CN101698681A - 一种双靶向作用的嵌合多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种双靶向作用的嵌合多肽及其制备方法和应用。本发明的嵌合多肽包括具有以下特征的三段序列：序列1是从N端计起的前20-80个人溶菌酶蛋白的氨基酸序列；序列2是Exendin-4蛋白的氨基酸序列；序列3是序列1和序列2的连接序列，包含凝血酶酶切位点和二肽基肽酶的酶切位点。本发明的制备方法可以是通过多肽合成技术合成或者通过构建包含编码所述嵌合多肽的的核苷酸序列的表达载体，在基因工程菌株中表达并纯化得到。本发明的嵌合多肽具有显著的抗AGEs和降血糖的双靶向活性，可以应用于制备抗AGEs和/或降低高血糖的药物。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白制多肽的制备及其应用领域，具体涉及一种包含人溶菌酶N端氨基酸序列和Exendin-4氨基酸序列的双靶向作用的嵌合多肽及其应用。
背景技术
溶菌酶是一种存在于蛋清和身体分泌液(如唾液、泪液等)中、能有效水解细菌壁多糖的防御性酶。人溶菌酶由148个氨基酸残基组成，其结构如SEQ ID No：1所示，其中靠近N-端约有18个氨基酸残基组成的结构域与晚期糖基化终产物(AGEs)具有高度亲和力，其解离常数Kd为50nM。体外实验发现溶菌酶能结合AGEs修饰的清蛋白，并促进单核巨噬细胞对AGEs的摄入。基于体内AGEs受细胞外酶降解的事实，科学家在实验糖尿病小鼠体内注入溶菌酶后，发现其血清AGEs水平显著降低，并减少细胞因子如IGF-1的产生，恢复系膜细胞的MMP-9表达水平，降低尿蛋白含量，尿中AGEs浓度升高达2倍，减少糖尿病并发症的发生，尤其对糖尿病性肾病的减缓效果，显示溶菌酶对于清除体内AGEs和防治糖尿病并发症具有显著的功效。最近美国的科学家研究发现，小鼠输入溶菌酶后，其血清和肝脏的AGEs含量显著减少，同时减少AGEs造成的氧化应激反应，还原型谷胱甘肽比例升高(GSH/GSSG)，小鼠的存活率比对照的高两倍，再次证明溶菌酶对于体内AGEs有对抗作用。然而，溶菌酶对体内AGEs的对抗作用与它的水解酶活性无关，此酶主要通过它的N端序列与AGEs结合，进而促进后者的清除，包括被细胞吞噬和水解酶的水解，其水解产物(小分子AGEs)经过肾脏从尿中排出体外。最近的实验证明，溶菌酶N端约77个氨基酸组成的序列(多肽)对AGEs具有很高的结合活性，能在体外实验中有效地结合AGEs分子，但这个多肽并没有溶菌酶的水解酶活性，说明溶菌酶的N端片段可能具有溶菌酶全酶的抗AGEs活性，包括促进体内AGEs的清除和排泄。另外，在生产溶菌酶蛋白的技术上，当应用基因工程技术利用原核细菌生产溶菌酶时，因产物溶菌酶蛋白对工程菌的破坏作用，大大影响了产量的提高，因此，用溶菌酶的部分基因构建的原核表达载体，只生产溶菌酶的N端片段，将有利于大量生产上述的具有抗AGEs活性的溶菌酶片段。
AGEs是一类非酶催化的糖基化产物。体内的葡萄糖、果糖、6-磷酸葡萄糖等还原糖的醛基与蛋白质、脂质或核酸等生物大分子的氨基形成Schiff碱，再经过分子重排生成早期糖基化产物--Amadori产物，后者经过一系列非酶促反应包括氧化、脱水、分子重排等变成不可逆的AGEs。由于AGEs具有很强的反应活性(如形成分子间交联)以及对蛋白水解酶的抵抗性等特点，生物大分子一经形成AGEs加合物后即严重影响甚至丧失其生物学活性，如AGEs使胶原分子异常交联而降低其转换率，导致组织老化及血管弹性降低，DNA经AGEs修饰后导致基因突变，AGEs修饰LDL而影响后者与LDL受体结合，造成它的清除率减慢等。同时，AGEs还通过与细胞膜上的受体结合，促进细胞因子如IL-6，粘附分子如VCAM-1，ICAM-1，及生长因子如PDGF，IGF-1的产生和分泌，造成炎症反应和组织损伤。
正常人体内缓慢地产生少量AGEs，其生成与清除处于一定平衡。随着年龄增加，体内AGEs水平逐渐升高，因而AGEs被认为是引起组织器官衰老的重要因素之一。糖尿病患者由于长期处于高血糖水平，体内AGEs的生成异常增加，AGEs的大量堆积导致一系列病理变化，如血管壁基底膜增厚、弹性降低、通透性增高、管腔变狭窄，细胞外基质分子结构与组成改变，以及炎症因子的产生和释放等，这些变化是造成糖尿病慢性并发症如糖尿病性肾病、糖尿病性脑病、白内障、糖尿病性心血管病等的主要原因。同时，老年患者因体内AGEs含量升高，可导致一些老年性精神障碍疾病的发生，如阿尔茨海默病(老年痴呆症)、脑血管病所致精神障碍、血管性痴呆等。因此，控制或降低体内AGEs的水平，能延缓组织器官衰老、预防或减轻糖尿病慢性并发症的发生和发展。
Exendin-4(一种肠促胰岛素拟似物)是从一种蜥蜴的唾液腺毒素中分离出来的由39个氨基酸组成的多肽，其结构如SEQ ID No：2所示。Exendin-4是一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体的长效激动剂，它与GLP-1具有53％的序列同源性，具有促进葡萄糖依赖性的胰岛素合成和分泌的作用，与GLP-1相比，exendin-4的降血糖作用更强。目前其人工合成多肽exenatide(商品名Byetta)已被用于临床糖尿病治疗。近年来，Exendin-4作为治疗2型糖尿病的新型药物广泛引起人们的关注，而Exenatide作为首个获准的肠降血糖类似物，于2005年4月获美国食品与药物管理局(FDA)批准用于二甲双胍、磺脲类药物血糖控制不理想的糖尿病患者的治疗，2007年5月在英国也成为一种有效的降糖药。
多肽药物是近年来生物医药研究的成果之一，多肽药物的生产主要有化学合成法和基因工程生产法。化学合成法主要是固相或液相合成法。固相合成技术目前已较为成熟，但成本较高，随着基因工程技术的成熟，国内外都尝试用基因工程技术生产多肽以提高产量，降低成本。用基因工程方法生产中等长度(20-60个氨基酸残基)多肽时，由于表达水平低，且容易降解，因此常与其他载体蛋白融合表达。但由于目的多肽在融合蛋白中所占比例很小，裂解后分离纯化困难，影响了基因工程生产多肽药物的发展。另一解决途经就是把目的多肽的基因串联，可以提高产量。但串联体切割时需要大量的酶，间接增加了生产成本。近年来，随着基因工程技术的进展，构建各种融合蛋白或单体、串联体多肽的报道迅速增加。然而，利用人体自身存在的酶，在体内对多肽药物进行裂解并缓慢释放其有效成分，使之成为可在体内产生两种多肽而发挥不同效应并达到治疗同一种疾病的多肽药物，尚未见报道。
综上所述，溶菌酶能有效地发挥抗AGEs作用，促进AGEs的清除与排泄，主要是因为其对AGEs分子有结合作用，与溶菌酶的水解作用无关。所以，溶菌酶的N端序列是结合AGEs的部分，具有抗AGEs的药用功能。Exendin-4是一种比GLP-1更有效、作用时间更长的降糖物质。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种既能抗AGEs又能改善高血糖并对AGEs或高血糖引起的疾病具有防治作用的一种双靶向作用的嵌合多肽及其应用。
本发明的目的通过以下的技术方案实现：一种双靶向作用的嵌合多肽，包括具有以下特征的三段序列：序列1是人溶菌酶蛋白从N端计起的前20-80个氨基酸序列，也即从人溶菌酶N端第一个氨基酸残基算起的20-80个氨基酸序列；序列2是Exendin-4蛋白的氨基酸序列；序列3是序列1和序列2的连接序列，包含凝血酶酶切位点和二肽基肽酶的酶切位点。
所述二肽基肽酶的酶切位点位于与Exendin-4蛋白的氨基酸序列相接的一侧。
所述溶菌酶蛋白的氨基酸序列包括已发表的各种人源性溶菌酶N端氨基酸序列。
所述溶菌酶蛋白的氨基酸序列优选SEQ ID No：1的序列
所述Exendin-4蛋白的氨基酸序列已在NCBI网站登记，序列号为AAB22006，具体序列如SEQ ID No：2所示。
所述嵌合多肽的结构示意图见图1。
本发明提供了所述双靶向作用的嵌合多肽的制备方法，通过本领域公知多肽合成技术合成；或者通过公知的基因工程技术来实现，具体包括包含编码所述嵌合多肽的的核苷酸序列(此序列可通过PCR和或人工合成的技术得到)的表达载体，在基因工程菌株中表达并纯化得到。
上述方法中还可包括任何本领域公知的对多肽进行化学修饰的步骤。
通过过对本发明嵌合多肽进行体内和体外的活性实验，证明其具有显著的抗AGEs和降血糖的活性，完全可以应用于制备抗AGEs和/或降低高血糖的药物。
本发明的基本原理如下：由于这种嵌合多肽含有凝血酶的切点和二肽基肽酶(DPP-4)的切点，当这嵌合多肽直接用于人体后，在血液中的凝血酶和DPP-4作用下，将其裂解并产生两种具有药用活性的多肽，即人溶菌酶N端序列和Exendin-4，发挥不同的治疗效果。所产生的人溶菌酶N端序列的多肽发挥与AGEs结合并促进后者清除和排泄的功能，达到防治由于AGEs升高而产生的疾病，包括糖尿病的并发症和老年性精神障碍等；而所产生的Exendin-4则发挥调节血糖的功能，达到改善高血糖的问题，可防治由于高血糖而产生的疾病，包括1型和2型糖尿病等。因此，这种嵌合多肽在体内能够缓慢释放溶菌酶N端序列和Exendin-4两种具有药效功用的多肽，因而具有抗AGEs和降血糖的双靶向作用机制。
本发明的嵌合多肽在体内和体外实验具有图2所示的作用机制。
相比于现有技术，本发明的嵌合多肽具有以下有益效果：
1、在应用基因工程技术生产本发明的嵌合多肽时，将不存在生产其他融合蛋白所需的裂解纯化的缺点，同时又可提高该多肽的表达量。
2、这种嵌合蛋白在体内的缓慢水解能延长该两种多肽药物的半衰期，从而减少用药次数。
3、这种嵌合蛋白在体内产生的人溶菌酶N端序列和Exendin-4两种多肽分别发挥两种不同的作用，形成一种双靶向叠加效应。
4、由于糖尿病患者血中的凝血酶活性比正常人高20倍，本发明的嵌合多肽尤其适用于糖尿病及其并发症，因而针对性强。
附图说明
图1为本发明的双靶向作用嵌合多肽的氨基酸序列示意图。
图2为本发明的双靶向作用嵌合多肽在体内的作用机制示意图。本示意图列出的本发明的双靶向嵌合多肽在体内的作用机制所涉及的酶包括DPP-4、凝血酶、凝血因子X。
图3为溶菌酶N端肽段对AGEs的结合活性。
具体实施方式
实施例1
1、本发明嵌合多肽的制备
按照图1的排列设计，用基因工程技术生成溶菌酶N端80个氨基酸、2个氨基酸连接序列、Exendin-4组成的嵌合肽序列，序列如下：
MKALIVLGLVLLSVTVQGKVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNT
RATNYNAGDRSTDYGIFQINSRGPHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No：3)
下划线为连接序列，连接序列中的P还可以是A、S、V、L。
具体制备上述序列的步骤如下：
1、利用PCR方法或化学合成法得到人溶菌酶N端80个氨基酸和含凝血酶和二肽肽酶酶切位点的DNA序列；
2、利用PCR方法或化学合成法得到含凝血酶和二肽肽酶酶切位点的连接序列和Exendin-4的DNA序列；
3、将上述两段序列混合，94℃变性、52℃退火，互为模板延伸，得到嵌合肽的全DNA序列；
4、设计一对PCR引物，上游含有载体酶切位点、EK酶切位点序列和人溶菌酶N端DNA序列，下游含有Exendin-4C末端DNA系列和载体酶切位点序列，以嵌合肽全序列为模板进行PCR。酶切、纯化PCR产物，连接到pET-32a(+)表达载体上，转染E.coli DH5αAmp+平板挑取阳性菌落，小量提取质粒，送上海生工测序证实后，扩大培养提取质粒，转导受体菌BL21(DE3)，通过筛选获得阳性工程菌。用IPTG诱导并筛选高表达菌株保存，发酵罐扩大培养得到嵌合肽的基因工程表达产物，按常规方法纯化和制备适用于人体的本嵌合多肽。
2、生理活性实验部分：
以凝血酶、二肽基肽酶于PBS溶液中，37℃，1h模拟体内水解嵌合肽，凝胶层析分离得到溶菌酶N端肽段和Exenden-4，分别开展活性实验。
(1)以间接法测定溶菌酶N端肽段对AGEs的结合活性。取100mL浓度的5mg/mL糖基化白蛋白，4℃包被过夜，100mL封闭液于37℃封闭1h，洗涤后加入100mL不同浓度的溶菌酶N端肽段(3个复孔)于室温温育3h，洗涤后加入100mL兔抗嵌合多肽抗体，于37℃温育1h，再加入100mL HRP-羊抗兔IgG抗体，于37℃温育1h，洗涤后加入100mL OPD底物显色，以BSA为阴性对照，测A490nm。结果发现多肽与包被的糖基化蛋白温育3h，浓度在0.25mg/mL以上时，可以观察到明显的结合活性，并且随着多肽浓度的提高，结合程度也随之升高(如图3所示)。
(2)体内法鉴定Exenden-4的降血糖作用
利用链脲佐菌素制备糖尿病大鼠模型，随机分为不同浓度给药组和对照组，每组10只，分别于腹腔给药(对照组注射生理盐水)10min后取尾静脉血用血糖仪测定血糖，1h后用尿糖试纸测定尿糖。如表1所示，Exenden-4具有显著的降血糖效果。
表1体内法鉴定Exenden-4的降血糖作用
| 组别 | 动物数(只) | Exenden-4浓度(ug/ml) | 血糖浓度(mmol/L) | 尿糖定性结果 |
| 对照组 | 10 | 0 | 15.52？.46 | +++ |
| 药物组A | 10 | 0.5 | 9.74？.31 | ++ |
| 药物组B | 10 | 5 | 5.01？.37 |
下述实施例2-6是本发明实现的另外几种实现方式，其制备方法均为现有基因工程及核苷酸或氨基酸化学合成的公知技术，它们得到的嵌合多肽在与实施例中所述的生理活性实验中均体现了不同程度的对AGEs的结合活性以及将血糖的作用。
实施例2
按照图1的排列设计，用化学合成的方法合成由人由溶菌酶N端60个氨基酸、6个氨基酸连接序列、Exendin-4组成的嵌合多肽，再按常规方法纯化和制备适用于人体的本嵌合多肽药物成分。
本例嵌合多肽的序列为：
MKALIVLGLVLLSVTVQGKVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNT
RALVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No：4)
下划线为连接序列，连接序列中的L、V还可以是A、I、M、F、P、W等，连接序列中G后一位的P还可以是A、S、V、L。
实施例3
按照图1的排列设计，用化学合成的方法合成由溶菌酶N端40个氨基酸、12个氨基酸连接序列、Exendin-4组成的嵌合多肽，再按常规方法纯化和制备适用于人体的本嵌合多肽药物成分。
本例嵌合多肽的序列为：
MKALIVLGLVLLSVTVQGKVFERCELARTLKRLGMDGYRGLVPRGPLVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No：5)
下划线为连接序列，连接序列中的L、V还可以是A、I、M、F、P、W等，连接序列中G后一位的P还可以是A、S、V、L。
实施例4
按照图1的排列设计，用化学合成的方法合成由人由溶菌酶N端20个氨基酸、18个氨基酸连接序列、Exendin-4组成的嵌合多肽，再按常规方法纯化和制备适用于人体的本嵌合多肽药物成分。
本例嵌合多肽的序列为：
MKALIVLGLVLLSVTVQGKVLVPRGPLVPRGPLVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No：6)
下划线为连接序列，连接序列中的L、V还可以是A、I、M、F、P、W等，连接序列中G后一位的P还可以是A、S、V、L。
实施例5
按照图1的排列设计，用化学合成的方法合成人由溶菌酶N端80个氨基酸、24个氨基酸连接序列、Exendin-4组成的嵌合多肽，再按常规方法纯化和制备适用于人体的本嵌合多肽药物成分。
本例嵌合多肽的序列为：
MKALIVLGLVLLSVTVQGKVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNT
RATNYNAGDRSTDYGIFQINSRLVPRGPLVPRGPLVPRGPLVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No：7)
下划线为连接序列，连接序列中的L、V还可以是A、I、M、F、P、W等，连接序列中G后一位的P还可以是A、S、V、L。
实施例6
按照图1的排列设计，用化学合成的方法合成人由溶菌酶N端20个氨基酸、6个氨基酸连接序列、Exendin-4组成的嵌合多肽，再按常规方法纯化和制备适用于人体的本嵌合多肽药物成分。
MKALIVLGLVLLSVTVQGKVLVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ IDNo：8)
下划线为连接序列，连接序列中的L、V还可以是A、I、M、F、P、W等，连接序列中G后一位的P还可以是A、S、V、L。
实施例7
按照图1的排列设计，用化学合成的方法合成人溶菌酶N端20-80个氨基酸序列、由24个氨基酸组成的连接序列、Exendin-4序列组成的嵌合多肽，再按常规方法纯化和制备适用于人体的本嵌合多肽药物成分。
实施例8
利用常规工艺制成含本发明的嵌合多肽250微克/毫升、500微克/毫升、750微克/毫升、1000微克/毫升、1500微克/毫升和2000微克/毫升的皮下注射药物。该药物在临床实验中均体现了按AGEs和降血糖的功能。
实施例9
利用常规工艺制成含本发明的嵌合多肽0.1微克/毫升、0.2微克/毫升、0.5微克/毫升、1微克/毫升和2微克/毫升的静脉注射药物。该药物临床实验中均体现了按AGEs和降血糖的功能。
序列表
<110>暨南大学
<120>一种双靶向作用的嵌合多肽及其应用
<130>5
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>80
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>1
Met Lys Ala Leu Ile Val Leu Gly Leu Val Leu Leu Ser Val Thr Val
1 5 10 15
Gln Gly Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg
20 25 30
Leu Gly Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys
35 40 45
Leu Ala Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn
50 55 60
Ala Gly Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg
65 70 75 80
<210>2
<211>39
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210>3
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
Met Lys Ala Leu Ile Val Leu Gly Leu Val Leu Leu Ser Val Thr Val
1 5 10 15
Gln Gly Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg
20 25 30
Leu Gly Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys
35 40 45
Leu Ala Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn
50 55 60
Ala Gly Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg
65 70 75 80
Gly Pro His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met
85 90 95
Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly
100 105 110
Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
115 120
<210>4
<211>105
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
Met Lys Ala Leu Ile Val Leu Gly Leu Val Leu Leu Ser Val Thr Val
1 5 10 15
Gln Gly Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg
20 25 30
Leu Gly Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys
35 40 45
Leu Ala Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Leu Val Pro Arg
50 55 60
Gly Pro His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met
65 70 75 80
Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly
85 90 95
Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
100 105
<210>5
<211>91
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
Met Lys Ala Leu Ile Val Leu Gly Leu Val Leu Leu Ser Val Thr Val
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Gln Gly Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg
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Leu Gly Met Asp Gly Tyr Arg Gly Leu Val Pro Arg Gly Pro Leu Val
35 40 45
Pro Arg Gly Pro His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys
50 55 60
Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn
65 70 75 80
Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
85 90
<210>6
<211>77
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
Met Lys Ala Leu Ile Val Leu Gly Leu Val Leu Leu Ser Val Thr Val
1 5 10 15
Gln Gly Lys Val Leu Val Pro Arg Gly Pro Leu Val Pro Arg Gly Pro
20 25 30
Leu Val Pro Arg Gly Pro His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu
35 40 45
Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu
50 55 60
Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
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<210>7
<211>143
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7
Met Lys Ala Leu Ile Val Leu Gly Leu Val Leu Leu Ser Val Thr Val
1 5 10 15
Gln Gly Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg
20 25 30
Leu Gly Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys
35 40 45
Leu Ala Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn
50 55 60
Ala Gly Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg
65 70 75 80
Leu Val Pro Arg Gly Pro Leu Val Pro Arg Gly Pro Leu Val Pro Arg
85 90 95
Gly Pro Leu Val Pro Arg Gly Pro His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser
100 105 110
Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu
115 120 125
Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
130 135 140
<210>8
<211>65
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
Met Lys Ala Leu Ile Val Leu Gly Leu Val Leu Leu Ser Val Thr Val
1 5 10 15
Gln Gly Lys Val Leu Val Pro Arg Gly Pro His Gly Glu Gly Thr Phe
20 25 30
Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe
35 40 45
Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro
50 55 60
Ser
65
Claims (9)
1.一种双靶向作用的嵌合多肽，其特征在于包括具有以下特征的三段序列：序列1是从N端计起的前20-80个人溶菌酶蛋白的氨基酸序列；序列2是Exendin-4蛋白的氨基酸序列；序列3是序列1和序列2的连接序列，包含凝血酶酶切位点和二肽基肽酶的酶切位点。
2.根据权利要求1所述的双靶向作用的嵌合多肽，其特征在于：所述二肽基肽酶的酶切位点位于与Exendin-4蛋白的氨基酸序列相接的一侧。
3.根据权利要求1所述的双靶向作用的嵌合多肽，其特征在于：所述溶菌酶蛋白的氨基酸序列包括已发表的各种人源性溶菌酶N端氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的双靶向作用的嵌合多肽，其特征在于：所述溶菌酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
5.根据权利要求1所述的双靶向作用的嵌合多肽，其特征在于：所述Exendin-4蛋白的氨基酸序列是NCBI已公布序列，序列号为AAB22006，氨基酸序列如SEQ IDNo：2所示。
6.权利要求1-5任一项所述双靶向作用的嵌合多肽的制备方法，其特征在于：通过多肽合成技术合成；或者通过构建包含编码所述嵌合多肽的的核苷酸序列的表达载体，在基因工程菌株中表达并纯化得到。
7.根据权利要求6所述的双靶向作用的嵌合多肽，其特征在于：所述核苷酸序列通过PCR和/或人工合成的手段得到。
8.根据权利要求7所述的双靶向作用的嵌合多肽，其特征在于：还包括对多肽进行化学修饰。
9.权利要求1-5任一项所述双靶向作用的嵌合多肽应用于制备抗AGEs和/或降低高血糖的药物。
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2008
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