CN101824423A - 一种融合基因gad-glp-1和糖尿病食疗型黄瓜的培育方法 - Google Patents

Abstract

一种融合基因GAD-GLP-1和糖尿病食疗型黄瓜的培育方法。本发明提供的融合基因GAD-GLP-1如序列表所示，包含一段谷氨酸脱羧酶基因GAD和一段胰高血糖素样肽-1基因GLP-1，两个基因之间通过EcoRV位点进行连接，在EcoRV位点的两侧分别添加了两个赖氨酸，这四个氨基酸同时起到连接肽的作用。本发明将克隆载体pMD-GAD-GLP-1中的融合基因用BamHI和SalI酶切回收后连入Marker-free植物表达载体pX6中，构建得到无选择性标记的植物表达载体pX6-GAD-GLP-1，并转化到农杆菌LBA4404中构建成工程菌株。本发明通过农杆菌介导法，将GAD-GLP-1融合基因成功地转化到黄瓜自交系2M1，并获得了稳定表达GAD-GLP-1融合蛋白的转基因植株。糖尿病模型大鼠灌胃本发明提供的转基因黄瓜后，可以降低其血糖水平并改善其糖尿病症状。

Description

一种融合基因GAD-GLP-1和糖尿病食疗型黄瓜的培育方法

【技术领域】：

本发明属植物基因工程领域，具体涉及表达糖尿病治疗相关融合蛋白GAD-GLP-1的转基因黄瓜及其培育方法，通过直接食用该黄瓜从而对糖尿病起到预防和治疗的作用。

【背景技术】：

糖尿病(diabetes mellitus)是胰岛素绝对或相对分泌不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低所引起的代谢紊乱，临床以高血糖、高血脂、高粘血症为主要标志的全身慢性代谢性临床综合征。近年来，糖尿病本身及其并发症对人们的身心健康危害重大。全世界糖尿病患者人数呈逐年上升，并向低龄化趋势。随着社会进步和人们生活方式的变化，糖尿病已成为威胁人类健康的重要慢性非感染性流行疾病。

在糖尿病治疗过程中，患者必须长期注射胰岛素或其他化学药物，用药后可能会出现低血糖及药物继发性失效等副作用。而且，胰岛素注射疗法只是补充胰岛素，是一种治标不治本的维持疗法，不能从根本上改善和恢复胰岛细胞的正常功能，并且给经济欠发达地区的患者带来很大的经济压力。

胰岛素依赖型糖尿病(insulin dependent diabetes mellitus，IDDM)是自身抗原介导的免疫系统破坏胰岛β细胞的自身免疫性疾病。近年来的研究已证实，谷氨酸脱羧酶(GAD)是1型糖尿病的始动靶抗原之一，GAD可预防胰岛炎和IDDM。胰岛β细胞特异性表达GAD可导致非肥胖糖尿病鼠发生自身免疫性糖尿病，调节GAD的表达可能对1型糖尿病有治疗作用，口服早期的靶抗原GAD65诱导免疫耐受可能是终止自身免疫反应，进而防止β细胞损伤、治疗人类1型糖尿病的有效手段。

天然胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)由胰升糖素原衍生而来，为30个氨基酸的多肽，是一种葡萄糖依赖型高效胰岛素分泌促进激素。在肠腔内葡萄糖刺激下，回肠、结肠和直肠的L细胞及胰腺α细胞经过一系列反应生成具有活性的GLP-1(7-36)酰胺，通过与胰岛β细胞表面的特异受体相互作用，迅速降低空腹和餐后血糖水平；刺激胰腺内胰岛β细胞分泌胰岛素，改善胰岛细胞功能，促进胰岛细胞功能再生，防止胰岛细胞调亡；抑制胰升血糖素的分泌，GLP-1可抑制胃的排空，增加肥胖病人和II型糖尿病人的饱食感而调节食物的摄入，消除糖尿病人饥饿感和“三多”症状，提高对胰岛素敏感性，降低血浆极低密度脂度蛋白、甘油三脂水平，增加低密度脂蛋白(LDL)粒径，减少发生冠心病的危险，可预防高胰岛素血症诱发的各种并发症。因此研究可用于口服的长效GLP-1对糖尿病(特别是2型糖尿病)的治疗具有重要意义。

黄瓜脆嫩味美，含糖量低，是糖尿病人理想的蔬菜及水果之一。黄瓜亦是一种优良的真核细胞表达系统，以此作为表达系统生产治疗糖尿病的口服药物，经济实用，不仅可节省药物生产、运输及注射等巨额费用，产生巨大的社会效益和经济效益。而且可减轻患者长期打针吃药的痛苦，使其在享用美味黄瓜的同时预防和治疗糖尿病，为数以亿计的糖尿病患者乃至全人类带来福音。

因此，若将GAD和GLP-1融合并在黄瓜中同时表达，可集GAD和GLP对I型和II型糖尿病的预防和治疗效果于一体，通过直接食用黄瓜对糖尿病的预防和治疗发挥作用。经文献检索，目前尚未发现采用GAD和GLP-1基因转化和培育糖尿病食疗型黄瓜的文献和专利报道。

【发明内容】：

本发明的目的是：

1)构建一种含有GAD和GLP-1编码序列的融合基因GAD-GLP-1。

2)构建一种含有GAD-GLP-1融合基因的Ti载体和携带该载体的农杆菌。

3)培育表达GAD-GLP-1融合蛋白、无抗生素标记的糖尿病食疗型转基因黄瓜。

4)将获得的转基因黄瓜应用于糖尿病的预防和治疗。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

首先，本发明提供了一种融合基因GAD-GLP-1，该基因包含一段谷氨酸脱羧酶基因GAD和一段胰高血糖素样肽-1基因GLP-1，其基因序列如图1所示。

在本发明提供的融合基因GAD-GLP-1中，所述的谷氨酸脱羧酶基因GAD，其基因内的终止密码子已被剔除；所述的胰高血糖素样肽-1GLP-1，其基因内的二肽酶IV和胰蛋白酶识别位点已被剔除，第8位上的Ala被Ser取代，26位和34位的Lys分别被Gin和Asp取代；GAD和GLP-1两个基因之间通过EcoRV位点进行连接，在EcoRV位点的两侧分别添加了两个赖氨酸，这四个氨基酸同时起到连接肽的作用，其中的两个氨基酸编码赖氨酸，食用后在体内能够被胰蛋白酶识别并切割，使连接位点两侧的GAD和GLP-1成为两个独立发挥作用的单体。

融合基因GAD-GLP-1的构建过程：

将PCR克隆得到的GAD基因插入到克隆载体pMD-GLP-1中GLP-1基因的上游，得到克隆载体pMD-GAD-GLP-1，该载体即包含本发明图1所示的融合基因GAD-GLP-1的基因序列。

其次，本发明提供了一种表达载体，该表达载体包含以上所述的融合基因GAD-GLP-1，具体是指无抗生素选择标记的植物表达载体————pX6-GAD-GLP-1。其构建过程如下：

将克隆载体pMD-GAD-GLP-1中的融合基因用BamHI和SalI酶切回收后连入Marker-free植物表达载体pX6中，构建得到无选择性标记的植物表达载体pX6-GAD-GLP-1。

第三方面，本发明提供了一种工程菌株，该菌株是用以上所述的表达载体pX6-GAD-GLP-1转化的农杆菌LBA4404工程菌株。

第四方面，本发明提供了一种含有以上所述的融合基因GAD-GLP-1的糖尿病食疗型黄瓜的培育方法，该方法包括：

第一、用以上所述的工程菌株感染黄瓜子叶节，使融合基因GAD-GLP-1转入黄瓜组织，从而整合到其染色体中；

第二、选择出转入融合基因GAD-GLP-1的黄瓜组织；

第三、将第二步中的黄瓜组织再生成植株。

以上所述糖尿病食疗型黄瓜的培育方法的具体过程是：

第一、黄瓜自交系2M1出芽四天后，以黄瓜子叶节为外植体，进行表面灭菌，用权利要求4所述的工程菌株的悬浮液侵染15分钟，转移到共培养基中共培养两天；

第二、然后将上步培养后的子叶节移到含有30mg/L卡那霉素的筛选培养基中，待抗性芽伸长到1.5-2cm左右，转移至芽伸长培养基中；

第三、待芽生长到3～4cm时，将基部老化部分切除，转入生根培养基中；15-17天长出不定根，待根生长到4-6cm以上，并且不定根上长出一些侧根后，生长健壮的植株便可移栽；

第四、移栽之前，打开培养瓶，炼苗3-5天，将苗从培养瓶中取出，冲洗干净根部的培养基，植入含蛭石或沙子培养钵中，浇透水，放在气候培养箱中培养，湿度不低于80％，待新叶、新根长出，逐渐降低湿度到70％；

第五、在MS液体培养基中添加2μM的17-β-甾二醇，浇灌移栽至蛭石中的转化幼苗，诱导CRE重组酶表达，完成在LoxP之间的切割，实现抗生素基因自动剔除；

第六、20天后，将幼苗移栽到土壤中；经过PCR和Southem斑点杂交检测，筛选出融合基因GAD-GLP-1转化到黄瓜自交系2M1中的植株；收获T0代种子，并将其播于含蛭石培养钵中，通过PCR检测确定分离后的转化阳性植株T1；取部分阳性植株提取总蛋白，进行Westernblotting检测，确证融合蛋白GAD-GLP-1在植株中获得了正确表达。

以上所述方法获得的糖尿病食疗型黄瓜，可应用于预防和治疗糖尿病的食疗中。

糖尿病大鼠模型的构建。将T1代转基因黄瓜粉碎后对模型大鼠进行灌胃处理。20天后，检测模型大鼠的血糖水平。证明转基因黄瓜对于糖尿病大鼠具有一定的降血糖功效，并且可以改善糖尿病大鼠的生理功能。

本发明的有益效果：

通过农杆菌介导法，将GAD-GLP-1融合基因成功地转化到黄瓜自交系2M1，并获得了稳定表达GAD-GLP-1融合蛋白的转基因植株。糖尿病模型大鼠灌胃本发明提供的转基因黄瓜后，可以降低其血糖水平并改善其糖尿病症状。

【附图说明】

图1是Marker-free植物表达载体pX6-GADGLP-1结构图。(A)胰蛋白酶的消化位点及连接位点的氨基酸序列，Eco RV位点两侧的赖氨酸残基为胰蛋白酶消化部位。(B)pX6-GAD-GLP-1载体结构图谱。

图2是EcoRV酶切pX6-GAD-GLP-1重组子鉴定结果。泳道1-2，反向连接转化子；泳道3-4，正向连接转化子；泳道5，质粒pX6酶切结果；泳道6，λ-EcoT14 I digest marker。

图3是pX6-GAD-GLP-1转化2M1得到的黄瓜抗性植株PCR检测结果。泳道1：DNA分子量标准；泳道2：阴性对照(未转化植株)；泳道3：阳性对照(pX6-GAD-GLP-1质粒)；泳道4-8：2M1的抗性植株。

图4是PCR阳性植株的Southern斑点杂交检测结果。每个杂交斑点用Dij表示(i为行，j为列)。D11-13，D21-23：斑点杂交结果；D14：CK-；D24：CK+。

图5是融合蛋白GAD-GLP-1的Western blotting分析结果。泳道1-7：转化植株的Westernblotting结果；泳道8：阴性对照(非转基因植株)。

图6是转基因黄瓜植株的获得流程图。

【具体实施方式】

实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照具体制造厂商所建议的条件。

实施例1

一种融合基因GAD-GLP-1的构建。包括如下步骤：

(1)将GAD基因克隆到克隆载体中，构建得到pMD-GAD。实验中所用的PCR引物是根据GAD基因的序列设计的：

P1：5′-GGATCCATGGCATCTCCGGGCTCTG-3′，

P2：5′-GATATCCTTTAAATCTTGTCCAAG-3′，

p1的上游引入BamH I，p2下游引入EcoRV位点，均用下划线表示。

(2)将GLP-1基因克隆到克隆载体中，构建得到pMD-GLP-1。实验中所用的PCR引物是根据GLP-1基因的序列设计的：

P3：5′-GATATCAAGCATTCTGAGGGAAC-3′，

P4：5′-GTCGACTTAACGGCCATCTACGAC-3′

P3的5′端添加了EcoRV位点，p4的3′端添加了Sal I位点。均用下划线表示。

(3)用BamHI和EcoRV消化克隆载体pMD-GAD，酶切后得到GAD片段。用BamHI和EcoRV对质粒pMD-GLP-1进行双酶切，回收载体大片段。连接GAD基因片段与pMD-GLP-1大片段，得到克隆载体pMD-GAD-GLP-1。测序结果表明，融合基因序列完全正确。

实施例2

一种含有GAD-GLP-1融合基因的Ti表达载体的构建

用BamHI和SalI消化克隆载体pMD-GAD-GLP-1，酶切后得到粘末端的GAD-GLP-1基因。质粒pX6用Spe I完全酶切，将载体及基因片段的粘性末端补平。将补平纯化的GAD-GLP-1基因片段与去磷酸后的线性载体pX6进行连接。如图3所示，外源基因已经连入载体pX6中，挑选正向连接的转化子，即为本发明中所用的表达载体，含有GAD-GLP-1融合基因的Ti表达载体pX6-GAD-GLP-1。

将上述Ti表达载体pX6-GAD-GLP-1转化到农杆菌LBA4404中可以得到含有GAD-GLP-1融合基因的工程菌株。

实施例3

培育表达GAD-GLP-1融合蛋白的转基因黄瓜

以黄瓜子叶节为外植体，用权利要求4所述的工程菌株的悬浮液侵染15分钟，转移到共培养基中共培养；然后将子叶节转移到筛选培养基，待抗性芽伸长到1.5-2cm左右，转移至芽伸长培养基中；待芽生长到3～4cm时，转入生根培养基中；待根生长到4-6cm以上，并且不定根上长出一些侧根后，生长健壮的植株便可移栽；培养基的配制如表1所示。

表1本试验所用培养基

按图6所示，通过子叶节器官发生途径，30mg/L的卡那霉素抗性筛选，获得了卡那霉素抗性植株。将得到的抗性植株经过2μM浓度的17-β-甾二醇诱导后，通过PCR(图3)及Southem斑点杂交检测(图4)，表明融合基因GAD-GLP-1已经整合到黄瓜自交系2M1基因组中。收获T0代种子，约3周后，将种子播于含蛭石得钵中，对T1代转基因植株经PCR检测呈阳性的植株提取总蛋白，浓缩上清液，然后进行SDS-PAGE，转膜后进行western blotting检测。Western blotting检测结果表明，蛋白在69kDa的位置出现印迹反应(图5)，与预期大小一致。说明目的融合蛋白GAD-GLP-1在植株中获得了正确表达。

实施例4

转基因黄瓜应用于糖尿病的预防和治疗

(1)糖尿病大鼠模型的建立

Wistar大鼠禁食不禁水12h后，测定血糖值。实验时分成两组，阴性对照组(只注射生理盐水)，模型组(尾静脉一次性注射65mg/kg链尿佐菌素)，然后大鼠分组饲养，自由进食进水，两周后测定血糖值。结果表明，糖尿病大鼠模型构建成功。

(2)供试材料为T1代转化植株的果实。将供试材料分别进行两种处理，黄瓜总蛋白提取液处理组：提取黄瓜总蛋白后，进行冷冻干燥处理，灌胃时用0.9％NaCl溶解；黄瓜果实粉碎液处理组：将黄瓜的果实冷冻研磨成粉末后，用0.9％NaCl溶解。

每天上午8点和晚上8点，分两次灌胃给药，正常组不进行任何处理，0.9％NaCl组灌服20ml/kg/d的0.9％NaCl溶液，黄瓜总蛋白提取液处理组蛋白剂量为300mg/kg/d，黄瓜果实粉碎液处理组剂量为60g/kg/d。在给药20天后，发现模型大鼠的饮水、饮食和体重都有较明显的改变(表2)，黄瓜总蛋白提取液处理组血糖值从24.5±5.1mM降低到12.9±2.8mM，黄瓜果实粉碎液处理组血糖值降低到13.2±2.4mM，而正常对照组和0.9％NaCl组的血糖值在实验前后均无明显变化。表明通过口服GAD-GLP-1融合蛋白可以降低糖尿病大鼠的血糖水平，并能改善糖尿病大鼠体内的饮食和饮水平衡，降低它的食欲和饮水量，使其生理状态趋于正常化，对于糖尿病大鼠的糖尿病症状的控制有一定作用。

表2口服GAD-GLP-1融合蛋白对大鼠体重、摄食量、饮水量以及血糖值的影响

Claims (7)

1.一种融合基因GAD-GLP-1，该基因包含一段谷氨酸脱羧酶基因GAD和一段胰高血糖素样肽-1基因GLP-1，其基因序列如图1所示。

2.如权利要求1所述的融合基因GAD-GLP-1，其特征在于，所述的谷氨酸脱羧酶基因GAD，其基因内的终止密码子已被剔除；所述的胰高血糖素样肽-1GLP-1，其基因内的二肽酶IV和胰蛋白酶识别位点已被剔除，第8位上的Ala被Ser取代，26位和34位的Lys分别被Gln和Asp取代；GAD和GLP-1两个基因之间通过EcoRV位点进行连接，在EcoRV位点的两侧分别添加了两个赖氨酸，这四个氨基酸同时起到连接肽的作用，其中的两个氨基酸编码赖氨酸，食用后在体内能够被胰蛋白酶识别并切割，使连接位点两侧的GAD和GLP-1成为两个独立发挥作用的单体。

3.一种表达载体，其特征在于该表达载体包含权利要求1所述的融合基因GAD-GLP-1，具体是指无抗生素选择标记的植物表达载体-pX6-GAD-GLP-1。

4.一种工程菌株，其特征在于，是用权利要求3所述的表达载体pX6-GAD-GLP-1转化的农杆菌LBA4404工程菌株。

5.一种含有权利要求1所述的融合基因GAD-GLP-1的糖尿病食疗型黄瓜的培育方法，其特征在于该方法包括：

第一、用权利要求4所述的工程菌株感染黄瓜子叶节，使融合基因GAD-GLP-1转入黄瓜组织，从而整合到其染色体中；

第二、选择出转入融合基因GAD-GLP-1的黄瓜组织；

第三、将第二步中的黄瓜组织再生成植株。

6.如权利要求5所述的培育方法，其特征在于该方法的具体过程是：

第一、黄瓜自交系2M1出芽四天后，以黄瓜子叶节为外植体，进行表面灭菌，用权利要求4所述的工程菌株的悬浮液侵染15分钟，转移到共培养基中共培养两天；

第二、然后将上步培养后的子叶节转移到含有30mg/L卡那霉素的筛选培养基中，待抗性芽伸长到1.5-2cm左右，转移至芽伸长培养基中；

第三、待芽生长到3～4cm时，将基部老化部分切除，转入生根培养基中；15-17天长出不定根，待根生长到4-6cm以上，并且不定根上长出一些侧根后，生长健壮的植株便可移栽；

第四、移栽之前，打开培养瓶，炼苗3-5天，将苗从培养瓶中取出，冲洗干净根部的培养基，植入含蛭石或沙子培养钵中，浇透水，放在气候培养箱中培养，湿度不低于80％，待新叶、新根长出，逐渐降低湿度到70％；

第五、在MS液体培养基中添加2μM的17-β-甾二醇，浇灌移栽至蛭石中的转化幼苗，诱导CRE重组酶表达，完成在LoxP之间的切割，实现抗生素基因自动剔除；

第六、20天后，将幼苗移栽到土壤中；经过PCR和Southern斑点杂交检测，筛选出融合基因GAD-GLP-1转化到黄瓜自交系2M1中的植株；收获T0代种子，并将其播于含蛭石培养钵中，通过PCR检测确定分离后的转化阳性植株T1；取部分阳性植株提取总蛋白，进行Western blotting检测，确证融合蛋白GAD-GLP-1在植株中获得了正确表达。

7.一种权利要求5所述方法获得的糖尿病食疗型黄瓜的用途，其特征在于，用于预防和治疗糖尿病的食疗。

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