CN102839185B - 一种rolGLP-HV工程菌的构建方法及应用技术 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生产治疗糖尿病及血栓并发症的双功能药物(rolGLP-HV)工程菌的构建、制备方法和应用技术。将对2型糖尿病具有“治标治本”疗效的长效促胰岛素rolGLP-1与有效防治其心脑血管并发症的水蛭素rHV1融合，使其具有预防和治疗糖尿病及血栓并发症的双重功能。具体来说，应用基因工程技术获得rolGLP-1和rHV1的融合基因rolGLP-HV，并将其克隆到大肠杆菌表达载体pET22b(+)，构建表达载体pNK-EC-rolGLP-HV，转化大肠杆菌，获得高表达rolGLP-HV的工程菌NK-rolGLP-HV-E007。该菌株通过诱导表达和纯化可获得高纯度rolGLP-HV。胡氏血栓模型小鼠灌胃rolGLP-HV，可显著减缓其尾部血栓出现的时间和程度；糖尿病模型小鼠灌胃rolGLP-HV，可明显降低血糖水平并改善糖尿病症状，因此，本发明可用于开发同时治疗糖尿病及其血栓并发症的双功能药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种rolGLP-HV(长效促胰岛素-水蛭素)工程菌的构建方法及应用技术，属于生物制药技术领域。
背景技术
糖尿病(diabetes mellitus)是胰岛素绝对或相对分泌不足以及机体对胰岛素敏感性降低所引起的代谢紊乱，其主要临床特点是血糖高、糖尿、多尿、多饮、多食、消瘦、疲乏等，是最常见的慢性病之一。目前，随着人们生活水平的提高，人口老龄化以及肥胖发生率的增加，糖尿病的发病率呈逐年上升趋势，并有向低龄化发展的趋向。据统计，中国已确诊的糖尿病患者达4000万，并以每年100万的速度递增，预计到2025年将达到6000万。
如今，糖尿病被许多学者说成是“百病之源”，是因为若糖尿病得不到有效的治疗，会引起多种并发症。糖尿病的并发症可达百种以上，主要有肠胃功能紊乱(大便干稀不定)、眼病(视力模糊，眼底出血，视网膜病变及脱落，白内障等)、脑血管病(脑动脉硬化，脑出血，脑血栓，失眠)、心血管病(冠心病，心律不齐，心跳过速等)、肾病(尿蛋白，肾炎，肾蟀，尿毒症等)等等。据世界卫生组织统计，糖尿病患者死亡率最高的为心脑血管病变，占50％，糖尿病人患脑血栓的发病率为非糖尿病人的12倍。因此，寻找一种治疗糖尿病同时又能有效预防和治疗其严重的并发症特别是心脑血管疾病的治疗方法或药物至关重要。
胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)，由胰升糖素原衍生而来，为30个氨基酸的多肽，大量研究证实GLP-1能刺激胰岛素分泌，且血糖越高，GLP-1的促胰岛素作用越强；如果血糖浓度恢复至正常值时，GLP-1就不会再继续作用，因而不会产生低血糖现象，被称为聪明的降糖药物；GLP-1还能减少胰岛细胞损伤，改善胰岛细胞结构，修复胰岛β细胞功能，促进胰岛β细胞再生，提高胰岛细胞活力并延长其寿命，抑制胰升糖素的释放，调控胰腺β细胞特异基因表达并通过这种基因调控改善葡萄糖转运和代谢，提高β细胞对葡萄糖的反应性以及降低食欲和抑制胃的排空等功能(Gastroenterology，2002，122：531-544，Endocr Rev，1995，16：390-410，Curr Diab Rep，2003，3：365-372，Diabetologia，1992，35：701-711，Digestion，1994，55：22-28，Endocrinol，1992，130：159-166，Euro J Endocrinol，2000，143：717-725，J Clin Invest，1993，91：301-307，Diabetes，1989，38：902-909，J Clin Invest，2000，105：955-965，Diabetes，1999，48：2270-2276，Gastroenterology，1994，107：1948-1955)。GLP-1被认为是可从根本上治疗糖尿病的一种“治标治本”的药物，对于糖尿病的治疗具有重要意义。
水蛭素(Hirudin，HV)是从医蛭(Hirudomedieinalis)唾液腺中分离提纯的一类酸性小分子蛋白质，一般由65-66个氨基酸组成，有很多酸性氨基酸。水蛭素的分子量大约在7kDa左右。水蛭素是目前最好的凝血酶抑制剂，对于治疗和预防弥散性血管内凝结(DIC)、心及脑血管栓塞具有很大的应用价值。水蛭素能够阻止凝血酶对纤维蛋白原的作用，起到凝血作用，同时 又能抑制血小板凝集，加速血栓溶解，降低血液黏稠度，对心脑血管疾病患者因血液流变性异常而出现的浓、黏、聚状态有较好的改善作用；水蛭素能明显降低血脂，调节血浆中的PGI和TXB的相对平衡，维持血管内环境的稳态，从而起到预防动脉粥样硬化和高血脂的功效，是治疗心脑血管疾病的首选良药(Biomed Biochim Acta，1985，44：1007-1013，Biochem.J.1994，300：643-650，Thromb Rest，2003，109：S17-S22，JPhar Sci，2000，89(5)：579-585，Thromb Res，2002，106：V275-V284，Semin Thromb Hemost，2001，27(5)：543-9，Circulation，2001，103：1479-1484，N Engl J Med，1995，332(20)：1330-1335)。
在预防和治疗糖尿病过程中，关注其并发症特别是血栓的预防和治疗十分必要。因此，本发明将rolGLP-1基因和rHV1基因通过平端连接进行融合，使其在大肠杆菌中高效表达，纯化获得的rolGLP-HV口服后可被胃肠道中的胰蛋白酶切成两种功能性药物，起到治疗糖尿病及其血栓并发症的双重功能，为治疗糖尿病及心脑血管疾病提供一种新的方法和药物。经文献检索，目前国内外尚无将rolGLP-1和HV1两种基因融合表达以及rolGLP-HV大肠杆菌工程菌的报道。
发明内容
本发明的目的是：
1)构建一种含有rolGLP-1和rHV1编码序列的融合基因rolGLP-HV。
2)构建一种含有rolGLP-HV融合基因的载体pNK-EC-rolGLP-HV和高表达rolGLP-HV的大肠杆菌工程菌NK-rolGLP-HV-E007。
3)NK-rolGLP-HV-E007诱导表达，可获得糖尿病与血栓双功能口服药物rolGLP-HV。
4)纯化的rolGLP-HV可进行糖尿病及血栓并发症的治疗。
本发明是通过以下技术方案实现的：
首先，本发明提供了一种融合基因rolGLP-HV，该基因包含一段胰高血糖素样多肽-1基因rolGLP-1和一段水蛭素基因rHV1，其基因序列如图1所示。
在本发明提供的融合基因rolGLP-HV中，所述的胰高血糖素样多肽-1基因GLP-1，其基因内的二肽酶IV和胰蛋白酶识别位点已被去除，第8位的Ala被Ser取代，第26位和34位的Lys分别被Gln和Asp取代；所述的水蛭素基因是水蛭素变异体-1基因rHV1；rolGLP-1基因和rHV1基因直接首尾串联连接，获得融合基因rolGLP-HV。利用rolGLP-1的C端最后氨基酸为Arg(恰好为胰蛋白酶的识别位点)的特点，进而保证其表达产物rolGLP-HV在体内可被胰蛋白酶切割成具有完整N端的rolGLP-1和rHV1单体而发挥作用。
融合基因rolGLP-HV的构建过程：
通过对合成的寡核苷酸片段磷酸化处理、Pfu补平、T4连接酶连接获得rHV1基因；通过PCR获得rolGLP-1基因。通过平端直接连接的方法将二者融合，获得rolGLP-HV融合基因。将其克隆到pMD18T-Simple载体，获得pMD18T-Simple-rolGLP-HV，该载体即包含本发明图1所示的融合基因rolGLP-HV的基因序列。
其次，本发明提供了一种大肠表达载体，该表达载体包含以上所述的融合基因rolGLP-HV，具体是指大肠杆菌表达载体——pNK-EC-rolGLP-HV。其构建过程如下：
将上述得到的克隆载体pMD18T-Simple-rolGLP-HV中的融合基因rolGLP-HV进行PCR扩增，得到的融合基因用HindIII内切酶进行酶切，回收后连入pET-22b(+)载体，构建得到大肠杆菌表达载体pNK-EC-rolGLP-HV。
第三，本发明提供了一种大肠杆菌工程菌株NK-rolGLP-HV-E007，该菌株是用以上所述的表达载体pNK-EC-rolGLP-HV转化大肠杆菌BL21(DE3)所筛选得到的工程菌株。
第四，用本发明所提供的基因工程菌NK-rolGLP-HV-E007进行诱导表达及产物纯化，可大量获得高纯度的rolGLP-HV。
采以上所述方法获得的rolGLP-HV，可应用于预防和治疗糖尿病及其血栓并发症。
胡氏血栓小鼠模型的建立(皮下注射50mg/kg的卡拉胶导致尾部出现血栓构建血栓小鼠模型)。将上述纯化后得到的rolGLP-HV对胡氏血栓模型小鼠进行灌胃处理，观察小鼠尾部血栓出现的时间以及相对长度。证明rolGLP-HV可有效延缓模型小鼠尾部血栓出现的时间，并使其血栓的相对长度明显降低。
糖尿病小鼠模型的建立(腹腔注射150mg/kg的链脲佐菌素并辅以高脂高糖饲料喂养诱发小鼠发生2型糖尿病)。用纯化的rolGLP-HV对糖尿病模型小鼠进行灌胃10天(1次/天)，隔5天检测小鼠的血糖水平。证明rolGLP-HV可明显降低模型小鼠的血糖水平，并可改善模型小鼠的多饮、多食、多尿等糖尿病症状。
本发明的有益效果：
运用基因操作技术，获得了rolGLP-HV融合基因，将其克隆到大肠杆菌表达载体pNK-EC-rolGLP-HV构建了大肠杆菌工程菌株NK-rolGLP-HV-E007，对其进行诱导表达，获得高纯度rolGLP-HV。胡氏血栓模型小鼠灌胃本发明提供的rolGLP-HV，可明显延缓和改善模型小鼠的血栓症状；糖尿病模型小鼠灌胃本发明获得的rolGLP-HV，可明显降低糖尿病小鼠血糖水平并改善其糖尿病症状，证明rolGLP-HV具有治疗糖尿病及血栓的双功能，可用于糖尿病及其血栓并发症的预防和治疗。
附图说明
图1融合基因roGLP-HV的DNA序列。
图2大肠杆菌表达载体pNK-EC-rolGLP-HV的构建过程。
图3rHV1基因的克隆。(A)为rHV1基因克隆过程；(B)rHV1基因的PCR产物电泳检测结果。M为Marker，1，2，3泳道为rHV1基因的PCR产物电泳结果。
图4rolGLP-HV融合基因的PCR产物电泳检测结果。M为Marker，1，2泳道为rolGLP-HV融合基因的PCR产物电泳检测结果。
图5pNK-EC-rolGLP-HV载体的转化子菌液PCR产物的琼脂糖电泳检测结果。M为Marker，1-4泳道为阳性转化子的菌液PCR结果。
图6大肠杆菌工程菌NK-rolGLP-HV-E007的诱导表达、纯化及Western Blot分析结果。(A)为诱导表达后的Tricine-SDS-PAGE，(B)为纯化处理后的Tricine-SDS-PAGE，(C)为rolGLP-HV的Western Blot分析结果。
图7小鼠尾部血栓长度测量。1为正常组小鼠，2为灌胃ddH2O对照组小鼠，3为灌 胃rolGLP-HV组小鼠。
图8连续灌胃rolGLP-HV十天后对小鼠空腹血糖影响的测定结果。
具体实施方式
实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1
一种融合基因rolGLP-HV的构建。包括如下步骤：
(1)以pMD-GLP为模板(其rolGLP-1的基因序列已由本发明人申请国家发明专利，专利公开号为：CN 101824388A)，通过PCR(用Pfu酶)，获得rolGLP-1基因片段。实验所用的PCR引物是根据rolGLP-1的序列设计的：
P1：5′-CATTCTGAGGGTACTTTCACTTCTG-3′
P2：5′-TCTACCATCAACCAACCAAGCGATG-3′
(2)采用基因半合成法，获得rHV1基因片段(图3A)。首先根据rHV1的基因序列合成四个寡核苷酸片段：P3，P4，P5，P6：
P3：5′-GTTGTCTACACTGACTGTACTGAATCTGGTCAAAACTTGTGTTTGTGTGAAGGTTCCAACGTTTGTGGTCAAGGTAACAAGTGTATCTT-3′
P4：5′-TTACTGGTGAGGGTACTCCTAAGCCACAATCCCATAACGACGGTGACTTCGAGGAGATTCCAGAGGAATACTTGCAATAAAAGCTTGGG-3′
P5：5′-GGCTTAGGAGTACCCTCACCAGTAACACATTGGTTCTTCTCACCGTCAGAA CCCAAGATACACTTGTTACCTTGACCAC-3′
P6：5′-CCCAAGCTTTTATTGCAAGTATTCCTCTG-3′
下划线部分为HindIII酶切位点。
将上述四个寡核苷酸片段分别在50μL体系的磷酸化混合液中进行磷酸化处理。混合液中包括合成的引物片段，5μL 10×激酶bufffer，5μL 10mmol/LATP，1μL T4磷酸激酶(2U)，34μL ddH2O。混合液至于37℃保温60分钟，然后100℃加热1分钟终止反应。冰浴。将磷酸化的寡核苷酸片段用冰冻乙醇沉淀30分钟，离心后将沉淀用75％乙醇清洗两次，将沉淀干燥，分别用10μL ddH2O溶解。
将磷酸化后的片段进行Pfu酶补平，配制50μL体系。混合液中包含磷酸化的P3、P4、P5、P6片段各10μL，1μL 10mmol/LdNTP，5μL 10×bufffer，1.5μL Pfu酶，2.5μL ddH2O。混匀液置于水浴中94℃3分钟，55℃2分钟，72℃5分钟。然后冰冻乙醇沉淀30分钟，离心后将沉淀用75％乙醇清洗两次，将沉淀干燥，用20μL ddH2O溶解。
用上述补平片段进行T4连接酶缺口连接反应。配制25μL连接体系。混合液中包含补平片段20μL，2.5μL 10×bufffer，1μL T4连接酶，1.5μL ddH2O。16℃反应过夜。连接产物中加入等体积氯仿：异戊醇抽提杂蛋白，乙醇沉淀获得rHV1基因。
用引物P6和P7，上述获得的rHV1基因为模板进行PCR，获得用于平端连接的rHV1模板(图3B)。其中P7序列如下：
P7：5′-GTTGTCTACACTGACTGTACTGAATCTGG-3′。
将上述用Pfu酶分别扩增得到的rolGLP-1基因片段和rHV1基因片段混合，加入T4连接酶进行平端连接。反应结束后，使用引物P1和P6进行PCR扩增。配制50μL反应体系。混合液中包含1μL平端连接反应产物，P1和P6引物各1μL，5μL 10×bufffer，0.5μL Taq酶，4μL 2.5mmol/L dNTP，37.5μL ddH2O。PCR反应条件为：94℃预变性10分钟；94℃1分钟，58℃30秒，72℃1分钟，循环30次；72℃延伸10分钟，4℃保温。获得融合基因rolGLP-HV(图4)。
实施例2
一种含有rolGLP-HV融合基因的大肠杆菌表达载体pNK-EC-rolGLP-HV的构建。
用HindIII消化rolGLP-HV基因片段。质粒pET-22b(+)用Nco I酶切后，用Pfu酶补平，然后用HindIII对载体大片段进行酶切处理。将酶切后的载体和基因片段进行连接(图2)。挑取阳性转化子即为本发明中所用的表达载体，含有rolGLP-HV融合基因的大肠杆菌表达载体pNK-EC-rolGLP-HV(图5)。
实施例3
大肠杆菌工程菌NK-rolGLP-HV-E007的诱导表达及rolGLP-HV的纯化。
选取NK-rolGLP-HV-E007菌株，37℃、230r摇瓶培养到OD600为0.6～0.8时添加终浓度为1mmol/L诱导剂IPTG，在25℃条件下诱导12h，离心取菌体进行超声破碎，抽提蛋白进行Tricine-SDS电泳检测证明成功表达rolGLP-HV(图6A)。超声处理后的上清液进行亲和层析(Ni-NTA层析柱)纯化处理，获得高纯度的rolGLP-HV(图6B)。Western blot结果(图6C)表明，构建的大肠杆菌已成功表达rolGLP-HV。
实施例4
rolGLP-HV用于血栓的预防和治疗。
(1)血栓小鼠模型的建立
在小鼠背部皮下注射卡拉胶可以诱使小鼠在24h之内尾部出现明显的血栓。选择50mg/kg的剂量在昆明小鼠(清洁级)后背后皮下注射卡拉胶稀释液，双功能融合蛋白处理组在注射卡拉胶的同时口服灌胃20mg/Kg剂量的rolGLP-HV，然后观察小鼠尾部皮肤变化情况，根据其颜色变化时间、变化程度以及尾部血栓出现的程度(即相对长度)来判断血栓形成情况及rolGLP-HV的抗血栓活性(表1和表2)。
(2)结果表明，灌胃rolGLP-HV可有效发挥抗血栓、延缓血栓出现的功效，使小鼠尾部血栓形成时间从一般的24h延迟至32h，尾部血栓相对长度从37.5％减少至25％左右(图7)。
表1表示不同处理的小鼠尾部出现血栓的时间。
表2表示不同处理组小鼠尾部血栓相长度测量结果。
实施例5
rolGLP-HV用于糖尿病的治疗
(1)糖尿病小鼠模型的建立
C57BL小鼠按照体重随机分成空白对照组(n＝7)和预备造模组(n＝20)。分别给予高脂高糖饲料和普通饲料。喂食三周后，小鼠隔夜禁食17h，按150mg/kg体重的剂量腹腔快速注射链脲佐菌素，注射7d后，测定血糖，结果表明成功建造2型糖尿病模型。
(2)供试药品为表达纯化后的rolGLP-HV
将实验小鼠按血糖值水平随机分成四组：正常组(n＝7)，阴性对照组(n＝7)，阳性药组(n＝7)和rolGLP-HV(n＝7)组。其中，正常组和阴性对照组灌胃等体积生理盐水，阳性药组采用罗格列酮(5mg/Kg)，rolGLP-HV组灌胃rolGLP-HV(15mg/Kg)，1次/d，连续给药10d，检测小鼠的血糖水平、饮水量、摄食量以及体重的变化。在给药10天后，发现rolGLP-HV灌胃组糖尿病小鼠的饮食、饮水、和体重都有较明显的改善，rolGLP-HV灌胃给药小鼠的血糖值明显下降，其血糖值从10.6mmol/L降低到5.3mmol/L，而正常组血糖值在实验前后无明显变化(图8)。证明rolGLP-HV可明显降低模型小鼠的血糖水平，并可改善模型小鼠的多饮、多食、多尿等糖尿病症状。一种rolGLP-HV融合基因，该融合基因包含长效胰高血糖素-1(rolGLP-1)基因和水蛭素rHV1基因，其DNA碱基序列为：
一种rolGLP-HV融合基因，该融合基因包含长效胰高血糖素-1(rolGLP-1)基因和水蛭素rHV1基因，其DNA碱基序列为：
10 20 30 40 50 60 70 80
CATTCTGAGG GTACTTTCAC TTCTGATGTT TCCTCCTACT TGGAGGGTCA GGCTGCTCAA GAGTTCATCG CTTGGTTGGT
CTAAGACTCC CATGAAACTG AAGACTACAA AGGAGGATGA ACCTCCCAGT CCGACGAGTT CTCAAGTAGC GAACCAACCA
90 100 110 120 130 140 150 160
TCATCCTAGA GTTGTCTACA CTGACTGTAC TGAATCTGGT CAAAACTTGT GTTTCTGTGA ACCTTCCAAC GTTTGTGGTC
ACTACCATCT CAACAGATGT GACTGACATG ACTTAGACCA GTTTTGAACA CAAACACACT TCCAAGGTTG CAAACACCAG
170 180 190 200 210 220 230 240
AACCTAACAA CTGTATCTTC GCTTCTGACG GTCAGAACAA CCAATGTCTT ACTGGTGAGG GTACTCCTAA GCCACAATCC
TTCCATTCTT CACATAGAAC CCAAGACTGC CACTCTTCTT GGTTACACAA TGACCACTCC CATGACGATT CGGTGTTAGG
250 260 270 280 290 300 310 320
CATAACGACG GTGACTTCGA GGAGATTCCA GAGGAATACT TGCAA
GTATTCCTCC CACTGAACCT CCTCTAAGCT CTCCTTATGA ACCTT
编码的氨基酸序列为：
[His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Asp-Gly-Arg-Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-S er-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-GLu-Tyr-Leu-Gln]
Claims (8)
1.一种rolGLP-HV融合基因，该融合基因包含长效胰高血糖素-1和水蛭素rHV1基因，其DNA碱基序列如SEQ ID：1所示
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示
His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Asp-Gly-Arg-Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-GLu-Tyr-Leu-Gln。
2.根据权利要求1所述的rolGLP-HV融合基因，其特征在于：融合基因中rolGLP-1基因编码产物C端的最后一个氨基酸是Arg，其恰好是胰蛋白酶识别位点，保证rolGLP-HV口服后被胃肠道内胰蛋白酶无损失切割为完整的rolGLP-1和rHV1独立发挥功能。
3.根据权利要求1所述的rolGLP-HV融合基因，其特征在于：利用DNA合成技术将天然胰高血糖素样肽-1的第8、26、34位Ala、Lys、Lys分别替换为Ser、Gln、Asp，从而消除了基因内部的二肽酶IV和胰蛋白酶识别位点。
4.一种表达载体，其特征在于该表达载体包含权利要求1所述的融合基因rolGLP-HV，该表达载体是指大肠杆菌表达载体pNK-EC-rolGLP-HV。
5.一种工程菌株，其特征在于，是用权利要求4所述的表达载体pNK-EC-rolGLP-HV转化大肠杆菌BL21(DE3)所获得的工程菌株NK-rolGLP-HV-E007。
6.一种含有权利要求1所述rolGLP-HV融合基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于该方法包括：
1)通过平端相连的方法获得权利要求1所述的融合基因rolGLP-HV；
2)将rolGLP-HV融合基因克隆到表达载体pET22b(+)中获得权利要求4所述表达载体；
3)转化大肠杆菌BL21，通过筛选得到权利要求5中所述的工程菌株。
7.根据权利要求1-3所述的rolGLP-HV融合基因、权利要求4所述的表达载体、或权利要求5所述的工程菌株在制备防治2型糖尿病及其引发的血栓并发症的双功能口服药物中的用途，rolGLP-HV作为一种用于预防和治疗2型糖尿病及其引发的血栓并发症的双功能口服药物。
8.根据权利要求7所示用途，其中所述药物作为药物组合的一个组分。
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2011
- 2011-06-21 CN CN201110166533.3A patent/CN102839185B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN101824423A (zh) * | 2009-03-06 | 2010-09-08 | 南开大学 | 一种融合基因gad-glp-1和糖尿病食疗型黄瓜的培育方法 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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