺苷蛋氨酸合成酶进行酶促催化生成SAM；(3)采用S-腺苷同型半胱氨酸与甲基供体进行化学合成SAM。其中，化学合成技术应用于工业化生产的难度很高，目前尚未见应用于腺苷蛋氨酸工业化生产的成功案例。天然菌发酵提取与体外酶促合成法则均已应用于工业化生产。
体外酶促合成法系利用基因工程技术，于细菌或酵母菌中超量表达重组腺苷蛋氨酸合成酶(简称SAM合成酶)。再将SAM合成酶提取并进行纯化后，作用于ATP、蛋氨酸、镁盐、钾盐等组成的底物液，在适宜的温度及pH值下消耗ATP使蛋氨酸腺苷化，酶促生成S-腺苷-L-蛋氨酸。该工艺的关键在于重组SAM合成酶的表达量与使用效率。酶活保留率、底物转化率、使用周期、重复使用次数等都是反映酶使用效率的指标。引入固定化酶技术能够大幅提高SAM合成酶的使用效率。固定化酶的技术及基质多种多样，其中氨基型载体是比较适用于SAM合成酶固定化的，例如专利CN 101985616所述。
氨基型载体以丙烯酸共聚物等材料为骨架结构，以氨基为官能团，其典型的伯氨基载体结构如附图2所示。该类酶载体在联酶使用前，一般首先于适宜条件下以稀的戊二醛溶液进行活化处理，戊二醛的一端醛基与载体官能团缩合连接，经活化后另一端暴露的醛基与酶分子中的碱性氨基酸残基侧链(如赖氨酸、精氨酸)及末端氨基缩合交联，进而实现酶分子的固定化。固定化酶是一项复杂的多因素交互影响的技术，成功的开发以及使用效率的提升难度很高。虽然固定化酶技术发展至今已具备了丰富的理论基础与技术手段。但由于各类酶的分子构象、性质与应用的多样性，使在载体与酶之间很难建立一个通用性固定化原则及方法，问题的复杂性依然存在。对于戊二醛活化的氨基型酶载体而言，酶分子的活性区域或其附近的碱性氨基酸残基侧链与载体连接，酶活性中心会被遮蔽进而造成固定化后酶活力的丧失；酶分子上一些不在酶活性中心的结构域，与载体发生交联也可能会导致酶活保留率的下降，比如一些位点的交联会阻碍酶分子高级结构的形成，进而导致酶活性的降低，因此酶取向的可控制性对于酶活保留率非常重要。酶分子与载体的成键数量过多、过高的结合点密度会使酶分子的空间结构柔性降低，导致酶活力降低；酶分子与载体官能团成键数量过少则会使酶分子更易脱落，造成使用寿命与次数的下降。
对于大多数天然酶分子而言，碱性氨基酸残基是无规律散布在其氨基酸全序列上的。如大肠杆菌源腺苷蛋氨酸合成酶由384个氨基酸残基组成，其N端第3位、18位、37位、47位、99位、154位、166位、177位、197位、209位、222位、246位、266位、270位、284位、320位、353位、370位、373位、384位，均为赖氨酸残基。在进行固定化处理时，这些赖氨酸残基侧链只要是暴露于酶分子表面的均有一定几率与酶载体上的醛基发生交联。“Takusagawa F,Kamitori S,Misaki S,et al.Crystal structure of S-adenosylmethioninesynthetase.[J].Journal of Biological Chemistry,1996,271(1):136-47.”、“Taylor JC,Markham GD.Conformational dynamics of the active site loop of S-adenosylmethionine synthetase illuminated by site-directed spin labeling[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,2003,415(2):164-171.”等文献对大肠杆菌腺苷蛋氨酸合成酶的三维构象、活性区域进行了研究与报导。揭示了大肠杆菌源metK基因编码的腺苷蛋氨酸合成酶由分子量为43KD的四个相同亚基组成，单亚基含有384个氨基酸残基。单体亚基结合为四聚体的高级结构后，才能够发挥生物活性。而在形成的四聚体高级结构中，两个同源亚基通过Glu42、Thr242、Arg244参与形成的盐桥组成紧密的二聚体，二聚体中亚基的紧密结合面为该酶的活性提供了刚性构架，使两个亚基之间形成活性位点，是酶活产生的关键。另外，B4 b-strand上的Ser93也在二聚体的形成上发挥了作用。两组二聚体再以相对较弱的结合形成四聚体，在二聚体结合为四聚体的时，Ser80与Cys89被认为发挥着关键作用。在腺苷蛋氨酸合成酶的四聚体活性结构中的每个亚基包含9个α-螺旋、11个β-折叠股、5个310螺旋，形成三个结构域，分别为1～12位与129～233位残基组成的N端区，13～101位与234～268位残基组成的中心区，以及108～128位与234～383位残基组成的C端区，参见附图3与图4。His14、Lys165、Lys245、Lys265、Glu8、Glu42、Asp16、Asp118、Cys239、Asp271等氨基酸残基被认为是参与生物活性的关键位点，这些位点与酶促时协同作用的Mg2+等二价金属离子、K+等单价金属离子、磷酸根离子以及反应底物的结合有关。
利用固定化酶技术，开发适宜的工艺进行腺苷蛋氨酸的酶促制备，能够大幅提升重组腺苷蛋氨酸合成酶的利用效率，降低生产成本。在此基础上，进一步提升固定化腺苷蛋氨酸合成酶的酶活保留率、催化效率、连接稳定性、使用寿命等性能指标，能够进一步降低腺苷蛋氨酸的生产成本，具有显著的实用性与经济价值，也具有更高的开发难度，需要攻克诸多技术难题。
与载体官能团成键密度过高，会使酶分子的柔性降低；与载体连接时的方向性不佳，酶活中心被遮蔽，这些原因均会造成固定化后一部分酶分子活性的丧失或减弱。酶活保留率这一指标即是反映经固定化处理后，酶活性损失的整体情况。催化效率用来表示固定化酶对反应底物的利用效率也即转化率，直接关乎到酶促合成的生产成本。连接稳定性是指酶分子与载体连接的牢固程度，用来反映固定化酶在使用过程中的脱落情况，是影响固定化酶使用寿命的重要因素。重组酶的表达量，则是指经工程菌的发酵及诱导表达后，能够获得的重组酶占全部菌体蛋白的百分比。这些主要技术指标之间存在一定的互斥性，想要同时实现这些主要指标的提升，以进一步提升腺苷蛋氨酸固定化酶的使用性能，进一步大幅降低腺苷蛋氨酸的生产成本，具备较高的技术难度。针对氨基型固定化酶载体，顾及均衡性的腺苷蛋氨酸合成酶的基因工程改造，是一个有可能实现上述性能突破的技术途径，而基于理性设计的腺苷蛋氨酸合成酶的分子改造研究也尚未见有报道。
发明内容
本发明针对氨基型固定化酶载体以及MetK基因编码的大肠杆菌腺苷蛋氨酸合成酶的结构特征，通过理性设计、定向改造与大量实验筛选工作，提供了一种经突变改造的腺苷蛋氨酸合成酶。相较原始酶，该突变后的腺苷蛋氨酸合成酶，在配合氨基酶载体固定化使用时具有更高的酶活性保留、更好的催化效率与稳定性，具有更长的使用寿命，性能更优。并且不对其重组表达量带来负面影响，在大肠杆菌工程菌中目的蛋白的表达量达到了30％以上的水平。
本发明旨在通过突变改造，增加酶分子与经戊二醛活化的氨基型载体结合的定向性，提高固定化连接后的酶活保留；增加重组腺苷蛋氨酸合成酶与载体的连接强度，使其在使用及存放过程中不易脱落，进而增加固定化酶的使用寿命；保证连接位点及数量的合理性，使酶分子的空间柔性不受影响，保证催化效率。通过对原始腺苷蛋氨酸合成酶的构象与序列解析，针对性设计以及多轮次的实验筛选，本发明突变位点的选择避开了腺苷蛋氨酸合成酶活性相关区域以及亚基结合相关区域所在的N端序列及中心序列。增加C端非活性区域的Lys残基丰度，增大该局部区域与酶载体的连接概率，酶活中心及其附近序列上的Lys残基与载体的结合概率也会随之减低，进而增加固定化时酶分子的定向性，提高固定化后的酶活保留。在C端区域中，突变操作倾向于末端序列，以使固定化后酶分子的空间柔性受到的影响较小。突变位点的设计与考察主要集中于氨基酸侧链多分布于螺旋外侧且柔性更好的310螺旋结构以及多位于蛋白分子表面的环区，以提高突变的Lys残基侧链的暴露性，使更易于与戊二醛活化后的氨基酶载体成键结合，以实现本发明的优化改造之意图。另外，突变改造时参考众多文献中报道的蛋白质工程化改造时突变Lys的实例经验，尽可能使突变改造不对重组酶的表达效率造成负面影响。综上，在酶活保留、固定化稳定性、催化效率、重组蛋白表达量等因素之间寻求最优平衡点，以确认改造突变位点的位置与数量，最终通过实验筛选获得最优改造方案。
具体地说，本发明提供了一种工程化突变改造的腺苷蛋氨酸合成酶。其氨基酸序列由序列为SEQ ID NO.1的大肠杆菌腺苷蛋氨酸合成酶改造而来，其改造方法为将第305位氨基酸V、第325位氨基酸Q、第343位氨基酸Q、第347位氨基酸L、第360位氨基酸H中的一个或多个突变改造为氨基酸K。
优选地，改造的腺苷蛋氨酸合成酶将SEQ ID NO.1氨基酸序列中的第305位氨基酸V、第325位氨基酸Q、第343位氨基酸Q、第347位氨基酸L、第360位氨基酸H中的3～4个突变改造为氨基酸K。
例如，一种突变改造的腺苷蛋氨酸合成酶，其序列为：
MAKHLFTSESVSEGHPDKIADQISDAVLDAILEQDPKARVACETYVKTGMVLVGGEITTSAWVDIEEITRNTVREIGYVHSDMGFDANSCAVLSAIGKQSPDINQGVDRADPLEQGAGDQGLMFGYATNETDVLMPAPITYAHRLVQRQAEVRKNGTLPWLRPDAKSQVTFQYDDGKIVGIDAVVLSTQHSEEIDQKSLQEAVMEEIIKPILPAEWLTSATKFFINPTGRFVIGGPMGDCGLTGRKIIVDTYGGMARHGGGAFSGKDPSKVDRSAAYAARYVAKNIVAAGLADRCEIQVSYAIGKAEPTSIMVETFGTEKVPSEKLTLLVREFFDLRPYGLIQMLDKLHPIYKETAAYGKFGREHFPWEKTDKAQLLRDAAGLK(SEQ ID NO.2)
一种突变改造的腺苷蛋氨酸合成酶，其序列也可以为：
MAKHLFTSESVSEGHPDKIADQISDAVLDAILEQDPKARVACETYVKTGMVLVGGEITTSAWVDIEEITRNTVREIGYVHSDMGFDANSCAVLSAIGKQSPDINQGVDRADPLEQGAGDQGLMFGYATNETDVLMPAPITYAHRLVQRQAEVRKNGTLPWLRPDAKSQVTFQYDDGKIVGIDAVVLSTQHSEEIDQKSLQEAVMEEIIKPILPAEWLTSATKFFINPTGRFVIGGPMGDCGLTGRKIIVDTYGGMARHGGGAFSGKDPSKVDRSAAYAARYVAKNIVAAGLADRCEIQVSYAIGVAEPTSIMVETFGTEKVPSEQLTLLVREFFDLRPYGLIKMLDKLHPIYKETAAYGKFGREHFPWEKTDKAQLLRDAAGLK(SEQ ID NO.3)
应理解，本发明的范围包括上述5个位点突变1～5个氨基酸残基的所有组合构成的技术方案，限于篇幅在此不再一一列述。
有益效果：本发明提供的经突变改造的重组腺苷蛋氨酸合成酶，在配合氨基酶载体进行固定化使用时，能够显著提高固定化后的酶活保留率、底物催化效率、连接稳定性以及使用寿命。相较经相同载体固定化的原始序列的腺苷蛋氨酸合成酶，其酶活保留与催化效率均能够提升30％以上，使用寿命能够提升1倍以上。催化效率的提升也能够减少反应底物的用量，经改造的重组腺苷蛋氨酸合成酶的发酵表达量也能够达到30％以上。整体上，大幅降低了腺苷蛋氨酸酶促制备的成本，提高了腺苷蛋氨酸生产过程控制的稳定性、升级了其工业化生产水平。
附图说明
图1S-腺苷-L-蛋氨酸的分子结构
图2伯氨基载体的结构示意图
图3大肠杆菌源腺苷蛋氨酸合成酶的结构图
图4大肠杆菌源腺苷蛋氨酸合成酶的序列与结构对应图
图5实施例1中腺苷蛋氨酸合成酶大肠杆菌工程菌制备过程中制得的重组载体pBV220-metK-SI032的结构
图6实施例1中腺苷蛋氨酸合成酶工程菌制备过程中的目的基因序列检测确认
图7实施例1中发酵及诱导后所得含改造酶工程菌的电泳表达量检测
图8测试例中酶促产物腺苷蛋氨酸含量检测的HPLC典型色谱图
图9实施例1与参比例1反应动力学曲线比对
图10腺苷蛋氨酸合成酶固定化反应示意图
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均视为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。
实施例一SEQ ID NO.2序列腺苷蛋氨酸合成酶的制备及固定化酶促应用
1.主要材料
细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)、质粒小提试剂盒(DP103)购自TIANGEN公司；克隆载体pBV220购自北京碧橙蓝生物科技有限责任公司；DH5α感受态、pEASY-BluntSimple Cloning Vector购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶EcoR I和SalI、T4DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；Pfu高保真DNA聚合酶购自TIANGEN公司；LB培养基所用蛋白胨、酵母粉购自OXOID公司；Agar购自JAPAN公司；戊二醛、七水合硫酸镁、硫酸钾、氯化铵、葡萄糖等购自国药集团化学试剂公司；三磷酸腺苷二钠购自杭州美亚药业股份有限公司；L-蛋氨酸购自无锡必康生物工程有限公司。
2.主要设备
电泳仪和紫外投射仪：北京六一；台式离心机：BECKMAN COULTER公司；恒温摇床：INNOVA公司；PCR扩增仪：TECHNE公司；发酵罐：上海国强、江苏镇江东方；酶促系统：青岛海越。
3.表达SEQ ID NO.2序列腺苷蛋氨酸合成酶的工程菌株的构建
①.根据SEQ ID NO.2的氨基酸序列(参见序列表)，参照大肠杆菌密码子使用偏好性数据，设计并合成改造的腺苷蛋氨酸合成酶核苷酸序列，全长1152bp，上下游分别加入EcoR I酶切位点与Sal I酶切位点，编号为metK-SI032，其序列信息参见序列表中的Sequence NO.2。
将合成的目的基因metK-SI032经PCR扩增后，与pEASY-Blunt Simple CloningVector混合，放入PCR仪中，37℃反应15min。再加入到DH5α感受态细胞中，轻轻混合，在冰浴中放置30分钟。42℃水浴中热激45秒，之后，加入无菌的LB培养基，置于37℃，200rpm振荡培养1小时，完成转化。于含100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基37℃培养过夜，再于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养10h，即得含有经改造的腺苷蛋氨酸合成酶基因重组质粒的菌株，加入等体积甘油冷冻保存。
②.根据质粒小提试剂盒说明书，培养上述菌株后提取pEASY-Blunt-metK-SI032质粒。以EcoR I限制性内切酶与Sal I限制性内切酶对pEASY-Blunt-metK-SI032质粒进行酶切，电泳鉴定metK-SI032基因片段。再以EcoR I限制性内切酶与Sal I限制性内切酶对pBV220质粒进行酶切。
将经过双酶切的质粒pBV220与回收的metK-SI032基因均匀混合，加入10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL，T4 DNA连接酶(350U/μl)1μL，混匀，于16℃保温12h以上，得到重组表达载体pBV220-metK-SI032，其结构图如附图5所示。测序分析测得目的基因序列与理论结果完全相一致，其目的基因序列如图6所示。GAATTC：限制性内切酶EcoR I酶切位点；GTCGAC：限制性内切酶Sal I酶切位点；ATG：起始密码子；TAA：终止密码子。
取重组表达载体pBV220-metK-SI032加到冰浴上融化的DH5α感受态细胞中，轻轻混合，在冰浴中放置30分钟；42℃水浴中热激45秒。再加入500μL无菌的LB培养基，混匀后置于37℃，200rpm培养1小时，完成转化。取已转化菌液，涂布于含梯度浓度氨苄青霉素的各LB琼脂培养基，倒置培养过夜。挑取各平板上的单菌落，筛选腺苷蛋氨酸合成酶表达量最高的阳性转化子，即为表达经改造的序列为SEQ ID NO.2的腺苷蛋氨酸合成酶的重组pBV220-metK-SI032/DH5α工程菌。
4.SEQ ID NO.2序列腺苷蛋氨酸合成酶的制备
①.以灭菌后的LB培养基，于30～37℃进行pBV220-metK-SI032/DH5α工程菌的一级种子液与二级种子液扩增培养，培养至OD600值1.0～2.5。根据发酵规模设置相应的种子培养级数。
按照Na2HPO4·12H2O 11.0g/L、KH2PO42.7g/L、NaCl 0.45g/L、YEAST EXTRACT9.0g/L、蛋白胨13.0g/L的配方配制130L培养基，于200L发酵罐121.0℃，30min在位灭菌。加入已灭菌的50.0g/LMgSO4溶液500ml、250.0g/LNH4Cl溶液500ml，将培养好的种子液按接种量4～10％接入一级发酵罐，再流加葡萄糖溶液。在搅拌转速140～500rpm、通气量0.5～1.0vvm、溶氧≥30％氧、温度32.0～35.0的控制条件下，进行培养扩增，培养至OD600值4.0～9.0后，转接入二级发酵罐进行发酵培养与诱导表达，该步骤所使用的培养基与上一级培养相同，搅拌转速140～500rpm、通气量0.25～1.0vvm、pH值7.00±0.20、溶氧≥20％、温度32.0～38.0℃。待培养密度达到要求后，升温至42℃并维持1.0～5.0h进行诱导，诱导结束后，使用高速管式离心机以14000r/min的转速，进行菌体收集。以SDS-PAGE电泳进行检测，目的蛋白表达量在30％以上，参见附图7。
②.将发酵所得含腺苷蛋氨酸合成酶的菌体，按一定比例混匀于pH值7.4的TE缓冲液中。使用高压均质机以65～90Mpa的压力进行破碎。再使用连续流管式离心机以14000rpm的转速澄清。加入硫酸铵静置盐析后，使用连续流管式离心机以14000rpm的转速澄清，得到联酶用酶液。
取已清洗的伯氨基载体，按质量比为1:10加入纯化水中，开启搅拌，设置温度23℃，加入50％戊二醛至终浓度为0.5～0.8％，在15～25℃控温搅拌的条件下活化6～12h，之后以纯化水进行洗涤，去除残存的戊二醛。将清洗后的已活化酶载体装载于层析柱或类似功能柱中，将所得酶液以0.5～1.0cm/min的线性流速上样至该柱床中，循环输料直至联酶完毕。之后，以纯化水进行清洗，再以0.15～0.30％的乙二胺浸泡3h，进行洗涤与封端，最后以纯化水冲洗至pH值5.0～7.5。
5.利用固定化合成酶制备腺苷蛋氨酸
将固定化酶装载于可温控酶促柱中，按照三磷酸腺苷二钠0.018～0.030mol/L、L-蛋氨酸0.06～0.09mol/L、EDTA-Na20.2～0.38mmol/L、Mg2+0.06～0.12mol/L、K+0.08～0.2mol/L与氢氧化钠适量进行底物液的配制。将底物液以0.25～2.0cm/min的线性流速泵入酶促柱中，酶促柱温控制在35～40℃，进行连续流酶促反应。期间检测酶促液中腺苷蛋氨酸的浓度，并根据浓度变化情况调整底物液输料速度，流速调节不得低于初始值的60％。所收集的腺苷蛋氨酸酶促液，用2M H2SO4溶液调pH值至3.0～4.0终止酶促反应。
实施例二SEQ ID NO.3序列腺苷蛋氨酸合成酶的制备及固定化酶促应用
该突变的腺苷蛋氨酸合成酶氨基酸序列参见序列表中的SEQ ID NO.3，其对应的核苷酸序列信息参见序列表中的Sequence NO.3。
除氨基酸序列以及对应的核苷酸序列有所不同外，其操作均与实施例一相一致。
参比例一SEQ ID NO.4序列腺苷蛋氨酸合成酶的制备及固定化酶促应用
该突变的腺苷蛋氨酸合成酶氨基酸序列参见序列表中的SEQ ID NO.4，其对应的核苷酸序列信息参见序列表中的Sequence NO.4。
除氨基酸序列以及对应的核苷酸序列有所不同外，其操作均与实施例一相一致。
参比例二SEQ ID NO.5序列腺苷蛋氨酸合成酶的制备及固定化酶促应用
该突变的腺苷蛋氨酸合成酶氨基酸序列参见序列表中的SEQ ID NO.5，其对应的核苷酸序列信息参见序列表中的Sequence NO.5。
除氨基酸序列以及对应的核苷酸序列有所不同外，其操作均与实施例一相一致。
参比例三SEQ ID NO.6序列腺苷蛋氨酸合成酶的制备及固定化酶促应用
该突变的腺苷蛋氨酸合成酶氨基酸序列参见序列表中的SEQ ID NO.6，其对应的核苷酸序列信息参见序列表中的Sequence NO.6。
除氨基酸序列以及对应的核苷酸序列有所不同外，其操作均与实施例一相一致。
参比例四SEQ ID NO.7序列腺苷蛋氨酸合成酶的制备及固定化酶促应用
该突变的腺苷蛋氨酸合成酶氨基酸序列参见序列表中的SEQ ID NO.7，其对应的核苷酸序列信息参见序列表中的Sequence NO.7。
除氨基酸序列以及对应的核苷酸序列有所不同外，其操作均与实施例一相一致。
参比例五SEQ ID NO.1序列腺苷蛋氨酸合成酶的制备及固定化酶促应用
该腺苷蛋氨酸合成酶氨基酸序列为原始序列，参见序列表中的SEQ ID NO.1，其对应的核苷酸序列信息参见序列表中的Sequence NO.1。
除氨基酸序列以及对应的核苷酸序列有所不同外，以及其目的基因是参照细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书进行提取而非合成外，其它操作均与实施例一相一致。
测试例
在测试例中，以相对于原始酶的固定化后的酶活力保留率、底物催化效率、连续使用寿命、重组蛋白表达量等指标对各实施例及参比例的腺苷蛋氨酸合成酶性能进行全面评价与比对。
1.腺苷蛋氨酸的含量检测：酶促反应液中腺苷蛋氨酸的生成量可用于固定化酶的酶活保留率、底物催化效率以及连续使用寿命的计算。
具体的测试方法为：取样用高效液相色谱法测腺苷蛋氨酸(SAM)含量。照高效液相色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.2mol/L甲酸铵的0.1％辛烷磺酸钠溶液(用甲酸调节pH值至2.8)-甲醇-乙腈(750:250:5)为流动相；检测波长为260nm，柱温15℃。理论板数按腺苷蛋氨酸峰计算应不低于3000。
测定法取本品适量，稀释至约0.1mg/ml过滤后精密量取供20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取丁二磺酸腺苷蛋氨酸对照品适量，加水溶解制成每1ml中约含0.1mg的溶液(以腺苷蛋氨酸计)作为含量对照品溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得SAM的含量，典型色谱图参见附图8。
2.固定化后的相对酶活力保留率：是指同步原始酶，经氨基载体的固定化处理后，分别将各固定化酶加入底物浓度及体积一定的底物液中进行控温的酶促反应，当原始酶的转化率达到40％左右时，相同反应时间下改造酶的酶促转化率相对于原始酶转化率的比率。
具体的测试方法为：按照三磷酸腺苷二钠0.018～0.030mol/L、L-蛋氨酸0.06～0.09mol/L、EDTA-Na20.2～0.38mmol/L、Mg2+0.06～0.12mol/L、K+0.08～0.2mol/L，调pH值至7.0～7.5，配制反应底物液。
取100ml上述配制的反应液各一份，分别加入20g待测酶与原始酶的固定化酶，温度36～38℃，振荡150～200rpm，同步反应4～16小时并监测腺苷蛋氨酸生成量，至原始酶的转化率达到40％左右时，用2M硫酸调pH至3.5～4.0终止反应，使用HPLC进行腺苷蛋氨酸的含量检测。进一步计算产物SAM的摩尔浓度与反应开始前底物液中ATP-Na2的摩尔浓度，即可得酶促转化率。反应过程中腺苷蛋氨酸生成量的监测结果也可用于反应动力学的对比。
3.相对底物催化效率：是指同步原始酶，将新制的腺苷蛋氨酸合成酶的固定化酶分别等量装载于控温酶促柱，以一定的线性流速将底物液流加入酶促柱中，控温进行连续流酶促反应，相同的酶促液流穿体积下改造酶的酶促转化率相对于原始酶转化率的比率。
具体的测试方法为：按照三磷酸腺苷二钠0.018～0.030mol/L、L-蛋氨酸0.06～0.09mol/L、EDTA-Na20.2～0.38mmol/L、Mg2+0.06～0.12mol/L、K+0.08～0.2mol/L，调pH值至7.0～7.5，配制反应底物液。
将新制的腺苷蛋氨酸合成酶的固定化酶分别等量装载于控温酶促柱，将底物液以0.8～1.2cm/min的线性流速泵入酶促柱中，酶促柱温控制在35～39℃，进行连续流酶促反应，于柱下端出液口收集的腺苷蛋氨酸酶促液，用2M H2SO4溶液调pH值至3.5～4.0终止酶促反应。当流穿的酶促反应液达2～4倍柱体积时取样，使用HPLC进行腺苷蛋氨酸的含量检测。进一步计算产物SAM的摩尔浓度与反应开始前底物液中ATP-Na2的摩尔浓度，即可得酶促转化率。
4.连续使用寿命：是指将新制的腺苷蛋氨酸合成酶的固定化酶分别等量装载于控温酶促柱，以一定的线性流速范围将底物液流加入酶促柱中，控温进行不间断的连续流酶促反应，在限定的流速范围内当酶促转化率低于初始值的75％时，认为固定化酶不再适合继续使用，即为其使用寿命。
具体的测试方法为：按照三磷酸腺苷二钠0.018～0.030mol/L、L-蛋氨酸0.06～0.09mol/L、EDTA-Na20.2～0.38mmol/L、Mg2+0.06～0.12mol/L、K+0.08～0.2mol/L，调pH值至7.0～7.5，配制反应底物液。
将新制的腺苷蛋氨酸合成酶的固定化酶装载于控温酶促柱，将底物液以1.0cm/min的起始线性流速泵入酶促柱中，酶促柱温控制在35～39℃，进行不间断的连续流酶促反应，于柱下端出液口收集的腺苷蛋氨酸酶促液，用2M H2SO4溶液调pH值至3.5～4.0终止酶促反应。期间以HPLC持续检测酶促液中腺苷蛋氨酸的浓度，并根据浓度变化情况调整底物液输料速度，最低可调整至初始流速的60％。当酶促转化率低于初始值的75％时，结束连续流固定化酶促反应，此时的总耗时及为固定化酶的连续使用寿命。
5.重组酶表达量：将发酵所得的表达重组腺苷蛋氨酸合成酶的大肠杆菌工程菌破菌后，离心收集上清液。使用SDS-PAGE电泳法检测目的蛋白占全菌蛋白的百分比，以此表示目的蛋白的表达量。
具体的测试方法为：
采用非还原型SDS-PAGE检测，15％的分离胶，常规考马斯亮蓝染色，凝胶经凝胶成像仪做灰度扫描判定。参照《中华人民共和国药典》2015年版四部0541“电泳法”第五法“SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳”分析。
a.试剂
(1)水(电阻率应不低于18MΩ·cm)。
(2)30％丙烯酰胺：称取145.5g丙烯酰胺，4.5g甲叉丙烯酰胺，用水定容至500mL。
(3)1.5M Tris(pH8.8)：18.15g Tris加适量水溶解，用HCl调pH至8.8，加水至100mL。
(4)0.5M Tris(pH6.8)：6.05g Tris加适量水溶解，用HCl调pH至6.8，加水至100mL。
(5)10％SDS：称取10gSDS，加入100mL水，摇匀。
(6)TEMED：N,N,N',N'-四甲基乙二胺。
(7)10％AP：称取10g过硫酸铵，加水100mL，摇匀。
(8)溴酚蓝溶液：称取10mg溴酚蓝，加入10mL水溶解，摇匀，过滤。
(9)电极缓冲液：称取72g甘氨酸、15.1g Tris、5g SDS，加适量水稀释，定容至1000mL。
(10)非还原液：量取19mL水、5mL0.5M Tris(pH6.8)、8mL10％SDS、4mL甘油、2mL溴酚蓝溶液，混匀。
(11)染色液称取考马斯亮蓝R2501g，加入甲醇200ml，冰醋酸50ml，水250ml，混合均匀。
(12)脱色液量取冰醋酸100ml，甲醇400ml，水500ml，混合均匀。
(13)分子量标准品(Low Range Protein Ladder，Thermo)
b.供试品溶液的制备
取腺苷蛋氨酸合成酶样品适量，用水溶解，与水按4:1的比例混匀，置微波炉中高火水浴加热15min。
c.测定法
(1)制备分离胶溶液：按表1制备分离胶溶液，灌入模具内至一定高度，加水封顶，室温下聚合。
表1腺苷蛋氨酸合成酶电泳胶板组方
(2)制备浓缩胶溶液：待分离胶溶液聚合后，用滤纸吸去上面的水层，再灌入浓缩胶溶液(配方见上表)，插入样品梳，注意避免气泡。
(3)加样：待浓缩胶溶液聚合后小心拔出样品梳，电泳上下槽中分别注入电泳缓冲液，在加样孔中加入供试品溶液10μg、分子量标准品5μg。
(4)电泳：恒压电泳，初始电压为80V，进入分离胶时调整电压为160V，当溴酚蓝迁移至距离胶底1cm处停止电泳。
(5)染色：取出胶片，放入染色液中染色1～2小时，用脱色液脱色至凝胶背景透明。取出凝胶置于凝胶成像仪中拍照保存。
d.结果判断
脱色处理后的凝胶经凝胶成像仪做灰度扫描判定重组腺苷蛋氨酸合成酶条带占菌体总蛋白量的比例。
6.各实施例与参比例的各性能指标检测结果及比对
按照测试例1-5中提供的检测方法，对本发明公开的突变改造方案范围内的实施例1、2以及范围之外的突变改造方案的参比例1、2、3、4，还有原始酶的参比例5进行了重组酶表达量、固定化后的相对酶活力保留率、相对底物催化效率及连续使用寿命等指标的测试与比较，并对实施例1与参比例5的反应动力学曲线进行对比，参见图9。结果显示，按照本发明提供的突变改造方案制得的腺苷蛋氨酸合成酶在配合氨基载体使用时，表现出了全面的优势，反应动力学更优，整体性能升级显著，能够大幅降低酶促法制备腺苷蛋氨酸的生产成本，提升其工业化制备水平。测试结果的比较参见表2。
表2各例的固定化酶性能比对结果
序号 氨基酸序列号 重组蛋白表达量 相对酶活保留率 相对酶促转化率 相对使用寿命
参比例5 SEQ ID NO.1 ＞30％ 100％ 100％ 100％
实施例1 SEQ ID NO.2 ＞30％ 138％ 141％ ＞250％
实施例2 SEQ ID NO.3 ＞30％ 131％ 133％ ＞200％
参比例1 SEQ ID NO.4 ＞30％ 91％ 94％ --
参比例2 SEQ ID NO.5 约5％ 107％ 102％ --
参比例3 SEQ ID NO.6 约11％ 102％ 97％ --
参比例4 SEQ ID NO.7 约16％ 73％ 66％ --
序列表
SEQ ID NO.1原始氨基酸序列
MAKHLFTSESVSEGHPDKIADQISDAVLDAILEQDPKARVACETYVKTGMVLVGGEITTSAWVDIEEITRNTVREIGYVHSDMGFDANSCAVLSAIGKQSPDINQGVDRADPLEQGAGDQGLMFGYATNETDVLMPAPITYAHRLVQRQAEVRKNGTLPWLRPDAKSQVTFQYDDGKIVGIDAVVLSTQHSEEIDQKSLQEAVMEEIIKPILPAEWLTSATKFFINPTGRFVIGGPMGDCGLTGRKIIVDTYGGMARHGGGAFSGKDPSKVDRSAAYAARYVAKNIVAAGLADRCEIQVSYAIGVAEPTSIMVETFGTEKVPSEQLTLLVREFFDLRPYGLIQMLDLLHPIYKETAAYGHFGREHFPWEKTDKAQLLRDAAGLK
SEQ ID NO.2突变氨基酸序列
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SEQ ID NO.3突变氨基酸序列
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SEQ ID NO.4突变氨基酸序列
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SEQ ID NO.5突变氨基酸序列
MAKHLFTSESVSEGHPDKIADQISDAVLDAILEQDPKARVACETYVKTGMVLVGGEITTSAWVDIEEITRNTVREIGYVHSDMGFDANSCAVLSAIGKQSPDINQGVDRADPLEQGAGDQGLMFGYATNETDVLMPAPITYAHRLVQRQAEVRKNGTLPWLRPDAKSQVTFQYDDGKIVGIDAVVLSTQHSEEIDQKSLQEAVMEEIIKPILPAEWLTSATKFFINPTGRFVIGGPMGDCGLTGRKIIKDTYGGMARHGGGAFSGKDPSKVDRSAAYKARYVAKNIVAAGLADRCEIQVSYAIGVAEPTSIMVEKFGTEKVPSEQLTLLVREFFDLRPYGLIQMLDLLHPIYKETAAYGHFGREHFKWEKTDKAQLLRDAAGLK
SEQ ID NO.6突变氨基酸序列
MAKHLFTSESVSEGHPDKIADQISDAVLDAILEQDPKARVACETYVKTGMVLVGGEITTSAWVDIEEITRNTVREIGYVHSDMGFDANSCAVLSAIGKQSPDINQGVDRADPLEQGAGDQGLMFGYATNETDVLMPAPITYAHRLVQRQAEVRKNGTLPWLRPDAKSQVTFQYDDGKIVGIDAVVLSTQHSEEIDQKSLQEAVMEEIIKPILPAEWLTSATKFFINPTGRFVIGGPMGDCGLTGRKIIVDTYGGMARHKGGAFSGKDPSKVDRSAAYAARYVAKNIVAKGLADRCEIQVSYAIGKAEPTSIMVETFGTEKVPSEQLTLLVREFFDLRPYGLIKMLDKLHPIYKETAAYGKFGREHFPWEKTDKAQLLRDAAGLK
SEQ ID NO.7突变氨基酸序列
MAKHLFTSESVSEGHPDKIADQISDAVLDAILEQDPKARVACETYVKTGMVLVGGEITTSAWVDIEEITRNTVREIGYVHSDMGFDKNSCAVLSAIGKQSPDINQGVDRADPLKQGAGDQGLMFGYATNETDKLMPAPITYAHRLVQRQAEVRKNGTLPWLRPDAKSQVTFQYDDGKIVGIDAVVLSTQHSEKIDQKSLQEAVMEEIIKPILPAEWLTSATKFFINPTGRFVIGGPMGDCGLTGRKIIVDTYGGMARHGGGAFSGKDPSKVDRSAAYAARYVAKNIVAAGLADRCEIQVSYAIGVAEPTSIMVETFGTEKVPSEQLTLLVREFFDLRPYGLIQMLDLLHPIYKETAAYGHFGREHFPWEKTDKAQLLRDAAGLK
Sequence NO.1原始核苷酸序列
ATGGCAAAACACCTTTTTACGTCCGAGTCCGTCTCTGAAGGGCATCCTGACAAAATTGCTGACCAAATTTCTGATGCCGTTTTAGACGCGATCCTCGAACAGGATCCGAAAGCACGCGTTGCTTGCGAAACCTACGTAAAAACCGGCATGGTTTTAGTTGGCGGCGAAATCACCACCAGCGCCTGGGTAGACATCGAAGAGATCACCCGTAACACCGTTCGCGAAATTGGCTATGTGCATTCCGACATGGGCTTTGACGCTAACTCCTGTGCGGTTCTGAGCGCTATCGGCAAACAGTCTCCTGACATCAACCAGGGCGTTGACCGTGCCGATCCGCTGGAACAGGGCGCGGGTGACCAGGGTCTGATGTTTGGCTACGCAACTAATGAAACCGACGTGCTGATGCCAGCACCTATCACCTATGCACACCGTCTGGTACAGCGTCAGGCTGAAGTGCGTAAAAACGGCACTCTGCCGTGGCTGCGCCCGGACGCGAAAAGCCAGGTGACTTTTCAGTATGACGACGGCAAAATCGTTGGTATCGATGCTGTCGTGCTTTCCACTCAGCACTCTGAAGAGATCGACCAGAAATCGCTGCAAGAAGCGGTAATGGAAGAGATCATCAAGCCAATTCTGCCCGCTGAATGGCTGACTTCTGCCACCAAATTCTTCATCAACCCGACCGGTCGTTTCGTTATCGGTGGCCCAATGGGTGACTGCGGTCTGACTGGTCGTAAAATTATCGTTGATACCTACGGCGGCATGGCGCGTCACGGTGGCGGTGCATTCTCTGGTAAAGATCCATCAAAAGTGGACCGTTCCGCAGCCTACGCAGCACGTTATGTCGCGAAAAACATCGTTGCTGCTGGCCTGGCCGATCGTTGTGAAATTCAGGTTTCCTACGCAATCGGCGTGGCTGAACCGACCTCCATCATGGTAGAAACTTTCGGTACTGAGAAAGTGCCTTCTGAACAACTGACCCTGCTGGTACGTGAGTTCTTCGACCTGCGCCCATACGGTCTGATTCAGATGCTGGATCTGCTGCACCCGATCTACAAAGAAACCGCAGCATACGGTCACTTTGGTCGTGAACATTTCCCGTGGGAAAAAACCGACAAAGCGCAGCTGCTGCGCGATGCTGCCGGTCTGAAGTAA
Sequence NO.2突变核苷酸序列
ATGGCAAAACACCTTTTTACGTCCGAGTCCGTCTCTGAAGGGCATCCTGACAAAATTGCTGACCAAATTTCTGATGCCGTTTTAGACGCGATCCTCGAACAGGATCCGAAAGCACGCGTTGCTTGCGAAACCTACGTAAAAACCGGCATGGTTTTAGTTGGCGGCGAAATCACCACCAGCGCCTGGGTAGACATCGAAGAGATCACCCGTAACACCGTTCGCGAAATTGGCTATGTGCATTCCGACATGGGCTTTGACGCTAACTCCTGTGCGGTTCTGAGCGCTATCGGCAAACAGTCTCCTGACATCAACCAGGGCGTTGACCGTGCCGATCCGCTGGAACAGGGCGCGGGTGACCAGGGTCTGATGTTTGGCTACGCAACTAATGAAACCGACGTGCTGATGCCAGCACCTATCACCTATGCACACCGTCTGGTACAGCGTCAGGCTGAAGTGCGTAAAAACGGCACTCTGCCGTGGCTGCGCCCGGACGCGAAAAGCCAGGTGACTTTTCAGTATGACGACGGCAAAATCGTTGGTATCGATGCTGTCGTGCTTTCCACTCAGCACTCTGAAGAGATCGACCAGAAATCGCTGCAAGAAGCGGTAATGGAAGAGATCATCAAGCCAATTCTGCCCGCTGAATGGCTGACTTCTGCCACCAAATTCTTCATCAACCCGACCGGTCGTTTCGTTATCGGTGGCCCAATGGGTGACTGCGGTCTGACTGGTCGTAAAATTATCGTTGATACCTACGGCGGCATGGCGCGTCACGGTGGCGGTGCATTCTCTGGTAAAGATCCATCAAAAGTGGACCGTTCCGCAGCCTACGCAGCACGTTATGTCGCGAAAAACATCGTTGCTGCTGGCCTGGCCGATCGTTGTGAAATTCAGGTTTCCTACGCAATCGGCAAAGCTGAACCGACCTCCATCATGGTAGAAACTTTCGGTACTGAGAAAGTGCCTTCTGAAAAGCTGACCCTGCTGGTACGTGAGTTCTTCGACCTGCGCCCATACGGTCTGATTCAGATGCTGGATAAACTGCACCCGATCTACAAAGAAACCGCAGCATACGGTAAGTTTGGTCGTGAACATTTCCCGTGGGAAAAAACCGACAAAGCGCAGCTGCTGCGCGATGCTGCCGGTCTGAAGTAA
Sequence NO.3突变核苷酸序列
ATGGCAAAACACCTTTTTACGTCCGAGTCCGTCTCTGAAGGGCATCCTGACAAAATTGCTGACCAAATTTCTGATGCCGTTTTAGACGCGATCCTCGAACAGGATCCGAAAGCACGCGTTGCTTGCGAAACCTACGTAAAAACCGGCATGGTTTTAGTTGGCGGCGAAATCACCACCAGCGCCTGGGTAGACATCGAAGAGATCACCCGTAACACCGTTCGCGAAATTGGCTATGTGCATTCCGACATGGGCTTTGACGCTAACTCCTGTGCGGTTCTGAGCGCTATCGGCAAACAGTCTCCTGACATCAACCAGGGCGTTGACCGTGCCGATCCGCTGGAACAGGGCGCGGGTGACCAGGGTCTGATGTTTGGCTACGCAACTAATGAAACCGACGTGCTGATGCCAGCACCTATCACCTATGCACACCGTCTGGTACAGCGTCAGGCTGAAGTGCGTAAAAACGGCACTCTGCCGTGGCTGCGCCCGGACGCGAAAAGCCAGGTGACTTTTCAGTATGACGACGGCAAAATCGTTGGTATCGATGCTGTCGTGCTTTCCACTCAGCACTCTGAAGAGATCGACCAGAAATCGCTGCAAGAAGCGGTAATGGAAGAGATCATCAAGCCAATTCTGCCCGCTGAATGGCTGACTTCTGCCACCAAATTCTTCATCAACCCGACCGGTCGTTTCGTTATCGGTGGCCCAATGGGTGACTGCGGTCTGACTGGTCGTAAAATTATCGTTGATACCTACGGCGGCATGGCGCGTCACGGTGGCGGTGCATTCTCTGGTAAAGATCCATCAAAAGTGGACCGTTCCGCAGCCTACGCAGCACGTTATGTCGCGAAAAACATCGTTGCTGCTGGCCTGGCCGATCGTTGTGAAATTCAGGTTTCCTACGCAATCGGCGTGGCTGAACCGACCTCCATCATGGTAGAAACTTTCGGTACTGAGAAAGTGCCTTCTGAACAACTGACCCTGCTGGTACGTGAGTTCTTCGACCTGCGCCCATACGGTCTGATTAAGATGCTGGATAAACTGCACCCGATCTACAAAGAAACCGCAGCATACGGTAAGTTTGGTCGTGAACATTTCCCGTGGGAAAAAACCGACAAAGCGCAGCTGCTGCGCGATGCTGCCGGTCTGAAGTAA
Sequence NO.4突变核苷酸序列
ATGGCAAAACACCTTTTTACGTCCGAGTCCGTCTCTGAAGGGCATCCTGACAAAATTGCTGACCAAATTTCTGATGCCGTTTTAGACGCGATCCTCGAACAGGATCCGAAAGCACGCGTTGCTTGCGAAACCTACGTAAAAACCGGCATGGTTTTAGTTGGCGGCGAAATCACCACCAGCGCCTGGGTAGACATCGAAGAGATCACCCGTAACACCGTTCGCGAAATTGGCTATGTGCATTCCGACATGGGCTTTGACGCTAACTCCTGTGCGGTTCTGAGCGCTATCGGCAAACAGTCTCCTGACATCAACCAGGGCGTTGACCGTGCCGATCCGCTGGAACAGGGCGCGGGTGACCAGGGTCTGATGTTTGGCTACGCAACTAAAGAAACCGACGTGCTGATGCCAGCACCTATCACCTATGCACACCGTCTGGTACAGCGTCAGGCTGAAGTGCGTAAAAACGGCACTCTGCCGTGGCTGCGCCCGGACGCGAAAAGCCAGGTGACTTTTCAGTATGACGACGGCAAAATCGTTGGTATCGATGCTGTCGTGCTTTCCACTCAGCACTCTGAAGAGATCGACCAGAAATCGCTGCAAGAAGCGGTAATGGAAGAGATCATCAAGCCAATTCTGCCCGCTGAATGGCTGACTTCTGCCACCAAATTCTTCATCAACCCGACCGGTCGTTTCGTTATCGGTGGCCCAATGGGTGACTGCGGTCTGACTGGTCGTAAAATTATCGTTGATACCTACGGCGGCATGGCGCGTCACGGTGGCAAAGCATTCTCTGGTAAAGATCCATCAAAAGTGGACCGTTCCGCAGCCTACGCAGCACGTTATGTCGCGAAAAACATCGTTGCTGCTGGCCTGGCCGATCGTTGTGAAATTCAGGTTTCCTACGCAATCGGCAAAGCTGAACCGACCTCCATCATGGTAGAAACTTTCGGTACTGAGAAAGTGCCTTCTGAACAGCTGACCCTGCTGGTACGTGAGTTCTTCGACCTGCGCCCATACGGTCTGATTCAGATGCTGGATCTGCTGCACCCGATCTACAAAGAAACCGCAGCATACGGTCACTTTGGTCGTGAACATTTCCCGTGGGAAAAAACCGACAAAGCGCAGCTGCTGCGCGATGCTGCCGGTCTGAAGTAA
Sequence NO.5突变核苷酸序列
ATGGCAAAACACCTTTTTACGTCCGAGTCCGTCTCTGAAGGGCATCCTGACAAAATTGCTGACCAAATTTCTGATGCCGTTTTAGACGCGATCCTCGAACAGGATCCGAAAGCACGCGTTGCTTGCGAAACCTACGTAAAAACCGGCATGGTTTTAGTTGGCGGCGAAATCACCACCAGCGCCTGGGTAGACATCGAAGAGATCACCCGTAACACCGTTCGCGAAATTGGCTATGTGCATTCCGACATGGGCTTTGACGCTAACTCCTGTGCGGTTCTGAGCGCTATCGGCAAACAGTCTCCTGACATCAACCAGGGCGTTGACCGTGCCGATCCGCTGGAACAGGGCGCGGGTGACCAGGGTCTGATGTTTGGCTACGCAACTAATGAAACCGACGTGCTGATGCCAGCACCTATCACCTATGCACACCGTCTGGTACAGCGTCAGGCTGAAGTGCGTAAAAACGGCACTCTGCCGTGGCTGCGCCCGGACGCGAAAAGCCAGGTGACTTTTCAGTATGACGACGGCAAAATCGTTGGTATCGATGCTGTCGTGCTTTCCACTCAGCACTCTGAAGAGATCGACCAGAAATCGCTGCAAGAAGCGGTAATGGAAGAGATCATCAAGCCAATTCTGCCCGCTGAATGGCTGACTTCTGCCACCAAATTCTTCATCAACCCGACCGGTCGTTTCGTTATCGGTGGCCCAATGGGTGACTGCGGTCTGACTGGTCGTAAAATTATCAAAGATACCTACGGCGGCATGGCGCGTCACGGTGGCGGTGCATTCTCTGGTAAAGATCCATCAAAAGTGGACCGTTCCGCAGCCTACAAAGCACGTTATGTCGCGAAAAACATCGTTGCTGCTGGCCTGGCCGATCGTTGTGAAATTCAGGTTTCCTACGCAATCGGCGTGGCTGAACCGACCTCCATCATGGTAGAAAAATTCGGTACTGAGAAAGTGCCTTCTGAACAGCTGACCCTGCTGGTACGTGAGTTCTTCGACCTGCGCCCATACGGTCTGATTCAGATGCTGGATCTGCTGCACCCGATCTACAAAGAAACCGCAGCATACGGTCACTTTGGTCGTGAACATTTCAAATGGGAAAAAACCGACAAAGCGCAGCTGCTGCGCGATGCTGCCGGTCTGAAGTAA
Sequence NO.6突变核苷酸序列
ATGGCAAAACACCTTTTTACGTCCGAGTCCGTCTCTGAAGGGCATCCTGACAAAATTGCTGACCAAATTTCTGATGCCGTTTTAGACGCGATCCTCGAACAGGATCCGAAAGCACGCGTTGCTTGCGAAACCTACGTAAAAACCGGCATGGTTTTAGTTGGCGGCGAAATCACCACCAGCGCCTGGGTAGACATCGAAGAGATCACCCGTAACACCGTTCGCGAAATTGGCTATGTGCATTCCGACATGGGCTTTGACGCTAACTCCTGTGCGGTTCTGAGCGCTATCGGCAAACAGTCTCCTGACATCAACCAGGGCGTTGACCGTGCCGATCCGCTGGAACAGGGCGCGGGTGACCAGGGTCTGATGTTTGGCTACGCAACTAATGAAACCGACGTGCTGATGCCAGCACCTATCACCTATGCACACCGTCTGGTACAGCGTCAGGCTGAAGTGCGTAAAAACGGCACTCTGCCGTGGCTGCGCCCGGACGCGAAAAGCCAGGTGACTTTTCAGTATGACGACGGCAAAATCGTTGGTATCGATGCTGTCGTGCTTTCCACTCAGCACTCTGAAGAGATCGACCAGAAATCGCTGCAAGAAGCGGTAATGGAAGAGATCATCAAGCCAATTCTGCCCGCTGAATGGCTGACTTCTGCCACCAAATTCTTCATCAACCCGACCGGTCGTTTCGTTATCGGTGGCCCAATGGGTGACTGCGGTCTGACTGGTCGTAAAATTATCGTTGATACCTACGGCGGCATGGCGCGTCACAAAGGCGGTGCATTCTCTGGTAAAGATCCATCAAAAGTGGACCGTTCCGCAGCCTACGCAGCACGTTATGTCGCGAAAAACATCGTTGCTAAAGGCCTGGCCGATCGTTGTGAAATTCAGGTTTCCTACGCAATCGGCAAAGCTGAACCGACCTCCATCATGGTAGAAACTTTCGGTACTGAGAAAGTGCCTTCTGAACAGCTGACCCTGCTGGTACGTGAGTTCTTCGACCTGCGCCCATACGGTCTGATTAAAATGCTGGATAAACTGCACCCGATCTACAAAGAAACCGCAGCATACGGTAAATTTGGTCGTGAACATTTCCCGTGGGAAAAAACCGACAAAGCGCAGCTGCTGCGCGATGCTGCCGGTCTGAAGTAA
Sequence NO.7突变核苷酸序列
ATGGCAAAACACCTTTTTACGTCCGAGTCCGTCTCTGAAGGGCATCCTGACAAAATTGCTGACCAAATTTCTGATGCCGTTTTAGACGCGATCCTCGAACAGGATCCGAAAGCACGCGTTGCTTGCGAAACCTACGTAAAAACCGGCATGGTTTTAGTTGGCGGCGAAATCACCACCAGCGCCTGGGTAGACATCGAAGAGATCACCCGTAACACCGTTCGCGAAATTGGCTATGTGCATTCCGACATGGGCTTTGACAAAAACTCCTGTGCGGTTCTGAGCGCTATCGGCAAACAGTCTCCTGACATCAACCAGGGCGTTGACCGTGCCGATCCGCTGAAGCAGGGCGCGGGTGACCAGGGTCTGATGTTTGGCTACGCAACTAATGAAACCGACAAACTGATGCCAGCACCTATCACCTATGCACACCGTCTGGTACAGCGTCAGGCTGAAGTGCGTAAAAACGGCACTCTGCCGTGGCTGCGCCCGGACGCGAAAAGCCAGGTGACTTTTCAGTATGACGACGGCAAAATCGTTGGTATCGATGCTGTCGTGCTTTCCACTCAGCACTCTGAAAAGATCGACCAGAAATCGCTGCAAGAAGCGGTAATGGAAGAGATCATCAAGCCAATTCTGCCCGCTGAATGGCTGACTTCTGCCACCAAATTCTTCATCAACCCGACCGGTCGTTTCGTTATCGGTGGCCCAATGGGTGACTGCGGTCTGACTGGTCGTAAAATTATCGTTGATACCTACGGCGGCATGGCGCGTCACGGTGGCGGTGCATTCTCTGGTAAAGATCCATCAAAAGTGGACCGTTCCGCAGCCTACGCAGCACGTTATGTCGCGAAAAACATCGTTGCTGCTGGCCTGGCCGATCGTTGTGAAATTCAGGTTTCCTACGCAATCGGCGTGGCTGAACCGACCTCCATCATGGTAGAAACTTTCGGTACTGAGAAAGTGCCTTCTGAACAACTGACCCTGCTGGTACGTGAGTTCTTCGACCTGCGCCCATACGGTCTGATTCAGATGCTGGATCTGCTGCACCCGATCTACAAAGAAACCGCAGCATACGGTCACTTTGGTCGTGAACATTTCCCGTGGGAAAAAACCGACAAAGCGCAGCTGCTGCGCGATGCTGCCGGTCTGAAGTAA

Claims (6)

1.一种工程化突变改造的高性能腺苷蛋氨酸合成酶，其特征在于所述的高性能腺苷蛋氨酸合成酶由Met K基因编码的大肠杆菌源腺苷蛋氨酸合成酶突变改造而来。
2.根据权利要求1所述，改造的腺苷蛋氨酸合成酶将SEQ ID NO.1氨基酸序列中的第305位氨基酸V、第325位氨基酸Q、第343位氨基酸Q、第347位氨基酸L、第360位氨基酸H中的一个或多个突变改造为氨基酸K，
SEQ ID NO.1序列：
MAKHLFTSESVSEGHPDKIADQISDAVLDAILEQDPKARVACETYVKTGMVLVGGEITTSAWVDIEEITRNTVREIGYVHSDMGFDANSCAVLSAIGKQSPDINQGVDRADPLEQGAGDQGLMFGYATNETDVLMPAPITYAHRLVQRQAEVRKNGTLPWLRPDAKSQVTFQYDDGKIVGIDAVVLSTQHSEEIDQKSLQEAVMEEIIKPILPAEWLTSATKFFINPTGRFVIGGPMGDCGLTGRKIIVDTYGGMARHGGGAFSGKDPSKVDRSAAYAARYVAKNIVAAGLADRCEIQVSYAIGVAEPTSIMVETFGTEKVPSEQLTLLVREFFDLRPYGLIQMLDLLHPIYKETAAYGHFGREHFPWEKTDKAQLLRDAAGLK。
3.根据权利要求1～2，优选地，改造的腺苷蛋氨酸合成酶将SEQ ID NO.1氨基酸序列中的第305位氨基酸V、第325位氨基酸Q、第343位氨基酸Q、第347位氨基酸L、第360位氨基酸H中的3～4个突变改造为氨基酸K。
4.根据权利要求3，优选地，改造的腺苷蛋氨酸合成酶的氨基酸序列为：
MAKHLFTSESVSEGHPDKIADQISDAVLDAILEQDPKARVACETYVKTGMVLVGGEITTSAWVDIEEITRNTVREIGYVHSDMGFDANSCAVLSAIGKQSPDINQGVDRADPLEQGAGDQGLMFGYATNETDVLMPAPITYAHRLVQRQAEVRKNGTLPWLRPDAKSQVTFQYDDGKIVGIDAVVLSTQHSEEIDQKSLQEAVMEEIIKPILPAEWLTSATKFFINPTGRFVIGGPMGDCGLTGRKIIVDTYGGMARHGGGAFSGKDPSKVDRSAAYAARYVAKNIVAAGLADRCEIQVSYAIGKAEPTSIMVETFGTEKVPSEKLTLLVREFFDLRPYGLIQMLDKLHPIYKETAAYGKFGREHFPWEKTDKAQLLRDAAGLK。
5.如权利要求1～4所述的经突变改造的腺苷蛋氨酸合成酶，使用大肠杆菌工程菌进行发酵与表达制备。
6.如权利要求1～4所述的经突变改造的腺苷蛋氨酸合成酶，配合氨基型酶载体用于固定化酶的制备与使用。
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