CN110256553A - 一种glp-1突变体及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种GLP‑1突变体。本发明还公开了编码GLP‑1突变体的核苷酸序列，及包含该核苷酸序列的重组载体、重组菌，还公开了所述GLP‑1突变体的制备方法和用途。本发明GLP‑1突变体，可以有效降低血糖浓度，可用于治疗II型糖尿病，临床应用前景良好。

Description

一种GLP-1突变体及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种GLP-1突变体及其制备方法和用途。
背景技术
糖尿病是世界范围内的流行病，根据世界卫生组织数据，2030年全球糖尿病患者将达到3.66亿。而中国已成为全世界糖尿病大国，并且随着我国人口老龄化速度的增加，糖尿病的发病率也将呈现逐年递增的趋势。糖尿病作为一种慢性多发疾病已成为全球关注的重点公共卫生问题。
糖尿病目前的治疗方法是在饮食、运动控制的基础上，应用多种口服药物或胰岛素以控制血糖达到标准水平。但传统治疗手段存在如低血糖风险、体重增加等局限。近年来T2DM治疗的趋势是在病程中尽早开始针对胰岛β细胞功能的治疗，新型的基于肠促胰素的治疗药物由于其特殊的作用机制和肯定的效果备受关注。
胰高血糖素样肽1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)即是肠促胰素之一，具有促进胰岛素分泌，调节血糖的生理作用。但是，天然GLP-1易被二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)迅速水解失活，其半衰期小于5min，不适于临床应用。
2010年，诺和诺德公司以GLP-1为原型设计的Liraglutide(中文名利拉鲁肽，商品名为诺和力(Victoza)在美国上市，因其良好的临床效果、较低的副作用以及较长的半衰期赢得了广泛关注，从而掀起了GLP-1类似肽的研究热潮。因此，有必要积极探索更多的GLP-1类似肽药物，为糖尿病治疗提供更多选择。
目前包括利拉鲁肽在内的GLP-1类似肽多肽药物，均需注射给药，直接口服无效，存在用药不便等缺点。但是糖尿病的治疗通常需要长期、持续用药。注射给药的方式，使用携带不方便，用药依从性差，还可能存在刺激性和过敏反应等风险，给患者带来巨大的生理和心理痛苦。而口服制剂最符合人们“服”药的习惯，制剂工艺也成熟而简单。
发明内容
本发明的目的在于提供一种GLP-1突变体及其制备方法和用途。
本发明提供了一种GLP-1突变体，它是在野生型GLP-1基础上，经过氨基酸位点突变得到，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
其中，序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明提供了一种重组载体，它包含上述核苷酸序列；进一步地，所述重组载体是重组原核载体；更进一步地，所述原核载体为pGEX质粒或者pMG36e载体。
本发明提供了一种重组菌，其特征在于：它包含上述重组载体；进一步地，所述重组菌为重组大肠杆菌Nissle 1917或者重组乳酸菌。
本发明提供了一种制备上述GLP-1突变体的方法，包含如下步骤：
取上述重组菌，接种到LB培养基上，振荡培养至OD600为0.8-1.0时，离心，取沉淀，分离纯化，即可。
其中，当重组菌为大肠杆菌Nissle 1917时，培养基为LB培养基；
重组菌为乳酸菌时，培养基为MRS培养基。
本发明提供了上述突变体、核苷酸序列、重组载体、重组菌在制备治疗糖尿病和/或肥胖的药物中的用途。
本发明提供了一种治疗糖尿病的药物，其特征在于：它含有上述突变体、核苷酸序列、重组载体和/或重组菌。
与天然的GLP-1相比，本发明GLP-1突变体，减小了DPP-Ⅳ的降解作用，半衰期约为3h；而且本发明构建的含有GLP-1突变体的重组益生菌，可制备成多种类型的固体及液体制剂实现口服给药，避免患者长期注射用药的痛苦；同时，人体服用后，该基因工程益生菌可以在人体肠道中存活定植，成为功能性的体内生物反应器，持续产生并分泌GLP-1突变体多肽，从而起到持续降糖作用，临床应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1本发明中GLP-1GM突变体蛋白的筛选结果。
图2本发明的GLP-1GM突变体SDS-PAGE及WB检测结果。
图3本发明中大肠杆菌表达的GLP-1GM突变体灌胃T2DM大鼠模型的降糖效果。
图4本发明中乳酸菌菌表达的GLP-1GM突变体灌胃T2DM大鼠模型的降糖效果。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
本发明所用的实验试剂与仪器如下：
pGEX-4T-1、pMG36e、pET32a、E.coli TOP10及E.coli BL21(DE3)、大肠杆菌Nissle1917、乳酸杆菌、乳酸乳球菌等菌株与质粒由成都里来生物科技有限公司和重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室保存；雄性大鼠由重庆医科大学实验动物中心提供。T4连接酶、Taq普通酶、SalⅠ、BamHⅠ、蛋白质Marker、DNA Marker、Plasmid Mini kit I、Cycle-PureKit、胶回收试剂盒、IPTG、红霉素、氨苄青霉素、脲佐菌素、BCA蛋白浓度测定试剂盒、PMSF等试剂(均为市售)。
实施例1本发明突变体序列的筛选及活性检测
从GLP-1原始序列出发，改造设计了4个突变体多肽序列，通过化学合成(中肽生化)，获得纯度高达85％的多肽产物。多肽序列如下：
GLP-1片段(7-37aa)：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG
GM(SEQ ID NO：1)：
HHEGTFTSDVSSYLEGQAAKKFIAWLVRGGKKKKKYGRKKRRQRRREF
C33：HACGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLCKGRG
K34：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKKKK
R34：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRRRR
GM是在GLP-1原始序列的基础上，将GLP-1第8位丙氨酸突变为组氨酸，27位的谷氨酸突变为赖氨酸，34位的赖氨酸突变为精氨酸，36位的精氨酸突变为甘氨酸，37位的甘氨酸突变为赖氨酸，并且末端加入一段序列。
C33是在GLP-1原始序列的基础上，将GLP-1第9位谷氨酸突变为半胱氨酸，33位缬氨酸突变为半胱氨酸。
K34是在GLP-1原始序列的基础上，将GLP-1第35位甘氨酸突变为赖氨酸、第36位精氨酸突变为赖氨酸、第37位甘氨酸突变为赖氨酸。
R34是在GLP-1原始序列的基础上，将GLP-1第34位赖氨酸突变为精氨酸，第35位甘氨酸突变为精氨酸，第37位甘氨酸突变为精氨酸。
GLP-1原始序列与突变体R34、K34和C33的区别如表1所示。
表1 GLP-1及突变体的序列比较
取雄性大鼠，每组6只，禁食12h，测定血糖后，腹腔注射20mmol/kg葡萄糖，后腹腔注射给予上述四个突变体多肽50μg/kg。给药后各时间点用三诺血糖仪(GA-3型)测定血糖。
结果如图1所示。
天然GLP-1易被二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)迅速水解失活，其半衰期小于5min，不适于临床应用，故未进行该项动物实验。
可见，编号为GM的GLP-1突变体(GLP-1GM)降糖活性较好，且半衰期长达3小时，而其它GLP-1突变体降糖能力及半衰期均较差。
实施例2本发明突变体的重组大肠杆菌表达及活性验证
1、本发明GLP-1突变体的大肠杆菌表达
(1)在GLP-1突变体GM的序列前加入一段信号肽序列、在3’-端加入HIV穿膜肽序列和6个His-tag序列，构建出能够分泌表达和具有穿过细胞膜能力的GLP-1突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
SEQ ID NO：2：
atgaaaaagaacatcgcattcctcctggcatctatgtttgttttctctatcgctaccaacgcttacgctggatcccaccacgagggcaccttcacctccgacgtgtcctcctacctggagggccaggccgccaagaagttcatcgcctggctggtgcgcggcggcaagaagaagaagaagtacggccgcaagaagcgccgccagcgccgccgcctcgaggacgacgacgacaagcaccatcaccatcaccattaa
(2)将SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列克隆到大肠杆菌表达载体pGEX的BamHI和SalI位点，获得pGEX-GLP-1GM载体，测序正确后转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，目的片段大小约为12KD。经含镍磁珠纯化后Western blot鉴定表达结果正确，结果如图2所示。可见，本发明成功表达了GLP-1突变体蛋白。
(3)将pGEX-GLP-1GM表达载体转化到大肠杆菌Nissle 1917中，经PCR和测序鉴定pGEX-GLP-1GM转化成功。取重组大肠杆菌组菌Nissle 1917，接种到添加有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基上，37℃、250r/min摇床培养至OD600值达到0.8～1.0，菌液离心后弃上清，沉淀用PBS调OD600值到1.2，即可。
3、GLP-1突变体的活性验证
按照每只大鼠口服灌胃1ml重组大肠杆菌(OD600＝1.2)处理STZ诱导成功的T2DM大鼠模型，每组6只大鼠，在灌胃后各时间点，断尾取血，采用三诺血糖仪(GA-3型)测定一次血糖，用以确定口服GLP-1GM突变体的降糖效果。结果如图3所示。
可见，大肠杆菌Nissle 1917中表达的GLP-1GM突变体灌胃后2小时具有降糖效果(与未灌胃的对照组相比，P＜0.01)。灌胃8小时后血糖略有回升。
实施例3本发明突变体的重组乳酸菌表达及活性验证
1、本发明GLP-1突变体的乳酸菌表达
(1)将GLP-1GM，即SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列克隆构建到乳酸菌表达载体pMG36e质粒上SalI和HindIII位点，电转化乳酸杆菌后，挑取重组乳酸杆菌的单菌落，培养后提取质粒，PCR检验和测序检测GLP-1GM基因存在于该受体菌中。
(2)将上述的重组乳酸菌接种到添加有终浓度为20μg/ml的红霉素的MRS培养基上，30℃静置培养至OD600值达到0.8～1.0时，离心，弃上清，取菌体，备用。
2、GLP-1突变体的活性验证
按照每只大鼠灌胃1ml重组乳酸菌OD600＝1.2，处理STZ诱导的T2DM动物模型，每组6只大鼠，在灌胃后各时间点，断尾取血，采用三诺血糖仪(GA-3型)测定一次血糖，用以确定口服重组乳酸菌-GLP-1GM突变体的降糖效果。
结果如图4所示。图4中，26小时后的降糖效果为24h补喂重组乳酸菌后2h的降糖效果。
可见，重组乳酸菌中表达的GLP-1GM突变体有一定的降糖效果，与在大肠杆菌中的结果相似，GLP-1GM的半衰期仍然较短，灌胃2小时血糖浓度下降(P＜0.01)，5-7小时后血糖略有回升(P＜0.05)，24h降糖效果减弱，如果立即二次灌胃等量的重组乳酸菌，2h后(即26h)又获得降糖效应(P＜0.01)。
因此，重组乳酸菌中表达的GLP-1GM突变体同样具有口服降糖效果。与天然的GLP-1相比，本发明GLP-1突变体，减小了DPP-Ⅳ的降解作用，半衰期约为3h；而且本发明构建的含有GLP-1突变体的重组益生菌具有持续降糖作用，临床应用前景良好。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川利通科创生物医药科技有限公司
<120> 一种GLP-1突变体及其制备方法和用途
<130> GY848-18P1766
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 48
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GM
<400> 1
His His Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Lys Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Gly Lys Lys
20 25 30
Lys Lys Lys Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Glu Phe
35 40 45
<210> 2
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GLP-1突变体GM
<400> 2
atgaaaaaga acatcgcatt cctcctggca tctatgtttg ttttctctat cgctaccaac 60
gcttacgctg gatcccacca cgagggcacc ttcacctccg acgtgtcctc ctacctggag 120
ggccaggccg ccaagaagtt catcgcctgg ctggtgcgcg gcggcaagaa gaagaagaag 180
tacggccgca agaagcgccg ccagcgccgc cgcctcgagg acgacgacga caagcaccat 240
caccatcacc attaa 255
<210> 3
<211> 31
<212> PRT
<213> GLP-1片段
<400> 3
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 4
<211> 31
<212> PRT
<213> C33
<400> 4
His Ala Cys Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Cys Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 5
<211> 31
<212> PRT
<213> K34
<400> 5
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Lys Lys Lys
20 25 30
<210> 6
<211> 31
<212> PRT
<213> R34
<400> 6
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Arg Arg Arg
20 25 30

Claims (10)

1.一种GLP-1突变体，其特征在于：它是在野生型GLP-1基础上，经过氨基酸位点突变得到，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于：序列如SEQ ID NO：2所示。
4.一种重组载体，其特征在于：它包含权利要求2或3所示的核苷酸序列；进一步地，所述重组载体是重组原核载体；更进一步地，所述原核载体为pGEX质粒或者pMG36e载体。
5.一种重组菌，其特征在于：它包含权利要求4所述的重组载体；进一步地，所述重组菌为重组大肠杆菌Nissle 1917或者重组乳酸菌。
6.一种制备权利要求1或2所述GLP-1突变体的方法，其特征在于：包含如下步骤：
取权利要求5所述的重组大肠杆菌Nissle 1917，接种到LB培养基上，振荡培养至OD600为0.8-1.0时，离心，取沉淀，分离纯化，即可。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：当重组菌为大肠杆菌Nissle 1917时，培养基为LB培养基。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：重组菌为乳酸菌时，培养基为MRS培养基。
9.权利要求1或2所述突变体、权利要求3所述核苷酸序列、权利要求4所述重组载体、权利要求5所述重组菌在制备治疗糖尿病和/或肥胖的药物中的用途。
10.一种治疗糖尿病的药物，其特征在于：它含有权利要求1所述突变体、权利要求2或3所述核苷酸序列、权利要求4所述重组载体和/或权利要求5所述重组菌。
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