CN103865965A

CN103865965A - 一种多基因组合表达制备藻类红色素的方法及应用

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Publication number: CN103865965A
Application number: CN201410110997.6A
Authority: CN
Inventors: 葛保胜; 王祥法; 黄方; 李�杰
Original assignee: China University of Petroleum East China
Current assignee: China University of Petroleum East China
Priority date: 2014-03-25
Filing date: 2014-03-25
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2034-03-25
Also published as: CN103865965B

Abstract

本发明公开了一种多基因组合表达制备藻类红色素的方法，具体地说是一种利用多基因组合表达技术生产可应用在制备免疫荧光分析或功能食品中的藻类红色素的制备方法及其应用。具体步骤包括：由螺旋藻中克隆出藻类红色素合成关键酶基因（hox1和pebS），通过多基因组合表达技术，将两个关键酶基因导入受体细胞中，从而在受体细胞中建立藻类红色素的生物合成途径。经该两步酶促催化反应，可以利用大肠杆菌体内的血红素转化合成藻类红色素。最后经萃取、制备HPLC等纯化步骤，得纯度在95%以上的高纯度藻类红色素。本发明所得藻类红色素最大吸收波长为550nm，最大荧光发射波长为570nm。此法制备的藻类红色素藻类红色素可以作为荧光探针或色素类抗氧化剂应用于制备功能食品的有效成份中。

Description

一种多基因组合表达制备藻类红色素的方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程和食品医药领域，具体地说是一种利用多基因组合表达工程技术，具体涉及可应用在制备免疫荧光探针或功能食品中的制备藻类红色素的方法及其应用。

背景技术

藻类红色素是存在于红藻及蓝藻中的一种光合作用辅助色素。与胆红素类似，是由4个吡咯环通过甲烯基呈直链连接，分子量约为586.68g/mol。它们在体内与可溶性蛋白质结合称为藻红蛋白（phycoerythrin），溶于稀盐溶液中。它们在光合作用中起吸收及传递光能的作用。

作为胆红素的衍生物，藻类红色素目前已被证明具有抗氧化(Hirata, T., Tanaka, M., Ooike, M., Tsunomura, T., and Sakaguchi, M. Antioxidant activities of phycocyanobilin prepared from Spirulina platensis J Appl Phycol12, 2000, 435-439.)、清除羟自由基以及氧自由基、保护生物膜免受氧化伤害(Hirata, T., Tanaka, M., Ooike, M., Tsunomura, T., and Sakaguchi, M. Radical scavenging activities of phycocyanobilin prepared from a cyanobacterium, Spirulina platensis, Fisheries Sci 1999, 65, 971-974.)以及消炎(Bhat, V. B., and Madyastha, K. M. Scavenging of peroxynitrite by phycocyanin and phycocyanobilin from Spirulina platensis: protection against oxidative damage to DNA, Biochem Biophys Res Commun 2001, 285, 262-266.)等多种功效。最新研究证据发现，藻类红色素在细胞内可以被血红素还原酶还原而转化为胆红素，进而反馈抑制由氧化损伤引起的NADPH氧化酶的过量表达，对于糖尿病、Gilbert综合症等由氧化损伤引起的疾病起到很好的疗效(McCarty, M. F., Barroso-Aranda, J., and Contreras, F. NADPH oxidase mediates glucolipotoxicity-induced beta cell dysfunction--clinical implications, Med Hypotheses 2010, 74, 596-600; McCarty, M. F., Barroso-Aranda, J., and Contreras, F. Oral phycocyanobilin may diminish the pathogenicity of activated brain microglia in neurodegenerative disorders, Med Hypotheses 2010, 74, 601-605.)。美国食品医药局（FDA）已批准将藻胆蛋白（藻胆色素与脱辅基蛋白结合在一起）用于皮肤癌、乳腺癌的光敏治疗（范晓，海藻化学研究的展望，海洋科学，1996，（2）：24）。同时藻类红色素可以作为荧光探针及天然色素，在生物荧光探针检测以及功能食品制备方面具有广阔的用途(Wu, S. H., McDowell, M. T., and Lagarias, J. C. Phycocyanobilin is the natural precursor of the phytochrome chromophore in the green alga Mesotaenium caldariorum, J Biol Chem 1997, 272, 25700-25705.)。

现有的藻类红色素的提取技术主要是从红藻中天然提取。它包括一系列长周期、高成本、复杂的工艺过程。主要包括：藻细胞的培养、离心收集，藻体的破碎和藻类红色素的抽提、精制等。其中藻类红色素的分离纯化方法主要有：热甲醇裂解法和甲醇两步抽提法。热甲醇裂解法是利用热甲醇（70-75℃）缓慢打开藻类红色素和脱辅基蛋白之间的硫醚键，从而抽提得到2/3左右的自由藻类红色素。但由于天然红藻中还含有叶绿素和类胡萝卜素等多种色素，这种方法往往只能得到纯度不高的藻类红色素。而甲醇两步抽提法是先用冷乙醇抽提，去除大部分的叶绿素和类胡萝卜素，此时藻类红色素不溶于冷乙醇，然后再用热甲醇抽提，这样可以获得纯度较高（80%左右）的藻类红色素(O'Carra, P., Murphy, R. F., and Killilea, S. D. The native forms of the phycobilin chromophores of algal biliproteins. A clarification, Biochem J 1980, 187, 303-309.)。更高纯度的藻类红色素需要进一步的薄层层析或制备性高效液相色谱纯化方可得到。

目前，市场上高纯度藻类红色素价格较高（作为光敏剂高纯度藻类红色素的价格约为150-180美元/毫克），目前主要依赖于从美国进口，尚不适合作为医疗保健品广泛应用。因此开发工艺简单、成本低廉的藻类红色素规模制备技术，将为藻类红色素作为免疫荧光探针或食用色素的广泛应用奠定基础。

发明内容

本发明目的在于提供一种简便、快速、低成本的制备藻类红色素方法，及其在免疫荧光探针或功能食品等方面的应用。

实现本发明目的技术方案是：

一种多基因组合表达制备藻类红色素的方法，分别由集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803和Prochlorococcus phage P-SSM2中克隆出藻类红色素合成关键酶基因血红素氧化酶基因hox1和藻类红色素合成酶基因pebS，采用多基因组合表达方法，将该两基因克隆到适当的表达载体上，并将此构建的重组表达载体转入大肠杆菌中，以大肠杆菌自身血红素为底物，通过Hox1和PebS两步酶促催化反应，从而建立一条重组藻类红色素的生物合成途径，并获得相应的大肠杆菌重组工程菌株，应用此工程菌株生产重组藻类红色素，其制备步骤：

（1）根据Genebank中公布的集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803血红素氧化酶基因hox1和Prochlorococcus phage P-SSM2藻红素合成酶基因pebS的基因序列，设计适当引物，分别以集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803和Prochlorococcus phage P-SSM2基因组DNA为模板，采用基因工程方法，克隆藻类红色素合成关键酶基因hox1和pebS；

（2）采用多基因组合表达方法将上术步骤（1）克隆得到的藻类红色素合成关键酶基因hox1和pebS适当多基因组合表达载体上，并将此构建重组表达载体转入大肠杆菌中，从而在该大肠杆菌工程中建立一条重组藻类红色素的生物合成途径，并获得相应的大肠杆菌重组工程菌株；

（3）将上述步骤（2）所得到的大肠杆菌工程菌株在37℃培养至OD₆₀₀＝0.5~0.7菌体浓度后，降温至25℃，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂进行诱导，继续避光培养24小时，离心收集菌体；

（4）将上述步骤（3）收集到的菌体用甲醇悬浮萃取2小时，离心分离后，上清液即得藻类红色素粗提液，将藻类红色素粗提液与等体积的氯仿混合，萃取出多余的蛋白质，然后再经制备型HPLC进一步精制，得到高纯度的藻类红色素，将藻类红色素溶液冷冻干燥或旋转蒸发除去多余水分，即得高纯度藻类红色素粉末产品。

在本发明中，藻类红色素合成相关基因的获得是通过分子克隆方法分别从集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803和Prochlorococcus phage P-SSM2中克隆得到；而后将藻类红色素合成相关基因亚克隆到各种载体上，如大肠杆菌（E.coli）的pET28a、pETDuet-1，pCDFDuet-1等基因共表达载体系列，再将构建的重组表达载体导入大肠杆菌表达体系中异源表达，从而在工程菌株体内建立一条重组藻类红色素的生物合成途径，并应用该工程菌株高效生产重组藻类红色素；运用溶剂萃取和各种层析技术纯化获得高纯度藻类红色素。该重组藻类红色素可以直接用作药物、试剂、食品添加剂、保健或功能食品有效成分等。

在本发明中，利用多基因组合表达工程技术，将血红素氧化酶和藻类红色素合成酶基因导入大肠杆菌中，从而在大肠杆菌体内建立一条重组藻类红色素的生物合成途径。通过该两基因的组合表达，以大肠杆菌中血红素为底物，通过两步酶促催化反应，利用重组工程菌株生产重组藻类红色素。

在本发明中，血红素氧化酶基因（hox1）是指与Synechocystis sp. PCC 6803中sll1184基因同源的基因；藻类红色素合成酶基因（pebS）是指与Prochlorococcus phage P-SSM2中YP_214290.1基因同源的基因。

在本发明中，应用多基因组合表达工程方法，在hox1基因两端分别加上BamH I和Sac I酶切位点，并插入到pET28a、pETDuet-1，pCDFDuet-1质粒的第一个多克隆位点处，得到重组载体pET28a-hox1、pETDuet-hox1、pCDFDuet- hox1。在基因pebS两端分别加上NdeⅠ和Xho I酶切位点，并插入到pET28a-hox1、pETDuet-hox1、pCDFDuet- hox1的另一个多克隆位点处，得到重组载体pET28a-hox1-pebS、pETDuet-hox1-pebS、pCDFDuet- hox1-pebS 。

在本发明中，根据Genebank中所公布的hox1和pebS基因序列设计引物。hox1的正向引物P1：5’-TAGGATCCTATGAGTGTCAACTTAGCTTCCCAG-3’，反向引物P2: 5’-TTGAGCTCCTAGCCTTCGGAGGTGGCGAG-3’。pebS的正向引物P3：5’-TTCATATGATGACGAAGAACCCGCG-3’，反向引物P4: 5’-TGCTCGAGTTACTTGTAGGAGAACAG-3’。

在本发明中，酶促催化反应为血红素经Hox1作用得到胆绿素，再经Pebs作用得到藻类红色素。

在本发明中，将萃取分离后的藻红素粗制品，用甲醇溶解后，采用waters制备型液相色谱分离，分离柱为C-18反相色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）。流动相采用95%乙腈/超纯水进行梯度洗脱。流动相A为H₂O（含0.1%三氟乙酸），流动相B为95%乙腈/超纯水（含0.1%的三氟乙酸）。收集洗脱峰（洗脱时间为18.35min，乙腈浓度为56%-58%），从而得到高纯度的藻类红色素。经分析型HPLC分析检测知，其纯度为大于95%。而普通采用溶剂萃取法从螺旋藻中萃取获得的藻类红色素纯度只有75%-80%左右。

在本发明中重组藻类红色素最大吸收波长为550nm，最大荧光发射波长为570nm，可应用在制备免疫荧光探针或色素类功能食品的有效成份中。

本发明具有如下优点：

1．本发明为运用多基因组合表达工程技术，将藻类红色素合成关键酶基因导入大肠杆菌表达体系中，在受体细胞体内建立一条藻红蛋白生物合成途径，以大肠杆菌自身血红素为底物，通过两步酶促催化反应生产藻类红色素（制备流程见图2）。这一生产过程避免了藻类养殖这一长周期过程，同时大肠杆菌易于实现高密度规模培养，从而大大降低生产成本。

2．与藻类相比，大肠杆菌细胞不含有叶绿素、类胡萝卜素等其他光合色素，使得下游纯化过程变得更加简单，容易获得低成本、高纯度的藻类红色素。

3．本发明直接表达藻类红色素色基，不含有脱辅基藻红蛋白，因此不涉及色基与蛋白间硫醚键的断裂问题，所以更容易获得结构单一、性质稳定的藻类红色素，可以建立统一质量标准，适于大规模制备及应用。

附图说明

图1 本发明由血红素制备藻类红色素反应过程。

图2 本发明的藻类红色素制备流程。

图3为本发明表达藻类红色素重组载体pETDuet-hox1-pebS的构建图。

图4为本发明表达藻类红色素重组载体pET28a-hox1-pebS的构建图。

图5 高纯度的藻类红色素HLPC谱。

图6 纯化后的藻类红色素分析HLPC谱，纯度达到95%。

图7纯化后的藻类红色素呈现鲜亮的橙红色。

图8纯化后的藻类红色素在550nm有最大吸收峰。

图9纯化后的藻类红色素在PBS溶液条件下，经510nm激发，分别在570nm和620nm处有最大发射峰。

具体实施方式

下面结合附图及实施例进一步描述本发明，但并不限制本发明的保护范围。

重组藻类红色素的制备方法：由藻类中克隆出藻类红色素合成关键酶基因（hox1和pebS），将hox1和pebS基因克隆到适当表达载体上，而后将重组表达载体导入大肠杆菌表达体系中，利用多基因组合表达工程技术，进行表达生产重组藻类红色素。最终经菌体收集、氯仿萃取和制备型HPLC层析技术，获得红色洗脱液，即得以上所述的重组藻类红色素。所述重组藻类红色素为红色化合物，溶于稀盐溶液，分子量约为586.68g/mol。

实施例1

（1）根据Genebank中公布的集胞藻6803（Synechocystis sp. PCC 6803）血红素氧化酶基因（hox1）和Prochlorococcus phage P-SSM2藻红素合成酶基因（pebS）的基因序列，设计适当引物，分别以集胞藻6803（Synechocystis sp. PCC 6803）和Prochlorococcus phage P-SSM2基因组DNA为模板，采用基因工程方法，克隆藻类红色素合成关键酶基因hox1和pebS。藻类红色素合成关键酶基因hox1和pebS在Genebank中的编号分别为sll1184和YP_214290.1。

（2）应用多基因组合表达工程方法，在hox1基因两端分别加上BamH I和Sac I酶切位点，并插入到pETDuet-1质粒的第一个多克隆位点处，得到重组载体pETDuet-hox1。在基因pebS两端分别加上NdeⅠ和Xho I酶切位点，并克隆到pETDuet-hox1的另一个多克隆位点处（如图1所示），得到重组载体pETDuet-hox1-pebS（如图3所示）。具体操作方法如下：

根据Genebank中所公布的hox1和pebS基因序列设计引物。hox1的正向引物P1：5’-TAGGATCCTATGAGTGTCAACTTAGCTTCCCAG-3’，反向引物P2: 5’-TTGAGCTCCTAGCCTTCGGAGGTGGCGAG-3’。pebS的正向引物P3：5’-TTCATATGATGACGAAGAACCCGCG-3’，反向引物P4: 5’-TGCTCGAGTTACTTGTAGGAGAACAG-3’。分别以Synechocystis sp. PCC 6803和Prochlorococcus phage P-SSM2基因组DNA作为PCR反应扩增模板。经PCR扩增得到所需基因片段。PCR产物经Cycle pure试剂盒（Omega公司）纯化回收。首先，将所得hox1基因片段与pETDuet-1载体分别用相应适当的核酸内切酶37℃消化6h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，从胶上回收，基因片段与载体3：1混合，在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α。利用含相应抗生素的LB平板筛选，挑取阳性克隆，利用PCR和DNA测序进行验证，得到重组表达载体pETDuet-hox1。经测序验证后，将pebS与pETDuet-hox1质粒再用另两种限制性内切酶消化后，酶切产物与上述同样步骤从胶上回收，连接，既得重组载体pETDuet-hox1-pebS。经进一步测序验证后，用碱变性法提取出构建好的表达质粒pETDuet-hox1-pebS，转化感受态大肠杆菌 BL21（DE3），得到能在T₇启动子驱动下高效表达活性藻类红色素的大肠杆菌菌株P1。

实施例2

从LB固体（含1.5%琼脂的LB培养基）平板上挑取基因工程菌菌株P1单菌落于5mL含100 μμg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，在恒温振荡培养箱中培养（温度：37℃，转速：200r/min左右）。将过夜培养物以1：100的比例接种于1L的TB培养基（含氨苄青霉素100 μg/mL）中。在恒温振荡培养箱中以温度37℃、转速200r/min的培养条件下培养至OD₆₀₀＝0.5~0.7时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，Isopropyl-β-D- thiogalactopyranoside）至终浓度为0.5mmol/L进行诱导。加入诱导剂后，在温度30℃、转速200r/min的培养条件继续培养24h后停止。

将上述培养液10,000g，离心10min收集菌体。将收集的菌体经1×PBS洗涤2次后，将菌体重悬于甲醇溶液中，60℃萃取2小时。然后于4℃以12,000g离心30min，上清液用0.45μm硝酸纤维素膜过滤后，加入等体积的氯仿，颠倒均匀1h。取下层红色溶液，经旋转蒸发蒸干溶剂后，既得藻红素粗制品。

将上述藻红素粗制品，用甲醇溶解后，采用waters制备型液相色谱分离，分离柱为C-18反相色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）。流动相A为H₂O（含0.1%三氟乙酸），流动相B为95%乙腈/超纯水（含0.1%的三氟乙酸），按照下表1进行梯度洗脱。收集洗脱峰（洗脱时间为18.35min，乙腈浓度为56%-58%），从而得到高纯度的藻类红色素（图5）。经分析型HPLC分析检测知，其纯度为大于95%（图6）。而普通采用溶剂萃取法从螺旋藻中萃取获得的藻类红色素纯度只有75%-80%左右。

表1 制备型高效液相的梯度洗脱

时间/min	流动相A/%	流动相B/%
			0	100	0
5	100	0
			8	80	20
40	30	70
			50	0	100
55	0	100
			56	100	0

实施例3

根据Genebank中所公布的hox1和pebS基因序列设计引物。hox1的正向引物P1：5’-TACATATGTATGAGTGTCAACTTAGCTTCCCAG-3’，反向引物P2: 5’-TTGATATCCTAGCCTTCGGAGGTGGCGAG-3’。pebS的正向引物P3：5’-TTGATATCATGACGAAGAACCCGCG-3’，反向引物P4: 5’-TGCTCGAGTTACTTGTAGGAGAACAG-3’。分别以Synechocystis sp. PCC 6803和Prochlorococcus phage P-SSM2基因组DNA作为PCR反应扩增模板。经PCR扩增得到所需基因片段。PCR产物经Cycle pure试剂盒（Omega公司）纯化。首先，将所得hox1基因片段与pET28a载体分别用相应适当的核酸内切酶37℃消化6h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，从胶上回收，基因片段与载体3：1混合，在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α。利用含相应抗生素的LB平板筛选，挑取阳性克隆，利用PCR和DNA测序进行验证，得到重组表达载体pET28a-hox1。经测序验证后，将pebS与pET28a-hox1质粒再用另两种限制性内切酶消化后，酶切产物与上述同样步骤从胶上回收，连接，既得重组载体pET28a-hox1-pebS（见附图4）。经进一步测序验证后，用碱变性法提取出构建好的表达质粒pET28a-hox1-pebS，转化感受态大肠杆菌 BL21（DE3），得到能在T₇启动子驱动下高效表达活性藻类红色素的大肠杆菌菌株P2。

实施例4

从LB固体（含1.5%琼脂的LB培养基）平板上挑取基因工程菌菌株P2单菌落于5mL含50 μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，在恒温振荡培养箱中培养（温度：37℃，转速：200r/min左右）。将过夜培养物以1：100的比例接种于1L的TB培养基（含卡那霉素50 μg/mL）中。在恒温振荡培养箱中以温度37℃、转速200r/min的培养条件下培养至OD₆₀₀＝0.5~0.7时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，Isopropyl-β-D- thiogalactopyranoside）至终浓度为0.5mmol/L进行诱导。加入诱导剂后，在温度30℃、转速200r/min的培养条件继续培养24h后停止。将上述培养液10,000g，离心10min收集菌体。藻类红色素的提取方法同实施例2。

实施例5 藻类红色素的紫外-可见吸收光谱及荧光发射光谱及其作为天然色素及抗氧化剂方面的应用

纯化后的藻类红色素呈现鲜亮的橙红色（图7），在550nm处有较强的吸收值（如图8），溶液呈橙红色。在PBS溶液条件下，经510nm激发，分别在570nm和620nm处有最大发射峰（图9）。藻胆蛋白及其色素已被美国医药监督管理局批准为药物用于保健及光动力治疗等方面，所以其安全性也得到了验证。因此，藻类红色素可以作为天然色素及抗氧化剂，加入到食品（如面条、面包、冰激淋等）或饮料（含藻类红色素的矿泉水、运动饮料、保健饮料等）中，从而增加产品的色泽及保健功能。

从上述实施例可以看出，利用基因工程技术，通过基因工程菌株发酵生产重组藻类红色素是本发明的基本特点。另外本方法不涉及占地广、周期长的藻类原料的培养问题，直接生产藻类红色素；不涉及藻类红色素与脱辅基蛋白的断裂问题，更容易获得高纯度、低成本的藻类红色素。该方法生产的重组藻类红色素具有优良的荧光特性，可用于制备免疫荧光探针或功能食品、食品添加剂、试剂等用途。

Claims

1. 一种多基因组合表达制备藻类红色素的方法，分别由集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803和Prochlorococcus phage P-SSM2中克隆出藻类红色素合成关键酶基因（血红素氧化酶基因hox1和藻类红色素藻类红色素合成酶基因pebS），采用多基因组合表达方法，将该两基因导入大肠杆菌中，以大肠杆菌自身血红素为底物，通过Hox1和PebS两步酶促催化反应，在受体细胞中建立重组藻类红色素的生物合成途径，从而获得相应的大肠杆菌重组工程菌株，并应用此工程菌株生产重组藻类红色素，其制备步骤：

（1）根据Genebank中公布的集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803血红素氧化酶基因hox1和Prochlorococcus phage P-SSM2藻红素合成酶基因pebS的基因序列，设计适当引物，分别以集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803和Prochlorococcus phage P-SSM2基因组DNA为模板，采用基因工程方法，克隆藻类红色素合成关键酶基因hox1和pebS；

（2）采用多基因组合表达方法将上述步骤（1）克隆得到的藻类红色素合成关键酶基因hox1和pebS重组到适当表达载体上，并将此构建重组表达载体转入大肠杆菌中，得到大肠杆茵工程茵株；

（3）将上述步骤（2）所得到的大肠杆菌工程菌株在37℃培养至OD₆₀₀＝0.5~0.7菌体浓度后，降温至25℃，利用IPTG作为诱导剂进行诱导，继续避光培养24小时，离心收集菌体；

2. 根据权利要求1所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述的血红素氧化酶基因hox1是指与Synechocystis sp. PCC 6803中sll1184基因同源的基因；藻类红色素合成酶基因pebS是指与Prochlorococcus phage P-SSM2中YP_214290.1基因同源的基因。

3. 根据权利要求1所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述的表达载体是大肠杆菌E. coli的pET28a、pETDuet-1，pCDFDuet-1等多基因共表达载体系列。

4. 根据权利要求1所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述的设计适当引物是根据Genebank中所公布的hox1和pebS基因序列设计引物，hox1的正向引物P1：5’-TAGGATCCTATGAGTGTCAACTTAGCTTCCCAG-3’，反向引物P2: 5’-TTGAGCTCCTAGCCTTCGGAGGTGGCGAG-3’；pebS的正向引物P3：5’-TTCATATGATGACGAAGAACCCGCG-3’，反向引物P4: 5’-TGCTCGAGTTACTTGTAGGAGAACAG-3’。

5. 根据权利要求1所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述的多基因组合表达方法是指多基因组合表达工程方法，在hox1基因两端分别加上BamH I和Sac I酶切位点，并插入到pET28a、pETDuet-1、pCDFDuet-1质粒的第一个多克隆位点处，得到重组载体；在基因pebS两端分别加上NdeⅠ和Xho I酶切位点，并插入到pET28a-hox1、pETDuet-hox1、pCDFDuet- hox1质粒的另一个多克隆位点处，得到重组载体。

6. 根据权利要求1所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述的酶促催化反应为血红素经Hox1作用得到胆绿素，再经Pebs作用得到藻类红色素，

。

7. 根据权利要求1所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述的制备型HPLC进一步精制是指将萃取分离后的藻类红色素粗制品，用甲醇溶解后，采用waters制备型液相色谱分离，分离柱为C-18反相色谱柱，流动相采用95%乙腈/超纯水进行梯度洗脱，收集洗脱峰时物质，从而得到高纯度的藻类红色素。

8. 根据权利要求1所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述的重组藻类红色素最大吸收波长为550nm，最大荧光发射波长为570nm。

9. 根据权利要求7所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述制备型HPLC流动相A为H₂O，其中含0.1%三氟乙酸；流动相B为95%乙腈/超纯水，其中含0.1%的三氟乙酸；收集洗脱峰时物质是指收集洗脱时间为18.35min，乙腈浓度为56%-58%时洗脱液，从而得到高纯度的藻类红色素。

10. 权利要求1-9任一方法制备的藻类红色素，可应用在制备免疫荧光探针或色素类功能食品的有效成份中。