CN114181920B

CN114181920B - 荚膜红细菌5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及应用

Info

Publication number: CN114181920B
Application number: CN202210140409.8A
Authority: CN
Inventors: 王智文; 姜玫如; 何桂美; 孙曦; 崔真真; 陈涛
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2022-02-16
Filing date: 2022-02-16
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2042-02-16
Also published as: CN114181920A

Abstract

本发明提供了一种荚膜红细菌5‑氨基乙酰丙酸合成酶突变体及应用，荚膜红细菌5‑氨基乙酰丙酸合成酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的荚膜红细菌5‑氨基乙酰丙酸合成酶突变体与野生型的荚膜红细菌5‑氨基乙酰丙酸合成酶相比，在宿主细胞中对5‑氨基乙酰丙酸产量提升约22%；在20μM血红素存在下，突变型5‑氨基乙酰丙酸合成酶C201A能够保持较高的相对酶活。

Description

荚膜红细菌5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术与应用领域，具体地涉及一种荚膜红细菌（Rhodopseudomonas palustris）5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及及应用。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA），是生物体内合成维生素B₁₂、血红素、叶绿素等四吡咯类化合物的重要前体，广泛存在于微生物和动植物细胞中。由于其绿色无毒、易降解且无残留的特性，作为光动力学药物、生物可降解除草剂、植物生长调节剂以及饲料添加剂等在医药以及农业等领域得到广泛应用。此外，面对2019新型冠状病毒（COVID-19）对全球健康和生命安全产生的重大威胁，5-ALA在预防以及治疗COVID-19感染中显示出极大的应用潜力（[1] Bando H. Some measures for COVID-19 including deepultraviolet light-emitting diode (DUV-LED), Gc protein-derived macrophage-activating factor (Gcmaf), and 5-aminolevulinic acid (5-ALA)[J].AsploroJournal of Biomedical and Clinical Case Reports, 2021 Jun 30;4(2):110-13.[2]Ngwe Tun, MM, Sakura, T, Sakurai, Y et al. Antiviral activity of 5-aminolevulinic acid against variants of severe acute respiratory syndromecoronavirus 2[J]. Tropical Medicine and Health, 2022, 50: 6.）体外和临床研究表明，5-ALA与柠檬酸亚铁钠联合使用可抑制COVID-19致病因子SARS-CoV-2的感染（[3]Negoroa H, Chatziantoniob C and Razzaque MS. Therapeutic potential of 5-aminolevulinic acid and sodium-ferrous citrate for viral insults: relevanceto the COVID-19 crisis[J].Expert Review of Anti-infective Therapy, 2021, 1-5.），

缓解新型冠状病毒感染造成的严重急性呼吸综合征，有利于提高细胞中血红素加氧酶-1含量而预防感染（[4] Kaketani K and Nakajima M. Case Reports: Safety,tolerability, and efficacy of 5-aminolevulinic acid phosphate, an inducer ofheme oxygenase 1, in combination with sodium ferrous citrate for thetreatment of COVID-19 patients[J].The Open COVID Journal, 2021, 1: 52-61.），有望作为COVID-19的治疗药物进行深入研究（[5] Sakurai Y, Ngwe Tun MM, Kurosaki Y,et al. 5-amino levulinic acid inhibits SARS-CoV-2 infection in vitro[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2021, 545: 203-207.）。目前5-ALA的大规模生产主要以化学法为主，但是合成过程中存在的高成本、高污染和低得率等问题大大限制了其大规模生产与应用。鉴于此，微生物合成法应运而生，并随着合成生物学，特别是代谢工程手段的兴起，5-ALA的生物法生产工艺得到了进一步提高。

自然界中微生物合成5-ALA的主要途径有两条，分别为C4途径和C5途径。C4途径由两种前体物质—甘氨酸和琥珀酰辅酶A在依赖于磷酸吡哆醛（PLP）的5-氨基乙酰丙酸合成酶（5-aminolevuLinate synthase，ALAS）的催化下生成5-ALA，继而通过下游血红素途径生成血红素等卟啉物质。5-ALA合成酶作为C4途径中的关键酶，其活性直接影响5-ALA的产量。但是，当5-ALA积累到一定程度后，下游途径生成的血红素会对ALAS产生反馈抑制作用，从而影响5-ALA的合成。Tan等人（[6] Tan ZJ, Zhao J, Chen, JZ, et al. Enhancingthermostability and removing hemin inhibition of Rhodopseudomonas palustris5-aminolevulinic acid synthase by computer-aided rational design[J].Biotechnology Letters, 2019, 41(1): 181-191.）

发现，在10 μM血红素存在条件下，来源于Rhodopseudomonas palustris的野生型ALAS酶活降低至27%，而突变型H29R、H15K酶活分别保持在64%、76%，说明该突变酶能够一定程度上解除血红素反馈抑制作用。但是随着5-ALA产量的提升，对血红素耐受浓度也有了更高的要求，因此发掘能够在更高血红素浓度下解除血红素反馈抑制作用的5-氨基乙酰丙酸合成酶显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种荚膜红细菌5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体。

本发明的第二个目的是提供一种编码上述合成酶突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供一种包含上述基因的表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种包含上述表达载体的宿主细胞。

本发明的第五个目的是提供上述宿主细胞发酵生产5-氨基乙酰丙酸的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种荚膜红细菌5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体，所述合成酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码上述合成酶突变体的基因，上述基因的核苷酸序列优选：SEQ ID NO.2所示。

包含上述基因的表达载体。

包含上述表达载体的宿主细胞。

上述宿主细胞发酵生产5-氨基乙酰丙酸的应用。

本发明的优点：

本发明的荚膜红细菌5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体与野生型的荚膜红细菌5-氨基乙酰丙酸合成酶相比，在宿主细胞中对5-氨基乙酰丙酸产量提升约22%；在20 μM血红素存在下，突变型5-氨基乙酰丙酸合成酶C201A能够保持较高的相对酶活。

附图说明

图1为野生型的荚膜红细菌5-氨基乙酰丙酸合成酶（HemA_RC）及荚膜红细菌5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体(HemA_RC ^C201A）在不同血红素浓度下剩余酶活百分比。

具体实施方式

术语定义

宿主细胞

本文所用的术语“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即能够产生本发明5-ALA合成酶的宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要本发明的5-ALA合成酶能在该宿主细胞中表达。

例如，适用于本发明的宿主细胞来自(但不限于)大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、荚膜红细菌(Rhodopseudomonas capsulatusla)、沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonaspalustris）和希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）等。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。

本实施例中涉及到的表达质粒pXMJ19和pET28a购买于BioVector NTCC公司（http://www.biovector.net/）。

本发明所用的DNA聚合酶、限制性核酸内切酶和DNA连接酶均来自Thermo FisherFermentas；酵母浸粉、胰蛋白胨、葡萄糖、甘氨酸、抗生素等购自上海生工生物工程有限公司；MOPS购自天津所罗门公司；5-氨基乙酰丙酸盐、血红素等购自Sigma公司；冰乙酸、对二甲氨基苯甲醛等购自天津市大茂化学试剂厂；

质粒提取试剂盒购自康宁生命科学有限公司，琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒和纯化试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司，相关操作均严格按照说明书执行。

质粒构建测序验证由金唯智公司完成；

E.coli DH5α感受态细胞、E.coli BL21感受态细胞通过常规CaCl₂法制备；

LB液体培养基：酵母浸粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，LB固体培养基中添加2%的琼脂粉。

CGIII培养基：酵母浸粉10g/L，胰蛋白胨10g/L，MOPS 21g/L，NaCl 2.5g/L，用5M的NaOH水溶液调节pH=7。

BHI液体培养基：脑心浸液肉汤粉74g/L。BHIS固体培养基中添加2%的琼脂粉。

抗生素浓度为：卡那霉素40μg/mL，氯霉素10μg/mL。

5-ALA的检测方法：取250μL的5-氨基乙酰丙酸标准品溶液（终浓度为1、2、4、6、8mg/L）或稀释的发酵液或酶活力测定反应终止后的反应液，加入125μL pH=4.6的乙酸钠缓冲液，然后加入62.5μL的乙酰丙酮，100℃金属浴温浴15min，冷却至室温后加入440μL现配的Modified Ehrlich's reagent试剂(0.2g对二甲氨基苯甲醛，1mL冰乙酸，1mL高氯酸，冰乙酸定容到10mL)混匀，室温反应20min后测反应液在554nm波长下的吸光值。利用测定5-氨基乙酰丙酸标准品得到的标准曲线计算发酵液或者酶活力测定反应终止后的反应液中的5-ALA含量。

实施例1. 荚膜红细菌5-ALA合成酶突变体的构建

选择KEGG数据库中荚膜红细菌(R. capsulatusla SB1003)来源的hemA基因为模板，根据宿主细胞谷氨酸棒杆菌的密码子偏爱性进行密码子优化，并在金唯智公司合成如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列。以该序列为模板，分别以SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.5，SEQ IDNO.6/SEQ ID NO.4为上、下游引物扩增得到片段1及片段2，再以SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4为引物对片段1及片段2进行融合PCR扩增，得到基因hemA第201位的半胱氨酸(C)突变为丙氨酸(A)的PCR片段记作片段3，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示（该基因编码如SEQ IDNO.1所示的5-ALA合成酶突变体）。以SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4为引物对SEQ ID NO.9所示核苷酸序列进行PCR扩增，得到片段4。

PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各2μL，dNTP 1μL，phanta Buffer 25μL，灭菌的双蒸水17μL，DNA聚合酶1μL，总体积50μL。

PCR反应条件为：95℃ 3min，30个循环(95℃ 20s, 58℃ 20s, 72℃ 1min)，72℃10min，4℃ 10min。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行回收和纯化。

利用基本载体pET28a构建质粒，分别以限制性内切酶HindIII/XbaI对片段3、片段4及质粒载体pET28a进行双酶切，将酶切后的片段及质粒分别进行连接，由金唯智公司测序无误后，最终得到质粒pET28a-RC及突变体质粒pET28a-RC-C201A。

表1 菌株构建所用引物序列

引物名称	引物序列（5’-3’）
		pET28a-RC-1（SEQ ID NO.3）	GGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGACTACAATCTGG
pET28a-RC-2（SEQ ID NO.4）	GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATGCGCAACGTGCCCACAG
		pET28a-201-1（SEQ ID NO.5）	GGCCCTATCAAGGAGATTGCAGATATCGCCGATGAG
pET28a-201-2（SEQ ID NO.6）	CGAACTCATCGGCGATATCTGCAATCTCCTTGATAG
		pX-RC-1（SEQ ID NO.7）	CTGAGAAGCTTAAAGGAGGACAACCATGGACTAC
pX-RC-2（SEQ ID NO.8）	CTACGTCTAGATTATGCGCAACGTGCCCACAGCAGATCCATG

实施例2. 荚膜红细菌5-ALA合成酶突变体酶学性质的检测

分别将野生型质粒pET28a-RC和突变体质粒pET28a-RC-C201A转化到E.coliBL21，获得菌株BL21-pET28a-RC、BL21-pET28a-RC-C201A。

（1）菌体培养：将上述重组单菌落分别接种于5mL含有40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h。转接到5mL含有40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，待种子长浓后，转接到装有200mL含40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基的1L三角瓶中，待OD₆₀₀到0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度为16℃，诱导时间约为14h，4500rpm离心，去上清，收集菌体。

（2）蛋白纯化：

Binding buffer A : 25mM Tris，150mM NaCl，20mM咪唑, pH为7.5（buffer中添加1mM的DTT，现用现加）；Elution buffer B : 25mM Tris，150mM NaCl，500mM咪唑，pH为7.5（buffer中添加1mM的DTT现用现加）。

菌体用适量的buffer A悬浮（buffer A添加量一般是400mL的发酵液后离心的菌利用20mL的bufferA悬浮），转移到50mL离心管中，放置于冰上。

高压均质机（压力800-1000bar）破碎3-4次，破碎后4℃、4500rpm离心40min。

利用重力柱纯化蛋白：平衡柱子后，加入镍填料后，利用双蒸水冲柱子三次，再利用的BufferA冲柱子三次，下面接离心管，然后上样。上样完成后，用不同浓度的咪唑进行洗脱，收集流出液。

蛋白洗脱后，首先利用BufferB冲柱子，然后换成BufferA冲，最后用体积浓度为20%的乙醇水溶液保存柱子。

咪唑的去除和蛋白的浓缩：通过超滤管浓缩的方法去除咪唑。选择孔径为10kD的超滤管，将全部的蛋白洗脱液倒入超滤管中，不断添加50mM的Tris-HCl缓冲液，在4℃条件下，4500rpm或者4000rpm离心去除咪唑，最后得到浓缩后的蛋白，置于-80 ℃冰箱冷冻保存。

（3）蛋白浓度的测定：蛋白浓度测定参照说明书，使用Thermo Scientific公司的BCA蛋白定量试剂盒完成。

（4）酶活力的测定：酶反应体系中反应液各组分浓度如表2所示，37℃水浴中反应10min后向体系中加入60μL的10％三氯乙酸溶液终止反应。之后检测酶反应体系中5-ALA的生成量。酶活力单位U定义为：37℃时，每分钟内产生1nmol 5-ALA所需的酶量。

表2酶活反应体系

反应体系组分名称	所需体积（μL）	终浓度
			1M Glycine	20	0.1M
1M MgCl<sub>2</sub>	2	10mM
			1M Tris-HCl（pH=7.5）	2.08	50mM
10mM PLP	5.4	0.27mM
			8mM succinyl-CoA	5	0.2mM
5-ALA合成酶(2 mg/mL)	5	50 μg/mL
			50mM Tris-HCl	定容反应体系到200μL	50mM

按上述方法所测得酶活参数如表3所示。其中HemA_RC表示来源于R. capsulatusla的野生型5-氨基乙酰丙酸合成酶，HemA_RC ^C201A表示来源于R. capsulatusla的突变型5-氨基乙酰丙酸合成酶C201A。可以看出，HemA_RC ^C201A酶活较野生型提升约6.9%。

表35-氨基乙酰丙酸合成比活力

ALAS	酶活性 (U/mg protein)
		HemA<sub>RC</sub>	129.70 ± 0.97
HemA<sub>RC</sub><sup>C201A</sup>	138.64 ± 1.35

（5）解除血红素反馈抑制能力的测定：在HemA_RC及HemA_RC ^C201A反应体系中加入终浓度为15μM、20μM的血红素，并按照上述测定方法测定得到此时剩余的酶活力是没有血红素添加时的酶活力的百分比，结果如图1所示。以未添加血红素时两菌株中的ALAS酶活为100%，在分别添加15、20 μM血红素后，野生型荚膜红细菌ALAS酶活分别降至73.2、54.9%，荚膜红细菌5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体HemA_RC ^C201A酶活分别降至81.9、78.3%。在20 μM血红素浓度下，突变后的荚膜红细菌ALASHemA_RC ^C201A仍能够保持75%以上的酶活，较野生型提高24.4%，在一定程度上解除了血红素对ALAS酶活的反馈抑制作用，为高产5-ALA提供了基础。

实施例3.荚膜红细菌5-ALA合成酶突变体在谷氨酸棒杆菌中对5-ALA合成的影响

分别以质粒pET28a-RC及pET28a-RC-C201A为模板，以SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8为上、下游引物，进行PCR扩增，分别得到片段5及片段6。分别以限制性内切酶HindIII/XbaI对片段5、片段6及质粒载体pXMJ19（商品）进行双酶切，将酶切后的片段及质粒分别进行连接，测序无误后最终分别得到质粒pX-RC、pX-RC-C201A。将构建好的质粒分别电转导入到实验室前期所构的谷氨酸棒杆菌工程菌株CB8（谷氨酸棒杆菌CB8的来源详见中国专利CN106636171 A，发明名称为：生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株构建）中，经PCR验证并送测后分别得到菌株CGC1、CGC2。

将上述重组菌单菌落分别接种5mL含有10 μg/mL氯霉素的BHI液体培养基，30℃，220rpm培养12h，接着按照1%的接种量转接二级种子于含有50mLCGIII培养基的500mL三角瓶中。12h后，按照初始OD₆₀₀=0.5接种于有50 mL CGIII培养基的500 mL三角瓶中。添加终浓度10 μg/mL氯霉素和10 g/L葡萄糖，于30 ℃，220 rpm的摇床中培养。培养到5小时，添加7.5 g/L的甘氨酸及IPTG。诱导培养约48h左右收集发酵液，检测5-ALA的浓度。重组菌摇瓶发酵结果见表4。突变后的荚膜红细菌5-ALA合成酶使得宿主菌株5-ALA产量得到提升。

表4荚膜红细菌5-ALA合成酶突变体对5-ALA合成的影响

菌株	5-ALA相对产量
		CGC1	1
CGC2	1.22

在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> 荚膜红细菌5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 401

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Tyr Asn Leu Ala Leu Asp Lys Ala Ile Gln Lys Leu His Asp

1 5 10 15

Glu Gly Arg Tyr Arg Thr Phe Ile Asp Ile Glu Arg Glu Lys Gly Ala

20 25 30

Phe Pro Lys Ala Gln Trp Asn Arg Pro Asp Gly Gly Lys Gln Asp Ile

35 40 45

Thr Val Trp Cys Gly Asn Asp Tyr Leu Gly Met Gly Gln His Pro Val

50 55 60

Val Leu Ala Ala Met His Glu Ala Leu Glu Ala Val Gly Ala Gly Ser

65 70 75 80

Gly Gly Thr Arg Asn Ile Ser Gly Thr Thr Ala Tyr His Arg Arg Leu

85 90 95

Glu Ala Glu Ile Ala Asp Leu His Gly Lys Glu Ala Ala Leu Val Phe

100 105 110

Ser Ser Ala Tyr Ile Ala Asn Asp Ala Thr Leu Ser Thr Leu Arg Leu

115 120 125

Leu Phe Pro Gly Leu Ile Ile Tyr Ser Asp Ser Leu Asn His Ala Ser

130 135 140

Met Ile Glu Gly Ile Lys Arg Asn Ala Gly Pro Lys Arg Ile Phe Arg

145 150 155 160

His Asn Asp Val Ala His Leu Arg Glu Leu Ile Ala Ala Asp Asp Pro

165 170 175

Ala Ala Pro Lys Leu Ile Ala Phe Glu Ser Val Tyr Ser Met Asp Gly

180 185 190

Asp Phe Gly Pro Ile Lys Glu Ile Ala Asp Ile Ala Asp Glu Phe Gly

195 200 205

Ala Leu Thr Tyr Ile Asp Glu Val His Ala Val Gly Met Tyr Gly Pro

210 215 220

Arg Gly Ala Gly Val Ala Glu Arg Asp Gly Leu Met His Arg Ile Asp

225 230 235 240

Ile Phe Asn Gly Thr Leu Ala Lys Ala Tyr Gly Val Phe Gly Gly Tyr

245 250 255

Ile Ala Ala Ser Ala Lys Met Val Asp Ala Val Arg Ser Tyr Ala Pro

260 265 270

Gly Phe Ile Phe Ser Thr Ser Leu Pro Pro Ala Ile Ala Ala Gly Ala

275 280 285

Gln Ala Ser Ile Ala Phe Leu Lys Thr Ala Glu Gly Gln Lys Leu Arg

290 295 300

Asp Ala Gln Gln Met His Ala Lys Val Leu Lys Met Arg Leu Lys Ala

305 310 315 320

Leu Gly Met Pro Ile Ile Asp His Gly Ser His Ile Val Pro Val Val

325 330 335

Ile Gly Asp Pro Val His Thr Lys Ala Val Ser Asp Met Leu Leu Ser

340 345 350

Asp Tyr Gly Val Tyr Val Gln Pro Ile Asn Phe Pro Thr Val Pro Arg

355 360 365

Gly Thr Glu Arg Leu Arg Phe Thr Pro Ser Pro Val His Asp Leu Lys

370 375 380

Gln Ile Asp Gly Leu Val His Ala Met Asp Leu Leu Trp Ala Arg Cys

385 390 395 400

Ala

<210> 2

<211> 1206

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggactaca atctggcact ggacaaggca atccaaaagc tccacgatga aggccgctat 60

cgcaccttca tcgacatcga gcgcgagaag ggcgcattcc caaaggcaca gtggaaccgc 120

ccagatggcg gtaagcaaga tattaccgtc tggtgcggca atgactacct cggcatgggc 180

caacacccag tggtgctcgc agccatgcac gaagcactcg aagcagtggg tgccggctct 240

ggtggcaccc gcaacatctc tggcactacc gcctaccacc gccgtctcga agccgagatt 300

gcagatctgc acggcaagga ggcagccctc gtgttttctt ccgcctacat cgcaaacgat 360

gccactctct ctactctgcg cctgctgttt ccgggcctca tcatctactc cgactctctg 420

aaccacgcat ccatgatcga aggcatcaag cgcaacgccg gccctaagcg catcttccgc 480

cacaacgacg tggcacatct gcgtgagctg attgccgcag atgacccagc cgcccctaag 540

ctcatcgcct tcgaatccgt gtactccatg gatggcgact tcggccctat caaggagatt 600

gcagatatcg ccgatgagtt cggcgcactc acctatatcg atgaagtcca cgcagtcggc 660

atgtatggtc cacgtggcgc cggcgtcgca gagcgtgatg gtctgatgca ccgtatcgac 720

atcttcaatg gcaccctcgc caaggcctac ggcgtcttcg gtggctacat tgcagcatcc 780

gccaagatgg tcgatgccgt ccgctcctac gcaccgggct tcattttctc cacctctctg 840

ccaccagcaa tcgcagccgg cgcacaagca tccattgcct tcctcaaaac tgccgaaggc 900

cagaaactcc gcgacgccca gcagatgcat gcaaaggtgc tgaagatgcg tctgaaggca 960

ctgggcatgc ctatcattga ccacggctct cacatcgtgc cagtggtcat cggcgaccca 1020

gtgcacacca aagccgtgtc cgatatgctg ctctccgact acggcgtcta cgtgcagcca 1080

atcaacttcc caaccgtccc acgtggcacc gaacgtctgc gcttcacccc atctccagtg 1140

cacgacctca agcagatcga tggtctggtg cacgccatgg atctgctgtg ggcacgttgc 1200

gcataa 1206

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcctggtgc cgcgcggcag ccatatggac tacaatctgg 40

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggtggtg gtggtgctcg agttatgcgc aacgtgccca cag 43

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggccctatca aggagattgc agatatcgcc gatgag 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgaactcatc ggcgatatct gcaatctcct tgatag 36

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgagaagct taaaggagga caaccatgga ctac 34

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctacgtctag attatgcgca acgtgcccac agcagatcca tg 42

<210> 9

<211> 1206

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggactaca atctggcact ggacaaggca atccaaaagc tccacgatga aggccgctat 60

cgcaccttca tcgacatcga gcgcgagaag ggcgcattcc caaaggcaca gtggaaccgc 120

ccagatggcg gtaagcaaga tattaccgtc tggtgcggca atgactacct cggcatgggc 180

caacacccag tggtgctcgc agccatgcac gaagcactcg aagcagtggg tgccggctct 240

ggtggcaccc gcaacatctc tggcactacc gcctaccacc gccgtctcga agccgagatt 300

gcagatctgc acggcaagga ggcagccctc gtgttttctt ccgcctacat cgcaaacgat 360

gccactctct ctactctgcg cctgctgttt ccgggcctca tcatctactc cgactctctg 420

aaccacgcat ccatgatcga aggcatcaag cgcaacgccg gccctaagcg catcttccgc 480

cacaacgacg tggcacatct gcgtgagctg attgccgcag atgacccagc cgcccctaag 540

ctcatcgcct tcgaatccgt gtactccatg gatggcgact tcggccctat caaggagatt 600

tgtgatatcg ccgatgagtt cggcgcactc acctatatcg atgaagtcca cgcagtcggc 660

atgtatggtc cacgtggcgc cggcgtcgca gagcgtgatg gtctgatgca ccgtatcgac 720

atcttcaatg gcaccctcgc caaggcctac ggcgtcttcg gtggctacat tgcagcatcc 780

gccaagatgg tcgatgccgt ccgctcctac gcaccgggct tcattttctc cacctctctg 840

ccaccagcaa tcgcagccgg cgcacaagca tccattgcct tcctcaaaac tgccgaaggc 900

cagaaactcc gcgacgccca gcagatgcat gcaaaggtgc tgaagatgcg tctgaaggca 960

ctgggcatgc ctatcattga ccacggctct cacatcgtgc cagtggtcat cggcgaccca 1020

gtgcacacca aagccgtgtc cgatatgctg ctctccgact acggcgtcta cgtgcagcca 1080

atcaacttcc caaccgtccc acgtggcacc gaacgtctgc gcttcacccc atctccagtg 1140

cacgacctca agcagatcga tggtctggtg cacgccatgg atctgctgtg ggcacgttgc 1200

gcataa 1206

Claims

1.荚膜红细菌5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体，其特征是所述5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述荚膜红细菌5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体的基因，其特征是所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.包含权利要求2所述基因的表达载体。

4.包含权利要求3所述表达载体的宿主细胞。

5.权利要求4所述宿主细胞发酵生产5-氨基乙酰丙酸的应用。