CN102134274A - tGLP-1衍生物及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种人GLP-1衍生物，即tGLP-1衍生物，所述衍生物的分子结构式为tGLP-1(7-38)，Seq ID NO.2；其中，Xaa2是Ser；Xaa20是Gln；Xaa28是Asp；Xaa30是Thr，Asp，Ser，Ala，Gly，Leu，Gln，His中的任何一种；Xaa32是Cys。本发明还提供一种人GLP-1衍生物的制备方法及应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域的GLP-1衍生物及其制备和应用，尤其是涉及一种可口服的tGLP-1衍生物及其制备和应用。
背景技术
糖尿病(Diabetes Mellitus)一种常见慢性全身性的代谢性疾病，是由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合征。是由于人体内胰岛素绝对或相对缺乏所至。它的临床表现大概包括两个方面，一是血糖高、尿糖多造成的“三多一少”，即多饮、多尿、多食及消瘦；二是并发症造成的症状，如糖尿病肾病、视网膜病变等。糖尿病分I型糖尿病和II型糖尿病。其中I型糖尿病多发生于青少年，其胰岛素分泌缺乏，必须依赖胰岛素治疗维持生命。II型糖尿病多见于30岁以后中、老年人，其胰岛素分泌不足。
目前糖尿病发病迅速，其已经成分为继肿瘤、心脑血管病之后第三位严重危害人类健康的慢性疾病。2009年10月21日国际糖尿病联合会(IDF)公布最新数据：目前患糖尿病的人数为2.85亿，如果这种发展趋势得不到遏制，到2030年这个数字预计将上升到约4.4亿。IDF的糖尿病地图(Diabetes Atlas)最新数据表明中低收入国家(LMC)人民正受到糖尿病蔓延的冲击，而且工作年龄段的糖尿病患者要比原来预料的多得多。我们成为继印度(5080万)之后发病人数最多的国家(4320万)。糖尿病者需终生给药，因此开发高效低廉的糖尿病新药具有诱人的前景。
GLP-1是一种主要由远端回肠、直肠和结肠的L细胞分泌的多肽激素。具有刺激胰岛素分泌和生物合成、增加胰岛β细胞数量、抑制胰高血糖素分泌和抑制胰岛β细胞凋亡等作用。GLP-1降血糖活性最大的特点是葡萄糖浓度依赖性降糖，不会引起低血糖。因此其具有很大的应用前景。由于其在体内受DPPIV酶的降解，在体内的半衰期只有2-3min。因此寻求一种延长GLP-1体内半衰期，延长其生物活性的方法，成为目前GLP-1研究的热点。
目前国内外对GLP-1治疗糖尿病的研究方向之一是对其结构进行改变，得到GLP-1衍生物，用该衍生物治疗糖尿病，达到延长药物在体内药效时间的目的。例如诺华诺德公司研制的NN2211(商品名Liraglutide)，其在GLP-1的Lys26上进行酰化，可以显著提高GLP-1的体内半衰期。也有人在C端接上脂肪酸以与血浆白蛋白结合，从而增加其在体内的稳定性。
这些改变与天然GLP-1相比半衰期显著延长，但是这些衍生物仍然存在着制备和纯化困难，半衰期不够长的问题，并且这些衍生物都是局限于注射给药，不能应用于口服给药。本发明对GLP-1结构进行改变，提供一种tGLP-1结构，可以增强其抗蛋白酶降解的能力，从而有效地提高半衰期。由于口服给药需药量较大，因此，本发明同时采用基因串联的方法来大量表达蛋白。另外pET载体系统常用乳糖类似物异丙基-β-D-巯基半乳糖苷(IPTG)诱导，但IPTG具有潜在的毒性，对菌体生长有一定的抑制作用，且价格昂贵，而本发明采用乳糖代替IPTG的方法，利用自诱导培养基表达外源蛋白，使得细菌在该培养基中的表达量显著得以提高。
发明内容
本发明所涉及的GLP-1是指GLP-1(7-37)，其氨基酸序列(Seq ID No.1)如下：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly。
本发明的目的之一是提出一种GLP-1衍生物，即tGLP-1，其特征在于，所述tGLP-1的分子结构式为tGLP-1(7-38)，Seq ID NO.2；其中，Xaa2是Ser；Xaa20是Gln；Xaa28是Asp；Xaa30是Thr，Asp，Ser，Ala，Gly，Leu，Gln，His中的任何一种；Xaa32是Cys。
本发明的tGLP-1，是指以上位点的氨基酸经过本发明改造后的GLP-1蛋白。
本发明的tGLP-1衍生物将体内蛋白酶DPP-IV酶切位点突变，将胰酶酶切位点突变，使其既可以抵抗DPP-IV的降解又可以抵抗胰酶的降解，从而延长其在人体内的半衰期。
本申请人的在先发明专利申请(申请号：200910045188.0；发明名称：一种GLP-1衍生物)中所提出GLP-1衍生物，是指aGLP-1(7-38)(Seq.ID NO.3)，其中Xaa2是Ser，His和D-Ala中的任何一种；Xaa20是Ser，His，Gln和Ala的任何一种；Xaa28是Ser，His，Asp和Ala的任何一种；Xaa32是Gly和Cys中的任何一种。
本发明的又一目的是提供了所述tGLP-1的制备方法，所述制备方法的操作步骤如下：
(1)首先，制备基因工程菌，其步骤为：
步骤①：按照目的物tGLP-1的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱密码子，合成以下长度为146bps的片段，即如下Seq ID No.4所示：
ggagatctgg gtaccgacga cgacgacaag catagcgaag gcacctttac cagcgatgtg 60
agcagctatc tggaaggcca ggccgcccag gaatttattg cctggctggt ggacggcnnn 120
ggctgcaaaa ctagttaaaa gcttcc 146
其中n＝a或g或c或t，该片段含有肠激酶EK位点、tGLP-1基因、终止密码子taa及限制性内切酶Bgl II、Spe I和HindIII位点。
将片段克隆至pET32a(+)中，得到含TrxA-纯化标签His Tag-肠激酶酶切位点-重组人胰高血糖素样肽-1，即含有重组人胰高血糖素样肽-1-终止密码子TAA的重组pET32a(+)质粒，pET32a-tGLP-1-C1。
用Xba I/HindIII酶切pET32a-tGLP-1-C1和pET28a(+)，分别回收两者的酶切小片段和大片段，进行连接，即得到含重组GLP-1衍生物基因的pET28a(+)质粒，pET28a-tGLP-1-C1。
步骤②：构建含单串tGLP-1基因的DNA序列的菌株。
将含有合成的tGLP-1序列的pET28a(+)质粒转化BLR(DE3)或BLR(DE3)，制得含单串tGLP-1基因的基因工程表达菌株。
步骤③：构建高效表达tGLP-1的基因工程菌株
以P1，P2为引物，
P1：gggctagcaaacatagcgaaggcacctttac；
P2：ggaagcttttaactagttttgcagccnnngccgtccac；
以含单串tGLP-1基因的pET28a(+)质粒为模版进行PCR，最终得到串联小片段，即如下Seq ID No.5所示：
gggctagcaa acatagcgaa ggcaccttta ccagcgatgt gagcagctat ctggaaggcc 60
aggccgccca ggaatttatt gcctggctggt ggacggcnnn ggctgcaaa actagttaaa 120
agcttcc 127
其中n＝a或g或c或t，P1引入酶切位点Nhe I。用Spe I/HindIII和Nhe I/HindIII分别酶切第二步得到的重组质粒pET28a-tGLP-1-C1和第三步得到的串联小片段，将Spe I/HindIII双酶切得到的大片段与Nhe I/HindIII双酶切得到的小片段连接，得到重组GLP-1衍生物基因的二聚体重组质粒：pET28a-tGLP-1-C2，Spe I和Nhe I为一对同尾酶。重复上述步骤6次，分别得到tGLP-1基因的三聚体，四聚体，五聚体，六聚体，七聚体，八聚体质粒：pET28a-tGLP-1-C3，pET28a-tGLP-1-C4，pET28a-tGLP-1-C5，pET28a-tGLP-1-C6，pET28a-tGLP-1-C7，pET28a-tGLP-1-C8。将构建好的重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)或BLR(DE3)中，得到高效表达tGLP-1的基因工程菌。
本发明所述的基因工程菌是携带重组质粒的大肠杆菌DH5a，BL21(DE3)或BLR(DE3)，所述的重组质粒是含GLP-1衍生物基因的质粒pET32a(+)或pET28a(+)，所述的重组质粒含有tGLP-1基因的串数为1-8串。
本发明所述的基因工程菌的进一步特征在于：所述的重组质粒是重组质粒pET32a(+)-tGLP-1，或pET28a(+)-tGLP-1之一，也可以是pET28a(+)-TrxA-tGLP-1，其中的TrxA为硫氧环蛋白。
(2)液体培养
将步骤(1)所得的高效表达tGLP-1的基因工程菌挑取单菌落于LB培养基中培养12-16小时，以1％转接入自诱导培养基中培养12-24小时，即产生和积累以可溶形式或包涵体形式表达的tGLP-1融合蛋白。
自诱导培养基的成分为：蛋白胨19.17g/L，酵母膏9.59g/L，Na2HPO45.72g/L，KH2PO45.48g/L，(NH4)2SO42.66g/L，NaCl 3.33g/L，甘油2％(v/v)，葡萄糖0.68g/L，乳糖6.33g/L，MgSO40.24g/L。诱导条件为温度33℃、接种量1％、pH7，210rpm/min。
(3)纯化得到高纯度tGLP-1
对于以可溶形式表达的融合蛋白，将湿菌体破壁，经镍柱亲和层析获得含tGLP-1融合蛋白的粗品。
对于以包涵体形式表达的融合蛋白，将湿菌体破壁，离心得到包涵体蛋白沉淀，用洗涤缓冲液洗涤包涵体，即得到较高纯度的tGLP-1包涵体。
(4)胰酶酶切得到tGLP-1
将包涵体用8mol/l尿素溶解，用BSA试剂盒测蛋白浓度后，将蛋白稀释到4-5mg/ml，以可溶形式表达的融合蛋白直接测蛋白浓度，然后加入胰酶酶切，即得到具备生物学活性的GLP-1衍生物。
本发明的又一目的是以所述GLP-1衍生物在制备治疗糖尿病的药物中作该药物的活性成分的应用。
本发明GLP-1衍生物的特点是可采用口服给药方式，即可以通过口服液直接口服，也可以通过药片、胶囊、含片等剂型给药。
本发明的又一目的是提供一种药物组合物，所述组合物含有有效量的tGLP-1以及药学上可接受的成分。
本发明的优点是：(1)该衍生物与GLP-1相比口服降血糖活性显著提高；(2)通过基因工程的技术的方法构建含多个tGLP-1基因的基因工程菌，采用自诱导的方法，大大提高了tGLP-1的表达量；采用自诱导培养基进行培养，比LB培养基好，菌体量多，蛋白产量也高，且不会抑制菌体生长；(3)通过镍柱纯化得到高纯度的tGLP-1融合蛋白，对于包涵体只要通过破菌离心、洗涤包涵体即可得到高纯度的tGLP-1的包涵体；(4)只要通过一次胰酶酶切即可得到较高口服降血糖活性的GLP-1衍生物；(5)通过基因工程技术的方法生产GLP-1衍生物，比化学合成GLP-1衍生物成本更低；(6)该衍生物基因存在于pET28a(+)质粒上，其含有卡那霉素抗性基因，可用于工业大规模生产。
附图说明
下面的附图用于说明本发明的具体实施方案。
图1：重组质粒pET28a(+)-tGLP-1-C1-pET28a(+)-tGLP-1-C8构建示意图。
图2：tGLP-1的腹腔给药降血糖作用效果图。
其中GLP-1为天然人胰高血糖素样肽-1，(Thr35)-GLP-1为Xaa30＝Thr的tGLP-1。
图3：tGLP-1的四串包涵体口服降血糖作用效果图。
其中GLP-1为天然人胰高血糖素样肽-1，(Thr35)-GLP-1-C4为Xaa30＝Thr的tGLP-1四串包涵体。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步详述本发明。说明书及以下实施例中所用质粒、菌体等，以及未注明具体条件的实验方法，可按常规条件进行，或按商品供货商所建议的条件进行。
实施例1 本发明提供的GLP-1衍生物的氨基酸序列，如Seq ID No.2，其中Xaa30是Thr，Asp，Ser，Ala，Gly，Leu，Gln，His中的任何一种；Xaa2是Ser，Xaa20是Gln，Xaa28是Asp，Xaa32是Cys。
实施例2 构建含有一个tGLP-1基因的菌株。
按tGLP-1的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱密码子，合成以下长度为146bps的片段，即Seq ID No.4：
ggagatctgg gtaccgacga cgacgacaag catagcgaag gcacctttac cagcgatgtg 60
agcagctatc tggaaggcca ggccgcccag gaatttattg cctggctggt ggacggcnnn 120
ggctgcaaaa ctagttaaaa gcttcc 146
其中n＝a或g或c或t，该片段含有肠激酶EK位点、tGLP-1基因、终止密码子taa及限制性内切酶Bgl II、Spe I和HindIII位点。
将片段克隆至pET32a(+)中，得到含TrxA-纯化标签His Tag-肠激酶酶切位点-重组人胰高血糖素样肽-1，即含有重组人胰高血糖素样肽-1-终止密码子TAA的重组pET32a(+)质粒，pET32a-tGLP-1-C1。
用Xba I/HindHI酶切pET32a-tGLP-1-C1和pET28a(+)，分别回收两者的酶切小片段和大片段，进行连接，即得到含重组GLP-1衍生物基因的pET28a(+)质粒，pET28a-tGLP-1-C1。
将含有合成的tGLP-1序列的pET28a(+)质粒(pET28a-tGLP-1-C1)转化大肠杆菌BL21(DE3)或BLR(DE3)，制得含单串tGLP-1基因的基因工程表达菌株。
实施例3 构建含高效表达tGLP-1的基因工程菌。
P1：gggctagcaaacatagcgaaggcacctttac
P2：ggaagcttttaactagttttgcagccnnngccgtccac
gggctagcaa acatagcgaa ggcaccttta ccagcgatgt gagcagctat ctggaaggcc 60
aggccgccca ggaatttatt gcctggctggt ggacggcnnn ggctgcaaa actagttaaa 120
agcttcc 127
以P1，P2为引物以含单串tGLP-1基因的pET28a(+)质粒为模版进行PCR，最终得到串联小片段，即SeqID No.5，其中n＝a或g或c或t，P1引入酶切位点Nhe I。用SpeI/HindIII和Nhe I/HindIII分别酶切第二步得到的重组质粒pET28a-tGLP-1-C1和第三步得到的串联小片段，将Spe I/HindIII双酶切得到的大片段与Nhe I/HindIII双酶切得到的小片段连接，得到重组GLP-1衍生物基因的二聚体重组质粒：pET28a-tGLP-1-C2，Spe I和Nhe I为一对同尾酶。重复上述酶切步骤6次，分别得到tGLP-1基因的三聚体，四聚体，五聚体，六聚体，七聚体，八聚体质粒：pET28a-tGLP-1-C3，pET28a-tGLP-1-C4，pET28a-tGLP-1-C5，pET28a-tGLP-1-C6，pET28a-tGLP-1-C7，pET28a-tGLP-1-C8。将构建好的重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)或BLR(DE3)中，得到高效表达tGLP-1的基因工程菌。
实施例4 用构建的基因工程菌生产tGLP-1，具体操作步骤：
第一步：液体培养
将高效表达tGLP-1的基因工程菌挑取单菌落于LB培养基中培养过夜，以1％转接入自诱导培养基中培养12h，即产生和积累以可溶形式或包涵体形式表达的tGLP-1融合蛋白。
第二步：纯化得到高纯度tGLP-1
对于以可溶形式表达的融合蛋白，将湿菌体破壁，经镍柱亲和层析获得含tGLP-1融合蛋白的粗品。
对于以包涵体形式表达的融合蛋白，将湿菌体破壁，离心得到包涵体蛋白沉淀，用洗涤缓冲液洗涤包涵体，即得到较高纯度的tGLP-1包涵体。
第三步：胰酶酶切得到tGLP-1
将包涵体用8mol/L尿素溶解，用BSA试剂盒测蛋白浓度后将蛋白稀释到4-5mg/ml，以可溶形式表达的融合蛋白直接测蛋白浓度。然后加入胰酶酶切即得到具备生物学活性的GLP-1衍生物。
实施例5 pET28a-tGLP-1-C1、pET28a-tGLP-1-C4、pET28a-tGLP-1-C8IPTG诱导表达量分析
将pET28a-tGLP-1-C1、pET28a-tGLP-1-C4，pET28a-tGLP-1-C8质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落接种于20mlLB培养基中，37℃，210rpm/min，过夜培养.然后按5％接种量转接于LB培养基中，37℃，210rpm/min，培养至OD 600＝0.6-0.8，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导4h，收集菌体。SDS-PAGE电泳分析tGLP-1-C1，tGLP-1-C4，tGLP-1-C8表达量。
从表中我们可以看出，随着tGLP-1基因串数的增加，表达量显著提高，pET28a-tGLP-1-C4相对于pET28a-tGLP-1-C1的每升培养基的蛋白获得量提高2.66倍，pET28a-tGLP-1-C8相对pET28a-tGLP-1-C4提高量不多。
实施例6 pET28a-tGLP-1-C1、pET28a-tGLP-1-C4和pET28a-tGLP-1-C8自诱导表达量分析
材料与方法：
自诱导培养基中：蛋白胨19.17g/L，酵母膏9.59g/L，Na2HPO45.72g/L，KH2PO45.48g/L，(NH4)2SO42.66g/L，NaCl 3.33g/L，甘油2％(v/v)，葡萄糖0.68g/L，乳糖6.33g/L，MgSO40.24g/L。
将pET28a-tGLP-1-C1、pET28a-tGLP-1-C4和pET28a-tGLP-1-C8质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落接种于20mlLB培养基中，37℃，210rpm/min，培养12h。然后按1％接种量转接于自诱导培养基中33℃、pH7、210rpm/min培养12小时，离心收集湿菌体。SDS-PAGE电泳检测目的蛋白表达量。
从表中我们可以看出，自诱导培养基相对IPTG诱导表达量显著提高，pET28a-tGLP-1-C1，pET28a-tGLP-1-C4，pET28a-tGLP-1-C8平均提高3倍。
实施例7 tGLP-1腹腔给药降血糖作用。
实验材料与方法：
雌性健康昆明小鼠(清洁级，上海斯莱克实验动物有限公司提供)；
16％葡萄糖溶液；
tGLP-1，具有实施例1-实施例8所述GLP-1衍生物的结构；
给药方式：腹腔注射；
血糖测试仪(上海新立医疗器械有限公司出品)。
雌性健康昆明小鼠禁食16小时，分为2组(n＝10)。1，生理盐水对照组；2，tGLP-1给药组，具体的序列结构是实施例1-实施例8中所述的结构。tGLP-1给药组剂量为12nmol/kg。记此时为零时刻。1组于0、1.5、3.5小时给予400uL 16％葡萄糖溶液，分别于0.5、2、4小时进行小鼠尾静脉取血10uL，用血糖测试仪测定血糖浓度；2组于0、1.5、3.5小时给予400uL 16％葡萄糖溶液，分别于0.5、2、4小时进行小鼠尾静脉取血10uL，用血糖测试仪测定血糖浓度。
结果如图2所示，所示数值均为n＝10的均值，所示降糖率按如下方法计算：降糖率(％)＝(生理盐水对照组血糖值-给药组血糖值)/生理盐水对照组血糖值。Thr即实施例1中所述的结构；Asp即实施例2中所述的结构；Ser即实施例3中所述的结构；Ala即实施例4中所述的结构；Gly即实施例5中所述的结构；Leu即实施例6中所述的结构；Gln即实施例7中所述的结构；His即实施例8中所述的结构。与生理盐水对照组小鼠相比，在给药后0.5小时，tGLP-1各突变体均能显著降低小鼠血糖；在给药后2小时，tGLP-1的降血糖作用显著降低，其中以Thr效果最好。
实施例8 tGLP-1腹腔给药降血糖作用。
实验材料与方法：
雌性健康昆明小鼠(清洁级，上海斯莱克实验动物有限公司提供)；
16％葡萄糖溶液；
0.9％NaCl溶液；
GLP-1；
(Thr35)-GLP-1，具有实施例1所述GLP-1衍生物的结构；
给药方式：腹腔注射；
血糖测试仪(上海新立医疗器械有限公司出品)。
雌性健康昆明小鼠禁食16小时，分为3组(n＝10)。1，生理盐水对照组；2，GLP-1对照组；3，(Thr35)-GLP-1给药组，即Xaa30＝Thr的tGLP；具体的序列结构是实施例1中所述的结构。GLP-1对照组给药剂量为12nmol/kg；(Thr35)-GLP-1给药组剂量为12nmol/kg。记此时为零时刻。1组于0、1.5、3.5小时给予400uL 16％葡萄糖溶液，分别于0.5、2、4小时进行小鼠尾静脉取血10uL，用血糖测试仪测定血糖浓度；2组于0、1.5、3.5小时给予400uL 16％葡萄糖溶液，分别于0.5、2、4小时进行小鼠尾静脉取血10uL，用血糖测试仪测定血糖浓度；3组于0、1.5、3.5小时给予400uL 16％葡萄糖溶液，分别于0.5、2、4小时进行小鼠尾静脉取血10uL，用血糖测试仪测定血糖浓度。
结果如图2所示，所示数值均为n＝10的均值，与生理盐水对照组小鼠相比，在给药后0.5小时，GLP-1和(Thr35)-GLP-1均能显著降低小鼠血糖；在给药后2小时，GLP-1的已无降血糖作用，而(Thr35)-GLP-1可在2小时内显著降低小鼠血糖，体内药效时间比GLP-1延长。结果表明，按本发明方法制备出的tGLP-1表现出比GLP-1更加长效的降血糖活性。
实施例9 tGLP-1串联体口服给药降血糖作用
实验材料与方法：
雌性健康昆明小鼠(清洁级，上海斯莱克实验动物有限公司提供)；
16％葡萄糖溶液；
0.9％NaCl溶液；
GLP-1；
(Thr35)-GLP-1-C4，具有实施例1所述GLP-1衍生物的结构；
给药方式：灌胃；
血糖测试仪(上海新立医疗器械有限公司出品)。
雌性健康昆明小鼠禁食16小时，分为3组(n＝10)。1，生理盐水对照组；2，GLP-1对照组3，(Thr35)-GLP-1-C4给药组，即Xaa30＝Thr的tGLP-1四串包涵体；具体的序列结构是实施例1中所述的结构。GLP-1对照组口服给药剂量为400nmol/kg；(Thr35)-GLP-1-C4口服给药组剂量为400nmol/kg，记此时为零时刻。1组于0、1、2.5小时给予400uL 16％葡萄糖溶液，分别于0.5、1.5、3小时进行小鼠尾静脉取血10uL，用血糖测试仪测定血糖浓度；2组于0、1、2.5小时给予400uL 16％葡萄糖溶液，分别于0.5、1.5、3小时进行小鼠尾静脉取血10uL，用血糖测试仪测定血糖浓度；3组于0、1、2.5小时给予400uL 16％葡萄糖溶液，分别于0.5、1.5、3小时进行小鼠尾静脉取血10uL，用血糖测试仪测定血糖浓度。
结果如图3所示，所示数值均为n＝10的均值，与生理盐水对照组小鼠相比，在给药后0.5小时，GLP-1和(Thr35)-GLP-1-C4均能显著降低小鼠血糖；在给药后1.5小时，GLP-1的已无降血糖作用，而(Thr35)-GLP-1-C4可在1.5小时内显著降低小鼠血糖，体内药效时间比GLP-1延长。结果表明，按本发明方法制备出的tGLP-1口服给药时表现出比GLP-1更加长效的降血糖活性。
实施例10 包含tGLP-1的组合物
取0.6mg通过DNA重组技术制备的tGLP-1，溶解于2mL去离子水中；另取60mg甘露醇，溶解于1mL去离子水中；将二者混匀即为tGLP-1与甘露醇的组合物，其中含0.2mg/mL的tGLP-1以及20mg/mL的甘露醇。甘露醇作为一种常用的制剂成分对药效并无影响，上述包含tGLP-1的组合物具有与tGLP-1相同的降血糖作用。
我们在用上述方法测试其他tGLP-1的活性，得到了类似的结果。
上述具体实施方式旨在阐述本发明的最佳实施方式而不是以任何形式限制本发明。本领域技术人员根据本发明的启示，结合本领域的常识所做的各种变更，均落在本发明专利申请权利要求的范围内。
序列表
<110>华东师范大学
<120>tGLP-1衍生物及其制备和应用
<160>5
<210>1
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>1
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu G1u
5 10 15
Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
Gly
<210>2
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(30)
<223>Xaa＝Thr，Asp，Ser，Ala，Gly，Leu，Gln或His
<220>
<221>合成构建体
<222>(2)
<223>Xaa＝Ser
<220>
<221>合成构建体
<222>(20)
<223>Xaa＝Gln
<220>
<221>合成构建体
<222>(28)
<223>Xaa＝Asp
<220>
<221>合成构建体
<222>(32)
<223>Xaa＝Cys
<400>2
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
5 10 15
Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
Gly Cys
<210>3
<211>32
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>合成构建体
<222>(2)
<223>Xaa2＝Ser，Hi s或D-Ala
<220>
<221>合成构建体
<222>(20)
<223>Xaa20＝Ser，Hi s，Gln或Ala
<220>
<221>合成构建体
<222>(28)
<223>Xaa＝Ser，His，Asp或Ala
<220>
<221>合成构建体
<222>(32)
<223>Xaa＝Gly或Cys
<400>3
His Xaa2 Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
5 10 15
Gly Gln Ala Ala Xaa20 Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa28 Gly Arg
20 25 30
Gly Xaa32
<210>4
<212>DNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<222>(118，119，120)
<223>n＝a或g或c或t
<400>4
ggagatctgg gtaccgacga cgacgacaag catagcgaag gcacctttac cagcgatgtg 60
agcagctatc tggaaggcca ggccgcccag gaatttattg cctggctggt ggacggcnnn 120
ggctgcaaaa ctagttaaaa gcttcc 146
<210>5
<212>DNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<222>(98，99，100)
<223>n＝a或g或c或t
<400>5
gggctagcaa acatagcgaa ggcaccttta ccagcgatgt gagcagctat ctggaaggcc 60
aggccgccca ggaatttatt gcctggctggt ggacggcnnn ggctgcaaa actagttaaa 120
agcttcc 127
Claims (8)
1.一种人GLP-1衍生物，其特征在于，所述衍生物的分子结构式为tGLP-1(7-38)，SeqID NO.2；其中，Xaa2是Ser；Xaa20是Gln；Xaa28是Asp；Xaa30是Thr，Asp，Ser，Ala，Gly，Leu，Gln，His中的任何一种；Xaa32是Cys。
2.如权利要求1所述GLP-1衍生物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)构建高效表达如权利要求1所述tGLP-1的基因工程菌
①根据如权利要求1所述tGLP-1的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱密码子，合成Seq ID No.4所示的片段，该片段含有肠激酶EK位点、tGLP-1基因、终止密码子TAA、限制性内切酶Bgl II、Spe I和HindIII位点；
将该片段克隆至pET32a(+)中，得到重组质粒pET32a-tGLP-1-C1；
用Xba I/HindIII酶切pET28a(+)和pET32a-tGLP-1-C1，将两者的酶切小片段和大片段分别回收并连接，得到重组质粒pET28a-tGLP-1-C1；
②构建含有单串tGLP-1基因的DNA序列的基因工程菌
将重组质粒pET28a-tGLP-1-C1转化BLR(DE3)，制得含单串tGLP-1基因的基因工程表达菌株；
③构建高效表达tGLP-1的基因工程菌
以P1，P2为引物，以含单串tGLP-1基因的pET28a(+)质粒为模板，进行PCR，最终得到Seq ID No.5所示的串联小片段；
P1：gggctagcaaacatagcgaaggcacctttac
P2：ggaagcttttaactagttttgcagccnnngccgtccac
其中，P1引入酶切位点Nhe I；
用Spe I/HindIII和Nhe I/HindIII分别酶切步骤②的重组质粒pET28a-tGLP-1-C1和Seq ID No.5所示的串联小片段，将Spe I/HindIII双酶切得到的大片段与Nhe I/HindIII双酶切得到的小片段连接，得到tGLP-1基因的二聚体重组质粒pET28a-tGLP-1-C2；重复上述酶切连接6次，分别得到tGLP-1基因的三聚体质粒pET28a-tGLP-1-C3，四聚体质粒pET28a-tGLP-1-C4，五聚体质粒pET28a-tGLP-1-C5，六聚体质粒pET28a-tGLP-1-C6，七聚体质粒pET28a-tGLP-1-C7，八聚体质粒pET28a-tGLP-1-C8；
将上述重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)或BLR(DE3)中，得到高效表达tGLP-1的基因工程菌。
(2)液体培养
将步骤(1)所得的基因工程菌挑取单菌落于LB培养基中培养12-16小时，以1％转接入自诱导培养基中培养12-24小时，产生和积累以可溶形式或包涵体形式表达的tGLP-1融合蛋白；
(3)纯化得到高纯度tGLP-1
对于以可溶形式表达的融合蛋白，将湿菌体破壁，经镍柱亲和层析获得含tGLP-1融合蛋白的粗品；
对于以包涵体形式表达的融合蛋白，将湿菌体破壁，离心得到包涵体蛋白沉淀，用洗涤缓冲液洗涤包涵体，得到较高纯度tGLP-1包涵体；
(4)胰酶酶切得到tGLP-1
将蛋白稀释到4-5mg/ml，加入胰酶酶切，得到具备生物学活性的tGLP-1衍生物。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述基因工程菌是携带重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)或BLR(DE3)，所述重组质粒是含有人tGLP-1衍生物基因的质粒pET28a(+)，所述人tGLP-1衍生物基因的串数为1-8串。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述重组质粒为pET32a(+)-tGLP-1，pET28a(+)-tGLP-1。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的自诱导培养基包含有蛋白胨，酵母膏，Na2HPO4，KH2PO4，(NH4)2SO4，NaCl，甘油，葡萄糖，乳糖，MgSO4。
6.如权利要求1所述tGLP-1在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
7.如权利要6所述的应用，其中所述药物为口服药物。
8.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有有效量的如权利要求1所述的tGLP-1，以及药学可接受的成分。
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|---|---|---|---|---|
| CN106434717A (zh) * | 2015-11-05 | 2017-02-22 | 杭州九源基因工程有限公司 | 一种生物合成制备人glp‑1多肽或其类似物的方法 |
| CN109562144A (zh) * | 2016-06-09 | 2019-04-02 | 阿米德生物有限责任公司 | 胰高血糖素类似物及其使用方法 |
-
2010
- 2010-01-25 CN CN2010101018521A patent/CN102134274A/zh active Pending
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