CN109182232B - 重组大肠杆菌zjut-ho1及其在制备胆绿素中的应用 - Google Patents

重组大肠杆菌zjut-ho1及其在制备胆绿素中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组大肠杆菌zjut‑ho1及其在制备胆绿素中的应用，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60372，保藏日期2018年5月18日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。该重组大肠杆菌表达胞内活性的HO‑1，可以利用重组大肠杆菌为HO‑1酶源，以氯化血红素为底物，生物转化法制备胆绿素，为胆绿素的生产提高新途径。相比于现有的同类技术，本发明将原核生物来源的ho1在原核生物的大肠杆菌中表达，具有HO‑1活性高、培养周期短等优点，并以氯化血红素为底物，使胆绿素的产率有大幅度提高，是重组大肠杆菌全细胞合成法的2.6倍。

Description

重组大肠杆菌zjut-ho1及其在制备胆绿素中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一株表达藻类来源的血红素加氧酶-1的基因重组大肠杆菌，以及该菌株在生物转化血红素制备胆绿素中的应用。
(二)背景技术
胆绿素(biliverdin，CAS：114-25-0)是由血红素经血红素加氧酶(hemeoxygenase-1，HO-1)水解开环而得到的一种线性四吡咯环物质(反应式见图1)，因其呈深绿色而得名。在脊椎动物细胞内，血红素在HO-1的水解作用下，在α-亚甲基桥处开环形成胆绿素IXα异构体，因此，胆绿素一般就是指胆绿素IXα。
胆绿素不仅仅是血红素代谢循环系统的一个中间代谢物，更重要的是它能启动一系列的抗炎、抗氧化和免疫调节等生理作用，如可以改善肝功能、降低丙氨酸转氨酶、减轻因肝脏移植导致的缺血再灌注损伤，抑制新生血管内膜形成的血管重塑，以及抑制牛腹泻病毒复制等功能。因此，胆绿素作为临床药物使用的潜力巨大。所以，近年来，如何高效制备胆绿素一直是科研人员关注的热点。
目前，制备胆绿素主要有提取法、化学转化法、酶转化法和生物合成法。提取法是直接从三文鱼胆汁或鸸鹋蛋壳中提取胆绿素，存在的问题是原料来源不足，难以工业化应用；化学转化法是利用胆红素脱氢制备，但该方法存在2个问题：①需要价格高的胆红素作为底物，原料来源困难；②胆红素提取自哺乳动物的胆汁，而且需在酸性条件下，这使胆红素形成多种异构体，从而导致产物胆绿素IXα的收率和纯度较低；也有采用化学氧化血红素法制备胆绿素的报道，同样产生较多的异构体，收率较低；酶转化法制备胆绿素的报道是美国的一项专利，将来自蓝藻的HO-1基因重组到酵母细胞中，表达HO-1，再以血红素作为底物，全细胞生物转化制备胆绿素，该方法的优点是异构体少，但该专利未报道产率情况。生物合成法的报道是于2012年，美国犹他州立大学的Chen和Takemoto将蓝藻的HO-1基因重组到大肠杆菌，重组大肠杆菌全细胞能够合成胆绿素，胆绿素产率可达23.5mg/L，即便如此，产率仍然相对较低。可以看出，目前缺乏经济有效的胆绿素制备方法。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一株表达集胞藻(Synechocystis sp.)的胞内活性血红素加氧酶-1基因(ho-1)的基因重组大肠杆菌，经诱导表达培养后，在培养液中加入氯化血红素作为底物，在胞内HO-1的催化作用下，用于生物转化法制备胆绿素，获得相对较高的胆绿素收率，为胆绿素的生产提供新方法。
本发明的采用的技术方案是：
本发明提供一株表达胞内活性血红素加氧酶-1基因(HO-1)的重组大肠杆菌(Escherichia coli)zjut-ho1菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo:60372，保藏日期2018年5月18日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。
所述大肠杆菌zjut-ho1菌株的构建方法包括以下步骤：
(1)以集胞藻(Synechocystis sp.)PCC 6803总RNA逆转录得到的双链cDNA为模板，设计引物P1和P2，引入限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ的酶切位点，PCR扩增获得目的基因ho1序列，所述的基因ho1的核苷酸序列见SEQ ID NO:1。
所述的引物P1和P2分别为：
P1：5′-GGGAATTCCATATGAGTGTCAACTTAGC-3′
P2：5′-CCGCTCGAGCTAGCCTTCGGAG-3′
(2)PCR产物3′端加碱基A后连接pUCm-T质粒载体，转化大肠杆菌DH5α菌株，提取阳性克隆的质粒，经双酶切和测序验证，成功构建克隆载体pUCm-T-ho1。
(3)pUCm-T-ho1与pET-28a质粒分别经Nde I和Xho I双酶切后，目的基因ho1和开环pET-28a经T4DNA酶连接后，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，提取阳性克隆的质粒，经双酶切和测序验证，成功构建表达载体pET-28a-ho1。
(4)重组ho1的大肠杆菌BL21(DE3)菌株，于50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养2h(OD600≈0.8)，加入终浓度为0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养20h，收集菌体，经SDS-PAGE蛋白电泳分析，重组菌表达了分子量为29kD的蛋白，与HO-1分子量大小一致；经分离纯化获得HO-1，酶活测定表明具有转化血红素为胆绿素活力，表达HO-1的基因重组大肠杆菌构建成功。
本发明还涉及一种重组大肠杆菌zjut-ho1在生物转化血红素制备胆绿素中的应用，具体所述的应用方法为：以重组大肠杆菌zjut-ho1经诱导培养获得的培养液为反应介质，以氯化血红素为底物构成反应体系，于25～40℃、100～200r/min(优选37℃、180r/min)恒温振荡摇床中培养至转化完全，将反应液分离纯化，获得胆绿素；所述培养液OD600＝1.40～1.65，所述底物在培养液中的终浓度为100-200mg/L(优选200mg/L)；所述氯化血红素以2g/L氯化血红素水溶液的形式加入，所述2g/L氯化血红素水溶液的配制方法为：100mg氯化血红素微热溶解50mL质量浓度0.25％Na2CO3水溶液，即得2g/L的氯化血红素水溶液。
进一步，所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液经8000～1000g离心5～10min(优选1000g，10min)，收集菌体，菌体用等同反应体系体积的酸性甲醇悬浮，于40℃、100KHz、200W条件下超声30min，8000～1000g离心5～10min(优选1000g离心5min)，收集上清液；上清液于45℃下减压蒸干后，加入原反应体系1/4～1/5体积的酸性甲醇溶解残留物，用滤纸过滤后，于45℃下减压干燥，即得胆绿素；所述的酸性甲醇是在体积浓度95％甲醇水溶液中，加入1/1000体积比的质量浓度36％浓盐酸制成。
进一步，所述重组大肠杆菌zjut-ho1诱导培养方法为：
(1)将重组大肠杆菌zjut-ho1接种于含50μg/mL卡那霉素的LB斜面培养基，于37℃恒温培养24h，获得斜面菌体；所述的LB斜面培养基终浓度组成为：酵母浸出粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4，121℃灭菌15min；
(2)挑取斜面菌体2环，接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，于30～35℃、150～200r/min的恒温振荡摇床培养10～12h(优选30℃、180r/min、12h)，获得种子液；所述的LB培养基终浓度组成为：酵母浸出粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，溶剂为去离子水，pH7.4，121℃灭菌15～20min；
(3)按体积浓度1％～5％(优选3％)的接种量，将步骤(1)种子液接种至含50μg/mL卡那霉素甘油培养基(GY)，35～37℃、100～200r/min(优选37℃、180rmp)培养至菌浓OD600＝0.5～1.2时，加入终浓度为0.1～0.5mmol/L(优选0.5mmol/L)的IPTG，25～30℃、100～150r/min培养4～8h(优选30℃、100rpm、6h)，至OD600＝1.40～1.65，获得培养液；所述的GY培养基终浓度组成为：甘油15～20g/L，酵母浸出粉15～20g/L，NH4SO4 3～5g/L，NaCl 3～5g/L，Na2HPO4 10～15g/L，KH2PO4 3～5g/L，MgSO4 0.3～0.5g/L，溶剂为去离子水，pH自然，121℃灭菌15～20min；优选所述的GY培养基组成为：甘油20g/L，酵母浸出粉20g/L，NH4SO45g/L，NaCl 5g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4 0.5g/L，溶剂为去离子水，pH自然。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明克隆了集胞藻的HO-1编码基因，与表达载体连接，构建得到含该基因的重组质粒pET-28a-ho1，再转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，获得重组大肠杆菌。该重组大肠杆菌表达胞内活性的HO-1，可以利用重组大肠杆菌为HO-1酶源，以氯化血红素为底物，生物转化法制备胆绿素，为胆绿素的生产提高新途径。相比于现有的同类技术，本发明将原核生物来源的ho1在原核生物的大肠杆菌中表达，具有HO-1活性高、培养周期短等优点，并以氯化血红素为底物，使胆绿素的产率有大幅度提高，是重组大肠杆菌全细胞合成法的2.6倍。
(四)附图说明
图1血红素生物转化为胆绿素的反应式示意图。
图2 PCR扩增ho1的电泳图(M：Marker；1,2：PCR产物)。
图3阳性克隆载体pUCm-T-ho1经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后电泳图(M：Marker；1：载体经双酶切)。
图4阳性表达载体pET-28a-ho1经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后电泳图(M：Marker；1：载体经双酶切)。
图5 zjut-ho1菌株诱导表达HO-1的SDS-PAGE电泳图(M：Marker；1：BL21(DE3)/pET-28a；2：BL21(DE3)/pET-28a-ho1)。
图6氯化血红素的质量浓度-A610标准曲线。
图7 zjut-ho1菌株在优选条件下表达HO-1的SDS-PAGE电泳图(M：Marker；1：阴性对照；2：细胞裂解液；3：经Ni-NTA柱分离的HO-1)。
图8 zjut-ho1菌株生物转化氯化血红素为胆绿素的HPLC分析图谱。
图9制备的胆绿素样品紫外吸收光谱图。
图10制备的胆绿素的LS-MS分析图谱。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
下列实施例中，如未说明具体的实验方法，均按照常规分子生物学实验方法操作，如F.M.奥斯伯主编《精编分子生物学实验指南》(马学军译，第五版，科学出版社，2008)中所述的方法，或按照试剂盒生产商建议方法操作。
实施例1表达HO-1的基因重组大肠杆菌构建
本发明所述的表达HO-1的重组大肠杆菌zjut-ho1菌株，按以下步骤构建：
(1)用“Trizol Univer总RNA提取试剂”，提取集胞藻PCC 6803的总RNA后，用“AMV第一链cDNA合成试剂盒”，RT-PCR法合成第一链cDNA。
(2)以步骤(1)获得的cDNA为模板，设计引物P1和P2，引入限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，PCR扩增HO-1的基因(ho1)序列，PCR产物经“SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒”纯化，获得目的基因ho1序列，所述的基因ho1的核苷酸序列见SEQ ID NO:1。
所述的引物P1和P2分别为：
P1：5′-GGGAATTCCATATGAGTGTCAACTTAGC-3′
P2：5′-CCGCTCGAGCTAGCCTTCGGAG-3′。
所述的PCR扩增目的基因ho1的体系见表1。
表1扩增ho1基因的PCR体系
Figure BDA0001748162470000051
所述的PRC扩增反应过程为：94℃预变性4min，94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环后，72℃延伸10min。
PCR扩增产物经电泳检测(图2)，在750bp左右可以观察到单一的条带，与目的片段(723bp)大小一致。
(2)因Prime STAR Max DNA聚合酶扩增出的PCR产物为平末端，用“平端DNA片段添dA试剂盒”为PCR产物3′端加碱基A后，连接pUCm-T载体，转化大肠杆菌DH5α菌株，提取阳性克隆的质粒，经Nde I和Xho I双酶切鉴定，电泳图见图3，可以观察到在750bp处切下了条带单一明显的片段，经测序验证，成功构建了克隆载体pUCm-T-ho1。
(3)pUCm-T-ho1与pET-28a质粒分别经Nde I和Xho I双酶切后，目的基因ho1和开环pET-28a经T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，提取阳性克隆的质粒，电泳图见图4，可以观察到在750bp处切下了条带单一明显的片段，经测序验证，成功构建表达载体pET-28a-ho1，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)菌株(表示为BL21(DE3)/pET-28a-ho1)。
(4)重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a-ho1菌株，用LB培养基37℃培养2h(OD600为0.767)，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，30℃诱导培养20h，收集菌体，经SDS-PAGE蛋白电泳分析(图5)，重组菌表达了分子量为29kD的蛋白，与HO-1分子量大小一致。经分离纯化获得HO-1，酶活测定表明其具有转化血红素为胆绿素活力，比活力为2.68×104U/mg蛋白，说明表达HO-1的基因重组大肠杆菌构建成功。
表达HO-1的基因重组大肠杆菌编号为zjut-ho1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60372，保藏日期2018年5月18日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。
所述的Trizol Univer总RNA提取试剂、AMV第一链cDNA合成试剂盒、T载体PCR产物克隆试剂盒、平端DNA片段添dA试剂盒、限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ、T4DNA连接酶、质粒载体pUCm-T和pET-28a、大肠杆菌DH5α菌株和BL21(DE3)菌株、Prime STAR Max DNA聚合酶、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量制备试剂盒等，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
所述的HO-1分离方法，按以下步骤操作：
(1)重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a-ho1的培养液，于4℃、8000g离心10min，弃上清，用PBS缓冲液(20mmol/L)悬浮菌体，再次离心收集菌体，重复2次。
(2)每100mL培养液的菌体用5mL结合缓冲液(20mmol/L PBS缓冲液，pH 8.0，添加500mmol/L NaCl和10mmol/L咪唑)，冰浴条件下超声破碎细胞(工作2s，间隔3s，共进行200次，功率200W)。细胞破碎后4℃、10000g离心5min，上清经Millex-HV 0.45μm微孔滤膜过滤后，收集滤液，作细胞裂解液。
(3)Ni-NTA柱(1cm×5cm)经蒸馏水冲洗后，用平衡缓冲液(20mmol/L PBS缓冲液，pH 8.0，添加500mmol/L NaCl)平衡30min，确定流出液A280为0开始上样(步骤(2)滤液)，流速为1mL/min。
(4)上样结束后，用洗脱缓冲液(20mmol/L PBS缓冲液，pH 6.5，添加500mmol/LNaCl和200mmol/L的咪唑)洗脱，收集流出峰，在pH 6.5的PBS缓冲液(20mmol/L)中透析除去咪唑(透析袋截留分子量3.5kDa)，即得纯化的HO-1酶液。
所述的HO-1酶活测定方法为：在EP管中加入2g/L氯化血红素水溶液120μL，加入浓度为1g/L NADPH水溶液200μL和大肠杆菌BL21(DE3)细胞裂解液300μL(按照步骤(2)方法收集的大肠杆菌BL21(DE3)滤液)，加入经纯化的HO-1酶液1mL，补pH 8.0的PBS缓冲液(20mmol/L)至3mL，轻轻混匀，以不加氯化血红素溶液的相同处理为参比，测定A610(A1)。EP管37℃避光水浴15min后，立刻测定A610(A2)，A＝A1-A2，依据氯化血红素质量浓度-A610的标准曲线，由A值计算被转化的氯化血红素质量，依据HO-1活力定义计算其酶活。所述的氯化血红素质量浓度-A610标准曲线以氯化血红素水溶液浓度为横坐标，以A610为纵坐标制成，见图6。
HO-1的活力定义：在上述条件下，以1min转化1μmol氯化血红素所需的酶量(mL)为一个活力单位(U)。
实施例2：重组大肠杆菌zjut-ho1菌株表达HO-1的优选条件
在实施例1获得能表达HO-1大肠杆菌zjut-ho1菌株的基础上，对该菌株表达HO-1的培养条件进行了优化，包括培养基的种类、诱导剂添加的时间、诱导培养的时间、诱导剂添加的浓度、诱导培养的温度。经过优化，HO-1的表达量显著提高，优选的zjut-ho1菌株表达HO-1工艺步骤如下：
(1)冷冻干燥或甘油冷冻保藏的zjut-ho1菌种，接种于含50μg/mL卡那霉素的LB斜面培养基，于37℃恒温培养24h，获得斜面菌体；所述的LB斜面培养基终浓度组成为：酵母浸出粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4，121℃灭菌15min。
(2)挑取zjut-ho1菌株斜面培养的菌体2环，接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，于30℃、180r/min的恒温振荡摇床培养12h，获得种子液。所述的LB培养基终浓度组成为：酵母浸出粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4，250mL三角烧瓶装50mL培养基，八层纱布扎口，121℃灭菌20min。
(3)按体积分数3％的接种量，将步骤(2)种子液接种至含50μg/mL卡那霉素甘油(GY)培养基，37℃、180r/min培养时间2h，菌浓OD600＝0.8±0.3时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，于30℃、100r/min继续培养6h，至OD600＝1.40～1.65，获得含重组大肠杆菌zjut-ho1湿菌体的培养液(即zjut-ho1培养液)。所述的GY培养基组成为：甘油20g/L，酵母浸出粉20g/L，NH4SO4 5g/L，NaCl 5g/L，Na2HPO4 15g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4 0.5g/L，溶剂为去离子水，pH自然(实测7.2)，250mL三角烧瓶装100mL培养基，八层纱布扎口，121℃灭菌20min。
按实施例1中所述的方法，采用Ni-NTA柱分离纯化重组大肠杆菌zjut-ho1表达的HO-1，培养液的HO-1活力为65.0U/mL。蛋白收率占细胞总蛋白的10.9％，表明zjut-ho1菌株，在上述优选的培养条件下，能高效地表达HO-1，SDS-PAGE分析图见图7。
实施例3大肠杆菌zjut-ho1应用于生物转化血红素制备胆绿素
在实施例2的基础，培养表达HO-1的zjut-ho1菌体，用于生物转化血红素制备胆绿素，具体步骤如下：
(1)按实施例2方法，经HO-1表达培养的zjut-ho1培养液(OD600＝1.40～1.65)中，加入2g/L的氯化血红素水溶液使氯化血红素终浓度为200mg/L，继续于37℃、180r/min恒温振荡摇床中培养5h。氯化血红素水溶液的配制方法为：100mg氯化血红素微热溶解50mL质量浓度0.25％Na2CO3水溶液，即得2g/L的氯化血红素水溶液。
(2)步骤(1)的反应体系经1000g离心10min，收集菌体，此时菌体呈深绿色。菌体用等同反应体系体积的酸性甲醇悬浮，于40℃、100KHz、200W条件下超声30min，再1000g离心5min，收集上清液。
(3)上清液于45℃下减压蒸干，加入原反应体系1/4～1/5体积的酸性甲醇溶解残留物；酸性甲醇溶液经滤纸过滤后，再于45℃下减压干燥，即得胆绿素。
所述的酸性甲醇是在95％甲醇中，加入1/1000体积比的质量浓度36％浓盐酸。
按上述方法，zjut-ho1菌株生物转化血红素为胆绿素，单位反应液获得胆绿素的得率为61.7mg/L，氯化血红素的摩尔转化率为34.5％。
制备的胆绿素样品HPLC分析图谱见图8，紫外吸收光谱图见图9，LC-MS分析图谱见图10。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 重组大肠杆菌zjut-ho1及其在制备胆绿素中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 723
<212> DNA
<213> 集胞藻(Synechocystis sp.)
<400> 1
atgagtgtca acttagcttc ccagttgcgg gaagggacga aaaaatccca ctccatggcg 60
gagaacgtcg gctttgtcaa atgcttcctc aagggcgttg tcgagaaaaa ttcctaccgt 120
aagctggttg gcaatctcta ctttgtctac agtgccatgg aagaggaaat ggcaaaattt 180
aaggaccatc ccatcctcag ccacatttac ttccccgaac tcaaccgcaa acaaagccta 240
gagcaagacc tgcaattcta ttacggctcc aactggcggc aagaagtgaa aatttctgcc 300
gctggccaag cctatgtgga ccgagtccgg caagtggccg ctacggcccc tgaattgttg 360
gtggcccatt cctacacccg ttacctgggg gatctttccg gcggtcaaat tctcaagaaa 420
attgcccaaa atgccatgaa tctccacgat ggtggcacag ctttctatga atttgccgac 480
attgatgacg aaaaggcttt taaaaatacc taccgtcaag ctatgaatga tctgcccatt 540
gaccaagcca ccgccgaacg gattgtggat gaagccaatg acgcctttgc catgaacatg 600
aaaatgttca acgaacttga aggcaacctg atcaaggcga tcggcattat ggtgttcaac 660
agcctcaccc gtcgccgcag tcaaggcagc accgaagttg gcctcgccac ctccgaaggc 720
tag 723

Claims (3)

1.一种重组大肠杆菌（Escherichia coli）zjut-ho1在生物转化血红素制备胆绿素中的应用，其特征在于所述的应用以重组大肠杆菌zjut-ho1经诱导培养获得的培养液为反应介质，以氯化血红素为底物构成反应体系，于37℃、180 r/min恒温振荡摇床中培养5h至转化完全，将反应液分离纯化，获得胆绿素；所述培养液OD600=1.40~1.65，所述底物在培养液中的终浓度为200 mg/L；
重组大肠杆菌zjut-ho1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60372，保藏日期2018年5月18日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075；
所述重组大肠杆菌zjut-ho1诱导培养方法为：
（1）将重组大肠杆菌zjut-ho1接种于含50 μg/mL卡那霉素的LB斜面培养基，于37℃恒温培养24 h，获得斜面菌体；所述的LB斜面培养基终浓度组成为：酵母浸出粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂 20 g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4；
（2）挑取斜面菌体2环，接种到含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，于30℃、180 r/min的恒温振荡摇床培养12 h，获得种子液；所述的LB液体培养基终浓度组成为：酵母浸出粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4；
（3）按体积浓度3%的接种量，将步骤（2）种子液接种至含50 μg/mL卡那霉素的甘油培养基，37℃、180 r/min培养至菌浓OD600=0.8±0.3时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，30℃、100 r/min培养至OD600=1.40~1.65，获得培养液；所述的甘油培养基终浓度组成为：甘油20g/L，酵母浸出粉20 g/L，(NH4)2SO4 5 g/L，NaCl5 g/L，Na2HPO4 15 g/L，KH2PO4 3 g/L，MgSO40.5 g/L，溶剂为去离子水，pH自然。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述氯化血红素以2 g/L氯化血红素水溶液的形式加入，所述2 g/L氯化血红素水溶液的配制方法为：100 mg氯化血红素微热溶解50 mL质量浓度0.25% Na2CO3水溶液，即得2 g/L的氯化血红素水溶液。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液经1000 g离心10 min，收集菌体，菌体用等同反应体系体积的酸性甲醇悬浮，于40℃、100 KHz、200 W条件下超声30 min，1000 g离心5 min，收集上清液；上清液于45℃下减压蒸干后，加入原反应体系1/4～1/5体积的酸性甲醇溶解残留物，用滤纸过滤后，于45℃下减压干燥，即得胆绿素；所述的酸性甲醇是在体积浓度95%甲醇水溶液中，加入1/1000体积比的质量浓度36%浓盐酸制成。
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