CN1206351C

CN1206351C - 一种溶菌酶蛋白生产工艺及其应用

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Publication number: CN1206351C
Application number: CN 01132373
Authority: CN
Inventors: 余龙; 郭泽坤; 唐丽莎; 蒋道军; 张亚州
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Shanghai Huaxing biotech Co., Ltd.
Priority date: 2001-11-30
Filing date: 2001-11-30
Publication date: 2005-06-15
Anticipated expiration: 2021-11-30
Also published as: CN1366044A

Abstract

本发明涉及一种人溶菌酶蛋白生产工艺。目前市场上的溶菌酶蛋白都来源于其他种属动物机体，对人体而言是异种蛋白，有很强的抗原性，副作用大。本发明的生产的溶菌酶蛋白具有人源的天然氨基酸序列，解决了异源性溶菌酶用于人体内的抗原性问题。更重要的是，人体中的溶菌酶活性最高，本发明提供的蛋白生产工艺与传统工艺相比，分离纯化步骤简单易行，能得到较高的蛋白投入产出比，为人溶菌酶蛋白的工业化生产提供了一个高效的生产工艺。本发明还涉及上述方法及其产物的应用。

Description

一种溶菌酶蛋白生产工艺及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体而言，本发明涉及一种用人LYC7核苷酸生产人溶菌酶蛋白的方法。本发明还涉及用上述工艺生产人溶菌酶所需的载体、重组质粒、宿主细胞、获得的溶菌酶蛋白产物及该生产方法的应用。

背景技术

随着生物技术的发展，获得蛋白的方法越来越多，经典的蛋白质分离纯化过程通常包括以下步骤：(1)破碎生物组织，用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来；(2)用离心法将细胞的亚细胞颗粒(如细胞核、线粒体、微粒体或核糖体等及细胞碎片去除；(3)应用盐析法或有机溶剂法将有关蛋白质组分沉淀下来；(4)进一步应用层析法或电泳使各种蛋白质分开；(5)如果用可能的话，将蛋白质结晶或制成冻干粉。用该方法获得人源蛋白需考虑以下问题：第一，人组织来源少，而目的蛋白含量高、活性高可溶性稳定性好的组织来源就更少了；第二，每个分离纯化的步骤都会损失一定量的蛋白及蛋白活性，但是分离步骤太少又不能达到一定的纯度；第三，每个分离纯化的步骤中所用的试剂及相关参数对不同的蛋白的适用范围都是不同的；第四，不同蛋白的精确定性定量通常需要特定的方法。

随着生物化学的发展，肽的人工合成已成为可能，然而这种方法只适合于合成最多含有几百个氨基酸残基的小蛋白，况且化学仪器中合成的蛋白是否与天然存在的蛋白具有一致的构象与功能还有待于进一步研究。

目前，运用基因工程技术也可以在大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物等多种表达体系中高效表达，但是这种生产蛋白的方法同样涉及到分离纯化的问题。

溶菌酶是分解粘多糖的多肽类免疫抗菌分子。它具有耐热、耐酸的理化特性，可溶于水、乙醇、油脂类溶剂，通过裂解细胞壁而达到裂解革兰氏阳性细菌的效果。对溶菌酶杀菌能力研究表明：极微量的溶菌酶即可杀灭溶壁微球菌、藤黄球菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、细球菌、八迭球菌、葡萄球菌等自然界常见细菌。目前市场上的溶菌酶都是来源于其他种属动物机体，对人体而言是异体蛋白，有很强的抗原性，副作用大。

本发明的人溶菌酶技术解决了异源性溶菌酶用于人体内的抗原性问题，更重要的是，人体中的溶菌酶活性最高，本发明提供的蛋白生产工艺与传统工艺相比，分离纯化步骤简单易行，能得到较高的蛋白投入产出比，为人溶菌酶蛋白的工业化生产提供了一个高效的生产工艺。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新的核苷酸序列，该核苷酸被命名为人LYC7。

本发明的另一个目的是提供一种用上述核苷酸序列生产人溶菌酶蛋白的方法。

本发明的再一个目的是提供一种重组载体，该载体含有人LYC7核酸序列并可以通过转化宿主细胞，如大肠杆菌、酵母细胞，表达出溶菌酶蛋白。

本发明的再一个目的是提供一种宿主细胞，该含有人LYC7核苷酸序列的重组质粒并可表达具有溶菌酶活性的蛋白。

本发明还提供了这种生产方法以及用该方法生产出的溶菌酶蛋白的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种用LYC7核苷酸序列生产具有人溶菌酶活性蛋白的方法，该方法包括：

(1).将分离纯化的编码具有人溶菌酶蛋白活性多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人溶菌酶蛋白表达载体；

(2).将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，筛选出表达人溶菌酶蛋白的重组细胞；

(3).高密度培养步骤(b)中的重组细胞；

(4).分离出具有人溶菌酶活性的蛋白，并将其制成冻干粉。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”溶菌酶蛋白(或多肽)编码序列是指，该序列或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该序列或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“溶菌酶蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有溶菌酶蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中核苷酸序列同源性低至约92％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中核苷酸序列杂交的核苷酸序列，更佳地能在高度严紧条件下与SEQ ID NO.1中核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.1中核苷酸序列的同源性至少92％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与人溶菌酶相同功能的蛋白的、SEQ IDNO.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

获得上述溶菌酶蛋白(或多肽)编码序列，可以通过人工化学合成、从现存的DNA库扩增、从含有该序列的细胞、组织、器官中分离纯化得到。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞等。

在本发明中，人LYC7的表达载体是如此获得的：首先，根据SEQ IDNO 1所述核苷酸序列及表达蛋白所使用的载体pPIC9序列，合成如SEQID NO 3所述核苷酸序列；将合成后的序列与pUCm19 T载体(上海SHANGON生物工程公司)连接形成Lyc7-pUCm19重组质粒。分别用限制性内切酶Xho I和EcoR I酶切Lyc7-pUCm19质粒和pPIC9质粒并分别进行胶回收。随后用T4 DNA连接酶连接经过处理的目的片段和pPIC9质粒。最后将连接产物转化大肠杆菌菌株DH5α，涂布LB-Amp平板，酶切鉴定转化子，抽提质粒，测序验证序列的正确性。

本发明中，表达人溶菌酶的甲醇酵母菌株是按如下方法获得的：抽提37℃培养18小时的Lyc7-pPIC9质粒，然后，用3-6ul限制性内切酶SacI切割100-200ug抽提的Lyc7-pPIC9质粒3-6小时，完全酶切后用与酶切体积相等的氯仿/异戊醇溶液(两者体积之比为24∶1)纯化酶切产物，之后用100％乙醇沉淀酶切的质粒，用10-30ul去离子水溶解沉淀并通过核酸电泳测定质粒浓度。制备酵母GS115菌株的感受态。取经限制性内切酶SacI切割后回收并定量的Lyc7-pPIC9质粒5～20ug(溶于5-10ul去离子水中)，加入80ul酵母GS115感受态细胞，转至电转化杯，电击转化。转化参数为；电压1500伏，电阻200欧姆，电容25微法。电击后迅速加入800ul的1M山梨糖醇。取电击液200-600ul涂MD(极限无水葡萄糖培养基)板，30℃培养至克隆长出。用50ml酵母培养基BMMY培养长出的克隆，30℃，取培养上清走SDS-PAGE电泳，筛选表达目的蛋白的克隆。

本发明中“MD培养基”按如下方法配制：称15g琼脂粉溶于800ml水中，115℃灭菌20分钟。待溶液凉至60℃，加入下列成份：100ml 10×YNB(酵母基本氮)，2ml 500×B(生物素)，100ml 10×D(无水葡萄糖).每20ml倒一块板。各成份的配制如下：10×YNB：称34g YNB，100g(NH₄)₂SO₄用水配成1升溶液，用0.22微米的膜过滤灭菌。500×B：称20mg生物素溶于100ml水中，用0.22微米的膜过滤灭菌。10×D：溶解200g无水葡萄糖于1000ml水中，用0.22微的膜过滤灭菌。

本发明中“BMMY培养基”按如下方法配制：溶解10g酵母提取物，20g peptone，于700ml水中115℃灭菌20分钟，冷至室温，加入100ml 1M磷酸缓冲液pH6.0，100ml 10×YNB，2ml 500×B，100ml 10×M(甲醇)。各成份的配制如下：1M pH6.0磷酸缓冲液：混合132ml 1M K₂HPO₄和868ml1M，KH₂PO₄，用KOH调pH＝6，121℃灭菌20分钟。10×M：量取5ml甲醇溶于95ml水中，用0.22微米的膜过滤灭菌。

本发明中“BMGY培养基”按如下方法配制：溶解10g酵母提取物，20g peptone，于700ml水中115℃灭菌20分钟，冷至室温，加入100ml 1M磷酸缓冲液pH6.0，100ml 10×YNB，2ml 500×B，100ml 10×GY(甘油)。各成份的配制如下：1M pH6.0磷酸缓冲液：混合132ml 1M K₂HPO₄和868ml 1MKH₂PO₄，用KOH调pH＝6，121℃灭菌20分钟。10×GY：量取100ml甘油溶于900ml水中，121℃灭菌20分钟。

本发明中“酵母GS115菌株感受态的制备”包括如下过程，将酵母GS115单克隆菌株接种于1ml YPD培养基，放于摇床上30℃，250转/分钟培养20-30小时。取100ul培养的上述细胞转接于100ml YPD培养基中，在摇床上30℃，250转/分钟培养12-18小时，OD₆₀₀＝1.3-1.5.将OD₆₀₀＝1.3-1.5的细胞培养液平均分至两个50ml离心管，在4℃下，5000转/分钟，离心8分钟。弃上清，加40ml 4℃无菌去离子水溶解沉淀，之后在4℃下，5000转/分钟，离心8分钟。重复上一步操作一次。弃上清，一管加1M山梨糖醇2ml，另一管加3ml，震荡，将两管合并为一管，离心，4℃下，5000转/分钟，离心8分钟。弃上清，加1M山梨糖醇200ul悬浮细胞一旦得到了含有目的蛋白编码序列的人LYC7克隆，就可以进行高密度培养。该过程包括接种、上罐、发酵、饲喂甘油、饲喂甲醇等过程。

本发明中YPD按如下方法配置(1升)：1％ yeast extract(酵母提取物)；2％peptone(蛋白胨)；2％dextrose(无水葡萄糖)。称10g yeast extract，20gpeptone，20g dextrose，溶于1000ml水中，115℃灭菌20分钟。

本发明中的“接种”包括一级接种和二级接种。“一级接种”是指将筛选到的高表达酵母菌株接种于YPD培养基，30℃，250转/分摇床培养36小时。本发明中的“二级接种”即将培养36小时的酵母菌转至BMGY培养基(初始发酵体积的5～10％)，30℃，250转/分培养至OD₆₀₀＝2～6，离心，弃上清，用25～50％培养体积的水重新悬浮细胞。

本发明中的“上罐发酵”即将配制好的基本盐培养基(50％发酵罐体积)倒入罐中，通热蒸气121℃灭菌20分钟，冷至29℃，用氨水调PH至5-6，加入PTM 4-5ml/L基本盐培养基。倒入上述的悬浮细胞，在29℃、400转/分、0.2-0.4氧气体积/升(起始发酵液体积)分钟条件下培养。

本发明中的“饲喂甘油”是指在上述培养24小时后，以18-20ml/小时/升(起始发酵液体积)的速度泵入50％甘油，时间是4-6小时。搅拌速度提高到600转/分。须注意检测发酵液中的溶解氧气浓度，当溶解氧气浓度低于20％时，停止加入甘油。当溶解氧气浓度回升到20％以上时，恢复甘油供给。

本发明中的“饲喂甲醇”是指停止泵入甘油后，当溶解氧气浓度升高到40％时，开始泵入甲醇溶液，速度为2-3ml/升(起始发酵液体积)/小时。当溶解氧气浓度下降到30％后，提高甲醇速度至5-8ml/升(起始发酵液体积)/小时。当溶解氧气浓度下降到20％以上时，提高甲醇速度至10ml/升(起始发酵液体积)/小时。维持此甲醇速度至发酵结束。加入甲醇的时间为3-6天。搅拌速度提高到800-1500转/分，通气量提高到甲醇的时间为3-6天。搅拌速度提高到800-1500转/分，通气量提高到0.6--2氧气体积/升(起始发酵液体积)分钟。注意检测发酵液中的溶解氧气浓度，当溶解氧气浓度低于20％时，停止加入甲醇。当溶解氧气浓度回升到20％以上时，恢复甲醇供给。

本发明中人溶菌酶蛋白分离纯化包括以下步骤：首先，发酵结束后，4000转/分离心发酵液，收集上清。然后将发酵上清装入透析袋中，对去离子水透析去盐，4℃下24小时。过滤将透析过的发酵上清用0.45微米的膜过滤，然后用NaOH溶液调pH至8.0。随后进行纯化过程。

本发明中的纯化过程包括(1)装柱：以每升发酵液10毫升CM-Sephrose FF装柱，用0.05M Tris-HCl pH8.0平衡柱子5-8个柱床体积；(2)上样：将发酵液以10-100毫升/分钟的流速上柱；(3)清洗：上样结束后，用0.05M Tris-HCl pH8.0洗脱未结合的蛋白，共洗脱4个柱床体积；(4)洗脱：用含有0.15-0.20M NaCl的0.05M Tris-HCl pH8.0溶液洗脱；(5)透析：将洗脱液对去离子水4℃透析24小时；(6)冻干：将透析过的洗脱液在冻干机上冻干，得到基本纯的人溶菌酶的白色干粉。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“溶菌酶蛋白多肽”指具有溶菌酶蛋白活性的SEQID NO.4序列的多肽。该多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO 2中的氨基酸序列相比缺少氨基端18个氨基酸残基，即1-18位的氨基酸。这18个氨基酸是SEQ ID NO 2所编码蛋白的分泌肽序列，在蛋白的生物合成过程中被自行切除。该术语还包括具有与人溶菌酶相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括溶菌酶蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导蛋白、以及利用抗溶菌酶多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含溶菌酶多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了溶菌酶多肽的可溶性片段。通常，该片段具有溶菌酶多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供溶菌酶蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然溶菌酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还包括溶菌酶多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可与SEQ ID NO 1中核苷酸序列结合，从而用于抑制细胞内溶菌酶的表达。

本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有溶菌酶多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在LYC7核苷酸分子。

本发明还包括检测LYC7核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于溶菌酶多肽的编码序列，可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。

另一方面，本发明还包括对LYC7 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于LYC7基因产物或片段。较佳地，指那些能与LYC7基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制溶菌酶蛋白的分子，也包括那些并不影响溶菌酶蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的LYC7基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的LYC7基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达溶菌酶或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断溶菌酶功能的抗体以及不影响溶菌酶功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用LYC7基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与LYC7基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的溶菌酶生产工艺还可用于生产溶菌酶家族的其他成员。

本发明的人溶菌酶蛋白属于溶菌酶家族一员。溶菌酶是分解粘多糖的多肽类免疫抗菌分子。它具有耐热、耐酸的理化特性，可溶于水、乙醇、油脂类溶剂，通过裂解细胞壁而达到裂解革兰氏阳性细菌的效果。对溶菌酶杀菌能力研究表明：极微量的溶菌酶即可杀灭溶壁微球菌、藤黄球菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、细球菌、八迭球菌、葡萄球菌等自然界常见细菌。

人溶菌酶技术可用于眼药水、隐型眼镜冲洗液、鼻腔冲洗液、除臭漱口液、痔疮护理剂、直肠灌洗剂、胃肠道术后康复剂、肿瘤术后辅助治疗剂、抗艾滋病辅助治疗剂、沐浴液、护肤化桩品、仿人乳、流质食品添加剂、食品保鲜剂、各种保健食品添加剂、胃药、餐巾纸和防菌湿纸巾、牙膏等二十多种产品的改良与升级换代。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

具体实施方案

实施例1

将SEQ ID NO 1中所述核苷酸序列与pUCm19 T载体连接，形成LYC7重组质粒。取200ug，然后用6ul限制性内切酶SacI切割3小时，完全酶切后用氯仿/异戊醇溶液纯化，之后用100％乙醇沉淀，用10ul去离子水溶解沉淀并通过核酸电泳测定质粒浓度。取经限制性内切酶SacI切割后回收并定量的Lyc7-pPIC9质粒9ug(溶于10ul去离子水中)，加入80ul酵母GS115感受态细胞，电击转化。取电击液400ul涂MD板，30℃培养至克隆长出。用50ml酵母培养基BMMY培养长出的克隆并走SDS-PAGE电泳，筛选出表达目的蛋白的克隆。

如本发明所述方法高密度发酵生产人溶菌酶，其中，二级接种时将初始发酵体积的10％的酵母菌转至BMGY培养基，30□，250转/分培养至OD₆₀₀＝6，离心，弃上清，用30％培养体积的水重新悬浮细胞；上罐时，将溶液酸度调至PH＝6后保持不变；加入甘油时，以18ml/小时/升(起始发酵液体积)的速度泵入；泵入甲醇溶液，速度为2.5ml/升(起始发酵液体积)/小时。

在人溶菌酶纯化过程中，发酵液上样速度为10毫升/分钟。随后按照本发明所述方法分离纯化，得到溶菌酶蛋白。

实施例2

实施例1所得到的人源性的溶菌酶蛋白具有基因产品的一般特点，即纯度高、成本低等。同时由于该蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与预计在施用于人时将具有很高的活性和/或很低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。更重要的是，该产品具有抑制癌细胞粘附作用，可用于癌症病人的肿瘤术后体腔清洗液以减少肿瘤细胞转移的机会。

实施例3

溶菌酶能更好的帮助眼球抵抗外界的感染。溶菌酶大量的存在于人体自然分泌的泪液中，是使眼泪起作用的重要物质。

实施例1所得到的人源性的溶菌酶蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与预计在施用于人时将具有很高的活性和/或很低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。将实施例1所得到的人源性的溶菌酶蛋白加入眼保健液和各类眼药中，无疑将减轻大量眼病患者及视疲劳患者的痛苦。这不仅能为广大眼病患者解除痛苦，还将带来巨大的经济效益。

实施例4

将实施例1中的人溶菌酶蛋白产物用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀LYC7基因翻译产物的能力加以评估。

本发明所涉及的序列如下：

(1)SEQ ID NO.1的信息：

(i)序列特征

(A)长度：453bp

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1

ATG AAG GCT TTG ATT GTC TTG GGT CTC GTT TTG CTC TCC GTC ACT GTT CAG GGT AAG GTC

TTC GAG AGA TGT GAG TTG GCT AGA ACC TTG AAG AGA CTT GGT ATG GAC GGT TAC AGA GGT

ATT TCC TTG GCT AAT TGG ATG TGC TTG GCT AAG TGG GAG TCT GGC TAC AAT ACC AGA GCT

ACT AAC TAC AAC GCT GGT GAC AGA TCC ACT GAC TAC GGT ATT TTC CAG ATC AAT TCC CGT

TAC TGG TGC AAC GAC GGT AAG ACC CCA GGC GCT GTC AAT GCT TGT CAC TTG TCC TGT TCC

GCT TTG CTG CAA GAG AAT ATC GCT GAC GCC GTC GCC TGT GCC AAG AGA GTT GTT AGA GAG

CCA CAA GGT ATT AGA GCT TGG GTC GCT TGG AGA AAT AGA TGT CAA AAT AGA GAC GTT AGA

CAA TAC GTC CAA GGT TGC GGT GTC TAG TAA TGA

(2)SEQ ID NO.2的信息：

(i)序列特征

(A)长度：148个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：多肽

(iii)序列描述：SEQ ID NO.2

MKALIVLGLVLLSVTVQGKVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRA

60

TNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRD

120

PQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV

148

(3)SEQ ID NO.3的信息

(i)序列特征

(A)长度：435碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.3

TCT CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT AAG GTC TTC GAG AGA TGT GAG

TTG GCT AGA ACC TTG AAG AGA CTT GGT ATG GAC GGT TAC AGA GGT ATT

TCC TTG GCT AAT TGG ATG TGC TTG GCT AAG TGG GAG TCT GGC TAC AAT

ACC AGA GCT ACT AAC TAC AAC GCT GGT GAC AGA TCC ACT GAC TAC GGT

ATT TTC CAG ATC AAT TCC CGT TAC TGG TGC AAC GAC GGT AAG ACC CCA

GGC GCT GTC AAT GCT TGT CAC TTG TCC TGT TCC GCT TTG CTG CAA GAC

AAT ATC GCT GAC GCC GTC GCC TGT GCC AAG AGA GTT GTT AGA GAC CCA

CAA GGT ATT AGA GCT TGG GTC GCT TGG AGA AAT AGA TGT CAA AAT AGA

GAC GTT AGA CAA TAC GTC CAA GGT TGC GGT GTC TAG TAA TGA GAA TTC

CCT

(4)SEQ ID NO.4的信息：

(i)序列特征

(A)长度：130个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：多肽

(iii)序列描述：SEQ ID NO.4

KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQIN

60

SRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRD

120

VRQYVQGCGV

130

Claims

1、一种产生具有人溶菌酶蛋白活性的多肽的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(a)将SEQ ID NO：1所示核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人溶菌酶蛋白表达载体；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，筛选出表达人溶菌酶蛋白的重组细胞，其中所述宿主细胞为甲醇酵母；

(c)高密度培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有人溶菌酶活性的蛋白，并将其制成冻干粉。

2、如权利要求1的方法，其特征在于所使用的核苷酸序列为SEQID NO：3的核苷酸序列。

3、一种分离出的DNA分子，其特征在于，它编码具有人溶菌酶活性的蛋白且为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。

4、一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的DNA。

5、一种用权利要求4所述载体转化的宿主细胞。

6、如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞为真核细胞。