CN107916271A - 一种重组腈水合酶的高效表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组腈水合酶的高效表达方法，该方法包括：(1)从原始菌株中克隆得到目的基因；(2)构建重组载体，将重组载体转化至宿主细胞，得到基因工程菌；(3)培养所述基因工程菌，获得重组腈水合酶蛋白；所述目的基因由编码α亚基和β亚基的腈水合酶基因和活化元件基因依次连接而成；其中，所述腈水合酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.1或4所示，所述活化元件基因的碱基序列如SEQ ID NO.2或5所示。本发明方法通过在腈水合酶结构基因的基础上加入活化元件基因，并采用自诱导培养基培养工程菌，获得了高活力的重组腈水合酶。

Description

一种重组腈水合酶的高效表达方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种重组腈水合酶的高效表达方法。

背景技术

腈化合物作为一类具有重要应用价值和潜力的手性合成子，被用于碳骨架的同系化反应，从而在精细化学品合成中占据极其重要的地位。然而，氰基的传统转化方法往往需要苛刻的反应条件，如高温高压、强酸强碱等，能耗较大，且产生大量的盐类等副产物，不利于产品的分离纯化，也势必对环境造成污染。相反，腈类化合物的生物法转化具有较好的选择性，反应条件温和(如在室温和中性pH条件下)，符合原子经济和绿色化学发展的方向。

自上世纪70年代以来，腈水合酶已成功应用于丙烯酰胺和烟酰胺等大宗化学品的大规模制备中。同时，腈转化酶在医药、农药中间体的合成中也体现出巨大的应用价值，如催化脂肪腈、酮腈、氨基腈、二腈和芳香腈生产具有光学活性的氨基酸、酮酸、酰胺、羧酸和单氰基羧酸等。

腈水合酶(EC 4.2.1.84)是一类广泛存在于自然界的微生物酶(迄今已报道的腈水合酶几乎全部来源于细菌)，催化腈化合物生成相应的酰胺，是微生物降解腈类物质代谢途径中的关键酶。腈水合酶的发现和应用是工业生物技术领域中的经典代表作之一，具有化学催化剂无法比拟的优势，从而被广泛应用于酰胺化学品的合成中。

腈水合酶最早被用于催化丙烯腈生产丙烯酰胺。丙烯酰胺被进一步合成聚丙烯酰胺，在石油、造纸、采矿、冶金和水处理等工业中具有广泛的应用。采油过程中，使用1吨聚丙烯酰胺，可获得150吨原油。

日本是生物法合成丙烯酰胺技术的最早实践和拥有者，而且生产工艺技术也最为先进。历经三次菌种革新，由三代菌种R.rhodochrous J1，实现了生产丙烯酰胺的能力由4000吨/年提升到20000吨/年(Nagasawa T.Shimizu H.Yamada H.The superiority ofthe third-generation catalyst,Rhodococcus rhodochrous J1nitrile hydratase,forindustrial production of acrylamide[J].Appl.Microbiol.Biotechnol.1993,40:189-195)。我国从上世纪80年开始进行微生物生产丙烯酰胺的研究，已取得了重大突破。上海农药研究所沈寅初院士课题组从泰山的土壤中发现了腈水合酶菌株Nocardia sp.86-163，和日本Rhodococcus Rhodochrous J1的产酶水平基本上处于同一高度(张云桦，方仁萍，沈寅初.一株产丙烯腈水合酶菌株的的研究[J].工业微生物，1998,28:1-5)(沈寅初，张国凡，韩建生.微生物生产丙烯酰胺[J].工业微生物，1994,24:24-32)。

目前，国内已建立了万吨级的微生物生产丙烯酰胺的生产线，开创了我国在生物催化领域生产大宗化学品的应用先河。生物催化法生产烟酰胺是腈水合酶应用的另一大实例。烟酰胺是一种重要的维生素，广泛应用于医药、食品、饲料及化妆品等产业中。瑞士龙沙(Lonza)集团已在我国广州南沙市建立一条年产9000吨的烟酰胺生产线，采用R.Rhodochrous J1全细胞作为催化剂，应用细胞固定化技术进行生产。

虽然，微生物法生产酰胺化合物的工艺表现出很多优势，但是针对腈水合酶仍然存在某些待解决的问题：(1)目前应用于工业化生产的腈水合酶都是通过野生菌来表达，由于野生菌中存在其他腈转化酶，可以催化酰胺继续水解为羧酸，或可以直接将氰基水解为羧酸，降低了产物酰胺的纯度和收率；(2)野生菌发酵周期长、产酶质量不稳定；(3)随着生物技术的迅猛发展，采用分子克隆构建腈水合酶基因工程菌，有望解决上述实际问题，但基因工程菌表达腈水合酶也存在诱导表达量低、容易形成无活性的表达等问题，阻碍了重组腈水合酶的工业应用。

发明内容

本发明针对现有腈水合酶重组表达存在的问题，提供了一种能够利用基因工程菌高效表达腈水合酶的方法，该方法获得的腈水合酶具有高活力的特点。

一种重组腈水合酶的高效表达方法，包括：

(1)从原始菌株中克隆得到目的基因；

(2)构建重组载体，将重组载体转化至宿主细胞，得到基因工程菌；

(3)培养所述基因工程菌，获得重组腈水合酶蛋白；

其特征在于：所述目的基因由编码α亚基和β亚基的腈水合酶基因和活化元件基因依次连接而成；

其中，当所述腈水合酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示时，所述活化元件基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；当所述腈水合酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示时，所述活化元件基因的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。

上述活化元件基因来源于原始菌株基因组，存在于原始菌株的腈水合酶基因簇中，能够表达获得一种激活蛋白，并在腈水合酶的表达和组装过程中发挥作用，确保腈水合酶的正确表达，从而获得高活力的腈水合酶。现有技术中，本领域技术人员在制备重组腈水合酶时，往往只克隆腈水合酶基因而忽略该活化元件基因，造成一些腈水合酶在转入基因工程菌后无表达活性或者活力较低。此外，经实验发现，并非所有腈水合酶的表达都需要活化元件，腈水合酶基因簇中的活化元件的表达有可能无法提高腈水合酶的活力甚至会降低腈水合酶的活力。

进一步地，所述重组载体为pET-21a(+)、pET-24a(+)、pET-28a(+)、pET-30a(+)或pET-Duet；作为优选，重组载体为pET-28a(+)或pET-30a(+)。

进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。

步骤(3)中，所述培养的过程包括：将所述工程菌活化后，进行扩大培养，再采用自诱导培养基进行发酵培养；

所述自诱导培养基为：0.3～2g/L葡萄糖，4～8g/L甘油，1～4g/L乳糖，6～18g/L酵母抽提物，10～20g/L Na₂HPO₄·12H₂O，1～4g/L KH₂PO₄，0.1～0.8g/L NaCl，1～2g/L NH₄Cl和0.1～0.8g/L MgSO₄。

更优选，所述自诱导培养基为：0.36g/L葡萄糖，6.84g/L甘油，2.04g/L乳糖，12g/L酵母抽提物，17.1g/L Na₂HPO₄·12H2O，3.0g/L KH₂PO₄，0.5g/L NaCl，1.0g/L NH₄Cl和0.6g/L MgSO₄。

现有诱导培养基中，均需要添加诱导剂，一般为ITPG，才能够诱导基因工程菌中腈水合酶的表达；但是，诱导剂ITPG的添加不仅成本较高，而且会造成腈水合酶的非活性表达，进而影响腈水合酶的活力。本发明采用的自诱导培养基不仅成本低廉，而且不会造成腈水合酶的非活性表达，能够显著提高腈水合酶的活力。

作为优选，所述发酵培养的温度为18～20℃，pH7.0～7.5。

作为优选，所述活化培养的固体培养基为：蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0，琼脂粉20g/L，卡那霉素的浓度为50μg/mL。

作为优选，所述扩大培养的培养基为：蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0，卡那霉素的浓度为50μg/mL。

具体地，本发明基因工程菌的培养方法如下：

(1)活化

将-80℃甘油管保藏的基因工程菌株在含有固体培养基的培养皿上划线，使用恒温培养箱进行培养，培养温度35-37℃，培养时间8-16小时；

所述固体培养基为LB-Kan固体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠，5M氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，加入20g/L琼脂粉，卡那霉素浓度为50μg/mL。

(2)扩大培养

将活化后的菌种接入事先灭菌过的种子培养基中，使用恒温摇床进行培养，控制转速200-220rpm，培养温度35-37℃，培养时间8-12小时；

所述种子培养基为LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠，5M氢氧化钠溶液调节pH值至7.0。卡那霉素浓度为50μg/mL。

(3)发酵培养

将生长正常的种子液，经过无菌接种方式接入事前灭活过的发酵培养基中，接种量控制在1％-10％，在10～40℃、pH6.5～8.0的恒温震荡或通气搅拌条件下进行发酵培养10～58h，获得所述腈水合酶。发酵结束后，收集大肠杆菌基因工程菌细胞，测定腈水合酶的活力。

所述发酵培养基(自诱导培养基(AIM-Auto Induced Medium))为：0.36g/L葡萄糖，6.84g/L甘油，2.04g/L乳糖，12g/L酵母抽提物，17.1g/L Na₂HPO₄·12H2O，3.0g/LKH₂PO₄，0.5g/L NaCl，1.0g/L NH₄Cl和0.6g/L MgSO₄。

培养结束后，将发酵液12000×g离心1min，去上清，再用50mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)重悬细胞，测定其中的腈水合酶酶活。

在通常情况下，腈水合酶酶活采用标准反应体系进行测定，反应体系为0.5mL，50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)含100mM底物3-氰基吡啶，添加适量细胞悬液起始反应。25℃振荡反应2min，立即添加0.5mL纯乙腈终止反应，12000×g离心1min，上清液采用高效液相色谱法(HPLC)测定体系中所生成的产物烟酰胺量。腈水合酶活力定义：1单位(U)为在25℃条件下1min催化形成1μmol烟酰胺所需要的酶量。HPLC法采用安捷伦高效液相色谱仪(Agilent 1100，USA)，色谱柱：Varian pursuit C18反向色谱柱(4.6mm×250mm)，流动相：10mM磷酸钾盐缓冲液(pH 2.8)：乙腈＝92:8(v/v)，流速设定为0.5mL/min，UV检测器，波长230nm。在此条件下，底物3-氰基吡啶、产物烟酰胺的HPLC出峰情况见附图1。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

(1)本发明提供的重组腈水合酶的高效表达方法通过在腈水合酶结构基因的基础上加入活化元件基因，显著提高了重组腈水合酶的活性表达，获得了高活力的重组腈水合酶。

(2)本发明提供的重组腈水合酶的的高效表达方法采用自诱导培养基诱导培养工程菌，省去了诱导剂的添加，不仅降低的生产成本，而且能够获得高活性的重组腈水合酶。

附图说明

图1为酶活力检测HPLC谱图，

其中，出峰时间5.471min和6.185min为未知杂质，6.782min是已知杂质烟酸，7.569min是产物烟酰胺，19.323min是底物3-氰基吡啶。

图2为实施例1中产酸克雷伯菌来源腈水合酶基因簇、结构基因和活化元件(17K)的核酸电泳图。

图3为实施例1中重组质粒pET-30a(+)-N-SD17K的图谱。

图4为实施例1中重组质粒pET-30a(+)-N的图谱。

图5为实施例2中诱导表达后的蛋白质SDS-PAGE电泳图；、

其中，A为基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-30a(+)-N诱导表达后的SDS-PAGE电泳图；B为基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-30a(+)-N-SD17K诱导表达后的SDS-PAGE电泳图；M：低分子量标准蛋白质；1和4：未经IPTG诱导的全细胞样品；2～3和5～7：经IPTG诱导的全细胞样品。

图6为实施例3中锰氧化橙单胞菌来源腈水合酶含活化元件的基因簇和不含活化元件的结构基因核酸电泳图。

图7为实施例3中重组质粒pET28a_nh08αβ_act的图谱。

图8为实施例3中重组质粒pET28a_nh08αβ的图谱。

图9为对比例5中传统LB培养基IPTG诱导和实施例3中自动诱导的比较；

其中，A，自动诱导培养基(AIM)与LB培养基在不同温度下培养的菌浓，以OD₆₀₀表示；B，自动诱导培养基(AIM)与LB培养基在不同温度下培养的重组腈水合酶的活力比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并非仅限于此。

实施例中的材料与方法为：本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

本发明实施例中使用的限制性内切酶EcoRI、HindIII和T4DNA连接酶等均购自TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司；基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli DH5α、E.coliBL21(DE3)、质粒pET-30a(+)、pET-21a(+),pET-22b(+)等购自Novagen公司；

本发明采用的产酸克雷伯菌KCTC 1686(KlebsiellaoxytocaKCTC 1686)购自韩国典型微生物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures(KCTC))；锰氧化橙单胞菌SI859A(Aurantimonas manganoxydansSI859A)购自美国标准生物品保藏中心(AmericanType Culture Collection)，编号为ATCC BAA-1229。

实施例1来源于产酸克雷伯菌KCTC 1686(KlebsiellaoxytocaKCTC 1686)的腈水合酶的基因及其活化元件基因的克隆

根据KlebsiellaoxytocaKCTC 1686基因组DNA序列(GenBank登录号：CP003218.1)设计引物：

PCR反应体系和反应条件如下：

PCR扩增体系：

PCR扩增条件：

1)预变性：95℃5min；

2)变性：98℃10s；退火：57℃15s；延伸：72℃60s；共循环30次；

3)延伸：72℃10min；

4)4℃保存2.0h。

用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，用DNA回收纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化回收，具体步骤参照该试剂盒说明书。

PCR扩增产物的琼脂糖核酸电泳检测结果如图2所示，以N6/N7、N4/N5和N4/N3为引物来PCR扩增，分别获得活化元件基因(17K)(SEQ ID NO.2)、腈水合酶结构基因(NHaseK)(SEQ ID NO.1)和腈水合酶含活化元件的基因簇(SEQ ID NO.3)。

实施例2来源于产酸克雷伯菌KCTC 1686(KlebsiellaoxytocaKCTC 1686)的腈水合酶的表达菌种构建及酶活测定

用重叠延伸PCR的方法，获得了在17K基因5′端引入了一个高效SD序列(5′-AAGGAG-3′)的目标片段NHaseK-SD17K。用DNA纯化试剂盒纯化基因片段NHaseK-SD17K，先将纯化回收后的目的片段和提取的pET-30a(+)空质粒分别用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切。双酶切体系和条件如下表所示，

之后用DNA回收纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收以去除限制性内切酶和酶切下来的核苷酸小片段。最后，用T4DNA连接酶将目的片段与pET-30a(+)质粒进行连接，连接体系如下表所示：

将上述各试剂进行轻轻混合，并放于16℃金属浴中连接12h，获得重组质粒pET-30a(+)-N-SD17K，重组质粒图谱见图3。之后，用重组质粒转化E.coliDH5a感受态细胞，涂平板、挑单菌落进行LB液体培养，PCR法鉴定构建成功的阳性转化子。用Axygen质粒提取试剂盒从E.coliDH5a阳性转化菌株中提取重组质粒，并用其转化表达宿主Ecoli BL21(DE3)感受态细胞。用PCR法来验证转化的重组子，验证无误后的基因工程菌即为E.coliBL21(DE3)/pET-30a(+)-N-SD17K。

将构建的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-30a(+)-N-SD17K接于5mL含50μg/mlKan的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，20℃下诱导18h。其诱导表达产物的SDS-PAGE电泳图，如图5B所示。

由图5B可知，腈水合酶实现了过量表达，测定腈水合酶的总酶活和比活分别为60.2U/mL发酵液和250U/mg蛋白。

对比例1来源于产酸克雷伯菌KCTC 1686(KlebsiellaoxytocaKCTC 1686)腈水合酶的结构基因的(不含活化元件)表达菌种构建及酶活测定

用DNA纯化试剂盒纯化实施例1中的基因片段NHaseK，并将目标基因片段连接到表达质粒pET-30a(+)上，获得重组质粒pET-30a(+)-N(重组质粒图谱见图4)。用重组质粒pET-30a(+)-N转化E.coli感受态细胞，获得工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-30a(+)-N。具体方法与实施例2一致。

将构建的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-30a(+)-N接于5mL含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，20℃下诱导18h。其诱导表达产物的SDS-PAGE电泳图，如图5A所示。

在标准条件下测定重组腈水合酶的酶活。发酵总酶活和比活分别为13.7U/mL发酵液和50U/mg蛋白。

实施例3来源于锰氧化橙单胞菌ATCC BAA-1229腈水合酶的基因及其活化元件基因的克隆

采用细菌基因组提取试剂盒提取锰氧化橙单胞菌ATCC BAA-1229的基因组。再根据锰氧化橙单胞菌ATCC BAA-1229基因组中假定腈水合酶的核苷酸序列(如SEQ ID NO.3)设计引物Ama_Alpha F和Ama_Act R，以锰氧化橙单胞菌ATCC BAA-1229基因组为模板，PCR扩增全长腈水合酶基因。在上、下游引物中分别加入限制性酶切位点BamHI、HindIII(下划线所示)。

PCR反应体系和反应条件如下：

PCR扩增体系：

PCR扩增条件：

1)预变性：95℃2min；

2)变性：95℃10s；退火：58℃15s；延伸：72℃15s；共循环30次；

3)延伸：72℃10min；

4)4℃保存2.0h。

用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，产物为单一条带。用DNA回收纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化回收，具体步骤参照该试剂盒说明书。

当以Ama_Alpha F和Ama_Beta R为引物进行PCR时，得到腈水合酶结构基因(SEQID NO.4)，约1400bp(图6-B)。以Ama_Alpha F和Ama_Act R为引物时，PCR得到腈水合酶以及活化元件基因的大小约为1700bp的基因片段(SEQ ID NO.6)，如图6-A所示。活化元件基因的序列如SEQ ID NO.5所示。

实施例4来源于锰氧化橙单胞菌ATCC BAA-1229腈水合酶的表达菌种构建及酶活测定

将实施例3中PCR扩增得到的含活化元件的1700bp基因片段用DNA纯化试剂盒纯化回收。再将纯化回收后的目的片段和提取的pET28a(+)空质粒分别用限制性内切酶BamHI和HindIII进行双酶切。之后用DNA回收纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收以去除限制性内切酶和酶切下来的核苷酸小片段。双酶切体系和反应条件如下表所示，

之后用T4DNA连接酶将目的片段与pET-30a(+)质粒进行连接，连接体系如下表所示：

将上述各试剂进行轻轻混合，并放于16℃金属浴中连接12h，获得重组质粒pET28a_nh08αβ_act，重组质粒图谱见图7。之后用重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，涂平板、挑单菌落进行LB液体培养，PCR法鉴定构建成功的阳性转化子。用Axygen质粒提取试剂盒从E.coli DH5α阳性转化菌株中提取重组质粒，最后再将重组质粒转入表达宿主E.coli BL21(DE3)细胞中，构建基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a_nh08αβ_act。

将基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a_nh08αβ_act接种于5mL LB培养基中，当培养液的OD600达到0.6时，添加0.1mM IPTG，再将摇瓶转移至18℃摇床中，继续培养14h，诱导重组腈水合酶表达。培养结束后，检测到明显的腈水合酶水合活力，为84.3U/mg细胞干重。

对比例2来源于锰氧化橙单胞菌ATCC BAA-1229腈水合酶的结构基因的(不含活化元件)表达菌种构建及酶活测定

将实施例3中PCR扩增得到的不含活化元件的1400bp基因片段用DNA纯化试剂盒纯化回收，并将目标基因片段连接到表达质粒pET-28a(+)上，获得重组质粒pET28a_nh08αβ(重组质粒图谱见图8)。用重组质粒转化E.coli感受态细胞，获得工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a_nh08αβ。具体方法与实施例4一致

将工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a_nh08αβ接种于5mL LB培养基中，当培养液的OD600达到0.6时，添加0.1mM IPTG，再将摇瓶转移至18℃摇床中，继续培养14h，诱导重组腈水合酶表达。培养结束后，没有检测到任何腈水合酶的催化活力。

实施例5来源于锰氧化橙单胞菌ATCC BAA-1229腈水合酶的基因工程菌的自诱导发酵

在超净台中，用接种环接基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a_nh08αβ_act的甘油保藏液于固体培养基上划线，37℃静置培养12小时。挑取单菌落于5mL LB培养基中，37℃振荡培养12小时，然后转接于100mL自动诱导AIM培养基的500mL摇瓶中，接种量3％，37℃振荡培养，2小时后分别转移至18℃、25℃、30℃、37℃摇床中，继续培养14～24小时。

培养结束后，测定发酵液的生物量，以600nm的吸光值表示。将发酵液12000×g离心1min，去上清，再用50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)重悬细胞，测定其中的腈水合酶酶活。测定结果见图9中AIM培养基结果。

对比例3来源于锰氧化橙单胞菌ATCC BAA-1229腈水合酶的基因工程菌的传统发酵

在超净台中，用接种环接基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a_nh08αβ_act的甘油保藏液于固体培养基上划线，37℃静置培养12小时。挑取单菌落于5mL LB培养基中，37℃振荡培养12小时，然后转接于100ml LB培养基的500mL摇瓶中，接种量3％，37℃振荡，OD600达到0.8时，添加100Μl IPTG，转移至18℃进行诱导，继续培养14小时。

培养结束后，测定发酵液的生物量，以600nm的吸光值表示。将发酵液12000×g离心1min，去上清，再用50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)重悬细胞，测定其中的腈水合酶酶活。测定结果见图9中的LB培养基结果。

当在18℃条件下，采用自动诱导AIM培养基时，最终OD600值达到了5.7，而且腈水合酶比活力为135U/mg细胞干重，大约是传统LB培养基IPTG诱导方式的1.6倍。当诱导温度高于18℃情况下(25℃、30℃和37℃)，自动诱导培养基更有利于细胞的生长和腈水合酶的活性表达。尤其在30℃条件下，腈水合酶活力为70U/mg细胞干重，而采用LB培养基IPTG诱导方式酶活仅为10U/mg。结果显示，该自动诱导培养基更有利于重组E.coli细胞的生长和腈水合酶的活性表达。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种重组腈水合酶的高效表达方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1263

<212> DNA

<213> 产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca KCTC 1686)

<400> 1

atgagccata aacacgacca cgaccatacc caaccccccg ttaatatcga gctacgcgtc 60

cgcgcactgg aatccctgct gcaggaaaaa ggcctgatcg acccagctgc gctggatgag 120

ctgattgaca cctacgagca caaagtcggc ccccgaaacg gcgcacaggt tgtcgccaga 180

gcgtggagcg acccggaata caaacgtcga ctgatggaaa acgccactgc cgctattgct 240

gaactgggtt tctccggaat acagggcgaa gacatgctgg tcgtggagaa cacgccggac 300

gtgcacaacg tcaccgtttg tacgctctgt tcctgctacc cctggccggt gctgggtctg 360

ccgccggtgt ggtacaaatc agcgccctat cgttcgcgta tcgtcatcga cccgcgcggc 420

gttctcgccg agttcgggtt acacatacca gaaaacaaag agattcgcgt ctgggacagc 480

agcgccgagc tgcgctatct ggtcctgcca gaacgtccgg caggcacgga aggctggagc 540

gaagcgcagt tgagcgaact catcacgcgc gattcgatga ttggcaccgg tgtggttagc 600

gcaccataaa tgaacgggat acatgatctg ggggggatgc acggccttgg cccgatccct 660

accgaggaaa acgagcccta tttccatcat gagtgggaac gccgggtatt tcctctgttc 720

gcctcgttgt tcgtcggcgg acactttaac gtcgatgaat ttcgccacgc catcgaacgt 780

atggcgccga ccgaatattt gcagtcaagt tactacgagc actggctgca tgcattcgaa 840

acgctgctgc tggcaaaggg gacgatcacc gttgaagaac tgtggggtgg cgcgaagcct 900

gccccctgca agcctggtac acctgtgctg acgcaggaga tggtgtcgat ggttgtcagc 960

accggcgggt ctgctcgggt cagtcacgat gttgcgcccc gcttccgggt gggcgattgg 1020

gtacgaacga aaaatttcaa cccgaccacc catacccgcc tgccacgcta cgcacgcgat 1080

aaagtcggtc gcatagagat cgctcacggt gtgtttatca cgccagatac tgcggcgcac 1140

gggctgggag aacatcccca gcatgtttac agcgtcagtt tcaccgcgca ggcgctgtgg 1200

ggagagccgc gccctgacaa agtgttcatc gatctgtggg acgactatct ggaggaagca 1260

tga 1263

<210> 2

<211> 468

<212> DNA

<213> 产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca KCTC 1686)

<400> 2

atgaatacgg tagcacaaca cgattacgcc gccctcgggt taccgcgcga tgaggaaggg 60

ccggtgtttg ataagccctg gcaggcaaaa gcgttctccc tgatagtcca tctccaccgg 120

gccgggctgt tcccgtgggc agaatgggta cagacattca gtaaagagat caacgcggtg 180

ccggcgcaac cgggtgaaag cgcgaatgat gcctactatc gtcagtggac ggcggcgatg 240

gaaaacatga tgacggcact caacctgacg gtgccggatg aaatcagccg acggacgcag 300

gagtggcgca aagcgtatct caacacgccc cacggccagc cgattgtact ggcgaacgcc 360

agttgcccgc cggcacatag ccatcatcac ctttcgccgg gcgtgccggt cacggtgagt 420

ccggcactct ctatcaacag caaaatcgat aatggagtta caccatga 468

<210> 3

<211> 1731

<212> DNA

<213> 产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca KCTC 1686)

<400> 3

atgagccata aacacgacca cgaccatacc caaccccccg ttaatatcga gctacgcgtc 60

cgcgcactgg aatccctgct gcaggaaaaa ggcctgatcg acccagctgc gctggatgag 120

ctgattgaca cctacgagca caaagtcggc ccccgaaacg gcgcacaggt tgtcgccaga 180

gcgtggagcg acccggaata caaacgtcga ctgatggaaa acgccactgc cgctattgct 240

gaactgggtt tctccggaat acagggcgaa gacatgctgg tcgtggagaa cacgccggac 300

gtgcacaacg tcaccgtttg tacgctctgt tcctgctacc cctggccggt gctgggtctg 360

ccgccggtgt ggtacaaatc agcgccctat cgttcgcgta tcgtcatcga cccgcgcggc 420

gttctcgccg agttcgggtt acacatacca gaaaacaaag agattcgcgt ctgggacagc 480

agcgccgagc tgcgctatct ggtcctgcca gaacgtccgg caggcacgga aggctggagc 540

gaagcgcagt tgagcgaact catcacgcgc gattcgatga ttggcaccgg tgtggttagc 600

gcaccataaa tgaacgggat acatgatctg ggggggatgc acggccttgg cccgatccct 660

accgaggaaa acgagcccta tttccatcat gagtgggaac gccgggtatt tcctctgttc 720

gcctcgttgt tcgtcggcgg acactttaac gtcgatgaat ttcgccacgc catcgaacgt 780

atggcgccga ccgaatattt gcagtcaagt tactacgagc actggctgca tgcattcgaa 840

acgctgctgc tggcaaaggg gacgatcacc gttgaagaac tgtggggtgg cgcgaagcct 900

gccccctgca agcctggtac acctgtgctg acgcaggaga tggtgtcgat ggttgtcagc 960

accggcgggt ctgctcgggt cagtcacgat gttgcgcccc gcttccgggt gggcgattgg 1020

gtacgaacga aaaatttcaa cccgaccacc catacccgcc tgccacgcta cgcacgcgat 1080

aaagtcggtc gcatagagat cgctcacggt gtgtttatca cgccagatac tgcggcgcac 1140

gggctgggag aacatcccca gcatgtttac agcgtcagtt tcaccgcgca ggcgctgtgg 1200

ggagagccgc gccctgacaa agtgttcatc gatctgtggg acgactatct ggaggaagca 1260

tgaatgaata cggtagcaca acacgattac gccgccctcg ggttaccgcg cgatgaggaa 1320

gggccggtgt ttgataagcc ctggcaggca aaagcgttct ccctgatagt ccatctccac 1380

cgggccgggc tgttcccgtg ggcagaatgg gtacagacat tcagtaaaga gatcaacgcg 1440

gtgccggcgc aaccgggtga aagcgcgaat gatgcctact atcgtcagtg gacggcggcg 1500

atggaaaaca tgatgacggc actcaacctg acggtgccgg atgaaatcag ccgacggacg 1560

caggagtggc gcaaagcgta tctcaacacg ccccacggcc agccgattgt actggcgaac 1620

gccagttgcc cgccggcaca tagccatcat cacctttcgc cgggcgtgcc ggtcacggtg 1680

agtccggcac tctctatcaa cagcaaaatc gataatggag ttacaccatg a 1731

<210> 4

<211> 1329

<212> DNA

<213> 锰氧化橙单胞菌(Aurantimonas manganoxydansSI859A)

<400> 4

atgacgggat cgcacggcag ggacggtgat caccacggcc atcaccacga ccgtgatcac 60

gacaaccatc tcgacccgat gaccgcgcgg gtcatggcgc tggagacgat cctcaccgaa 120

aagggcatgg tcgacccgga cgccctcgac gccatcatcg acacctacga gaccaaggtc 180

gggccgcgca acggcgccag cgtcgtcgcc aaggcctgga gcgacccgga ctacgccgac 240

tggctggcgc gcgacgcaac cgccgccatt gcctcgcttg gcttcaccgg ccgccagggc 300

gagcacatgc aggcggtgtt caacaccccg gagcgccaca acctcgtcgt ctgcaccctg 360

tgctcctgct atccgtggtc agtgctcggc ctgccgccgg tctggtacaa gtcgccgccc 420

tatcgctcgc gcgccgtctc cgatccgcgc ggcgtcctgc gcgaattcgg cgtcgcgctg 480

ccggacggcg tctcggtgcg agtctgggac tccaccgccg agctgcgcta cctcgtcgtg 540

cccgagcgcc cggcgggtac cgagggactg tccgaggcgg cgctggcggc gctcgtcacc 600

cgcaattcca tgatcggtac cgagcgtgac ctgagcccgc atgccgcgcc ggagacggcg 660

gcatgaatga acggccccca cgatctcggc ggtcggcacg gcttcgggcc gatcgcgccg 720

aaggcagacg agccgctgtt ccatgcgccc tgggagcgcc gcgccctcgc cctgacgctc 780

gccgccggtg cgatgggcca ttggtcgatc gacgaaagcc gcgccgcccg tgaggatcgc 840

cacccggccg actattacgg ttcgtcctat tacgagatct ggaccaaggg ccttgagacg 900

ctgctcctgc gccacggcct catcagccat cgcgaattgc gcgccgggcg gcccctcgac 960

ctgaccgtgc cgccgaaccg catcctgaag gccgatgccg tcgcgccggc ccttgccaag 1020

ggcagtccgg ccaaccgcga tcccgaaggc agcacgcccg ttttcgcgcc gggcgacagg 1080

gtccgcacgc tgaacctgca gccgcgccat cacatccgcc tgcccgccta tgcccgcgag 1140

aagaccggca ccatcgaaac cgttcagggt ttccatgtct tcgcggatgc cagcgccaag 1200

ggcgacgacc atgtcgcgca ctggctctac acggtggtct tcgacgcatt cacgctgtgg 1260

ggcggcgacg cttcgcccaa cgacaccgtc tccatcgatg cctgggagcc ctatcttgcg 1320

cacgcctga 1329

<210> 5

<211> 576

<212> DNA

<213> 锰氧化橙单胞菌(Aurantimonas manganoxydansSI859A)

<400> 5

atgcccgcga gaagaccggc accatcgaaa ccgttcaggg tttccatgtc ttcgcggatg 60

ccagcgccaa gggcgacgac catgtcgcgc actggctcta cacggtggtc ttcgacgcat 120

tcacgctgtg gggcggcgac gcttcgccca acgacaccgt ctccatcgat gcctgggagc 180

cctatcttgc gcacgcctga gaccggcatc gccgcatcgc ccggcctgcc acgcgatgcg 240

gcgggtgaac ccgtcttctt cgcgccctgg caggccaagg ccttcgccat gaccgtcgcg 300

ctgaacgagc gcggcatcct tgcctggacc gactgggctg ccgcgctcgg ccgcgcctgc 360

gccagcctgc ccgccgccgg cccctcgccc gaagcaacag cggatgccta tttcaccgca 420

tggctcgtcg cgctcgaaga aatcctcacg gcacgggcgc tggtaagcgc cgatgccgtc 480

gacgcggcgc aggccgtctg gcaccgcgcc gccgaggcca cgccccacgg cacgccgatc 540

cgcttcgagg ccggcctgcc gaacccacac gactga 576

<210> 6

<211> 1905

<212> DNA

<213> 锰氧化橙单胞菌(Aurantimonas manganoxydansSI859A)

<400> 6

atgacgggat cgcacggcag ggacggtgat caccacggcc atcaccacga ccgtgatcac 60

gacaaccatc tcgacccgat gaccgcgcgg gtcatggcgc tggagacgat cctcaccgaa 120

aagggcatgg tcgacccgga cgccctcgac gccatcatcg acacctacga gaccaaggtc 180

gggccgcgca acggcgccag cgtcgtcgcc aaggcctgga gcgacccgga ctacgccgac 240

tggctggcgc gcgacgcaac cgccgccatt gcctcgcttg gcttcaccgg ccgccagggc 300

gagcacatgc aggcggtgtt caacaccccg gagcgccaca acctcgtcgt ctgcaccctg 360

tgctcctgct atccgtggtc agtgctcggc ctgccgccgg tctggtacaa gtcgccgccc 420

tatcgctcgc gcgccgtctc cgatccgcgc ggcgtcctgc gcgaattcgg cgtcgcgctg 480

ccggacggcg tctcggtgcg agtctgggac tccaccgccg agctgcgcta cctcgtcgtg 540

cccgagcgcc cggcgggtac cgagggactg tccgaggcgg cgctggcggc gctcgtcacc 600

cgcaattcca tgatcggtac cgagcgtgac ctgagcccgc atgccgcgcc ggagacggcg 660

gcatgaatga acggccccca cgatctcggc ggtcggcacg gcttcgggcc gatcgcgccg 720

aaggcagacg agccgctgtt ccatgcgccc tgggagcgcc gcgccctcgc cctgacgctc 780

gccgccggtg cgatgggcca ttggtcgatc gacgaaagcc gcgccgcccg tgaggatcgc 840

cacccggccg actattacgg ttcgtcctat tacgagatct ggaccaaggg ccttgagacg 900

ctgctcctgc gccacggcct catcagccat cgcgaattgc gcgccgggcg gcccctcgac 960

ctgaccgtgc cgccgaaccg catcctgaag gccgatgccg tcgcgccggc ccttgccaag 1020

ggcagtccgg ccaaccgcga tcccgaaggc agcacgcccg ttttcgcgcc gggcgacagg 1080

gtccgcacgc tgaacctgca gccgcgccat cacatccgcc tgcccgccta tgcccgcgag 1140

aagaccggca ccatcgaaac cgttcagggt ttccatgtct tcgcggatgc cagcgccaag 1200

ggcgacgacc atgtcgcgca ctggctctac acggtggtct tcgacgcatt cacgctgtgg 1260

ggcggcgacg cttcgcccaa cgacaccgtc tccatcgatg cctgggagcc ctatcttgcg 1320

cacgcctgaa tgcccgcgag aagaccggca ccatcgaaac cgttcagggt ttccatgtct 1380

tcgcggatgc cagcgccaag ggcgacgacc atgtcgcgca ctggctctac acggtggtct 1440

tcgacgcatt cacgctgtgg ggcggcgacg cttcgcccaa cgacaccgtc tccatcgatg 1500

cctgggagcc ctatcttgcg cacgcctgag accggcatcg ccgcatcgcc cggcctgcca 1560

cgcgatgcgg cgggtgaacc cgtcttcttc gcgccctggc aggccaaggc cttcgccatg 1620

accgtcgcgc tgaacgagcg cggcatcctt gcctggaccg actgggctgc cgcgctcggc 1680

cgcgcctgcg ccagcctgcc cgccgccggc ccctcgcccg aagcaacagc ggatgcctat 1740

ttcaccgcat ggctcgtcgc gctcgaagaa atcctcacgg cacgggcgct ggtaagcgcc 1800

gatgccgtcg acgcggcgca ggccgtctgg caccgcgccg ccgaggccac gccccacggc 1860

acgccgatcc gcttcgaggc cggcctgccg aacccacacg actga 1905

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttcccaagct tgttatggtg taactccatt atcg 34

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccggaattcg atgagccata aacacgacca cg 32

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttcccaagct tttatgcttc ctccagatag 30

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggaattccat atgaatacgg tagcacaaca cg 32

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccggaagatc tgcttatggt gtaactccat tatcg 35

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgggatccat gacgggatcg cacggcag 28

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cccaagcttt caggcgtgcg caagatagg 29

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cccaagcttt cagtcgtgtg ggttcggcag g 31

Claims (8)

1.一种重组腈水合酶的高效表达方法，包括：

(1)从原始菌株中克隆得到目的基因；

(2)构建重组载体，将重组载体转化至宿主细胞，得到基因工程菌；

(3)培养所述基因工程菌，获得重组腈水合酶蛋白；

其特征在于，所述目的基因由编码α亚基和β亚基的腈水合酶基因和活化元件基因依次连接而成；

其中，当所述腈水合酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示时，所述活化元件基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；当所述腈水合酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示时，所述活化元件基因的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组载体为pET-21a(+)、pET-24a(+)、pET-28a(+)、pET-30a(+)或pET-Duet。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述培养的过程包括：将所述工程菌活化后，进行扩大培养，再采用自诱导培养基进行发酵培养；

所述自诱导培养基为：0.3～2g/L葡萄糖，4～8g/L甘油，1～4g/L乳糖，6～18g/L酵母抽提物，10～20g/L Na₂HPO₄·12H₂O，1～4g/L KH₂PO₄，0.1～0.8g/L NaCl，1～2g/L NH₄Cl和0.1～0.8g/L MgSO₄。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述自诱导培养基为：0.36g/L葡萄糖，6.84g/L甘油，2.04g/L乳糖，12g/L酵母抽提物，17.1g/L Na₂HPO₄·12H2O，3.0g/L KH₂PO₄，0.5g/L NaCl，1.0g/L NH₄Cl和0.6g/L MgSO₄。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为18～20℃，pH7.0～7.5。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化培养的固体培养基为：蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0，琼脂粉20g/L，卡那霉素的浓度为50μg/mL。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩大培养的培养基为：蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0，卡那霉素的浓度为50μg/mL。